JPS60117159A - 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 - Google Patents
免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法Info
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- JPS60117159A JPS60117159A JP22450983A JP22450983A JPS60117159A JP S60117159 A JPS60117159 A JP S60117159A JP 22450983 A JP22450983 A JP 22450983A JP 22450983 A JP22450983 A JP 22450983A JP S60117159 A JPS60117159 A JP S60117159A
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- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法に関
し、更に詳しくは、試料中に存在する特定の抗原又は抗
体を定量分析するための免疫分析用試薬及びそれを用い
た分析方法に関する。
し、更に詳しくは、試料中に存在する特定の抗原又は抗
体を定量分析するための免疫分析用試薬及びそれを用い
た分析方法に関する。
ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の腫瘍マ
ーカーが見出されるようになった。例えばα−７エトｆ
ｔ−ティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗よび膵ガン胎児性
抗原（ＰＯＡ ’）などがその代表例として挙げること
ができる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合
、非常に低い（例えば、ＡＦＰの場合：１０ｎｌ／ｍｌ
以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１０倍程度
の値を示すことが多い。いずれにしても、腫瘍マーカー
の分析定量には、非常に高い検出感度が要求される。
ーカーが見出されるようになった。例えばα−７エトｆ
ｔ−ティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗よび膵ガン胎児性
抗原（ＰＯＡ ’）などがその代表例として挙げること
ができる。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合
、非常に低い（例えば、ＡＦＰの場合：１０ｎｌ／ｍｌ
以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１０倍程度
の値を示すことが多い。いずれにしても、腫瘍マーカー
の分析定量には、非常に高い検出感度が要求される。
この要求を満すために、従来は、放射性物質で標識化し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ
）が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒
で廃棄処理も問題になる０そこで〜放射性物質の代りに
酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるい
は抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらに
おいても遊隙抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しな
け牡ばならないという欠点を有していた。また、Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌＡ 、Ｆ 、 Ｖａｒｇａｓ 、 Ｍ、Ｇ
、 ａｎｄｋｌａｓａ Ｃ，Ｓ、 （１９７６）ＣＩｉ
ｎ、Ｃｈｅｍ 、 ２２ 、 １８９９に発表されたＥ
ＭＩＴ法は、分離工程の不要な均一系で測定できる画期
的な手法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原
あるψは抗体には適用できない。
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ
）が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒
で廃棄処理も問題になる０そこで〜放射性物質の代りに
酵素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるい
は抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらに
おいても遊隙抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しな
け牡ばならないという欠点を有していた。また、Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌＡ 、Ｆ 、 Ｖａｒｇａｓ 、 Ｍ、Ｇ
、 ａｎｄｋｌａｓａ Ｃ，Ｓ、 （１９７６）ＣＩｉ
ｎ、Ｃｈｅｍ 、 ２２ 、 １８９９に発表されたＥ
ＭＩＴ法は、分離工程の不要な均一系で測定できる画期
的な手法であるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原
あるψは抗体には適用できない。
ところで、Ｈａｘｂｙ、 Ｊ、Ａ、ｋｉｎｓｋｙ、 Ｃ
，Ｂ、 ａｎｄｋｉｎｓｋｙＳｅｃ、（１９６８） Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１３００で、脂溶性の抗
原を膜内圧取り込みグルコースを封入したリポソームを
調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグ
ルコースの流出量を測定することにより、抗体の定量を
行う手法が発表された。
，Ｂ、 ａｎｄｋｉｎｓｋｙＳｅｃ、（１９６８） Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ６１３００で、脂溶性の抗
原を膜内圧取り込みグルコースを封入したリポソームを
調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグ
ルコースの流出量を測定することにより、抗体の定量を
行う手法が発表された。
しかしながら、腫瘍マーカーを測定するためには、マー
カー自身あるいはこれら゛のマーカーに対する抗体、す
なわちタンノ母り質である免疫グロブリンをりＩソーム
上に担持させねばならない。ところが、現在まで、脂溶
性のタンｉ＋り質を担持したリポソームを用いることは
可能であったが１、親水性のタンパク質を担持したリポ
ソームを用いる抗原または抗体の免疫分析法は報告され
ていない。それは、親水性のタンノリ質をリボン、−ム
に担持せしやる技術が確立されて−なかったからである
。
カー自身あるいはこれら゛のマーカーに対する抗体、す
なわちタンノ母り質である免疫グロブリンをりＩソーム
上に担持させねばならない。ところが、現在まで、脂溶
性のタンｉ＋り質を担持したリポソームを用いることは
可能であったが１、親水性のタンパク質を担持したリポ
ソームを用いる抗原または抗体の免疫分析法は報告され
ていない。それは、親水性のタンノリ質をリボン、−ム
に担持せしやる技術が確立されて−なかったからである
。
また、特開昭５６−１３２５６４″免疫分析用生成物お
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されて−るが、そこ、では、タンパク質の担持
方法としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を
用いる方法を提案している。本発明者らの研究によると
、このような架橋試薬で抗体をり？ソームに担持すると
、一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うりＩ
ソームの破壊が引起されなくなることが判明した。
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されて−るが、そこ、では、タンパク質の担持
方法としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を
用いる方法を提案している。本発明者らの研究によると
、このような架橋試薬で抗体をり？ソームに担持すると
、一般に抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うりＩ
ソームの破壊が引起されなくなることが判明した。
更に、従来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時
間を要し、しかも大量の試料を自、動的に測定すること
ができないという欠点を有して−た。
間を要し、しかも大量の試料を自、動的に測定すること
ができないという欠点を有して−た。
本発明は、親水性の抗原又は抗体をリポソームに担持せ
しめた免疫分析用試薬を開発し１．もって試料中の抗原
又は抗体を短時間で簡便に定員することができる免疫分
析方法を提供することを目的とする。
しめた免疫分析用試薬を開発し１．もって試料中の抗原
又は抗体を短時間で簡便に定員することができる免疫分
析方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性により溶解作用を受けるりＩソーム上
に、活性を低下させることなく、試料中の抗原又は抗体
に対応する抗体又は抗原を固定化することに成功し、更
に、リポソーム内に標識物質を封入することによシ、本
発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
た結果、補体活性により溶解作用を受けるりＩソーム上
に、活性を低下させることなく、試料中の抗原又は抗体
に対応する抗体又は抗原を固定化することに成功し、更
に、リポソーム内に標識物質を封入することによシ、本
発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
すなわち１本発明の免疫分析用試薬は、リポソーム；架
橋法もしくは活性脂質法によって該リポソーム上に固定
化された親水性の抗原又は抗体；及び、該リポソーム内
に封入された親水性の標識物質からなることを特徴とす
る。
橋法もしくは活性脂質法によって該リポソーム上に固定
化された親水性の抗原又は抗体；及び、該リポソーム内
に封入された親水性の標識物質からなることを特徴とす
る。
また、本発明の免疫分析方法は、−
リポソーム；架橋法もしくは活性脂質法によって該り４
ソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；及び、
該リポソーム上に封入された標識物質からなる免疫分析
用試薬を、抗原又は抗体を含も試料及び補体と混合し、
次いで、リポソーム内から溶出した標識物質を定量する
ことにより、試料中の抗原又は抗体を定量することを特
徴とす・る０ 以下、本発明を更に詳細に説明する〇 本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫瘍マーカ
ー（前述のＡＦＰ 、 ＢＦＰ 、 ＣＥＡ 、及びＰ
ＯＡ等）免疫グロブリン（ＩＩＡ、 ＩｇＥ、 ＩｇＧ
及びＩｇＭ等）、ホルモン（インシュリン、ＴＳ及びＴ
４等）及び薬物等の抗原、あるいはそれらに対応する抗
体であって、広範囲に亘る。
ソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；及び、
該リポソーム上に封入された標識物質からなる免疫分析
用試薬を、抗原又は抗体を含も試料及び補体と混合し、
次いで、リポソーム内から溶出した標識物質を定量する
ことにより、試料中の抗原又は抗体を定量することを特
徴とす・る０ 以下、本発明を更に詳細に説明する〇 本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫瘍マーカ
ー（前述のＡＦＰ 、 ＢＦＰ 、 ＣＥＡ 、及びＰ
ＯＡ等）免疫グロブリン（ＩＩＡ、 ＩｇＥ、 ＩｇＧ
及びＩｇＭ等）、ホルモン（インシュリン、ＴＳ及びＴ
４等）及び薬物等の抗原、あるいはそれらに対応する抗
体であって、広範囲に亘る。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームとは、赤血
球が−スＦ膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであってもよいが、リン脂質又は糖脂質とコレス
テロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン
脂質とコレステロールからリポソームを合成する場合は
、これらの比が１＝１前後にあるとき、安定なリポソー
ムが得られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素
原子数が１２〜１８であることが好ましく、更には偶数
であることがより好ましい。
球が−スＦ膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであってもよいが、リン脂質又は糖脂質とコレス
テロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン
脂質とコレステロールからリポソームを合成する場合は
、これらの比が１＝１前後にあるとき、安定なリポソー
ムが得られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素
原子数が１２〜１８であることが好ましく、更には偶数
であることがより好ましい。
リポソーム上に固定化される抗原又は抗体としては前記
のものが例示されるが、これらは親水性であることが必
要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体と
抗原抗体反応を起こす被検物質（抗体又は抗原）は、親
水性でなくともよい。
のものが例示されるが、これらは親水性であることが必
要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体と
抗原抗体反応を起こす被検物質（抗体又は抗原）は、親
水性でなくともよい。
本発明の試薬において、抗原又は抗体は、架橋剤又は脂
質の活性化剤によって、リポソーム上に原子間の共有結
合で固定化されている。
質の活性化剤によって、リポソーム上に原子間の共有結
合で固定化されている。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定月可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０−”
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルがキシルフル
オレセインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化
反応により発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸イｂ酵素の
作用により分解され酵素消費あるいは過酸化水素生成を
もたらすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テ
トラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン
性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ ）のような補酵素類；メチルビオｐグンを初めと
するラジカル化合物などが銀ましい。しかしながら、酵
素類は本発明におψては標識物質として使用しない。こ
れらの化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安定
性等の因子を勘案した上で、適宜に選択されるＯ 以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤（
これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応せ
しめ（架橋剤の代わりに脂質の活性化剤を用いてもよく
、この方法を活性脂質法という）、リポソーム上に固定
化される抗原又は抗体と結合し得る官能基を脂質分子に
導入する。
、リポソーム外に溶出された際に定月可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０−”
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルがキシルフル
オレセインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化
反応により発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸イｂ酵素の
作用により分解され酵素消費あるいは過酸化水素生成を
もたらすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テ
トラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン
性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ ）のような補酵素類；メチルビオｐグンを初めと
するラジカル化合物などが銀ましい。しかしながら、酵
素類は本発明におψては標識物質として使用しない。こ
れらの化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安定
性等の因子を勘案した上で、適宜に選択されるＯ 以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤（
これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応せ
しめ（架橋剤の代わりに脂質の活性化剤を用いてもよく
、この方法を活性脂質法という）、リポソーム上に固定
化される抗原又は抗体と結合し得る官能基を脂質分子に
導入する。
次いで、得られた官能性脂質とコレステロール及び必要
であれば他の脂質とを７ラスフに入れ、溶媒を加えて反
応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、
壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の
水溶液を加え、密栓をして振とうし、感作りｉソームの
懸濁液を得る〇一方、すｆソー今に固定化すべき抗原又
は抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
（例えばジチオトレイトール； ＤＴＴ）と更に反応さ
せて、修飾抗原又は抗体を得る。なお、前記工程で脂質
をその活性化剤で処理した場合は、本工程は不要である
◎ 最後に、感作リポソームと修飾抗原又は抗体（活性脂値
法を用いた場合は、未修飾の抗原又は抗体）とを緩衝液
中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬
が得られる。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、
表面に固定化された抗原又は抗体を担持したマイク四カ
プセルとして得られる。
であれば他の脂質とを７ラスフに入れ、溶媒を加えて反
応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、
壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の
水溶液を加え、密栓をして振とうし、感作りｉソームの
懸濁液を得る〇一方、すｆソー今に固定化すべき抗原又
は抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入
し、しかる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬
（例えばジチオトレイトール； ＤＴＴ）と更に反応さ
せて、修飾抗原又は抗体を得る。なお、前記工程で脂質
をその活性化剤で処理した場合は、本工程は不要である
◎ 最後に、感作リポソームと修飾抗原又は抗体（活性脂値
法を用いた場合は、未修飾の抗原又は抗体）とを緩衝液
中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬
が得られる。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、
表面に固定化された抗原又は抗体を担持したマイク四カ
プセルとして得られる。
上記製造法における架橋剤としては・、例えば、Ｎ−ス
クシンイミジル３″−（２−ピリジルジチオ）ｆｏピオ
ネ−） （８ＰＤＰ）％Ｎ−Ｘ クシ＞ イミＮ ｋ４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
、Ｎ−スクシンイミジル４− （ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（８ＭＰＡ） 、Ｎ−スクシンイミジ
ル４− ＣＤ−マレイＩＮＩエニル）プロビオネート（
ＳＭＰＰ） 、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）
スクシンイミド（ＧＭＢＳ ） 及びＮ−（ε−マレイ
ミドカグロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ８）が
挙げられる。
クシンイミジル３″−（２−ピリジルジチオ）ｆｏピオ
ネ−） （８ＰＤＰ）％Ｎ−Ｘ クシ＞ イミＮ ｋ４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
、Ｎ−スクシンイミジル４− （ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（８ＭＰＡ） 、Ｎ−スクシンイミジ
ル４− ＣＤ−マレイＩＮＩエニル）プロビオネート（
ＳＭＰＰ） 、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）
スクシンイミド（ＧＭＢＳ ） 及びＮ−（ε−マレイ
ミドカグロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ８）が
挙げられる。
５ＰＤＰは、次式：
で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
ファルマシア社から市販されている。該架橋剤は、例え
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用
させたマイクジカプセルと反応させると、室温以下、数
時間から１日でマイクロカプセル上に抗原を固定化する
ことができる。
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用
させたマイクジカプセルと反応させると、室温以下、数
時間から１日でマイクロカプセル上に抗原を固定化する
ことができる。
ＳＭＰＢは、次式：
で示され、５ＰＤＰと同様な反応でタンＩ？り質を固定
化できるが、最終生成物中に−５−８−結合を含まず（
−８−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定
である。
化できるが、最終生成物中に−５−８−結合を含まず（
−８−結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定
である。
一方、脂質の活性化剤としては、例えば、シアノ−ダン
プロミド（ＣＮＢｒ）、シアヌリツククロリド（ＣＣ）
、エビクロロヒドリン（ＥＨ）、０−フシモアセチル−
Ｎ−ヒドロオキシスクシンイミド及び１，４−ビス（２
，３−エポキシプロポキシ）ブタン（ＢＥＰＢ ）等が
挙げられる。このうち、ＣＮＢｒ 、 ＣＣ、ＥＨ，Ｂ
ＥＰＢは、糖残基を有する化合物を活性化して、それを
第一アミノ基を有する化合物と結合せしめる化合物であ
る。従って、マイクロカプセル上に糖残基が存在する場
合には本試薬が適用できる。また、抗原自身が糖タンパ
ク質であり、マイクロカプセル上に第一アミノ基が存在
するような場合にも有効である。
プロミド（ＣＮＢｒ）、シアヌリツククロリド（ＣＣ）
、エビクロロヒドリン（ＥＨ）、０−フシモアセチル−
Ｎ−ヒドロオキシスクシンイミド及び１，４−ビス（２
，３−エポキシプロポキシ）ブタン（ＢＥＰＢ ）等が
挙げられる。このうち、ＣＮＢｒ 、 ＣＣ、ＥＨ，Ｂ
ＥＰＢは、糖残基を有する化合物を活性化して、それを
第一アミノ基を有する化合物と結合せしめる化合物であ
る。従って、マイクロカプセル上に糖残基が存在する場
合には本試薬が適用できる。また、抗原自身が糖タンパ
ク質であり、マイクロカプセル上に第一アミノ基が存在
するような場合にも有効である。
以上に述べた架橋剤又は脂質の活性化剤を用いた場合は
、従来は不可能であった親水性抗原又は抗体のリポソー
ム上への固定化が可能となる。なお、本方法にあっては
、グルタルアルデヒドの如き強力な架橋剤を用いて固定
化した際に生じる抗原又は抗体の活性門下とい゛う現象
カー回避される。
、従来は不可能であった親水性抗原又は抗体のリポソー
ム上への固定化が可能となる。なお、本方法にあっては
、グルタルアルデヒドの如き強力な架橋剤を用いて固定
化した際に生じる抗原又は抗体の活性門下とい゛う現象
カー回避される。
なお、本発明の免疫分析用試薬＆’！、 ％まず脂質と
抗原又は抗体とを、架橋剤又は脂質の活性イヒ剤を用い
て結合せし宇、次いで得られた結合体を界面活性剤とと
もに水中に岬えて４９′を！成させ・しかる後、透析あ
るいはグル口過等を用いて界面活性剤を除失することに
より製造することも可能である。
抗原又は抗体とを、架橋剤又は脂質の活性イヒ剤を用い
て結合せし宇、次いで得られた結合体を界面活性剤とと
もに水中に岬えて４９′を！成させ・しかる後、透析あ
るいはグル口過等を用いて界面活性剤を除失することに
より製造することも可能である。
本発明の免疫分析方法は、前記の免疫分析用ム薬を、抗
原又は抗体を含む試料（リポソームに固定化したものが
抗原であれば抗体試料を用−１抗体で′あれば抗原試料
を用いる）及び補体と適当な緩衝液（例えば、ゼラチン
−ペルナール緩衝液）中で混合し、抗原−抗体と゛補体
との結合反応をヲ１き起こさせる。すると、かかる反応
量に比例、して、リポソーム内から標識物質が放出され
てくる。次いで、この標識物質に応じた分析方法（例え
ば、−−−、−−−−’−−−−、−＃−ｍ、７！、Ｉ
＋ＩＪＷｍＡ４ｃａＮＩｆ？シ定量を行い、例えば、予
め作成した検量線により、試料中あ抗原又は抗体の量を
測定することができる。
原又は抗体を含む試料（リポソームに固定化したものが
抗原であれば抗体試料を用−１抗体で′あれば抗原試料
を用いる）及び補体と適当な緩衝液（例えば、ゼラチン
−ペルナール緩衝液）中で混合し、抗原−抗体と゛補体
との結合反応をヲ１き起こさせる。すると、かかる反応
量に比例、して、リポソーム内から標識物質が放出され
てくる。次いで、この標識物質に応じた分析方法（例え
ば、−−−、−−−−’−−−−、−＃−ｍ、７！、Ｉ
＋ＩＪＷｍＡ４ｃａＮＩｆ？シ定量を行い、例えば、予
め作成した検量線により、試料中あ抗原又は抗体の量を
測定することができる。
定量操作において使用する補体は、格別限定されないが
、通常、モルモット血清が用いられる０しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
、通常、モルモット血清が用いられる０しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
なお、本発明を応用して、基質又は酵素をリポソーム上
に固定化した分析試薬を製造することにより、試料中の
酵素又は基質を定量することも可能である。
に固定化した分析試薬を製造することにより、試料中の
酵素又は基質を定量することも可能である。
本発明の分析方法では、活性を低、下させることなく抗
原又は抗体をリポソーム上に固定化し、更にリポソーム
内に標識物質を封入した免疫分析用試薬を用いているの
で、均−系で、かつ短時間で、検出感度の高い正確な抗
原又は抗体の定量を行うことができる。しかも、本発明
分析方法にあっては、被検物質の適用範囲が広く、かつ
分析費用も安い。更に、自動分析化も容易であって、多
項目同詩測定も可能である。
原又は抗体をリポソーム上に固定化し、更にリポソーム
内に標識物質を封入した免疫分析用試薬を用いているの
で、均−系で、かつ短時間で、検出感度の高い正確な抗
原又は抗体の定量を行うことができる。しかも、本発明
分析方法にあっては、被検物質の適用範囲が広く、かつ
分析費用も安い。更に、自動分析化も容易であって、多
項目同詩測定も可能である。
以下、実施例によシ本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１
ヒト免疫グロブリンＧ（１，９Ｇ）を感作したり？ソー
ムを用・い・する・、抗１．９’Ｇ抗体の測定（Ｉ）（
４）試薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロール、ジパルミトイルフオスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＥ ）及びジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−スクシンイ
ミジル３− （２−ピリジルジチオ）プルビオネート（
５ＰＤＰ ）及びセファデックスＧ−２５フアインはフ
ァルマシア社より購入した０他の試薬は市販品（特級）
を精製せずに使用した。なお、水はイオン交換水を用い
た。
ムを用・い・する・、抗１．９’Ｇ抗体の測定（Ｉ）（
４）試薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロール、ジパルミトイルフオスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＥ ）及びジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−スクシンイ
ミジル３− （２−ピリジルジチオ）プルビオネート（
５ＰＤＰ ）及びセファデックスＧ−２５フアインはフ
ァルマシア社より購入した０他の試薬は市販品（特級）
を精製せずに使用した。なお、水はイオン交換水を用い
た。
（２）感作りＩソームの調製
ａ） ＤＰＰＥ−ジチオビリジネート（ＤＰＰＥ−ＤＴ
Ｐ）の調製 試験管に１０ ｍＭ ＤＰＰＥ（クロロホルム溶液）５
ゴと５０〜の５ＰＤＰを加え、窒素ガスで置換した後、
密栓して室温で２時間反応させた。
Ｐ）の調製 試験管に１０ ｍＭ ＤＰＰＥ（クロロホルム溶液）５
ゴと５０〜の５ＰＤＰを加え、窒素ガスで置換した後、
密栓して室温で２時間反応させた。
反応後、５倍量の生理食塩水で３回抽出し１残ったクロ
ロホルム相を減圧乾燥し、最後に５ｄのクロロホルムを
加え、密栓試験管中、−２０℃で保存した。
ロホルム相を減圧乾燥し、最後に５ｄのクロロホルムを
加え、密栓試験管中、−２０℃で保存した。
ｂ）すＩソームの調製
使用する脂質はすべてりシロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１ ）に溶解シた。まず、５ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｔ） 、１０ｍＭコレステｐ−ル（
１００μｚ）及び１ ｍＭ ＤＰＰＥ−ＤＴＰ （６０
μｔ）を１０ｍＡ’のナス型フラスコに入れ、更に２１
１Ｌｌのクロロホルムを加えて良く混合した０水浴中（
約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除
去した。再び２−のりシロホルムを添加し、十分撹拌後
、再度ロータリーエバポレーターによシ溶媒を蒸発させ
た。この操作を数回繰シ返すと１フラスコ壁面に薄膜が
形成された。フラス、コをデシクーター中に移し真空ポ
ンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、
１００μｔの０．２Ｍカル？キシルフルオレ七イン（イ
ーストマン・コダック社製、 ｐＨ７，４）を添加し、
フラスコ内部を窒素で置換した後に密栓して、６０℃程
度の水浴中に約１分間浸漬した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘ
ミキサーを用−１壁面の脂質薄膜が完全に消失するま
でプラス１．コを激しく振とうした。この操作により、
１ｙポソーム懸濁液が調製された。ゼラチンーペシナー
ル緩衝液（０，１ｙＭＭＩＣ６＊及Ｃｌ Ｏ，０３ｍＭ
ｃＩＬＣ１＊含有；以下、ＧＶＢ”＋と略記）、を少
量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに移
、 した。４℃、１５．０００ｒｐｍで２０分間遠心し
、遊離のカルがキシルフルオレセインを除去した。上清
か透明になるまでＧＶＢ”十を用−てこの操作を繰シ返
した。最後に２ ｉ４ Ｃ） ＧＶＢ”十及び５μｔの
１０％ＮａＮ５を加え、ｖｏｒｔｅｘ ミキサーで懸濁
させ、窒、素封、人後、冷蔵庫に保存した。
／メタノール（２／１ ）に溶解シた。まず、５ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｔ） 、１０ｍＭコレステｐ−ル（
１００μｚ）及び１ ｍＭ ＤＰＰＥ−ＤＴＰ （６０
μｔ）を１０ｍＡ’のナス型フラスコに入れ、更に２１
１Ｌｌのクロロホルムを加えて良く混合した０水浴中（
約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除
去した。再び２−のりシロホルムを添加し、十分撹拌後
、再度ロータリーエバポレーターによシ溶媒を蒸発させ
た。この操作を数回繰シ返すと１フラスコ壁面に薄膜が
形成された。フラス、コをデシクーター中に移し真空ポ
ンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、
１００μｔの０．２Ｍカル？キシルフルオレ七イン（イ
ーストマン・コダック社製、 ｐＨ７，４）を添加し、
フラスコ内部を窒素で置換した後に密栓して、６０℃程
度の水浴中に約１分間浸漬した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘ
ミキサーを用−１壁面の脂質薄膜が完全に消失するま
でプラス１．コを激しく振とうした。この操作により、
１ｙポソーム懸濁液が調製された。ゼラチンーペシナー
ル緩衝液（０，１ｙＭＭＩＣ６＊及Ｃｌ Ｏ，０３ｍＭ
ｃＩＬＣ１＊含有；以下、ＧＶＢ”＋と略記）、を少
量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チューブに移
、 した。４℃、１５．０００ｒｐｍで２０分間遠心し
、遊離のカルがキシルフルオレセインを除去した。上清
か透明になるまでＧＶＢ”十を用−てこの操作を繰シ返
した。最後に２ ｉ４ Ｃ） ＧＶＢ”十及び５μｔの
１０％ＮａＮ５を加え、ｖｏｒｔｅｘ ミキサーで懸濁
させ、窒、素封、人後、冷蔵庫に保存した。
Ｃ）、１．？Ｇの修飾
５Ｍ９のＩＩ！Ｇ（ｖイルズ社製、）を２ ｄｏ Ｏ，
０１ＭＨ耳ＰＥＳ緩衝、液 （ｐ）１７．４５０．８５
％ＮａＣノ含有）、に溶解し、窒素で置換した後、１０
μｔの１０ ｍＭ ５ＰＤＰ （エタノール溶液）を加
え、。
０１ＭＨ耳ＰＥＳ緩衝、液 （ｐ）１７．４５０．８５
％ＮａＣノ含有）、に溶解し、窒素で置換した後、１０
μｔの１０ ｍＭ ５ＰＤＰ （エタノール溶液）を加
え、。
十分撹拌してそのま声室温で３０分間反応さ竺た。反応
後、反廃液を予め生理食塩水で飽和させたセフアゾ？ク
スＧ−２５ファインのグクを充填したカラム（グル体ｆ
ｌ＃１５ｙ）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
５、０，８５％ＮＪＬＣＪ含有）で溶出させた。最初の
ビークフラクション（約２プ）に更に２ｄ、９酢酸緩衝
液を加え、窒素置換後、ジチオ（レイトール（約３０９
）を添加した。十分に撹拌して２０分間室温で反応させ
た。反応後、予め０．０１ Ｍ ＨＥＰＥＳ 緩衝液で
飽和させたセファデックスＧ−２５ファインのグルを充
填してあるカラム（ダル体積：約３０ｍ）に反応栢を展
開し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のピークフラ
クション（約２ゴ）を集め、鰺素置換後、使用するまで
冷蔵庫に保存した。
後、反廃液を予め生理食塩水で飽和させたセフアゾ？ク
スＧ−２５ファインのグクを充填したカラム（グル体ｆ
ｌ＃１５ｙ）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
５、０，８５％ＮＪＬＣＪ含有）で溶出させた。最初の
ビークフラクション（約２プ）に更に２ｄ、９酢酸緩衝
液を加え、窒素置換後、ジチオ（レイトール（約３０９
）を添加した。十分に撹拌して２０分間室温で反応させ
た。反応後、予め０．０１ Ｍ ＨＥＰＥＳ 緩衝液で
飽和させたセファデックスＧ−２５ファインのグルを充
填してあるカラム（ダル体積：約３０ｍ）に反応栢を展
開し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のピークフラ
クション（約２ゴ）を集め、鰺素置換後、使用するまで
冷蔵庫に保存した。
ｄ）ＩＪＩＧ感作リポソームの調製
前述のようにして調製したり？ソーム懸濁液と等量の修
飾ｌｌ１Ｇ溶液を混合し、窒素置孜後密栓して室温でゆ
っくり振とうしながら１晩反応させた。ＨＥＰＥＳ緩衝
液、次いでＧＶＢ”→で洗浄して、未反応の■ＩＧを除
去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当する
ＧＶＢ”十及び５μｔの１０％Ｎ＆Ｎ、を最後に添加し
懸濁・窒素Ｎ換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
飾ｌｌ１Ｇ溶液を混合し、窒素置孜後密栓して室温でゆ
っくり振とうしながら１晩反応させた。ＨＥＰＥＳ緩衝
液、次いでＧＶＢ”→で洗浄して、未反応の■ＩＧを除
去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の量に相当する
ＧＶＢ”十及び５μｔの１０％Ｎ＆Ｎ、を最後に添加し
懸濁・窒素Ｎ換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
（３）ＩＩｉＧ感作りデソームを用いた抗１．ｆＧ抗体
の測定 タン゛り社製のＵ０ｍグレート（９６穴）に適当量のＧ
ＶＢＩ＋で希釈した抗１１Ｇ抗体を２５１４ｔずつ注入
した０次いで、上記感作リポソーム懸濁液をＧＶＢ”十
で１００倍に希釈し、５＝ずつ各ウニ２ ル（ｗｅｌｌ
）に分注した。最後に、適当にＧＶＢ”＋で希釈した補
体（モルモット由来）を２５μｔず□ つ添加した。反
応は３７℃高温度下で１．５時間行った。反応後、各ｗ
ｅｌｌ Ｋ １００１１ＬＩ） ０．０１ ＭＥＤＴＡ
−ペロナール溶液を加えて反応を停止し、プレート用螢
光分光光度計（コｐす電子社製）で各ｗｅｌｌの螢光を
測定した（ Ｅｘ ： ４９０ ｎｍ 、 Ｅｍ ：５
２０ｎｍ）。なお、測定値は、抗体の代わりに１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ −１００を２５１１１添加したｗｅｌ
ｌの螢光と、抗体の代わりに２５にのＧＶＢ２＋を添加
したものの差を１００％とした相対値で表示した。
の測定 タン゛り社製のＵ０ｍグレート（９６穴）に適当量のＧ
ＶＢＩ＋で希釈した抗１１Ｇ抗体を２５１４ｔずつ注入
した０次いで、上記感作リポソーム懸濁液をＧＶＢ”十
で１００倍に希釈し、５＝ずつ各ウニ２ ル（ｗｅｌｌ
）に分注した。最後に、適当にＧＶＢ”＋で希釈した補
体（モルモット由来）を２５μｔず□ つ添加した。反
応は３７℃高温度下で１．５時間行った。反応後、各ｗ
ｅｌｌ Ｋ １００１１ＬＩ） ０．０１ ＭＥＤＴＡ
−ペロナール溶液を加えて反応を停止し、プレート用螢
光分光光度計（コｐす電子社製）で各ｗｅｌｌの螢光を
測定した（ Ｅｘ ： ４９０ ｎｍ 、 Ｅｍ ：５
２０ｎｍ）。なお、測定値は、抗体の代わりに１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ −１００を２５１１１添加したｗｅｌ
ｌの螢光と、抗体の代わりに２５にのＧＶＢ２＋を添加
したものの差を１００％とした相対値で表示した。
、４００倍（図中、Ａ）及び８００倍（図中、Ｂ）希釈
の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。
の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。
実施例２
ＩＩＧ感作ＩＪ ／ソームを用−る抗１１９Ｇ抗体の測
定■（１）感作すＩソームの調製 実施例１と同様の操作でカルがキシルフルオレ七イン包
含すＩソームをｓ！ｉｉ！ｌ！シた。遠心洗浄後、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ 、 ０．８５％Ｎａ
Ｃノ含有）に懸濁させ（２ｍｌ）、これに１５０１１１
９のＤＴＴを添加した。窒素置換後、′よく撹拌し、そ
のまま室温で２時間反応させた。遠心（１５，０００ｒ
ｐｍ、２０分）洗浄（ＧＶＢ”＋ ＃窒素置換済）して
、５尾の′１０％ＮａＮ１ を加えた後、冷蔵庫に保存
した。一方、抗原につ―ては□実施例１と同様に８ＰＤ
Ｐを作用させ、グル口過 。
定■（１）感作すＩソームの調製 実施例１と同様の操作でカルがキシルフルオレ七イン包
含すＩソームをｓ！ｉｉ！ｌ！シた。遠心洗浄後、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ 、 ０．８５％Ｎａ
Ｃノ含有）に懸濁させ（２ｍｌ）、これに１５０１１１
９のＤＴＴを添加した。窒素置換後、′よく撹拌し、そ
のまま室温で２時間反応させた。遠心（１５，０００ｒ
ｐｍ、２０分）洗浄（ＧＶＢ”＋ ＃窒素置換済）して
、５尾の′１０％ＮａＮ１ を加えた後、冷蔵庫に保存
した。一方、抗原につ―ては□実施例１と同様に８ＰＤ
Ｐを作用させ、グル口過 。
（ＨＥＰＥＳ 緩衝液で溶出）Ｋよシ分゛離・精製した
。得られたリポソーム懸濁液及び修飾Ｉ＃Ｇ溶液を等量
ずつ混合し、窒−置換後、室温でゆつくシ浸とうしなが
ら１晩反応させた。反応後１十分に洗浄して（窒素置換
ＧＶＢ”十使用）５ｇの１０％ＮａＮ、を添加してから
冷蔵庫に保−７１だ。
。得られたリポソーム懸濁液及び修飾Ｉ＃Ｇ溶液を等量
ずつ混合し、窒−置換後、室温でゆつくシ浸とうしなが
ら１晩反応させた。反応後１十分に洗浄して（窒素置換
ＧＶＢ”十使用）５ｇの１０％ＮａＮ、を添加してから
冷蔵庫に保−７１だ。
なお、修飾ＩＩＩＧとのカッナリング反応に適用するリ
ポソームとしては、なるべくカッブリング直前にＤＴＴ
処理したものを使用するのが望崖しいが、やむを得ず冷
蔵保存しであるものを用−る場合には、カッｆ ）Ｊ−
レグ反応前に少量′（１０〜２０９）のＤＴＴを再び添
加し３６分程度温で反応させるようｋした方が好ましい
。これは、保存中にリポソーム間で生成したＳ−８結合
を切断する為である。
ポソームとしては、なるべくカッブリング直前にＤＴＴ
処理したものを使用するのが望崖しいが、やむを得ず冷
蔵保存しであるものを用−る場合には、カッｆ ）Ｊ−
レグ反応前に少量′（１０〜２０９）のＤＴＴを再び添
加し３６分程度温で反応させるようｋした方が好ましい
。これは、保存中にリポソーム間で生成したＳ−８結合
を切断する為である。
（２）’Ｉ Ｎ Ｇ感作リポソームを用いる抗■９Ｇ抗
体のｍ壷 □実施例１と全く同一の手法により本リポソームを用い
て抗１．９Ｇ抗体を測定したところ、実施例１ｚ同様め
結果が得られた〇 実施例３ ＩＦＧ感作り゛４ソームを用−るｉ？ 、１血清中の■
ＩＧの測定 実施例１で調製したＩＩＩＧ感作リポソームを用いて、
ヒト血清中のＩＩＧ量を測定した。マイクｐタイタニプ
レート上に１．０００倍、１０，０００倍及び２０．０
００倍希釈（ＧＶＢ諺＋使用）の抗■９Ｇ抗体を２５μ
ｔずつ、それぞれ１列ずつ分注し、試料のヒト血清を１
０〜１０６倍に希釈したものを２５μを添加して４℃で
１晩反応させた。次にＩＯＱ倍希釈し’ｔ＝ ＩｆＧ感
作リポソームを５ＩＩｔずつ添加し、最後に４００倍あ
るいは８ｏｏ倍に希釈した補体（モルモット血清）を２
５Ｉｔずつ加えて、３７℃で１．５時間静置した。以下
の操作は実施例１の抗ＩＩＩＧ抗体の測定の項に示した
ものと同一である。
体のｍ壷 □実施例１と全く同一の手法により本リポソームを用い
て抗１．９Ｇ抗体を測定したところ、実施例１ｚ同様め
結果が得られた〇 実施例３ ＩＦＧ感作り゛４ソームを用−るｉ？ 、１血清中の■
ＩＧの測定 実施例１で調製したＩＩＩＧ感作リポソームを用いて、
ヒト血清中のＩＩＧ量を測定した。マイクｐタイタニプ
レート上に１．０００倍、１０，０００倍及び２０．０
００倍希釈（ＧＶＢ諺＋使用）の抗■９Ｇ抗体を２５μ
ｔずつ、それぞれ１列ずつ分注し、試料のヒト血清を１
０〜１０６倍に希釈したものを２５μを添加して４℃で
１晩反応させた。次にＩＯＱ倍希釈し’ｔ＝ ＩｆＧ感
作リポソームを５ＩＩｔずつ添加し、最後に４００倍あ
るいは８ｏｏ倍に希釈した補体（モルモット血清）を２
５Ｉｔずつ加えて、３７℃で１．５時間静置した。以下
の操作は実施例１の抗ＩＩＩＧ抗体の測定の項に示した
ものと同一である。
実験結果を第２図に示した。一方、既知濃度の１１９Ｇ
を含む溶液を用い、同様の操作により■ＩＧ濃度に対す
る検量線を作成した。この検量線を用いて、ヒト血清中
の１．９Ｇ量が測定できる。
を含む溶液を用い、同様の操作により■ＩＧ濃度に対す
る検量線を作成した。この検量線を用いて、ヒト血清中
の１．９Ｇ量が測定できる。
実施例４
ヒトＡＦＰ 感作リポソームを用いたヒトＡＦＰの測定
実施例１に示した方法に従って、カルがキシル７にオレ
セインを含有するリポソーム表面上にヒ）ＡＦＰ（日本
バイオテスト研究所より購入）を固定化した。一方、実
施例３と同様に、マイクロタイタープレート上に抗ヒト
ＡＦＰ抗体を適当に（１００〜１０００ ｎ＃／ｍ／）
希釈した（ ＧＶＢ”十使用）溶液を２５尾ずつ加え、
各ｗｅｌｌに５ｕのヒ） ＡＦＰ標準液（３〜１０００
ｎＪＦ〜、日本バイオテスト研究新製）をそれぞれ２
’ｗａｌｌずつ添加して室温（約２５℃）で３０分間反
応させた。次に１上述ノヒトＡＦＰ感作リポソーム（Ｇ
ＶＢ””ｔ’ｌ ００ 倍ｔｃ希釈）Ｊｌ！！！濁液５
μｌ及びモルモット血清（ＧＶＢ２＋で４００倍に希釈
）２５μ！全添加して３７℃で１．５時間静置した後、
１００μノのＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止した。螢
光分光光度計で各ｗｅｌｌの螢光強度を測定し、ＡＦＰ
の濃度に対してプロットした。
セインを含有するリポソーム表面上にヒ）ＡＦＰ（日本
バイオテスト研究所より購入）を固定化した。一方、実
施例３と同様に、マイクロタイタープレート上に抗ヒト
ＡＦＰ抗体を適当に（１００〜１０００ ｎ＃／ｍ／）
希釈した（ ＧＶＢ”十使用）溶液を２５尾ずつ加え、
各ｗｅｌｌに５ｕのヒ） ＡＦＰ標準液（３〜１０００
ｎＪＦ〜、日本バイオテスト研究新製）をそれぞれ２
’ｗａｌｌずつ添加して室温（約２５℃）で３０分間反
応させた。次に１上述ノヒトＡＦＰ感作リポソーム（Ｇ
ＶＢ””ｔ’ｌ ００ 倍ｔｃ希釈）Ｊｌ！！！濁液５
μｌ及びモルモット血清（ＧＶＢ２＋で４００倍に希釈
）２５μ！全添加して３７℃で１．５時間静置した後、
１００μノのＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止した。螢
光分光光度計で各ｗｅｌｌの螢光強度を測定し、ＡＦＰ
の濃度に対してプロットした。
例えば、１００ ｎ帽の抗ヒ） ＡＦ’Ｐ抗体と８ｏｏ
倍希釈のモルモット血清（補体）を使用した場合、ｌＯ
〜５００ ｎｌＦ／−の範囲内でヒトＡＦＰが定量でき
ることが判明した。このような検量線を用い、未知試量
中のＡＦＰ濃度をめることができる。
倍希釈のモルモット血清（補体）を使用した場合、ｌＯ
〜５００ ｎｌＦ／−の範囲内でヒトＡＦＰが定量でき
ることが判明した。このような検量線を用い、未知試量
中のＡＦＰ濃度をめることができる。
実施例５
ＣＮＢｒ−活性化へマドシト（糖脂質）含有リポソーム
上へのヒ） −１ｆＱの１ｉｌｆＴ定化ａ）ＣＮＢｒ−
活性化へマドシトの調製５０ｍｙのへマドシト（ＧＭａ
）ｆｆｉりＩ：Ｉｏホルム／メタノール（２：１）３０
−に溶解し、５１ＮＮ ａ ＯＨを滴下して溶液のｐＨ
’ｉ１０．５に調節した。スターラーで攪拌しながら１
ｔのＣＮＢｒ（数−のメタノールに溶解したもの）を添
加し、即座に５ＮＮａＯＨを滴下してｐＨｔ−１０〜１
１の範囲に合せた。数分後、反応液を分液ロートに移し
、蒸留水５Ｈ１を添加して激しく振とうした０１０分後
１下層を分取して、ＣＮＢｒ−活性化へマドシトとした
。
上へのヒ） −１ｆＱの１ｉｌｆＴ定化ａ）ＣＮＢｒ−
活性化へマドシトの調製５０ｍｙのへマドシト（ＧＭａ
）ｆｆｉりＩ：Ｉｏホルム／メタノール（２：１）３０
−に溶解し、５１ＮＮ ａ ＯＨを滴下して溶液のｐＨ
’ｉ１０．５に調節した。スターラーで攪拌しながら１
ｔのＣＮＢｒ（数−のメタノールに溶解したもの）を添
加し、即座に５ＮＮａＯＨを滴下してｐＨｔ−１０〜１
１の範囲に合せた。数分後、反応液を分液ロートに移し
、蒸留水５Ｈ１を添加して激しく振とうした０１０分後
１下層を分取して、ＣＮＢｒ−活性化へマドシトとした
。
ｂ）リポソーム上へのヒト−ＩＩＧの固定化実施例１と
同様にしてリポソームを調製し、この懸濁液中にＦｉｌ
ｖのヒ） −Ｉ＃Ｇを加え、室温で３時間反応させた。
同様にしてリポソームを調製し、この懸濁液中にＦｉｌ
ｖのヒ） −Ｉ＃Ｇを加え、室温で３時間反応させた。
ＧＶＢで洗浄後、再び２１Ｒ１のＧＶＢに懸濁し、Ｎｔ
封入後冷蔵庫に保存した。
封入後冷蔵庫に保存した。
Ｃ）抗ヒ）−Ｉ＃Ｇ抗体（ウサギ）の定量実施例１と全
く同様の操作で抗体を定量した結果、１０−ａ〜１０″
″１０ ｇ ／、ｊの範囲で抗体の定量が行えることが
明らかになった。
く同様の操作で抗体を定量した結果、１０−ａ〜１０″
″１０ ｇ ／、ｊの範囲で抗体の定量が行えることが
明らかになった。
第１図は、ｌｌ１Ｇ感作リポソームを用−て抗ＩＩＩＧ
抗体の測定を行った場合における、抗ＩＩＧ抗体の希釈
倍率と相対螢光強度との相関図、第２図は、ＩＩＩＧ感
作りＩソームを用−て血清中のＩＩＧの測定を行った場
合における、血清希釈倍率と相対螢光強度との相関図で
ある◎
抗体の測定を行った場合における、抗ＩＩＧ抗体の希釈
倍率と相対螢光強度との相関図、第２図は、ＩＩＩＧ感
作りＩソームを用−て血清中のＩＩＧの測定を行った場
合における、血清希釈倍率と相対螢光強度との相関図で
ある◎
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）リポソーム；架橋法もしくは活性脂質法によって
該リポソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；
及び、該すｙｊ？ソーム内に封入された親水性の標識物
質からなることを特徴とする免疫分析用試薬。 （２）架橋法において使用される架橋剤がＳ ＰＤＰ
。 ＳＭＰＨ、ＳＭＰ人、 ５ＭＰＰ 、 ＧＭＢＳ又はＥ
ＭＣＳである特許請求の範囲第１項記載の免疫分析用試
薬０（３） 活性脂質法において使用される脂質の活性
化剤が、ＣＮＢｒ、ブロモアセチルヒドロオキシスクシ
ンイミド又はシアヌリツククロリドである特許請求の範
囲第１項記載の免疫分析用試薬。 （４）標識物質が、螢光性化合物、発光性化合物・吸光
性化合物、糖類、イオン性化合物、補酵囲第１項記載の
免疫分析用試薬。 （５）リポソーム；架橋法もしくは活性脂質法によって
該リポソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；
及び、該リポソーム内に封入された標識物質からなる免
疫分析用試薬を、抗原又は抗体を含む試料及び補体と混
合し、次いで、リポソーム内から溶出した標識物質を定
量することにより、試料中の抗原又は抗体を定量するこ
とを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58224509A JPH06100601B2 (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
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| US07/157,772 US5108934A (en) | 1983-11-30 | 1988-02-19 | Quantitative immunoassay utilizing liposomes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58224509A JPH06100601B2 (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
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| JPH06100601B2 JPH06100601B2 (ja) | 1994-12-12 |
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ID=16814910
Family Applications (1)
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1984
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0144084A2 (en) | 1985-06-12 |
| JPH06100601B2 (ja) | 1994-12-12 |
| EP0144084A3 (en) | 1988-07-27 |
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