CN113406335A - 一种补体价脂质体免疫测定试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种补体价脂质体免疫测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分;其中,试剂R1包括免疫脂质体、缓冲液、防腐剂,溶剂为纯化水;试剂R2包括羊抗脱DNP抗体、G6P、NAD、缓冲液,溶剂为纯化水。本发明还提供了一种上述补体价脂质体免疫测定试剂盒的制备使用方法。本发明的优点在于:(1)相比溶血法,本发明使用免疫脂质体检测血清中补体含量,提高了定量检测准确度;同时,在试剂制作与操作使用上也更为简单,检测速度也相对快速;(2)本发明可在全自动生化分析仪上使用,成本低廉,自动化高,节省检测时间;在高稳定性和高精密度情况下,相比同类产品也具有更高的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及化学脂质体及免疫学测定领域,尤其涉及一种补体价脂质体免疫测定试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
总补体活性测定,除临床藉以诊断遗传性补体缺陷外,还用于典型的免疫复合物介导的疾病,如系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球肾炎、自身免疫溶血性贫血等。由于免疫复合物慢性活化导致血清总补体活性(CH50)和补体组分水平继发性降低,故补体活性的检测对这类疾病的进程和疗效判断提供了重要的依据。目前,对于总补体活性测定,主要采用溶血法。溶血法为本领域金标准,具有很好的应用优势,但该方法存在操作麻烦、耗时长、定量困难等缺点。
脂质体免疫测定法(Liposome Immunoassay,简称LIA)是二十世纪七十年代初由日本学者Ka-atoka首创的一类崭新的免疫学检测方法。近年来,随着对溶膜机制的深入探讨以及生物膜结构理论在脂质体中的正确运用,LIA已发展到了一个新阶段,逐渐引起人们的关注。脂质体免疫测定法具有操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性好,且可定量检测等优点。
当脂质体表面结合有抗原或抗体分子时,称为免疫脂质体(Immunoliposome)。LIA的脂质体一般是具有复合磷脂成份的免疫包裹脂质体,多为大单层脂质体(LUV)和小单层脂质体(SUV)。随着脂质体制备方法和蛋白质交联技术的进步,人们已可以根据需要制备出不同大小、层次、带电性、磷脂构成的脂质体,使其内部包裹一定量的标记物、且表面交联特定基团的免疫分子。
因此,若能将脂质体免疫测定法用于补体活性检测,将能克服传统溶血法存在的缺陷,得到一补体活性检测新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种补体价脂质体免疫测定试剂盒及其制备使用方法,其可避免采用传统溶血法带来的操作麻烦、耗时长、定量困难的问题。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题:
一种补体价脂质体免疫测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
免疫脂质体 20%~40%
缓冲液 10~100mmol/L
防腐剂 0.1~1g/L
其溶剂为纯化水;
试剂R2:
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一,包括的成分及相应含量具体为:
试剂R1:
免疫脂质体 33%
缓冲液 50mmol/L
防腐剂 0.5g/L
其溶剂为纯化水;
试剂R2:
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一,所述试剂R1中的免疫脂质体为CH50免疫脂质体。
作为本发明的优选方式之一,所述CH50免疫脂质体的制备方法如下:用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的CH50免疫脂质体。
作为本发明的优选方式之一,所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液、PBS缓冲液、PB缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一,所述防腐剂为硫柳汞钠、叠氮钠和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
一种上述补体价脂质体免疫测定试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备免疫脂质体
用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的免疫脂质体;
(2)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将步骤(1)制得的免疫脂质体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R1;
(3)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将各组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R2。
具体地,所述免疫脂质体制备步骤中的“衍化后的DNP抗原”,以及,试剂R2中的“羊抗DNP抗体”均可通过购买渠道获得。
一种上述补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用方法,包括如下具体步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)lmin后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中补体价含量。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(3)中,采用全自动生化分析仪,于主波长340nm、副波长700nm处测定吸光值。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(4)中,依据定标值,根据ΔA测算样本中补体价含量;所述定标方法为:5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:0U/mL、37.5U/mL、75U/mL、150U/mL、300U/mL。
本发明试剂盒与待测血清样本中补体的反应原理:
CH50免疫脂质体(试剂R1中)的脂质体膜上装配的“DNP抗原”首先与“羊抗DNP抗体”(试剂R2中)反应,形成“DNP抗原-抗体复合物”;接着,“抗原-抗体复合物”进一步地激活血清样本中的“补体”;当“补体”被激活后,会攻击并破坏脂质体膜,而CH50免疫脂质体中的葡萄糖6磷酸脱氢酶(标记物,G-6-PDH)则得到释放;释放的葡萄糖6磷酸脱氢酶将参与反应进而引起信号放大与显色反应。
本发明相比现有技术的优点在于:
(1)相比以往较传统的溶血法,本发明试剂盒使用免疫脂质体检测血清中补体含量,提高了定量检测准确度;同时,可用于全自动生化分析仪,不必再用琼脂板或试管等仪器,操作更为简单,检测速度也更为快速;此外,本发明试剂盒在试剂制作上也简单方便,适用于大规模生产;
(2)本发明可在全自动生化分析仪上使用,成本低廉,且自动化高,节省检测时间;在高稳定性和高精密度情况下,相比同类产品也具有更高的灵敏度和特异性,提升了补体检测的应用价值。
附图说明
图1是实施例4中CH50免疫脂质体的结构示意图;
图2是实施例6中本发明试剂盒与市场补体价检测试剂盒的线性关系曲线图;
图3是实施例6中本发明试剂盒的线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种补体价脂质体免疫测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
CH50免疫脂质体 40%
Tris缓冲液 10mmol/L
叠氮钠 0.1g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2:
其溶剂为纯化水。
其中,CH50免疫脂质体的制备方法如下:用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的CH50免疫脂质体。
实施例2
本实施例的一种补体价脂质体免疫测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
CH50免疫脂质体 20%
PBS缓冲液 100mmol/L
硫柳汞钠 1g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2:
其溶剂为纯化水。
其中,CH50免疫脂质体的制备方法如下:用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的CH50免疫脂质体。
实施例3
本实施例的一种补体价脂质体免疫测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
CH50免疫脂质体 33%
HEPES缓冲液 50mmol/L
硫酸庆大霉素 0.5g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2:
其溶剂为纯化水。
其中,CH50免疫脂质体的制备方法如下:用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的CH50免疫脂质体。
实施例4
本实施例的一种上述实施例1~3中补体价脂质体免疫测定试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备CH50免疫脂质体
用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过0.22μm聚碳酸酯微孔滤膜进行过滤;过滤后,滤液分装于西林瓶,置于冷冻干燥机的冷阱中,打开制冷机,冷阱温度下降至约-70℃,样品预冻6h,打开真空泵,真空度约100mbar,样品冷冻干燥24h,将样品置于冷阱上部托盘中,温度约25℃,2次干燥2h,得到前体免疫脂质体;最后,重新水化后即可得到试剂所需CH50免疫脂质体。CH50免疫脂质体的结构如图1所示,该CH50免疫脂质体的脂质体膜上装配有脱氧核糖核蛋白(DNP)抗原,同时包入葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)作为标记物。
(2)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将步骤(1)制得的免疫脂质体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R1。
(3)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将各组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R2。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用方法。
分析方法:两点终点法;
反应方向:上升反应;
校准方式:Logit-Log(4P);
测定波长:主340nm、副波长700nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=10:250:125(μL);
CH50校准品:在BSA中加入补体C1 100U/mL、补体C2 50U/mL、补体C3 50U/mL、补体C4 50U/mL、补体C5 50U/mL、补体C6 50U/mL、补体C7 50U/mL、补体C8 50U/mL和补体C950U/mL,再加入质量比为0.05%的硫柳汞,1.5%的聚乙烯吡咯烷酮K30以及3%的蔗糖。
测试步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)1min后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中补体价含量。
其中,依据定标值,根据ΔA测算样本中补体价含量,所述定标方法为5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:0U/mL、37.5U/mL、75U/mL、150U/mL、300U/mL。
本发明试剂盒与待测血清样本中补体的反应原理:
CH50免疫脂质体(试剂R1中)的脂质体膜上装配的“DNP抗原”首先与“羊抗DNP抗体”(试剂R2中)反应,形成“DNP抗原-抗体复合物”;接着,“抗原-抗体复合物”进一步地激活血清样本中的“补体”;当“补体”被激活后,会攻击并破坏脂质体膜,而CH50免疫脂质体中的葡萄糖6磷酸脱氢酶(标记物,G-6-PDH)则得到释放;释放的葡萄糖6磷酸脱氢酶将参与反应进而引起信号放大与显色反应。
实施例6
本实施例的一种上述补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用效果。
1.线性相关性验证:
利用上述实施例3配方配制试剂,与国家食品药品监督管理总局认可的某上市公司的补体价检测试剂盒进行对照检测,检测100份临床血清样本,检测结果如下表1,获得了本发明试剂盒与上市某公司在售补体价检测试剂的相关性曲线(见图2);通过检测结果显示,两试剂盒的线性相关曲线为y=1.0000x+0.3315,相关系数r=0.99995,说明两者具有较大的相关性。
表1本发明试剂盒(测试样品)与某上市公司在售补体价检测试剂盒(作为对照)线性相关性比对值
2.线性范围验证:
配制5-300U/mL不同浓度CH50校准品,使用本发明试剂盒测定各测试品浓度,以稀释浓度为自变量,以测定结果为因变量求出线性回归方程,计算测定结果的相对偏差。测定与计算结果如表2所示,由表2可知,测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y=0.0329+1.0047X(如图3所示),相关系数r=1.0000,说明线性关系良好,线性范围可达300IU/L。
表2本发明试剂盒线性范围验证
3、准确度验证:
取具有溯源性高值血清质控和低值血清质控各一份,使用本发明试剂盒检测6次,取均值,与质控靶值进行比对。结果如表3所示,表明检测值较靶值相对偏差较小,准确度较高。
表3本发明试剂盒的准确度验证结果统计表
4、精密度验证:
取经在售试剂盒检测的临床血清样本高值和低值各一份,使用本发明试剂盒对同一份血清样本连续检测10次,计算所述试剂盒的变异系数。精密度检测数据如表4所示,检测结果表明,本发明试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小且分别为0.34%和1.73%,精密度较好。
表4本发明试剂盒精密度验证结果
5、灵敏度及特异度验证:
采用溶血法来检测筛选50份阳性血清、50份阴性血清,选择市售采用ELISA法测定CH50试剂盒与本发明试剂盒同步检测此100份血清样本,再按照各试剂盒判定标准,设不在参考标准内样本为阳性,在参考标准内样本为阴性,以溶血法测定样本为金标准计算各试剂盒的灵敏度和特异度,结果见表5。结果表明,较ELISA法测定CH50试剂盒而言,本发明试剂盒保证了灵敏度的同时有更高的特异度。本发明的突出优点是灵敏度高,且与ELISA制备的试剂盒相比,本发明试剂盒具有更高的特异度,大大地提高临床检测的准确性,满足临床检测的需求。
表5本发明试剂盒与市售试剂盒的灵敏度、特异度比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
3.根据权利要求1~2任一所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的免疫脂质体为CH50免疫脂质体。
4.根据权利要求3所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒,其特征在于,所述CH50免疫脂质体的制备方法如下:用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的CH50免疫脂质体。
5.根据权利要求1~2任一所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液、PBS缓冲液、PB缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种。
6.根据权利要求1~2任一所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为硫柳汞钠、叠氮钠和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
7.一种如权利要求1~6任一所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备免疫脂质体
用水溶性的葡萄糖6磷酸脱氢酶、大豆磷脂、胆固醇和衍化后的DNP抗原混合于纯化水中制作水相,然后通过微孔滤膜进行过滤;过滤后,对滤液进行冻干脱水,再重新水化即得试剂所需的免疫脂质体;
(2)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将步骤(1)制得的免疫脂质体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R1;
(3)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将各组分物质于同一容器中混合,混合均匀后,制得试剂R2。
8.一种如权利要求1~6任一所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下具体步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)1min后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中补体价含量。
9.一种如权利要求8所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(3)中,采用全自动生化分析仪,于主波长340nm、副波长700nm处测定吸光值。
10.一种如权利要求8所述的补体价脂质体免疫测定试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(4)中,依据定标值,根据ΔA测算样本中补体价含量;所述定标方法为:5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:0U/mL、37.5U/mL、75U/mL、150U/mL、300U/mL。
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