JPH03206962A

JPH03206962A - 免疫測定方法

Info

Publication number: JPH03206962A
Application number: JP99590A
Authority: JP
Inventors: Kyuji Mutsukawa; 六川　玖治
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1990-01-09
Filing date: 1990-01-09
Publication date: 1991-09-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的コ（産業上の利用分野）本発明は、試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量
分析するための免疫測定方法に関する。

（従来の技術）試料中の特定の抗原又は抗体の定量分析には、ＲＩＡ　
（ラジオイムノアッセイ）やＥＩＡ（エンザイムイムノ
アッセイ）等が知られている。しかしＲＩＡでは放射性
元素を用いるため、専用の機器を設置し、資格を有する
オペレータが操作を行わなければならず、しかも廃棄物
の処理等にも注意を要するという問題がある。

またＥＩＡでは感度的には優れているものの、測定に長
時間を要する上、手間も煩雑で更に測定のダイナミック
レンジも狭いという問題を有する。

そこで本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号公
報に示されるように、表面に親水性の抗体又は抗原を固
定化し内部に親水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封
入したリポソーム試薬を用いた測定方法を開示した。こ
の方法はＭＣＩＡ（マイクロカプセルイムノアッセイ）
と称される。このＭＣＩＡは以下のようなものである。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これと別に補体を加えると、抗原一抗
体反応及びそれに伴う補体の活性化が起り、補体の膜障
害作用によってリポソームが破壊され、封入されていた
標識物質が流出する。この流出した標識物質の量と、試
料中の被検物質（抗原又は抗体）との間には相関関係が
あるので、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば
蛍光分析）によって定量することにより、被検物質を定
量することができる。従ってこのＭＣＩＡによれば前記
のような問題は解決される。

（発明が解決しようとする課題）ところでＭＣＩＡでは、目的の抗原一抗体反応以外に補
体の作用によって非特異反応が起き、これに起因してリ
ポソームが破壊されるという問題がある。すなわち被検
物質の有無に拘らずにリポソームが破壊されて内部の標
識物質が破壊されるようになり、測定の信頼性を損なう
ことになる。

更にこの非特異反応には検体である血清の成分も関与し
ているので、反応液中の血清濃度を充分に増加させられ
ない不便さも存在している。

本発明は以上のような問題に対処してなされたもので、
非特異反応を防止する免疫測定方法を提供することを目
的とするものである。

［発明の構成］（課題を解決するための手段）上記目的を達成するために本発明は、マイクロカプセル
と、このマイクロカプセルに封入された標識物質と、前
記マイクロカプセルに固定化された抗体，抗体の一部も
しくは抗原とからなる免疫測定試薬を用いる免疫測定方
法において、前記マイクロカプセルと最終的に結合する
抗原又は抗体の担体として磁性物質を用いることを特徴
とするものである。

（作　用）ＭＣＩＡにおいて、補体を用いずにこの代りに磁性物質
を用い、これを抗原又は抗体の担体として使用して最終
的にマイクロカプセルと結合させる。従来は反応系をホ
モジニアス系にするために補体が必要であったがこの弊
害として非特異反応が避けられなかった。補体を不要に
することにより反応系はへテロジニアス系となってＢ／
Ｆ分離が必要となるが、前記のような磁性物質を用いる
ことにより、容易にＢ／Ｆ分離を行うことができる。従
って非特異反応の発生が防止され、信頼性の高い免疫測
定を行うことができる。

（実施例）以下本発明実施例について説明する。

第■図は本発明の免疫測定方法の実施例を示す概念図で
、先ず抗体（第１抗体）５が架橋法により固定化された
リポソーム６を用いる。このリポソーム６は前記したよ
うに、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内部に
親水性の標識物質（例えば蛍光性物質）７を封入した免
疫測定のためのリポソーム試薬が用いられる。

次にこのリポソーム６に対して被測定物質としての抗原
３が存在する試料（検体）４を加える。

この抗原３は抗体５と反応しいわゆる抗原一抗体反応が
生ずる。

続いてこれらに対して抗体（第２抗体）１が固定化され
た磁性物質２を加える。この磁性物質としては微粒子又
は多孔性のものが用いられ、例えばマグネタイト，フエ
ライト等が用いられる。ここで微粒子の大きさはリポソ
ーム等のマイクロカプセルの径と同等以下の大きさ、望
ましくは１／１０以下に設定される。尚、磁性物質が多
孔性の場合にはその大きさはその分散に支障のない限り
制限はされない。但し、その孔径は用いるリポソーム等
のマイクロカプセルの径に比べて充分に大きくなければ
ならない。これによって抗体１は抗原３に反応していわ
ゆる抗体５一抗原３一抗体↓からなるサンドイッチ構造
が形威される。尚、このとき磁性物質２と抗原３を反応
させた後、リポソーム６を添加しても構わない。この場
合には必要に応じてリポソーム６を加える前に磁性を利
用してＢ／Ｆ分離（後述）を行うことも可能である。

続いて存在しているＢ　（Ｂｏｕｎｄ：バウンド）型と
Ｆ　（Ｆｒｅｅ　：フリー）型との２種類のリポソーム
を分離するために、磁石を利用して処理する。このＢ　
，／　Ｆ分離は本実施例においては補体を不要となした
ことにより、ヘテロジニアス系の反応が行われるために
必要となったものである。

次にこれら反応液に対して水，有機溶媒又は界面活性剤
等の媒体を加えることによりリポソームを破壊し、内部
の標識物質７を流出しせめる。この流出した標識物質７
の量と、試料４中の抗原３（被検物質）との間には相関
関係があるので、流出した標識物質７を蛍光分析法等に
より定量することによって、抗原３を定量することがで
きる。

以上のような本実施例によれば、補体を不要となして磁
性物質を用いてヘテロジニアス系のＭＣＩＡを行うよう
にしたので、非特異反応の発生が防止され、信頼性の高
い免疫測定を行うことができる。特に比表面積が大きく
なるような微粒子又は多孔性の磁性物質を採用すること
により、反応効率を向上させることができまたＢ／Ｆ分
離を容易に行うことができる。更にＭＣ丁Ａの感度を向
上することができるので、検体量を増加することが可能
となる。

磁性物質自体はＥＩＡ等で応用されているが、ＥＩＡで
はＢ／Ｆ分離後に検出のために酵素反応を必要とするの
で、手間と時間がかかっていた。

この点本発明実施例ではマーカーとしてリポソームを用
い、Ｂ／Ｆ分離後は水，界面活性剤又は有機溶剤等の媒
体を添加するだけでリポソームを破壊して標識物質の流
出が可能となる。従って余分な酵素反応を行わずに迅速
に免疫測定ができるようになる。

次に実験例について説明する。

磁性物質とてしてマグネタイトを用いた例で説明する。

このマグネタイトは微粒子状されたものが用いられる。

（１）磁性物質への抗体固定化抗体を吸着法でマグネタイトに固定する。先ず、１ｇの
マグネタイトを用いて試験管に入れ、水で３回洗浄する
。次に１０ｍＭのＰＢＳ（０．８５％Ｎａｃｌ含有リン
酸バッファ）で３回、１０分間３０００ｒｐｍで遠心洗
浄する。次にプラスチック管に移した後磁石分離して洗
浄する。続いて抗体として２ｍｌのウサギ抗ＡＦＰ抗体
［（抗α−フエトプロテイン抗体）ダコ社製］を添加し
、次にウエーブロー夕で一夜４０Ｃに保って感作する。

次にＰＢＳで洗浄し上澄液を除去した後、安定化のため
にＩ％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んだＰＢＳで
懸濁する。次に４℃で１６時間保ち、ＰＢＳで３００Ｏ
ｒｐｍで１０分間遠心洗浄し、またＧＶＢ（ゼラチンベ
ロナールバッファ）で３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心洗
浄する。次に７００Ｏｒｐｍで１０分間処理し抗体結合
マグネット０．　　９０８ｇを得た。続いて、４ｍｌの
ＧＶＢ＋″で懸濁することにより、最終的に懸濁濃度を
調整した。

以上によって抗ＡＦＰ抗体が固定されたマグネタイトが
得られる。

（２）抗体固定化リポソームの調整本実質例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロ
ール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製の
ものを用いた。また、Ｍ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びセフ
ァデックスＧ−２５ファインはファルマシア社製のもの
を用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用
した。尚、水は全てイオン交換水を用いた。

■官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロピ
オン酸アミド（ＤＰＰＥ−，ＤＴＰ）の調整密栓付三角フラスコにＤＰＰＥ７０■を分取し、クロロ
ホルム／メタノール（５　：　１）混合溶媒２５ｍｌに
溶解した。次に、トリエタノールアミン６０μ１及びＳ
ＰＤＰ５０■を添加し、窒素置換した後、室温で１時間
反応させてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ
）を導入した。続いて、ロータリーエバボレータにより
溶媒を除去した。次いで、乾燥物をクロロホルム／メタ
ノール（１０・１）混合溶媒に溶解した後、シリカゲル
力ラムを用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収
した。更に、ロータリーエバポレータにより約５ｍｌま
で濃縮した。

ＤＰＰＥ−ＤＴＰの取率は８０〜８５％であった。これ
を窒素封入下−２０℃で保存した。

この反応によりＤＰＰＥの導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リポソームの調整使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤＰＰＣ２００μｌ，１０ｍＭのコレステロー
ル１００μｌ及びｌｍＭのＤＰＰＥＤＴＰ　（■で得ら
れた官能性リン脂質）５０μｌを１０ｍｌ容器のナス型
フラスコに入れ、更にクロロホルム２　ｍｌを加えてよ
く混合した。次に、約４０℃の水浴中でロータリーエバ
ボレータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム２ｍ
ｌを加えて充分に攪拌した後、再度、ロータリーエバポ
レータにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返す
と、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。続いて、フ
ラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで約Ｆ時間吸
引し、溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキジフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製．　　ｐＨ７．　　４，浸透圧２
８０ｍＯｓ　　ｍｏｌ：以下、ＣＦと記す）１００μｌ
を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して
約６０’Ｃの水浴中に約１分間浸漬した。続いて、Ｖｏ
ｒｔｅｘミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完
全に消失するまでフラスコを激しく振とうした。この操
作によりリポソーム懸濁液が調整された。更に、リポソ
ーム懸濁液に０．ＯＩＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０．８５
％ＮａＣ１含有、ｐＨ７．４５＋以下、ＨＢＳと記す）
を少量添加した後、全て遠心チューブに移し、４℃にお
いて２７０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心する操作を数回
繰り返した。最後に１ｍｌのＨＢＳに懸濁させた。

■抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾１　ｍｇ　／　ｍｌの抗ヒトＡＦＰ抗体２　ｍｌをＨＢ
Ｓで希釈し、１０ｍＭのＳＰＤＰエタノール溶液１０μ
ｌを添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応させ
、抗ヒトＡＦＰ抗体にジチオピリジル基を導入した。次
に予めＯ．ＬＭ酢酸緩衝液（０．８５％ＮａＣ１含有、
ｐＨ４．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５ファ
イン力ラム（ゲル体積約１５ｍｌ）を用いたゲルろ過に
より未反応のＳＰＤＰを除去して精製し、タンパク質分
画のみを回収した。

次いで、この分画にＤＴＴ約２０■を加え、窒素置換後
、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基をＳＨ基
と置換して修飾した。続いて、ＨＢＳで平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５ファイン力ラムを用いたゲルろ過に
よりＤＴＴを除去して精製し、タンパク質分画のみを回
収した。

■抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソームの調整■で得られ
たリポソーム懸濁液１　ｍｌを４℃において２７０００
　Ｘ　ｇで２０分間遠心したリポソーム沈査と、■で得
られた０．１ｇタンパク質／ｍｌの修飾された抗ヒトＡ
ＦＰ抗体溶液２　ｍｌとを混合し、窒素置換した後、密
栓して２０’Ｃでゆっくり振とうしながら１晩反応させ
た。次に、ＨＢＳで遠心洗浄して未反応の抗体を除去し
た。

更に、２７ＱＯＯＸｇで２０分間遠心したリポソーム沈
査の重量を測定し、１重量％濃度になるようにＣＶＢ＋
で希釈した。そして、０．０５％濃度となるようにアジ
化ナトリウムを添加し、４℃で保存した。

（３）材料各々３．７５倍，７．５倍，１５倍に希釈されたリポソ
ーム，抗ＡＦＰ抗体が固定されたマグネタイト，各々０
，１，１０，１００．１０００ｎｇ／ｍｌとなるように
希釈されたＡＦＰを用いる。

（４）分析１０μ１の抗ＡＦＰ抗体固定化リポソームを用い、４０
μｌの試料を加える。これを３７°Ｃで１０分間インキ
ユベートした後、４０μ１のマグネタイトを加え、さら
に、３７℃で３０分間インキユベートする。次に上澄液
を除いた後１５０μＩＧＶＢ−で洗浄する。続いて２．
５％の界面活性剤（トリトンＸＩＯＯ）を１５０μｌ加
えた後、３７℃で５分間放置する。これによってＢ／Ｆ
分離が行われた後、リポソームが破壊し標識物質が流出
することにより、免疫測定が行われる。尚、測定は蛍光
測定用マイクロプレートリーダＭＴＰ−３２ＴＭ（コロ
ナ社）を用いて行った。

第２図は以上によって得られたＡＦＰ濃度による応答性
をリポソームの希釈率ごとに示しており、縦軸は蛍光強
度、横軸はＡＦＰ濃度である。リポソームの希釈率が１
５倍及び３．８倍では応答性は良くなり、７．５倍の場
合が最も優れていることを示している。

［発明の効果］以上述べたように本発明によれば、補体を用いずに磁性
物質を用い、これに最終的にマイクロカプセルを結合さ
せるようにしたので、非特異反応が防止できて測定の信
頼度を向上することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の免疫測定方法の実施例を示す概略図、
第２図は本実施例によって得られた結果を示す特性図で
ある。２・・・磁性物質、３・・・抗原（被検物質）、６・・
・リポソーム、７・・・標識物質。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マイクロカプセルと、このマイクロカプセルに封
入された標識物質と、前記マイクロカプセルに固定化さ
れた抗体、抗体の一部もしくは抗原とからなる免疫測定
試薬を用いる免疫測定方法において、前記マイクロカプ
セルと最終的に結合する抗原又は抗体の担体として磁性
物質を用いることを特徴とする免疫測定方法。
（２）前記磁性物質が微粒子又は多孔性からなる請求項
１記載の免疫測定方法。
（３）前記磁性物質の微粒子の大きさが少なくともマイ
クロカプセルの径と同等以下の大きさを有している請求
項２記載の免疫測定方法。
（４）前記マイクロカプセルがリポソームからなる請求
項１記載の免疫測定方法。