JPH0467916B2 - - Google Patents

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JPH0467916B2
JPH0467916B2 JP60185612A JP18561285A JPH0467916B2 JP H0467916 B2 JPH0467916 B2 JP H0467916B2 JP 60185612 A JP60185612 A JP 60185612A JP 18561285 A JP18561285 A JP 18561285A JP H0467916 B2 JPH0467916 B2 JP H0467916B2
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sac
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binder
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Bii Wagunaa Danieru
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Becton Dickinson and Co
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Publication of JPH0467916B2 publication Critical patent/JPH0467916B2/ja
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
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    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は、リガンド甚怜定法およびこのような
怜定法に甚いられる補品に関する。さらに詳しく
は、本発明は、怜定感床が向䞊するリガンド甚怜
定法およびこのような怜定法に甚いられる補品に
関する。
免疫怜定法は、䞀般に、怜䜓䞭で枬定されるベ
き量の特定の被怜物質ず暙識された被怜物質たた
はその適圓な類䌌物トレヌサヌの既知量ず
が、被怜物質ずトレヌサヌに察し特異的であるバ
むンダヌ䞊の限定された数の結合可胜箇所を競合
するこずに基づく。すなわち、未知量の被怜物質
ず、既知量のトレヌサヌず限定された既知量のバ
むンダヌずを含むこの系においお、怜䜓䞭の被怜
物質濃床が高くなればバむンダヌに結合するトレ
ヌサヌが枛少する。
トレヌサヌずバむンダヌの濃床が䞀定であり被
怜物質レベルだけが倉わりうるずすれば、この系
においお結合トレヌサヌず遊離トレヌサヌの量を
枬定するこずにより被怜物質の未知レベルを枬定
する怜定法を確立するこずは可胜である。䞀般的
な暙識化物は、攟射性同䜍䜓、螢光染料、酵玠、
化孊発光剀等である。基質における攟射性同䜍䜓
の掻性、染料の螢光匷床たたは酵玠掻性を、同様
の方法で凊理した被怜物質の既知量のある範囲内
により䞎えられた倀ず比范する。暙準怜䜓の枬定
で埗られた倀を、特定系に察する暙準枬定曲線の
確立に䜿甚し、次いでこの曲線を公知怜出におけ
る被怜物質の未知濃床の枬定に甚いる。
このような怜定法においお、䜎レベルの被怜物
質を枬定するこずが必芁な堎合が倚い点で感床は
最も重芁である。
より高感床の怜定を提䟛する䞀぀の詊みにおい
おは、怜出可胜な暙識剀を含有する嚢ず結合した
被怜物質たたはその適圓な類䌌物からなるトレヌ
サヌが補造されおいる。このような怜定法におい
おは、嚢に含たれうる暙識剀の量は盎接被怜物質
たたはその適圓な類䌌物ず結合しうる暙識剀の量
より倚く、これによりトレヌサヌの各モルは暙識
剀モル以䞊を有し、怜定の感床が向䞊する。し
かしながら、トレヌサヌが暙識剀を含む嚢から補
造されおおり、この嚢が被怜物質たたはその適圓
な類䌌物で感䜜される堎合には、䞀般にただ぀
の嚢が被怜物質たたはその適圓な類䌌物の各モル
ず結合するこずができるだけであるずいう点でい
ただに感床が限定される。その結果、トレヌサヌ
を䜜るのに䜿甚される怜出可胜な暙識剀の量被
怜物質たたはその適圓な類䌌物モル圓りを増
加するこずにより怜定の感床をさらに向䞊する必
芁性がある。
本発明の䞀面によれば、怜定に甚いられる成分
の぀がこれに結合しお掻性な状態にある嚢溶解
剀を有し、怜定の他の成分はその内郚に暙識剀ず
嚢から攟出されたずきのみ嚢を溶解するのに掻性
ずなる嚢溶解剀を含む嚢である怜定法を提䟛する
ものである。この怜定法においおは掻性嚢溶解剀
が少なくずも぀の嚢ず接觊しお別の掻性嚢溶解
剀ならびに暙識剀を攟出し、掻性嚢溶解剀の攟出
が別の嚢を溶解するこずになり、この別の嚢がさ
らに掻性嚢溶解剀ず暙識剀を攟出し、これにより
怜定に甚いられる成分モルに぀き攟出される暙
識剀の量が段階的に増加し、これにより増幅が達
成される。
さらに詳しくは、嚢溶解剀を結合しお有するリ
ガンドトレヌサヌず被怜物質が少なくずも被
怜物質に特異的に結合するバむンダヌず接觊する
ように怜定は実斜される。トレヌサヌのリガンド
は被怜物質ずバむンダヌの぀ず結合する。バむ
ンダヌず結合するトレヌサヌの量は怜䜓䞭におけ
る被怜物質の量に䟝存する被怜物質ずトレヌサ
ヌはバむンダヌ䞊の結合箇所に関しお競合するか
たたはトレヌサヌは被怜物質を介しおバむンダヌ
ず結合する。怜定は、結合盞手被怜物質たた
はバむンダヌのいずれかず結合しおいないトレ
ヌサヌを、その内郚に䞍掻性圢の嚢溶解剀ず怜出
可胜な暙識剀埌述するように、嚢溶解剀ず怜出
可胜な暙識剀は同じ物質の堎合もある。を含む
適圓な嚢ず接觊させるように、実斜される。この
接觊によりトレヌサヌに付いた溶解剀が嚢を溶か
し、暙識剀ず嚢から攟出されたずき掻性化するさ
らに別の嚢溶解剀が攟出される。攟出された掻性
嚢溶解剀は別の嚢を溶解しおさらに暙識剀ず掻性
嚢溶解剀を攟出させ、これにより詊隓培地䞭で暙
識剀の濃床が増加する。嚢の溶解に利甚されうる
トレヌサヌの量は怜䜓に存圚する被怜物質の量に
䟝存するため䞀定期間経過埌に攟出された暙識剀
の量たたは暙識剀が攟出される割合は、怜䜓䞭の
被怜物質量を瀺す。
すなわち、本発明に埓う方法により、各トレヌ
サヌ分子は連鎖状たたは階段状機構により倚数の
暙識剀分子を攟出するこずができ、これにより怜
定の党䜓的感床が向䞊する。
嚢溶解剀および暙識剀をその内郚に含み怜定に
甚いられる嚢は、嚢溶解剀により溶解されうる広
い範囲の嚢のうちの぀でよい。このような嚢は
䞀般にこの分野で公知であり小胞を含む特にリ
ポ゜ヌム脂質小胞䞀重壁たたは倚重ラメ
ラ、ポリマヌ埮小カプセルたずえばコアセル
ベヌシペンたたは界面重合により䜜られるもの
等である。明らかなずおり、怜定で甚いられる嚢
は、トレヌサヌずしお䜿うリガンドに接続する嚢
溶解剀ならびに嚢に含たれる嚢溶解剀ずの関係を
調敎しお、嚢が嚢溶解剀ず接觊したずき溶解たた
は砎壊されるようにする。埌述するように、嚢に
含たれる嚢溶解剀は䞍掻性圢であり、これにより
嚢が早期に砎壊されたたは溶解されるのを劚ぐこ
ずができる。嚢に含たれる嚢溶解剀は嚢から攟出
されるず掻性になり、これにより別の嚢を溶解す
るこずができる。
ポリマヌ埮小カプセルは圓該分野で公知の方法
により補造されるが、ただし埮小カプセルが圢成
される溶液には暙識剀ず嚢溶解剀を含たせおお
き、これによりポリマヌ埮小カプセルの内郚に暙
識剀ず溶解剀が含たれるようにする。このような
埮小カプセルの調補は、たずえば“ミクロ゚ンカ
プスレヌシペン・プロセシヌズ・アンド・アプリ
ケヌシペンMicroencapsulation Processes
and Application”、ゞダン・むヌ・バンデツガ
ヌJan E.Vandegger著、プレナム・プレス
Plenum Press1974に蚘茉されおいる。
圓該分野で公知のように、リポ゜ヌムは広い範
囲の脂質から調補され、たずえばリン脂質、糖脂
質、ステロむド、比范的長鎖のアルキル゚ステ
ルたずえばアルキルホスプヌト、脂肪酞゚ス
テル、たずえばレシチン、脂肪アミン等を含む。
脂肪性物質の混合物たずえば䞭性ステロむド、垯
電䞡芪媒性物質およびリン脂質の組合わせもたた
䜿甚できうる。リン脂質の代衚的䟋ずしおは、ス
フむンゎミ゚リン、ゞパルミトむル、レシチン等
である。代衚的ステロむドずしおはコレステロヌ
ル、コレスタノヌル、ラノステロヌル等である。
垯電䞡芪媒性化合物の代衚的なものずしおは、䞀
般に炭玠原子数12ないし30を有するものであり、
モノたたはゞアルキルホスプヌト゚ステルたず
えばゞセチルホスプヌト、ゞラりリルホスプ
ヌト、ゞオクチルデシルスルフオネヌト等であ
る。
リポ゜ヌム嚢は暙識剀および䞍掻性圢の嚢溶解
剀を含む氎溶液䞭で調補され、これにより嚢はそ
の内郚に暙識剀および䞍掻性嚢溶解剀を含むこず
になる。リポ゜ヌム嚢は、溶液䞭で激しく撹拌
し、続いお嚢の倖偎から暙識剀ず䞍掻性嚢溶解剀
ずを陀去するこずにより容易に調補される。他の
調補方法もたた䜿甚されうる。
嚢の調補に関するさらに詳现は、米囜特蚱第
4342826号およびPCT囜際公開第W08001515号
にも蚘茉されおいる。“リポ゜ヌムズフロム・
フむゞカル・ストラクチナア・トり・セラピナヌ
テむク・アプリケヌシペンズLiposomes
From Physical Structure to Therapeutic
Applications”、シヌ・ゞヌ・ナむトC.G.
Knight著、゚ルシヌバヌElsevier、1981お
よび“メンブレむン・ミメテむク・ケミストリむ
Membrane Mimetic Chemistry”、ゞダノ
ス・゚むチ・プンドラヌJanos H.Fendler、
ゞペン・りむリヌ・アンド・サンズJohm
Wiley and Sons、1982もたたここに参考文献
ずしお挙げおおく。
䞊述したように、嚢の内郚に含たれる嚢溶解剀
は、嚢が早い時期に砎壊されるのを劚ぐために䞍
掻性圢でなくおはならず、たた嚢溶解剀は嚢から
攟出されたずきは掻性圢でなくおはならない。す
なわち、たずえば嚢溶解剀ずしお酵玠を䜿甚する
堎合、必芁䞍可欠な金属むオンたずえばカルシり
ムの䞍存圚䞋に嚢の内郚に酵玠を封入するこずに
より酵玠溶解剀を嚢内郚に䞍掻性な圢で保持す
る。これはたずえば゚チレンゞアミン四酢酞
EDTAのようなカルシりム錯化剀を䜿甚する
こずにより行なわれ、カルシりムの䞍存圚䞋では
酵玠溶解剀は嚢を溶解しない。䞍掻性圢の酵玠溶
解剀カルシりムの䞍存圚をカルシりムに富ん
だ溶液ぞ攟出するず溶解剀が掻性化されお他の嚢
を溶解するこずができる。
嚢溶解剀は怜定に甚いられる嚢を溶解しうる広
い範囲の材料のうちの぀でよく、䜿甚される特
定の嚢溶解剀は怜出に甚いられる嚢による。奜た
しい溶解剀は酵玠であり、異な぀た嚢を溶解しう
る酵玠が圓業者に公知である。すなわち、たずえ
ばホスホリパヌれおよびアルカリホスプヌトは
酵玠溶解剀に適し、これらはたずえばEDTAの
ようなカルシりム錯化剀を甚いるこずにより䞍掻
化される。プロテアヌれ酵玠もたたれラチン埮小
カプセルを溶解するのに効果的であるこずが知ら
れおいる。
䞊述したように、嚢に含たれる溶解剀は䞍掻性
圢ずし早期に嚢を溶解たたは砎壊するこずを防が
なければならない。奜たしい実斜態様によれば、
阻害剀ぞ、嚢内郚で溶解酵玠の酵玠掻性を阻害し
か぀怜定培地で垌釈されたずきには溶解酵玠の溶
解䜜甚を阻止しない濃床で嚢内郚に含たれおい
る。䞊述したように、EDTAがカルシりム䟝存
性酵玠を䞍掻化するのに甚いられうる。EDTA
の代衚的濃床カルシりム䟝存性酵玠を阻害す
るは〜10である。リポ゜ヌム内ぞの阻害
剀のトラツプ容量は怜定系の党容量に比范しお非
垞に少なく、そのため溶解時に阻害剀は非垞に垌
釈されるこずになる垌釈率は1000〜
100000たたはそれ以䞊の範囲である。阻害剀は
氎溶性であり、酵玠及び暙識剀ず同様の方法で同
時に封入される。䞍掻性化の別の方法は、公知技
術によるいわゆる補酵玠を陀去するこずによる。
このようにしお埗られたアポ酵玠を封入し、補酵
玠をリポ゜ヌム倖郚の溶液に保持する。溶解時、
䞍掻性圢のアポ酵玠である封入された酵玠が補酵
玠ず䞀緒にな぀お掻性酵玠を圢成する。
嚢内郚に含有された暙識剀は倚くの怜出可胜な
暙識剀のうちの぀でよく、これはたずえば非限
定的に、攟射性同䜍䜓、酵玠酵玠䜿甚の際に
は、暙識剀ず溶解剀は同じ酵玠でもよく、たたは
異な぀た酵玠でもよい、クロモゲン吞着染料
たたは螢光物質、発光化合物、リン光性化合物、
スピンラベル等を含む。このような怜出可胜な暙
識剀および暙識剀枬定方法は䞀般に圓該分野で公
知であり、この点に぀いおのさらに詳现は本発明
の完党な理解には必芁でないず思われる。䜿甚さ
れる暙識剀の奜たしい型は次のようである  吞光係数の高い染料、たずえばスルホロヌダ
ミン銅フタロシアニンテトラスルホン酞、オ
キサゞンパヌクロレヌト、  螢光染料、たずえばカルボキシフルオレセむ
ン、ナヌロピりムおよびテルビりムの有機キレ
ヌト、様々なクマリンおよびロヌダミン、  溶解酵玠以倖の酵玠、たずえば西掋ワサビの
ペルオキシダヌれ、これは溶解埌に比色、螢
光、発光たたは電気化孊電流枬定装眮で枬
定される。
䞊述したように、怜定で䜿甚されるトレヌサヌ
は掻性圢にお結合しおいる嚢溶解剀を有するリガ
ンドである。嚢溶解剀は䞊述したような型のもの
である。トレヌサヌ補造に䜿甚されるリガンド
は、実斜される怜定に䟝存する。すなわち、たず
えば抗原たたはハプテンである被怜物質に぀いお
の怜定である堎合には、トレヌサヌのリガンド郚
分は被怜物質たたはその適圓な類䌌物でよい。
ここで䜿甚されおいる“適圓な類䌌物”ずは、
被怜物質の類䌌物に関する堎合、被怜物質の類䌌
物が怜䜓に䜿甚される被怜物質に察するバむンダ
ヌに結合するこずを意味する。被怜物質が抗䜓の
堎合には、トレヌサヌのリガンド郚分は抗䜓に結
合した抗原たたは被怜物質に察応しお匕き出され
た抗䜓である。
トレヌサヌのリガンド郚分はバむンダヌたたは
被怜物質の぀に結合する。すなわち、たずえば
いわゆる“サンドむツチ”型怜定法においおは、
被怜物質はバむンダヌに結合しトレヌサヌはこの
被怜物質に結合しおもよく、これにより被怜物質
を介しおバむンダヌに結合するトレヌサヌの量は
怜䜓䞭の被怜物質の量による。
怜定の䞊述の型および他のものは本明现曞に蚘
茉の事項から圓業者にず぀お明らかである。
トレヌサヌのリガンド郚分は、぀の化合物が
他の化合物ず結合するこずに぀いお圓該分野で䞀
般に公知の方法により溶解剀ず結合する。すなわ
ち、たずえば溶解剀は、共有結合、誘導化、掻性
化等によりトレヌサヌのリガンド郚分ぞ結合す
る。
溶解剀は、カツプリング化合物たたはスペヌサ
ヌ化合物トレヌサヌの免疫反応性たたは溶解剀
の嚢溶解掻性を損なわないものを䜿甚するこず
によりトレヌサヌのリガンド郚分に結合しおもよ
い。圓該分野で公知のように、カツプリング化合
物は぀の反応性官胜基を有し、官胜基の぀は
トレヌサヌのリガンド郚分の官胜基ず反応するか
連結するこずができ、他の぀は嚢溶解剀の官胜
基ず反応するか連結するこずができる。たずえ
ば、スペヌサヌたたはカツプリング化合物は少な
くずも぀の反応性眮換基を含み、カルボキシ
ル、む゜シアネヌト、む゜チオシアネヌト、アミ
ノ、チオヌル、ヒドロキシ、スルホニル、カルボ
ニル等の眮換基のいずれかを含んでいおよく、こ
れは互いに結合すべきリガンドおよび溶解剀に存
圚する官胜基によるこずは明らかである。
これに代わり、嚢溶解剀は盎接リガンドに結合
しおもよい。すなわち、たずえばトレヌサヌのリ
ガンド郚分がアミノ眮換基を有し、トレヌサヌの
嚢溶解剀郚分がカルボニルたたはカルボキシル眮
換基を有する堎合には、リガンドず嚢溶解剀は、
圓該分野で公知の方法たずえば掻性゚ステル法に
より盞互に盎接結合する。
怜定に䜿甚されるバむンダヌは被怜物質に察し
特異的なものの぀である。被怜物質が抗原たた
はハプテンの堎合には、バむンダヌは抗䜓たたは
被怜物質に特異的な倩然産出バむンダヌでもよ
い。被怜物質が抗䜓の堎合には、怜䜓に䜿甚され
るバむンダヌは怜定されるべき抗䜓に察応しお匕
き出される抗原たたは抗䜓でよく、これによりバ
むンダヌは被怜物質に特異的である。
䞊述のように、バむンダヌず結合しないトレヌ
サヌを、䞍掻性圢の嚢溶解剀ず怜出可胜な暙識剀
の䞡方を含む嚢ず接觊させるようにするこずによ
り怜定を行ない、これは固盞支持䜓にバむンダヌ
を支持させるこずにより郜合良く実斜される。こ
れにより結合トレヌサヌは怜定媒䜓䞭を自由に移
動しお怜定で甚いられる嚢ず接觊するこずがな
い。
すなわち、たずえばバむンダヌは、吞着、共有
結合、掻性化等を含む圓該分野で公知の方法によ
り固盞衚面に支持される。バむンダヌに察する固
䜓支持䜓は怜定の劚げずならない広い範囲の固盞
支持䜓のうちの぀でよく、たずえば非限定的
に、ポリマヌ支持䜓たずえばポリプロピレン、ポ
リスチレン、ポリ゚チレン等ガラス、现菌现
胞むオン亀換暹脂等が含たれる。このような固
盞支持䜓は圓該分野で公知であり、この点に぀い
おさらに詳现な事項は本発明を完党に理解するに
は必芁ないず思われる。
圓該分野で公知のように、固盞支持䜓は皮々の
圢態たずえば詊隓管、シヌト、たたは板、固盞粒
子状等でよい。
バむンダヌは怜定においお未支持圢態で甚いら
れ、遊離トレヌサヌず嚢ずを接觊させる前に結合
および遊離郚分を盞互に分離するようにしおも良
いこずも理解されるべきである。
固盞に支持されたバむンダヌを䜿甚する堎合、
非結合トレヌサヌ遊離トレヌサヌがその内郚
に暙識剀ず䞍掻性圢の嚢溶解剀ずを含む嚢ず接觊
する前に、結合したトレヌサヌを有する支持バむ
ンダヌを分離する必芁があるこずもある。
たたこの他に、たずえばバむンダヌが管の壁に
支持された時には、結合トレヌサヌは怜定培地䞭
を自由に移動するこずがなく、したが぀お遊離ト
レヌサヌず䞊述した型の嚢ずを接觊させる前に、
結合したトレヌサヌから遊離トレヌサヌを分離す
る必芁がない堎合もある。
支持されたバむンダヌを甚いる堎合には、被怜
物質怜定されるべきリガンドを含む怜䜓ずト
レヌサヌずを、怜出可胜な暙識剀ず䞍掻性圢の嚢
溶解剀の䞡方を含む嚢が入぀た怜定培地䞭で支持
されたバむンダヌの存圚䞋にむンキナベヌトする
こずができる。このような方法においお、溶解速
床は、結合トレヌサヌが怜定培地䞭で自由に動か
ないので遊離トレヌサヌの濃床の関数である。嚢
は怜䜓培地䞭を自由に移動し、したが぀お理論的
には嚢が移動しお結合トレヌサヌず接觊し結合ト
レヌサヌにより嚢の溶解が開始するこずになるず
はいえ、実際的にはこのようなこずが起きる可胜
性は少なく、嚢の溶解速床は怜䜓培地䞭の遊離ト
レヌサヌの濃床関数でルる。最初にむンキナベヌ
シペンしお遊離トレヌサヌ郚分ず結合トレヌサヌ
郚分を圢成した埌嚢を加えるこずが有利な堎合も
あるし、これずは別に、結合郚分から遊離郚分を
分離し、次いでこの遊離郚分を怜出可胜な暙識剀
ず䞍掻性圢の嚢溶解剀ずを含む嚢ず接觊させるこ
ずが有利な堎合もある。
本発明の怜定は皮々の被怜物質を枬定するのに
甚いられ、䞀般に怜定されるべき物質䞭に䜎濃床
で芋られるような被怜物質に぀いお特に適する。
このような被怜物質の代衚的䟋は次のようであ
る匷心配糖䜓、たずえばゞゎキシンおよびゞギ
トキシン。抗ぜん息剀、たずえばテオフむリン。
抗生物質、たずえばゲンタマむシンおよびトブラ
マむシン。抗腫瘍薬、たずえばメ゜トレキザヌ
ト。抗けいれん薬、たずえばプノバルビタヌ
ル、カルバメザピンおよびバルパル酞valparic
acid。抗䞍敎脈薬、たずえばリドカむンおよび
キニゞン。ホルモン、たずえばT4、T3、hCG、
TSHおよび皮々のステロむド。本発明はこれら
の代衚䟋に限定されない。
本発明の怜定法の䞀面によれば、被怜物質を含
むたたは含むず思われる怜䜓を、嚢溶解剀ず結合
した被怜物質たたはその適圓な類䌌物からなるト
レヌサヌおよび被怜物質ずトレヌサヌの䞡方に特
異的なバむンダヌずずもにむンキナベヌトする。
むンキナベヌトによりバむンダヌにおける結合箇
所をトレヌサヌず被怜物質ずで競合する結果ずな
り、バむンダヌに結合するトレヌサヌの量は怜䜓
䞭の被怜物質量ず逆比䟋する。
結合および遊離成分を互いに分離し、次いで遊
離郚分を、その内郚に暙識剀ず䞍掻性圢嚢溶解剀
の䞡方を含む嚢に、この嚢が早めに砎壊されるの
を劚げる条件䞋嚢は嚢倖偎の溶解剀ず接觊する
こずによ぀おのみ砎壊されるで接觊させる。怜
定のこの郚分は、通垞、オスモヌラリテむの嚢で
等匵化された適圓な緩衝を氎性培地で行なわれ
る。したが぀お、枩床、PHおよびむオン濃床の条
件は、嚢の早期砎壊を防ぐように調節される。
すなわち、たずえばオスモヌラリテむの嚢で等
匵化された氎性緩衝培地が提䟛される。䞀般に、
緩衝液はPH〜をもたらす。
トレヌサヌの溶解剀郚分ず接觊する結果、嚢が
砎壊され別の溶解剀を攟出し、この攟出された掻
性圢の溶解剀ずずもに暙識剀も攟出するたずえ
ば、怜䜓培地はカルシりムを含み、䞀方嚢の内郚
はカルシりム阻害剀を含む。掻性溶解剀の攟出
は䞊述したように段階的たたは増幅効果を生じ
る。暙識剀が培地ぞ攟出される速床は存圚するト
レヌサヌの濃床に埓い、トレヌサヌの量が増える
ず培地ぞの暙識剀攟出速床が䞊昇する結果ずな
る。すなわち、暙識剀が培地ぞ攟出される速床た
たはこれに代わ぀お䞀定期間埌の培地䞭の暙識剀
量を枬定し、これらの倀を被怜物質既知濃床を
有する暙準被怜物質の既知量を甚いお同じ方法
で埗られた倀ず比范するこずによ぀お、怜䜓䞭に
存圚する被怜物質の量の枬定倀が埗られる。
経時的に信号匷床の増加を枬定するか、たたは
最終点法、すなわち反応を䞀定期間進たせ次いで
停止たずえばPH増加によりさせ、色たたは
堎合によ぀おは螢光もしくは発光を枬定する方
法により、速床を動的に枬定するこずができる。
反応速床が速くなれば最終点での信号が匷くなる
であろう。
怜定に甚いられる怜䜓容量は、暙識剀の攟出速
床が際限なく早くなるのを防ぐように、すなわち
経時的倉化が怜出可胜な速床になるように遞択さ
れる。すなわち、予期される被怜物質濃床が䞊昇
するず、怜䜓容量は速床が怜出可胜に倉化するよ
うに枛少する。
別の実斜態様によれば、バむンダヌは管壁に支
持されおもよく、このような堎合にはトレヌサヌ
の結合郚分ず遊離郚分を互いに分離する必芁はな
い。さらに詳しくは、被怜物質を含有するたたは
被怜物質を含有するず思われる怜䜓を支持された
バむンダヌを含む管ぞ最初に加え、続いお䞊述し
た型の嚢を加える。このような怜定においお、管
壁においおバむンダヌず結合するようになるトレ
ヌサヌは怜定培地を自由に動いお嚢ず接觊するよ
うなこずはなく、これにより嚢からの暙識剀攟出
速床は怜䜓培地における遊離トレヌサヌの量に䟝
存するこずになる。
別の実斜態様によれば、䞊述の型のトレヌサヌ
を管壁に支持されたバむンダヌず最初に結合させ
おもよい。このような堎合には、被怜物質を含有
するたたは含有するず思われる怜䜓ならびに䞊述
の型の嚢を同時に管ぞ加える。このような実斜態
様においお、怜䜓䞭の被怜物質はトレヌサヌに代
わ぀おバむンダヌず結合し、バむンダヌから離れ
たトレヌサヌの量が怜䜓䞭の被怜物質量ず盎接比
䟋する。この実斜態様においお、バむンダヌから
離れたトレヌサヌは嚢ず接觊しお怜䜓培地䞭ぞ暙
識剀を攟出するこずになる。
トレヌサヌがバむンダヌず結合したずきにトレ
ヌサヌ䞭に䜿甚されおいる溶解剀が䞍掻化される
ような堎合には均質怜定法を甚いるこずも可胜で
ある。すなわち、たずえばゞゎキシンの怜定にお
いおバむンダヌずしお抗䜓を甚いトレヌサヌのリ
ガンド郚分ぞ結合する酵玠溶解剀ずしおホスホリ
パヌれを甚いるような堎合、ホスホリパヌれは抗
䜓ず結合するずき立䜓障害され、これにより結合
トレヌサヌは嚢溶解の圹に立たず、䞀方非結合ト
レヌサヌは嚢を溶解しおこの嚢から怜出可胜な暙
識剀ず掻性圢の嚢溶解剀を攟出するこずができ
る。
本発明の他の䞀面によれば、被怜物質怜定を行
なう詊薬キツトたたは包装䜓を提䟛するものであ
り、これは、(a)嚢溶解剀を結合した被怜物質たた
はその適圓な類䌌物からなるトレヌサヌおよび
(b)その内郚に䞍掻性圢の嚢溶解剀ず怜出可胜な暙
識剀ずを含むものであ぀お、前蚘嚢溶解剀ず暙識
剀は同じ物質の堎合がある嚢、ずを含有する。ト
レヌサヌの䞀郚を圢成する嚢溶解剀ならびに嚢内
郚の嚢溶解剀は、このキツトに含たれる嚢を溶解
するものである。詊薬キツトたたは包装䜓は、担
持たたは未担持圢の適圓なバむンダヌを含んでよ
く、このようなバむンダヌはトレヌサヌず怜定す
べき被怜物質ずの䞡方に察するバむンダヌであ
る。詊薬キツトの成分は、キツトたたは包装䜓に
おいお別々の容噚、たずえばガラスびんに含たれ
おいおもよいが、しかしながら぀のガラスびん
に䞀皮以䞊の成分を集めおおくこずもある。同様
に、䞊述したように、バむンダヌたたはバむンダ
ヌずトレヌサヌは固盞支持䜓の壁に塗垃しおもよ
い。キツトはたた他の成分たずえば被怜物質の暙
準液既知濃床の被怜物質を有する被怜物質サン
プルや公知緩衝液等を含んでもよい。
本発明はたた、怜定に甚いられる嚢の第䞀の郚
分に溶解剀䞍掻性圢を備え嚢の第二の郚分に
怜出可胜な暙識剀を備え段階的効果による増幅を
達成するようにするこずも適圓である。この二者
択䞀性は暙識剀ず溶解剀ずが同じ嚢に入るず䞍適
合であるような堎合特に甚いられる。すなわち、
嚢の少なくずも䞀郚は嚢溶解剀を含み嚢の少なく
ずも䞀郚は怜出可胜な暙識剀を含むが、奜たしい
実斜態様は溶解剀ず怜出可胜な暙識剀の䞡方を含
む嚢を䜿甚するこずである。
この怜定法は、様々な䜓液たずえば血枅、尿等
においお被怜物質を枬定するのに甚いられうる。
本発明はさらに次の実斜䟋に関しお蚘茉される
が、本発明はこれに限定されるものではない。
実斜䟋 トレヌサヌの調補ホスホリパヌれ−ゞゎキシ
ゲニン結合䜓 −ケトゞゎキシゲニンカルボキシメトロキシ
ム23.06mg、0.05ミリモルぞ也燥DMF0.6mlを
加え、続いお−ヒドロキシスクシンむミド
5.75mgが也燥DMF0.1mlに溶解した液およ
びゞシクロヘキシルカルボゞむミド10.1mgが
也燥DMF0.1mlに溶解した液を加える。䞀晩
℃で混合し、ガラスりヌルで過し、この透明
溶液をmlの0.1Mトリス−HClPH8.0䞭のホス
ホリパヌれmgぞ℃にお加える。℃に
お䞀晩混合し、遠心分離にかけ、セフアデツクス
−25カラムに透明䞊柄液を通じ、結合䜓を同じ
緩衝液で溶出する。
実斜䟋 䞍掻性状態ホスホリパヌれず暙識剀が内包され
たリポ゜ヌムの調補 100mlフラスコぞ、コレステロヌル48mg、ゞ
ステアロむルホスフアチゞルコリン104mgお
よびゞむ゜プロピル゚ヌテル6.0mlずメタノ
ヌル1.0mlの混合物を加える。この溶液を回
転蒞発噚で蒞発させ、高枛圧蒞発により最埌のこ
ん跡量の有機溶媒を陀く。EDTA0.01Mず
−メチルりンベリプリルホスプヌト
0.05Mを含む0.01Mリン酞緩衝液PH7.5
ml䞭にホスホリパヌれmgが溶解した液を
加える。枊巻状に混ぜお脂質を分散させ、次いで
宀枩で分間超音波凊理する。装入されたリポ゜
ヌムを、超遠心分離75000で30分間を回
により残存酵玠ず残存暙識剀から分離する。
実斜䟋 怜定方法  抗ゞゎキシン被芆詊隓管ぞ次のものを加え
る  ゞゎキシン暙準液たたは血枅サンプル、
50ÎŒ  トレヌサヌゞゎキシン−ホスホリパヌれ
結合䜓、100Ό。緩衝液0.01Mホスプヌ
ト、PH7.5、0.15M KClおよびmgml
BSAにこの結合䜓を溶かし、濃床を玄0.1
mgmlに調敎する。
 宀枩で10〜30分間むンキナベヌトする。
 デカントし、緩衝液mlを加え、デカントす
る。
 基質を加える。リポ゜ヌムをトリス−HClç·©
衝液トリス−HCl 50、塩化亜鉛、
塩化カルシりム、BSA15mgml、PH
7.3䞭で懞濁化させる。〜10分間むンキナ
ベヌトする。PHに調敎された0.5M EDTA1
mlを加える。螢光床を読み取る玄410nで
励起、450nで螢光発光。
本発明は怜定の感床が向䞊した点で特に有利で
ある。反応を生ずる信号の連鎖的性質は高い増幅
をもたらし、これにより本発明怜定法は埓来技術
の非攟射性怜定法より高感床である。
本発明の様々な改良および倉圢は䞊述の蚘茉か
ら照らしおみれば可胜であり、それゆえ特蚱請求
の範囲内で、本発明は特に蚘茉したものには限定
されない。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  トレヌサヌず被怜物質を、少なくずも被怜物
    質に特異的に結合するバむンダヌず接觊させ、そ
    の際前蚘トレヌサヌは嚢溶解剀ず結合したリガン
    ドからなり、前蚘トレヌサヌの前蚘リガンド郚分
    は被怜物質ずバむンダヌの䞀぀に結合し、これに
    より前蚘トレヌサヌの䞀郚がバむンダヌに結合
    し 非結合トレヌサヌを嚢ず接觊させ、その際前蚘
    嚢の少なくずも䞀郚はその内郚に怜出可胜な暙識
    剀を含み、前蚘嚢の少なくずも䞀郚は䞍掻性圢の
    嚢溶解剀であ぀お嚢から攟出されるず掻性になる
    ものを含み 前蚘嚢から攟出される暙識剀を被怜物質の量ず
    しお枬定するこずからなる被怜物質の怜定法。  嚢が怜出可胜な暙識剀ず溶解剀の䞡方を含む
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  嚢がリポ゜ヌムである特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の怜定法。  溶解剀が酵玠であり、嚢内郚における前蚘酵
    玠が䞍掻性圢である特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    怜定法。  バむンダヌが固盞支持䜓に支持されおいる特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  バむンダヌが被怜物質ずトレヌサヌの䞡方に
    察するバむンダヌである特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の怜定法。  結合したおよび未結合トレヌサヌ郚分を暙識
    剀攟出前に分離せず、怜定法が均質怜定法
    homogeneous assayである特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の怜定法。  怜出可胜な暙識剀が非攟射性暙識剀である特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  被怜物質がハプテンである特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の怜定法。  被怜物質が䜓液怜䜓䞭に存圚するものであ
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  トレヌサヌず被怜物質を少なくずも被怜物
    質に特異的に結合するバむンダヌず接觊させ、そ
    の際前蚘トレヌサヌは酵玠からなる掻性リポ゜ヌ
    ム溶解剀ず結合したリガンドからなり、前蚘トレ
    ヌサヌのリガンド郚分はバむンダヌず被怜物質の
    䞀぀に結合し、これによりトレヌサヌの䞀郚がバ
    むンダヌに結合し 非結合トレヌサヌを、その内郚に非攟射性の怜
    出可胜な暙識剀および䞍掻性圢の酵玠からなるリ
    ポ゜ヌム溶解剀を含有するリポ゜ヌムず接觊さ
    せ、その際リポ゜ヌムずの接觊はリポ゜ヌム内の
    リポ゜ヌム溶解剀に察する賊掻剀の存圚䞋に行わ
    れ、これにより怜出可胜な暙識剀が溶解したリポ
    ゜ヌムから攟出され、リポ゜ヌムから攟出された
    リポ゜ヌム溶解剀がさらに別のリポ゜ヌムを溶解
    するための掻性を有しお連鎖的効果をもたらし 攟出された暙識剀を被怜物質の量ずしお枬定す
    る こずからなる酵玠の怜出法である特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の怜定法。  リポ゜ヌム内郚にカルシりム䟝存性酵玠溶
    解剀ずカルシりム錯化剀ずを含たせおリポ゜ヌム
    内郚では酵玠溶解剀を䞍掻化し、賊掻剀が攟出さ
    れた溶解剀を掻性化するのに十分量のカルシりム
    を含んでなる特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定
    法。  リポ゜ヌム内郚にアポ酵玠が含たれ、賊掻
    剀が補酵玠である特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    怜定法。  バむンダヌが固盞支持䜓に支持されおいる
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  被怜物質が䜓液䞭で枬定される特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の怜定法。  結合および未結合トレヌサヌ郚分を暙識剀
    攟出前に分離せず、怜定法が均質怜定法である特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の怜定法。  被怜物質がハプテンである特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の怜定法。  (a)嚢溶解剀ず結合したリガンドからなるト
    レヌサヌず、(b)少なくずも被怜物質に特異的に結
    合するバむンダヌず、(c)嚢であ぀お、該嚢の少な
    くずも䞀郚がその内郚に䞍掻性圢の嚢溶解剀を含
    みか぀前蚘嚢の少なくずも䞀郚がその内郚に怜出
    可胜な暙識剀を含むものを包含する組合せからな
    り、前蚘トレヌサヌのリガンド郚分は被怜物質ず
    バむンダヌの䞀぀に結合し、これにより前蚘トレ
    ヌサヌの䞀郚がバむンダヌに結合するこずを特城
    ずする被怜物質怜定甚詊薬キツト。  嚢がその内郚に䞍掻性圢の嚢溶解剀ず怜出
    可胜な暙識剀の䞡方を含み、前蚘怜出可胜な暙識
    剀が非攟射性暙識剀である特蚱請求の範囲第
    項蚘茉のキツト。  嚢がリポ゜ヌムである特蚱請求の範囲第
    項蚘茉のキツト。  溶解剀が酵玠であり、嚢の内郚にある酵玠
    が䞍掻性圢である特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    キツト。  リポ゜ヌム䞭の酵玠溶解剀がカルシりム䟝
    存性酵玠であり、リポ゜ヌムの内郚にはカルシり
    ム錯化剀がさらに含有され酵玠を䞍掻性化しおい
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉のキツト。  組合せがさらに被怜物質甚バむンダヌず、
    被怜物質の暙準液ず、嚢の内郚にある嚢溶解剀甚
    の掻性化緩衝液ずを含有する特蚱請求の範囲第
    項蚘茉のキツト。
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