JPH01240860A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定♀分
析するための免疫分析方法に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）か
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の機器を設置し、ｎｆｆ１８有するオペレータ
が操作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等に
も注意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えばエンザイムノア
ツセイ（以下ＥＩ△）等が知られている。

しかしＥＩＡは感度的には優れているものの、測定に長
時間を要するうえ、手間も煩雑で更に測定のダイナミッ
クレンジも狭いという問題を有する。

そこで、本発明者らは先に持聞昭６０−１１７１５９号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物ｒｔを封入したリポソーム試薬を用
いた方法を開示した。この方法はマイクロカプセルイム
ノアッセイ（以下ＭＣＩＡ）と呼ばれる。この方法は以
下のようなものである。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これと別に補体を７Ｊ［えると、抗原
−抗体反応及びそれに伴う神体の作用によってリポソー
ムか破壊され、封入されていた標識物質（例えば蛍光性
化合物）が流出する。この流出した標識物質の量と、試
料中の被検物質の母との間には相関関係があるので、流
出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分析）に
よって足場することにより、被検物質を定♀することが
できる。この試薬を用いれば、［Ａのような問題か生じ
ることはなく、免疫分析の簡便化か期待できる。

しかし、このリポソーム試薬を用いて血清やタンパク￥
１含イ１試料の分析を行う場合、抗原−抗体反応以外に
非特異反応が起り、これに起因してリポソームが破壊さ
れることがわかってきた。

非特異反応の一因として検体中の異好抗体を挙げること
ができる。例えばリポソームにマウス由来の抗ヒトαフ
ェトプロティンモノクローナル抗体（以下抗ヒトＡ　Ｆ
　Ｐ）ＩｏＡｂと記す）を固定化した試薬を用いてヒト
血清中の△「Ｐを分析する場合、検体であるヒト血清中
にマウスの抗体（イムノグロブリン）を認識する抗体（
抗マウスイムノグロブリン抗体）が含まれるとすると、
この抗マウスイムノグロブリン抗体は前記リポソーム上
に固定化された抗ヒトＡ　Ｆ　ＰＭｏＡｂ　（マウス）
を抗原として認識し結合する。これは明らかに抗原−抗
体反応である。従ってそこに補体を添加すると神体はこ
の非特異反応による抗原−抗体反応複合体により活性化
されて、リポソーム膜を破壊する。即ちこのような異好
抗体を有する検体においては被測定物質（例えばＡＦＰ
）の有無に拘らず、リポソームの溶解が起り（非特異的
溶解）、（±）の誤差を生ずることになる。

（発明が解決しようとする課題） 上述したように従来の免疫分析方法では非特異反応によ
るリポソームの破壊が生じたり、精密かつ簡便な足回が
できないという問題があった。

そこで本発明は非特異反応を抑え、精密かつ簡便な分析
が可能な免疫分析方法を提供する口とを目的とするもの
である。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の免疫分析方法は、リン脂質及び糖脂質のうち少
なくともいずれか一方を組成とするりボンームと、該リ
ポソーム中に封入された標識物質と、前記リポソームに
架橋法により固定化された抗体もしくは抗体の一部とか
らなる免疫分析試薬を用い当該免疫分析試薬と検体とを
接触せしめる際、反応液中にリポソームの非特異溶解防
止物資（以下「ブロッキング剤」という）を共存させ、
又は検体を予めブロッキング剤で処理した後に以後の免
疫反応を行わせるようにしたものである。

（作　用） 本発明の免疫分析方法によれば、検体中の異好抗体は当
該ブロッキング剤に結合し、リポソーム上に固定化され
た抗体又は抗体の一部との結合を阻害される。従って検
体中の異好抗体の有無に拘らず、リポソーム上において
は目的の抗原−抗体反応のみが進行し、精密な足回分析
が可能となり、操作もより簡便となる。

（実施例） 以下本発明実施例について詳述する。

本発明において、ブロッキング剤とはリポソーム膜表面
に固定化された抗体又は抗体の一部に由来し、検体（例
えば血漿、血清２体腔液、尿等）との接触において惹起
されるリポソームの非特異的溶解を防止するものである
。

本発明に用いる免疫分析試薬は、例えば以下のような方
法により製ｊ貨することかできる。

まず、所望の脂質と栗（ｎ剤とを溶媒中で反応させるこ
とにより、脂′ζ１分子に官能基を導入して官能性脂質
とり−る。この官能基がリポソーム上に、１３ける抗体
もしく（ま抗体の一部を固定化するための官能基とし作
用する。次に、得られた官能性脂質と、必要であればコ
レステロール及び他の脂７１の適当ωをフラスコに入れ
、溶媒を加えて溶解、混合させた後、溶媒を吸引除去し
て乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成
される。続いて、フラスコ内に標識物質を含有する水溶
液を加え、密栓して鬼とうすることにより、リポソーム
の懸濁液を調製する。

一方、リポソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部には、必要ならば架橋剤との反応により架橋基を導入
した後、必要に応じて還元剤等て逸埋して修飾する。

次いで、前記リポソーム１１液と抗体もしくは抗体の一
部とを適当な緩衝液中で反応させて、リポソームに抗体
もしくは抗体の一部を固定化さ−ぜる。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソームはリ
ン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一方を成分
とで−るものである。尚、前述したように必要に応じて
リン脂質、糖脂質に対してコレステロールを１０７”Ｊ
至５００モル％を加えてもよく、これによって安定リポ
ソームを得ることができる。また、リン脂質、糖脂質中
の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が１２乃至１８であること
が好ましく、更に偶数であることがより好ましい。

本発明に用いる免疫分析試薬にＪ３いて、リポソーム内
に封入される標識物質としては、親水性で、リポソーム
外に流出した際に定量可能な物質が選択される。このよ
うな物質としては、例えば、高温度では白己潤光により
蛍光を示さないが、低温度（１０−５Ｍ以下）で非常に
強い蛍光を発するカルボキシフルオレセイン、カルセイ
ン、ローダミンＢのような蛍光性物質；リポソーム外で
酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンのよ
うな発光性物質：可視域又は紫外域に特異的な吸収帯を
有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酸素の作用
により分解され、酸素消費又は過酸化水素生成をもたら
すグルコース、シュークロース等の糖類；テトラベンチ
ルアンモニ「クムのような比較的大きなイオン性化合物
；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＞の
ような補酵素類；メチルヒオログンなどのラジカル化合
物等が挙げられる。これらの化学物は、検出方法、感度
及びリポソームの安定性等の因子を考慮した上で適宜選
択される。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソーム上に
固定化される抗体もしくは抗体の一部は測定対象に応じ
て任意に選ぶことができる。リポソーム上に固定化され
る抗体のクラスとしては一般にイムノグロブリンＧ（Ｉ
ｑＧ＞又はイムノブ［］プリンＭ（ＩｇＭ）が用いられ
る。

当該１ｇＧ又はＩｃ＋Ｍ種の由来は特に問わないが一般
にはモノクローナル抗体の場合はマウス。

ポリクローナル抗体の場合には「クサギ、ヤギ、羊。

馬等がよく用いられる。また、当該ＩＱＧまたはＩＱＭ
は目的に応じて蛋白７１分ＶＲ酵素により予め処理され
て抗体断片（Ｆ（ａｂ“）２又はＦａｂ’）として利用
される。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソームに固
定化用官能基を導入するために脂質分子との反応か行わ
れる架橋剤、また必要に応じて抗体もしくは抗体の一部
に架）ａ基を導入するための架橋剤としては、例えば、
Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシンイミジル４−　
（ｐ−マレイミドフェニル）ゾチレート（ＳＭＰＢ）。

Ｎ−サクシンイミジル４−　（ｐ−マレイミドフェニル
）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−サクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネ−１へ（ＳＭＰ
Ｐ）、Ｎ−（Ｔ−マレイミドブチリルオキシ）サクシン
イミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（εマレイミドカプロイルオ
キシ）４ナクシンイミド（ＦＭＣ３）、ジサクシンイミ
ジルスペレート（ＤＳＳ＞、グルタルアルデヒド（ＧＡ
）、フタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド、フタル
酸。

テレフタル酸、ハロゲノアセデル、及びｔｌｏｏｃ　−
（ＣＨ２）　ｎ　−ＣＯＯＩＩ　　（ｎ　−１乃至１０
）の化学式で表わされる脂肪族ジカルボン酸等が挙げら
れる。

び分子間（架（凸）共役体生成のためのへテロ−２官能
試薬である。

尚、抗体もしくは抗体の一部に架）命剤を反応させて栗
僑阜を導入した場合、還元処理により栗（ｎ基を修飾す
ることが必要となる場合がある。

このようにして抗体（ＩＱＧ又はＩｑＭ）又は抗体の一
部を固定化したリポソームは免疫分析用試薬とに検体と
接触せしめられる。この時、検体側に異好抗体があると
上記リポソーム上の抗体（ＩｇＧ又はＩＣＢＭ）と反応
し、非特異反応を惹起する。ここで用いるブロッキング
剤とは、上記リポソーム上の抗体に代って異好抗体が結
合するものを示す。当該異好抗体認識物′ｉ１としては
一般に上記リポソーム上に固定化した抗体又は抗体の一
部と基本的に類似したものでなければならない。

従って、ブロッキング剤として用いられる物質は上記リ
ポソーム上に固定化した抗体又は抗体の一部と同じ種に
由来し、同じクラスに属するイムノグロブリンが用いら
れる。尚、ブロッキング剤として用いられるイムノグロ
ブリンは異好抗体のＩＨ害にのみ用いられるものである
。従って、リポソーム上に固定化された抗体又は抗体の
一部と冗％り特定の抗原を認識する必要はないし、史に
は認識しない方が望ましい。そこで特定の抗原で（盛作
してない動物より１ｑだイムノグロブリン画分がブロッ
キング剤として用いられることが望ましい。

ブロッキング剤としてはイムノグロブリン全分子を用い
る他、目的に応じイムノグロブリン断片（Ｆｃ、　Ｆ　
（ａｂ’）２　、　Ｆａｂ’　等）を用いることも可能
である。

（以下余白） （例）　ブロッキング剤選択例 ここで用いられるブロッキング剤の１ａｌｆｔは０．０
１乃至１０ｍ！ｇ／ｍ１であるが濶麿が高すぎると、本
来の目的である補体によるリポソームの溶解反応を阻害
する恐れもめる。従ってブロッキング剤がマウス１ｇＧ
である場合には０．２５乃至１ＲＥ／ｄ！で用いること
が望ましい。尚、本ブ［コツキング剤の添加方法として
は、種々考えられるが、直接本ブロッキング剤で検体を
希釈してもよいし、検体とリポソームを接触する際に別
途添加してもよい。

本発明に用いる免疫分析方法は、以下のようにして実施
される。すなわら、まず被検物質を含イ１する試料（検
体）をブロッキング剤を含む等張液と混合する。この時
検体の希釈率は測定対象物質の測定限界により選択され
る。

この検体及びブロッキング剤を含む試料に、リポソーム
よりなる免疫分析試薬を加え、これと別に袖体を加える
。尚、この際被検物質に対する第２抗体を加え被検物質
を挟みこむ方法を用いてもよい。第２抗体及び／又は補
体は必要に応じてブロッキング剤を含む等張液で希釈す
ることができる。この結果、被検物質とリポソーム上に
固定化された抗体もしくは抗体の一部との抗原−抗体反
応及びそれに伴う補体の作用により、リポソームが破壊
されて封入されている標識物質（例えば蛍光性化合物）
が流出する。この流出した標識物質の量と、試料中の被
検物質のＱとの間には相関関係があるので、流出した標
識物質を適当な分析方法（例えば蛍光分析）によって定
すすることにより、被検物質を定量することができる。

そして、実際の定量分析においては、予め既知の濃度の
被検物質を用いて検ｒｄ線を作成してあき、これをもと
にして同一条件で未知の）開度の被検物ｒｌどの反応に
より定量分析を行う。

本発明に用いる免疫分析試薬と被検物質どの十分な反応
に要する時間は、被検物質の種類、リポソームの特性２
反応条件、更にはりボソームに固定化された抗体もしく
は抗体の一部の種類、純度。

固定化形態等によって異なる。このため、個々の場合に
応じて予め特定の濃度に調製された被検物質と同種の物
質を含む試料を用いて予備測定を行うことにより、免疫
分析試薬と被検物質との最適反応時間を設定することが
望ましい。

本発明に用いる免疫分析試薬によって定量が可能な被検
物質は、腫瘍マーカー（ＡＦ−Ｐ（α−フェトプロティ
ン）　、　Ｂ　Ｆ　Ｐ　（ｆ＝基性フェトプロティン）
、ＣＦ△（癌胎児性抗原）、ＰＯＡ（肝癌胎児性抗原）
等、免疫グロブリン（Ｉ　Ｃ７Ｇ。

ＩｇＥ、　　ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等）、ホル［ン（
インシュリン、Ｔ３等）及び祭物等が挙げられ、その対
象は広範囲にわたる。

以下に実験例を説明する。

実験例１　ヒトの△ＦＰの測定 水実験例において用いた試薬のうち、シバルミ１ヘイル
ホスフアチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）　、シバ
ルミ１〜イルホスフン・チジルコワン（ＤＰＰＣ）　、
Ｔ］コレステロールびジチオスレイト−ル（ＤＴＴ）は
シグマ礼装のものを用いた。また、Ｎ−ザイクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチＡ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）及びセフ１デックスＧ−２５ノ？インはファルマ
シア社製のものを用いた。仙の試薬は市販品（時板）を
精製せずに使用した。尚、水は全てイオン交換水を用い
た。

■官能性１ノン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロ
ピオン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の調装密栓付三角
フラスコにＤＰＰＥ７（Ｃ！Ｆを分取し、クロロホルム
／メタノール（５：１）混合溶媒２５ｄに溶解した。次
に、トリエタノールアミン６０ｕｆ！及びＳＰＤＰ５０
ｍｙを添加し、窒素ｉｔ％した後、室温で１時間反応さ
せてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ）を導
入した。続いて、ロータリーエバポレータにより溶媒を
除去した。次いで、乾燥物をクロロボルム／メタノール
（１０：１）混合溶媒に溶解した後、シリカゲルカラム
を用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収した。

更に、ロータリーエバポレータにより約５ｄまで溢縮し
た。ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０乃至９５％であった
。これを窒素封入して一２０℃で保存した。

この反応によりＤＰＰＥに導入されたジヂオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール＜２／１）混合溶媒に溶解した。

５曲のＤＰＰＣ２００μｌ、１０ｍＨのコレステロール
１００μｐ及び’１ｍ）ｌのＤＰＰＥ−ＤＴＰ（■で得
られた官能性リン脂質＞５０μｌを１０威容母のナシ型
フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍｌを加えてよく
混合した。次に、約４０°Ｃの水浴中でロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム２ｍ
ｌを加えて十分に撹拌した後、再度ロータリーエバポレ
ータにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返すと
、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。続いて、フラ
スコをデシケータ中に移して真空ポンプで約１時間吸引
し、溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン〈イース
トマン・コダック社製、ｐＨ７．４：以下ＣＦと記す＞
１００μｍを添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後
、密栓して約６０’Ｃの水浴中に約１分間浸漬した。続
いて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラスコ壁面の脂
質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうし
た。この操作によりリポソーム懸濁液が調製された。更
にリポソーム懸濁液に０．１ＭのＩ−ＩＥＰＥｓ緩衝液
（　０．８５％Ｎａ（Ｊ’金含有　ｐＨ７、５　、以下
ＨＢＳと記す）を少量添加した後、全て遠心チューブに
移し、４°Ｃにおいて１５．　００Ｏｒｐｍで２０分間
遠心する操作を数回繰り返した。

■抗ヒ（〜ＡＦＰ抗体の修飾 １７ＩＩ！ＩＦ／ｄの抗ヒトＡＦＰ抗体（マウスモノク
〔］−ナル抗体：ｒｇＧ）２ｍ！！をｌ−Ｉ　Ｂ　Ｓで
希釈し、１０ｍＨのＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐエタノール溶液１ｏ
ｕｐを添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応さ
せ、抗ヒト△「Ｐ抗体にジチオピリジル基を導入した。

次に、予め０．ＩＭＮｉｆｆＭ綴ｔｈ液（０−８５％Ｎ
ａＣｆ含ｆ１、ｐＨ４，５）で平衡化したセフフ・デツ
クスＧ−２５７ンー・インカラム（ゲルイ本（前約１５
ｍ１）を用いたゲル濾過により未反応の５ＰＤＰを除去
して精製し、蛋白質分画のみを回収した。

次いで、この分画にＤＴ王約２０ｍｇを加え、窒素置換
後、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基を還元
してＳ　ｌ−１基と置換して修飾した。続いて、ｌ−Ｉ
　Ｂ　Ｓで平衡化したセファデックスＧ−２５フン・イ
ンカラムを用いたゲル濾過により未反応のＤ　Ｔ　Ｔを
除去して情装し、蛋白質分画のみを回収した。

■抗じトＡＦＰ抗体固定化リポソームの調装■で１ワら
れたリポソーム懸濁液１ｍｌを４°Ｃにおいてｉ５．ｏ
ｏｏｒｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈査と、■で
得られた０１１ｇ蛋白質／ｍｌの修飾された抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体溶液２ｍｌとを混合し、窒素置換した後、密栓し
て２０’Ｃでゆっくり振とうしながら１晩反応さけた。

次に、ＨＢ　Ｓで洗浄して未反応の抗体を除去した。

′このようにして得られたリポソーム試薬に、ゼラチン
ベ［」ナールバッファ’　−（ＤＨ７，４、以下ＧＶＢ
）２ｍ！！及び１０％ＮａＮ３２０μｌを添加して十分
に撹拌した後、窒素置換して４°Ｃで保存した。

■　ブロッキング剤濃度の検討 ■で１りられたリポソーム（抗体感作前）を用いて、血
清共存下で惹起されるリポソームの非特箕）ｄ解に及ぼ
すブロッキング剤の効果について検討した。正常ヒト血
清（Ｎ　）−Ｉ　Ｓ　）にＡＦＰ　（胎盤由来）をＯ乃
至１０，０００ｍＦ！／ｄとなるよう添加しそれをマウ
スＩｇＧＯ乃至１ｍ３／威含有するしラチンベロナール
バッフ７　　（ｐＨ７，４，０，５ｍＭＭ　ｑＣＪ４２
　。

０、１５　ｍＨｃ　ａ　Ｃｊ！　３含有、以下ＧＶＢ″
）でそれぞれ１０倍に希釈した、なお、コントロールＧ
ＶＢ４＋とじてＡＦＰ標品をＧＶＢ４＋Ｆ所定の温度と
したものを用いた。反応はマイクロプレート（９６穴）
を用いた。マイクロプレートのウェルに先ずサンプル１
０μで次に■で作られた抗ヒトＡＦＰ抗体感作リポソー
ム１０μｌを添加し、撹拌後３７°Ｃ，１０分間反応さ
せた。次にその反応混液に補体試薬（モル［ット血清５
０Ｈ５０）及び抗ヒト△「Ｐ抗血清（つ１ツギ）　　（
Ａ２ａｏｉ？０．１）を各２５μｌ添加後再び撹拌し、
３７°Ｃ，３０分反応さけた。次いで、０．０１　Ｍの
ＥＤ丁Ａ−ベロナール緩衝液１００μ犯で反応を停止さ
せ、各温度のヒト△ＦＰ溶液について、流出したＣＦ開
をＭ工Ｐ−３２マイクロプレートリーダー（コロナ電気
製）により、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎ…
の条件で測定した。

この測定に基づいて、次式によりリポソーム溶解率を訓
締した。

ここで、「ｅ：実測した蛍光強ｉＬ　Ｆｏ　　：バッフ
ァ溶液又は検体由来の蛍光強度、「ａ：脱イオン水を添
加しリポソームを全て破壊した時の蛍光強度である。こ
のようにして得られたリポソームの非特異溶解に対する
共存ブロッキング剤の効果を第１図に示した。ＧＶＢ４
＋をベースにした測定系では、リポソームのバックグラ
ウンドも３％位でＡＦＰ＆ｉ度に対してリポソームの溶
解率はきれいに比例した。ところが、血清（ＮＨ３＞ベ
ースではバックグラウンドが２０％にも増加し、応答性
も不良となった。バックグラウンド及び応答性は反応液
中にマウスＩｇＧを添加することによりその添加溢Ｉ哀
に依存して回復し、０．５ｍｇ／威では略ＧＶＢ４＋ベ
ースと同様のバックグラウンド及び応答性を得ることが
できた。

■血清中ＡＦＰ測定に及ぼすブロッング剤の効果 ■と同様な方法を用いてＮＨＳベースでヒ１へＡＦＰ濃
度を測定し、検量線を作成した（マウスＩ　ｇＧ　、　
１　ｍｇ、／ｍｌ　＠右ＧＶＢ″で希釈）。次にＲＩＡ
で予めＡＦＰ値を確認しである患者血清５１倹体につき
上記と同様にマウスＩＱＧ、０または１”Ｆ　／　ｒｒ
ｄ！　会イ１ＧＶＢ”＋で１０倍に希釈しそのＡＦＰ値
を水沫（ＭＣＩＡ＞で測定し１又ＩＡとの相関を求めた
。その結果を第２図（ａ＞、（ｂ）に示した。ブロッキ
ング剤（マウス（Ｉ　ｇＧ＞無添加系ではかい離検体が
みられ、相関係数（γ〉もも０．８３１７であったが、
ブロッキング剤添加系では、かい離は抑ｉ！ｉ１１され
Ｔ＝　０．９３７４と改善された。

実験例２　血清中にトフェリヂンの測定実験例１の■乃
至■の方法に基づいて作成した抗ヒトフェリチン抗体（
ヤギ：ＩｇＧ＞固定化リポソームを用い、実験例１の■
と同様に予めＲＩＡでフェリチン値を測定した患者血清
６０倹休につきＭＣＩＡでフェリチン値の測定を行い両
者の相関を求めた。尚、この時検体希釈液には０．５ｍ
ｇ／ｍｆ！のＡ７ギＩｇＧを含むＧ　Ｖ　Ｂ　”を用い
た。

結果を第３図に示した。水沫ではγ−０，９３０５とＡ
ＦＰと同様満足できる結果が得られた。

実験例３　血清中ヒ１〜ＣＥＡの測定 実験例１の■乃至■の方法に基づいて作成した抗ヒトＣ
ＥＡ抗体（マウス、モノクローナル：Ｉ　ｇＧ）固定化
リポソームを用い、実験例１の■及び実験例２と同様に
予めＲＩＡでＣＦＡ値を測定した患者血清４０倹体につ
きＭＣＩＡとの相関を求めた。この場合、検体希釈液中
に（ユ’Ｉｍ３．／ｄ！のマ・ノスＩｇＧをブロッキン
グ剤として添加した。

結果第４図に示した。水沫では７−＝　０．９０００と
ＡＦＰやフエ１ノチン同様満足できる結果が１１７られ
だ。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析方法によれば、被
検物質を含む血清等の試料を非特異反応を抑えつつ、分
析する口とができ、精密かつ簡便に被検物質を宙吊でき
る等顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヒト血清中ＡＦＰ測定におけるブロッ
キング剤（マウスＩ　ｇＧ）添加濃度の影響を示すグラ
フ、第２図（ａ）、（ｂ）は本発明のヒト血清中ＡＦＰ
測定におけるブロッキング剤（マウスＩ　ｇＧ）添加効
果とＲＩＡとの相関図、第３図は本発明のブロッキング
剤（ヤギＩ　ｑＧ）添加系におけるヒト血清中フェリチ
ン測定とＲＩＡとの相関図、第４図は本発明のブロッキ
ング剤（マウスＩｑＧ）添加系に３５けるヒト血清中Ｃ
ＦＡ値とＲＩＡとの相関図である。 ＼〜 （Ｇ） ＲＩＡ （ｂ） 手続補正書 昭和６３年６月２０日 ２．５を明の名称 ４、代理人 ５、補正命令の日付 明細書の発明の詳細な説明の）閤及び図面７、補正の内
容 （１）明細ｘ第３頁第１行目から第２行目にかけて記載
の［エンザイムノアッセイ］を 「エンザイムイムノアツセイ」に訂正する。 （２）明細書第６頁第１行目から第２行目にかけて記載
の「物資」を「物質」に訂正する。 （３）同上頁第９行目に記載の「阻古される。」を「阻
害する。」に訂正する。 （４）明細書第７頁第６行目に記載の「とし作用」を「
とじて作用」に訂正する。 （５）明細書第１］頁下から第５行目に記載の「試薬と
に」を「試薬として」に訂正する。 （６）明細占用１３頁下から第１行目に記載の「ブロッ
キング」を「ブロッキング」に訂正する。 （７）明細書第２１頁下がら第３行目乃至第２行［１に
かけて記載の「バッファ］を「バッファー」に訂正する
。 （８）明細占用２２頁第１１行目に記・戊の「略」を削
除する。 （９）明細書第２３頁第５行目に記載の［もも０．８３
１７　Ｊを「は０．８３１７　Ｊに訂正する。 （１０）図面の内、第４図を別紙のとおり訂正する。 以上 ＭＣＩＡ［ｎ９／ｍｌ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方を組成とするリポソームと、該リポソーム中に封入さ
   れた標識物質と、前記リポソームに架橋法により固定化
   された抗体もしくは抗体の一部とからなる免疫分析試薬
   を用いる免疫分析法において、反応液中にリポソームの
   非特異溶解防止物質を共存せしめることを特徴とする免
   疫分析方法。
2. （２）反応液中に共存せしめるリポソームの非特異防止
   物質が、前記リポソームに固定化された抗体もしくは抗
   体の一部に由来し、検体との共存下において惹起される
   リポソームの非特異溶解を防止する請求項１記載の免疫
   分析方法。
3. （３）当該非特異溶解防止物質が、前記リポソームに固
   定化された抗体もしくは抗体の一部と同じ種に由来する
   イムノグロブリン又はその一部である請求項２記載の免
   疫分析方法。
4. （４）当該非特異防止物質が前記リポソームに固定化さ
   れた抗体もしくは抗体の一部と同じクラスに属するイム
   ノグロブリン又はその一部である請求項２記載の免疫分
   析方法。
5. （５）リポソームがリン脂質及び糖脂質のうち少なくと
   もいずれか一方とコレステロールとからなる請求項１記
   載の免疫分析方法。