JPH03206963A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量
分析するための免疫測定方法に関する。

（従来の技術） 試料中の特定の抗原又は抗体の定量分析には、ＲＩＡ（
ラジオイムノアッセイ）やＥＩＡ（エンザイムイムノア
ッセイ）等が知られている。しかしＲＩＡでは放射性元
素を用いるため、専用の機器を設置し、資格を有するオ
ペレータが操作を行わなければならず、しかも廃棄物の
処理等にも注意を要するという問題がある。

またＥＩＡでは感度的には優れているものの、測定に長
時間を要する上、手間も煩雑で更に測定のダイナミック
レンジも狭いという問題を有する。

そこで本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号公
報に示されるように、表面に親水性の抗体又は抗原を固
定化し内部に親水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封
入したリポソーム試薬を用いた測定方法を開示した。こ
の方法はＭＣＩＡ（マイクロカプセルイムノアッセイ）
と称される。このＭＣＩＡは以下のようなものである。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これと別に補体を加えると、抗原一抗
体反応及びそれに伴う補体の活性化が起り、補体の膜障
害作用によってリポソームが破壊され、封入されていた
標識物質か流出する。この流出した標識物質の量と、試
料中の被検物質（抗原又は抗体）との間には相関関係が
あるので、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば
蛍光分析）によって定量することにより、被検物質を定
量することができる。従ってこのＭＣＩＡによれば前記
のような問題は解決される。

（発明が解決しようとする課題） ところでＭＣＩＡでは、目的の抗原一抗体反応以外に補
体の作用によって非特異反応が起き、これに起因してリ
ポソームが破壊されるという問題かある。すなわち被検
物質の有無に拘らずにリポソームが破壊されて内部の標
識物質が破壊されるようになり、測定の信頼性を損うこ
とになる。

更にこの非特異反応には検体である血清の成分も関与し
ているので、反応液中の血清濃度を充分に増加させられ
ない不便さも存在している。

本発明は以上のような問題に対処してなされたもので、
非特異反応を防止する免疫測定方法を提供することを目
的とするものである。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 上記目的を達戊するために本発明は、マイクロカプセル
と、このマイクロカプセルに封入された標識物質と、前
記マイクロカプセルに固定化された抗体，抗体の一部も
しくは抗原とからなる免疫測定試薬を用いる免疫測定方
法において、前記マイクロカプセルと最終的に結合する
抗原又は抗体の担体として比表面積の大きなネットワー
ク構造を有する物質を用いることを特徴とするものであ
る。

（作　用） ＭＣＩＡにおいて、補体を用いずにこの代りに比表面積
の大きなネットワーク構造を有する物質を用い、これを
抗原又は抗体の担体として使用して最終的にマイクロカ
プセルと結合させる。従来は反応系をホモジニアス系に
するために補体が必要であったがこの弊害として非特異
反応が避けられなかった。補体を不要にすることにより
反応系はへテロジニアス系となってＢ／Ｆ分離が必要と
なるが、前記のような比表面積の大きなネットワーク構
造を有する物質を用いることにより、容易にＢ／Ｆ分離
を行うことができる。従って非特異反応の発生が防止さ
れ、信頼性の高い免疫測定を行うことができる。

（実施例） 以下本発明実施例について説明する。

第１図は本発明の免疫測定方法の実施例を示す概略図で
、先ず抗体（第１抗体）１が架橋法により固定化された
比表面積の大きなネットワーク構造を有する物質２を用
意する。抗体１の担体として働くこの物質２としては例
えばナイロンメッシュ，ガラスファイバ，ガラスフィル
タ，多孔性ナイロンフィルタ，イオン交換樹脂，多孔性
多糖ゲルビーズ等の中から任意のものを選ぶことができ
る。ここでこの物質２のネットワークの孔径は、後で用
いられるリポソーム等のマイクロカプセルがネットワー
ク内を支障なく移動可能とするために少なくとも当該マ
イクロカプセルの径と同等以上望ましくは数倍の大きさ
に設定される。

次にこの物質２に対して被測定物質としての抗原３が存
在する試料（検体）４を加える。この抗原３は抗体２と
反応しいわゆる抗原一抗体反応が生ずる。このとき、必
要に応じて過剰の抗原を吸引，ろ過等で除去することも
可能である。続いてこれらに対して抗体（第２抗体）５
が固定化されたリポソーム６を加えると、抗体５は抗原
３と反応していわゆる抗体１一抗原３〜抗体５からなる
サンドイッチ構造が形或される。リポソーム６は前記し
たように、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物質（例えば蛍光性物質）７を封入し
た免疫測定のためのリポソーム試薬が用いられる。なお
、抗原３とリポソーム６の反応を行わしめた後物質２と
の反応を行わせることも可能である。

続いて存在しているＢ　（Ｂｏｕｎｄ：バウンド）型と
Ｆ　（Ｆｒｅｅ　：フリー）型との２種類のリポソーム
を分離するために、ろ過又は吸引等によって処理する。

このＢ／Ｆ分離は本実施例においては補体を不要となし
たことにより、ヘテロジニアス系の反応が行われるため
に必要となったものである。

次にこれら反応液に対して水、有機溶媒又は界面活性剤
等の媒体を加えることによりリポソーム６を破壊し、内
部の標識物質７を流出せしめる。

この流出した標識物質７の量と、試料４中の抗原３（被
検物質）との間には相関関係があるので、流出した標識
物質７を蛍光分析怯等により定量することによって、抗
原３を定量することができる。

リポソーム６の径は通常０．　　３μｍ乃至３０μｍ程
度のものが用いられており、この点でネットワーク構造
を有する物質２としてはそのリボソ一ム６を十分に通過
させ得る孔径のネットを有するものが用いられる。すな
わち０．　　３μｍ乃至３０μｍ以上の大きさの孔径を
有するものが用いられる。

以上のような本実施例によれば、補体を不要となして比
表面積の大きなネットワーク構造を有する物質を用いて
ヘテロジニアス系のＭＣｒＡを行うようにしたので、非
特異反応の発生が防止され、信頼性の高い免疫測定を行
うことができる。特に比表面積の大きなネットワーク構
造を採用することにより、反応効率を向上させることが
できまたＢ　，／　Ｆ分離を容易に行うことができる。

更にＭＣＩＡの感度を向上することができるので、検体
量を増加することが可能となる。

ネットワークシステム自体はＥＩＡ等で応用されている
が、ＥＩＡではＢ／Ｆ分離後に検出のために酵素反応を
必要とするので、手間と時間がかかっていた。この点本
発明実施例ではマーカーとしてリポソームを用い、Ｂ　
，／　Ｆ分離後は水，界面活性剤又は有機溶剤等の媒体
を添加するだけでリボソームを破壊して標識物質の流出
が可能となる。

従って余分な酵素反応を行わずに迅速に免疫測定ができ
るようになる。

次に実験例について説明する。

比表面積の大きなネットワーク構造を有する物質として
イムノダインＴ！′（米国，ポール社製）を用いた例で
説明する。このイムノダインＴＭは多孔性のナイロンメ
ッシュ構造を有している。

（１）抗体固定化 ４Ｘ１ｃｍの方形サイズに形成した１０個のイムノダイ
ンＴＭを用意し、９ｃｍ径のガラスシャーレに並べる。

次に抗体として７　ｍｌのウサギ抗ＡＦＰ抗体［（抗ａ
−フエトプロテイン抗体）ダコ社製］を用いて添加し、
ＰＢＳ　（０．８５％Ｎ　ａ　Ｃ　ｌ含有リン酸バッフ
ァ）で２０倍に希釈した後、室温で２時間震とうする。

続いて上澄液を除去した後ＰＢＳで３回洗浄する。次に
ＰＢＳを含有したグリチン１０ｍｌに浸漬し、室温で一
夜放置した後ＰＢＳで３回洗浄する。

（２）抗体固定化リポソームの調整 本実質例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロ
ール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製の
ものを用いた。また、Ｍ−サクシンイミジル３−　（２
−ピリジルジチオ）プロピオネーｈ　（ＳＰＤＰ）及び
セファデックスＧ−２５ファインはファルマシア社製の
ものを用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに
使用した。尚、水は全てイオン交換水を用いた。

■官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオビリジルプロピ
オン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の調整 密栓付三角フラスコにＤＰＰＥ７０■を分取し、クロロ
ホルム／メタノール（５　：　１）混合溶媒２５ｍｌに
溶解した。次に、トリエタノールアミン６０μＩ及びＳ
ＰＤＰ５０■を添加し、窒素置換した後、室温で１時間
反応させてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ
）を導入した。続いて、ロータリーエバポレータにより
溶媒を除去した。次いで、乾燥物をクロロホルム，／メ
タノール（■０：↓）混合溶媒に溶解した後、シリカゲ
ル力ラムを用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回
収した。更に、ロータリーエバボレータにより約５ｍｌ
まで濃縮した。

ＤＰＰＥ−ＤＴＰの取率は８０〜８５％であった。これ
を窒素封入下−２０°Ｃで保存した。

この反応によりＤＰＰＥの導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リポソームの調整 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤＰＰＣ２００μｌ，１０ｍＭのコレステロー
ル１００μｌ及び１ｍＭのＤＰＰＥＤＴＰ　（■で得ら
れた官能性リン脂質）５０μｌを１０ｍｌ容器のナス型
フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍｌを加えてよく
混合した。次に、約４０°Ｃの水浴中でロータリーエバ
ボレー夕により溶媒を除去した。再びクロロホルム２ｍ
ｌを加えて充分に攪拌した後、再度、ロータリーエバポ
レータにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返す
と、フラスコ壁面に脂質薄膜が形或された。続いて、フ
ラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで約１時間吸
引し、溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキジフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製，ｐＨ７．４，浸透圧２８０ｍＯ
ｓ　　ｍｏｌ：以下、ＣＦと記す）１００μｌを添加し
、フラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して約６００
Ｃの水浴中に約工分間浸漬した。続いて、Ｖｏｒｔｃｘ
ミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失
するまでフラスコを激しく振とうした。この操作により
ノポソーム懸濁液が調整された。更に、リポソーム懸濁
液に０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０．８５％ＮａＣ
ｌ含有、ｐＨ７．４５：以下、ＨＢＳと記す）を少量添
加した後、全て遠心チューブに移し、４℃において２７
０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心する操作を数回繰り返し
た。最後に１　ｍｌのＨＢＳに懸濁させた。

■抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾 ↓ｍｇ　／　ｍｌの抗ヒトＡＦＰ抗体２　ｍｌをＨＢＳ
で希釈し、１０ｍＭのＳＰＤＰエタノール溶液１０μｌ
を添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応させ、
抗ヒトＡＦＰ抗体にジチオピリジル基を導入した。次に
予めＯ，ＬＭ酢酸緩衝液（０．８５％ＮａＣ１含有、ｐ
Ｈ４．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５ファイ
ン力ラム（ゲル体積約１５ｍｌ）を用いたゲルろ過によ
り未反応のＳＰＤＰを除去して精製し、タンパク質分画
のみを回収した。

次いで、この分画にＤＴＴ約２０■を加え、窒素置換後
、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基をＳＨ基
と置換して修飾した。続いて、ＨＢＳで平衡化したセフ
ァデックスＧ一２５ファイン力ラムを用いたゲルろ過に
よりＤＴＴを除去して精製し、タンパク質分画のみを回
収した。

■抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソームの調整■で得られ
たリポソーム懸濁液↓ｍｌを４°Ｃにおいて２７０００
　Ｘ　ｇで２０分間遠心したリポソーム沈査と、■で得
られた０．１ｇタンパク質／ｍｌの修飾された抗ヒトＡ
ＦＰ抗体溶液２　ｍｌとを混合し、窒素置換した後、密
栓して２０’Ｃでゆっくり振とうしながら１晩反応させ
た。次に、ＨＢＳで遠心洗浄して未反応の抗体を除去し
た。

更に、２７０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心したリポソー
ム沈査の重量を測定し、↓重量％濃度になるようにＣＶ
Ｂ−で希釈した。そして、０．０５％濃度となるように
アジ化ナトリウムを添加し、４°Ｃで保存した。

（３）材料 ＡＦＰをＧＶＢ“（ゼラチンベロナールバッファ）で各
々１，０００，３３３，１１１，３７．１２．３，４．
１，１．４．０．４５．０　（ｎｇ／ｍｌ）となるよう
に希釈したものを用意して、Ｇ　Ｖ　Ｄ　”で１５倍に
希釈した抗ＡＦＰ抗体を結合させたリポソームに加える
。

（４）分析 試験管にイムノダイン片をセットした後、１００μ１の
試料を加える。これを３７°Ｃで３０分間振とうした後
、ＧＶＢ“で吸引洗浄する。次にリポソームを１００μ
ｌ用意して加えた後、３７゜Ｃで３０分間振とうし、さ
らにＧＶＢ−−で吸引洗浄する。続いて２．５％の界面
活性剤（トリトンＸ−１００）を１５０μｌ加えた後、
５分間放置する。これによってリポソームが破壊し標識
物質が流出することにより、免疫測定か行われる。なお
、測定は蛍光測定用マイクロプレートリーダＭＴＰ−３
２”（コロナ社製）により行った。

第２図は以上によって得られたＡＦＰ濃度による応答性
を示しており、縦軸は蛍光強度，横軸はＡ　Ｆ　Ｐ　ｌ
度である。ＡＦＰａ度が↓．４ｎｇ／ｍｌを越えると蛍
光強度か急激に増大し、リポソームから流出される蛍光
物質のような標識物質の量か急激に増大することを示し
ている。

［発明の効果］ 以上述べたように本発明によれば、補体を用いずに比表
面積の大きなネットワーク構造を有する物質を用い、こ
れに最終的にマイクロカプセルを結合させるようにした
ので、非特異反応が防止できて測定の信頼度を向上する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の免疫測定方法の実施例を示す概略図、
第２図は本実施例によって得られた結果を示す特性図で
ある。 ２・・・ネットワーク構造を有する物質、３・・・抗原
（被検物質）、６・・・リポソーム７・・・標識物質。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）マイクロカプセルと、このマイクロカプセルに封
   入された標識物質と、前記マイクロカプセルに固定化さ
   れた抗体、抗体の一部もしくは抗原とからなる免疫測定
   試薬を用いる免疫測定方法において、前記マイクロカプ
   セルと最終的に結合する抗原又は抗体の担体として比表
   面積の大きなネットワーク構造を有する物質を用いるこ
   とを特徴とする免疫測定方法。
2. （２）前記ネットワーク構造を有する物質がナイロンメ
   ッシュ、ガラスウール又は官能基を有する多孔性部材の
   いずれかからなる請求項１記載の免疫測定方法。
3. （３）前記ネットワーク構造を有する物質のネットワー
   クの孔径が少なくともマイクロカプセルの径と同等以上
   の大きさを有している請求項１記載の免疫測定方法。
4. （４）前記マイクロカプセルがリポソームからなる請求
   項１記載の免疫測定方法。