JPH01311277A - 免疫分析試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を特異的
に定量分析するための免疫分析試薬及びその製造方法の
改良に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッッセイ（以下、ＲＩＡと記す）
か用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いる
ため、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが
操作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等にも
注意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動か
知られている。しかし、免疫電気泳動では測定に長時間
を要するうえ、感度が低く被検物質がごく微量しか含ま
れていない場合には適用することができないという問題
がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭１３０−１１７１５９
号において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、
内部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬を開
示した。この試薬を用いた免疫分析方法は以下のような
ものである。すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中
に上記リポソーム試薬を加え、これと別に補体を加える
と、抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の作用によって
リポソームが破壊され、封入されていた標識物質（例え
ば蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の
量と、試料中の被検物質の量との間には相関関係がある
ので、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光
分析）によって定量することにより、被検物質を定量す
ることができる。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような
問題が生じることはなく、免疫分析の簡便化が期待でき
る。

しかし、このリポソーム試薬を用いて血清やタンパク質
含有試料の分析を行う場合、抗原−抗体反応以外の非特
異反応か起り、これに起因してリポソームが破壊される
ため、精密なＡＰＩ定かできないことがわかってきた。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは上記リポソームの非特異反応について鋭意
研究を重ねた結果、リポソーム上の抗体結合用の官能基
が試料中の成分と反応しリポソームの破壊が起ることが
明らかとなった。

すなわち、リポソームに抗体を固定化する反応において
は、リポソームの抗体結合用官能基の全てに抗体が結合
するわけではないため、リポソーム上に抗体と結合して
いない官能基か残存する。

こうした官能基が残存した部位において抗原−抗体反応
以外の反応が起り、リポソームの膜が破壊されるため、
被検物質の濃度とは無関係にリポソームに封入された標
識物質が流出し、定量が困難となる。

本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行える免疫分析試薬及びその
製造方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の免疫分析試薬は、リン脂質及び糖脂゛質のうち
少なくともいずれか一方、並びにリン脂質、糖脂質又は
脂肪酸を組成とするリポソームに、抗原又は抗体もしく
は抗体の一部を固定化し、標識物質を封入した免疫分析
試薬において、上記抗原又は抗体もしくは抗体の一部が
固定化されたリポソーム上に残存するチオール基をアル
キル化したことを特徴とするものである。

また、本発明の免疫分析試薬の製造方法は、リン脂質及
び糖脂質のうち少なくともいずれが一方に、チオール基
を有するリン脂質、糖脂質又は脂肪酸を混入し、標識物
質を添加して、標識物質が封入されたリポソームを調製
する工程と、上記リポソームに抗原又は抗体もしくは抗
体の一部を反応させて固定化する工程と、上記抗原又は
抗体もしくは抗体の一部が固定化されたリポソームに残
存するチオール基にハロゲン化アルキル基含有化合物を
反応させる工程とを具備したことを特徴とするものであ
る。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームの主要構成
成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともい
ずれか一方が用いられる。本発明で用いられるリン脂質
及び糖脂質としては分子量が小さいものだけでなくどの
ようなものであってもよく、特に限定されない。例えば
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰ
Ｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（
ＤＯＰＥ）　、シミリストイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＭＰＥ）　、ジステアロイルホスファチジ
ルエタノールアミン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｅ）等が挙げられる
。これらリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子
数が１２〜１８であることが好ましく、更に偶数である
ことがより好ましい。なお、必要に応じてリン脂質、糖
脂質に対してコレステロールを１０〜５００モル％の割
合で加えてもよく、これによって安定な脂質２重層膜を
調製することができる。

本発明の免疫分析試薬においては、リポソームの構成成
分として、固定化用官能基としてチオール基を有するリ
ン脂質、糖脂質又は脂肪酸が用いられる。通常、リン脂
質、糖脂質又は脂肪酸には、試薬との反応によりチオー
ル基か導入される。ここで用いられる試薬としては、例
えばチオールカルボン酸としてβ−メルカプトプロピオ
ン酸、チオラフ酸、チオ酢酸、その他チオール基を有す
る芳香族カルボン酸が挙げられる。また、二官能性試薬
として代表的な〜ザクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を還元したもの
も［り用できる。なお、活性な官能基としては、実質上
チオール基だけを含めばよいが、アミノ基が同程度含ま
れていてもよい。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム内に封入さ
れる標識物質としては、親水性でリポソーム外に流出し
た際に定量可能な物質が選択される。このような物質と
しては、例えば高濃度では自己消光により蛍光を示さな
いが、低濃度（１０−３〜１以下）で非常に強い蛍光を
発するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質；
リポソーム外で酸化反応により発光するルミノールやル
シフェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に特
異的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；
酸化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化水
素生成をもたらすグリコース、シュークロース等の糖類
；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイ
オン性化合物；ニコチンアミドアデニンヌクレチド（Ｎ
ＡＤ）のような補酵索類；メチルビオロゲンなどのラジ
カル化合物等が挙げられる。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮したう
えで適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム上に固定化
される抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡＳ　ＩｇＭ等いかなるタンパク質
であってもよい。感度の向上という点からは、モノクロ
ーナル抗体であることが好ましい。また、抗体の一部を
分離して得たＦ　（ａｂ’）２抗体でもよい。ただし、
これら抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、活性な官能
基としてチオール基、アミノ基、カルボキシル基、イン
ドール基、イミダゾール基、フェノール性水酸基、グア
ニジル基及び水酸基の群より選ばれる少なくとも１つの
基だけを含むものが望ましい。また、例えば抗原又は抗
体もしくは抗体の一部に存在するチオール基に二官能性
ハロゲン化アルキルｕ含有化合物を反応させてハロゲン
化アルキル基を導入してもよい。官能基として上記以外
のジチオピリジル基、スクシンイミジル基、マレイミド
基などを３何する場合、非特異反応が生起して精密な測
定を行うことができなくなるおそれがある。これらの抗
原又は抗体もしくは抗体の一部は、チオール基を有する
リポソームとの反応により固定化される。

本発明の免疫分析試薬は、上記抗原又は抗体もしくは抗
体の一部が固定化されたリポソーム上に残存するチオー
ル基を、後述するハロゲン化アルキル基含Ｇ化合物によ
りアルキル化した構造を合する。

以下、本発明の免疫分析試薬の製造方法をより詳細に説
明する。

まず、所望のリン脂質、糖脂質又は脂肪酸とチオールカ
ルボン酸等の試薬とを溶媒中で反応させることにより、
リン脂質分子等にチオール基を導入する。このチオール
基がリポソーム上における抗原又は抗体もしくは抗体の
一部を固定化するための官能基として作用する。次に、
得られたチオール基を有するリン脂質、糖脂質又は脂肪
酸と、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
方（更に必要であればコレステロール）の適当量をフラ
スコに入れ、溶媒を加えて溶解・混合させた後、溶媒を
吸引除去して乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂質
薄膜が形成される。つづいて、フラスコ内に標識物質を
含有する水溶液を加え、密栓して浸とつすることにより
、リポソームの懸濁液を調製する。

次いで、上記リポソーム懸濁液と抗原又は抗体もしくは
抗体の一部とを適当な緩衝液中で反応させて、リポソー
ムに抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化させる。

更に、リポソームに抗原又は抗体もしくは抗体の一部を
固定化させた後、リポソーム上に残存しているチオール
基にハロゲン化アルキル基含ａ化合物を反応させてアル
キル化させる。上記ハロゲン化アルキル基含有化合物と
しては、例えばモノヨード酢酸、モノヨード酢酸アミド
、モノブロモ酢酸、モノブロモ酢酸アミド、ａ−ヨード
プロピオン酸、β−ヨードプロピオン酸、β−ブロモエ
チルアミン、モノクロロ酢酸、クロロアセトフェノン等
が挙げられる。

以上のような本発明の免疫分析試薬は、以下のようにし
て使用される。すなわち、まず被検物質を含有する試料
に本発明の免疫分析試薬を加え、これと別に補体を加え
る。なお、この際被検物質に対する第２抗体を加え、被
検物質を挟みこむ方法を用いてもよい。この結果、被検
物質とリポソーム上に固定化された抗原又は抗体もしく
は抗体の一部との抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の
作用により、リポソームが破壊されて封入されている標
識物質（例えば蛍光性化合物）が流出する。

この流出した標識物質の量と、被検物質の量との間には
相関関係があるので、流出した標識物質を適当な分析方
法（例えば蛍光分析）によって定量することにより、被
検物質を定量することができる。

（作用） 本発明にかかる免疫分析試薬では、測定に際して、抗原
又は抗体もしくはその一部が固定化されたリポソーム上
に残存するチオール基がアルキル化（−８Ｃ−Ｒ，ただ
しＲはアルキル基含何化合物）されているので、非特異
反応が起ることはなく、感度低下を招くことなしに、安
定かつ精密な免疫分析が可能となる。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

■チオール基の導入による官能性リン脂質の合成りＰＰ
Ｅ１００μモル、β−メルカプトプロピオン酸１５０μ
モル、ジシクロへキシルカルボジイミド　１１０μモル
及びＮ−ヒドロキシザクシンイミド１１０μ チルアミン５０ｍ１を添加した後、室温で一晩攪拌・反
応させた。反応後、溶媒を除去し、酢酸エチル３０ｍ１
を加え、生じた白色沈殿をろ過して除いた。

再び溶媒を除去し、次いで１Ｍクエン酸酸性下でクロロ
ホルム／メタノール／水−７０／　３０／　１０の混合
溶媒を用い、脂質成分のみを抽出した。無水硫酸ナトリ
ウムで脱水後、所定濃度のクロロホルム溶液を調製した
。収率は約６０％であった。この反応によりＤＰＰＥに
導入されたチオール基が固定化用の活性な官能基となる
。

■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（１／２）混合溶媒に溶解した。

４０ｍＭのＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ　　２００μｍ　、　４０ｍ
　Ｍのコレステロール２００μｍ　、　２０ｍ　Ｍのチ
オール基導入ＤＰＰＥ（■で得られた官能性リン脂質）
２００μｌを２５ｍ１容量のナシ型フラスコに入れ、更
にクロロホルム４　ｍｌを加えてよく混合した。次に、
約４０℃の水浴中でロータリーエバポレータにより溶媒
を除去した。この操作でフラスコ壁面に脂質薄膜が形成
された。つづいて、フラスコをデシケータ中に移して真
空ポンプで約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．１Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマンコダック社製、ｐｌ（７．４：Ｊｕ下、ＣＦと記
す）３００μｌを添加し、フラスコ内壁の脂質薄膜にま
んべんなく付着させた後、密栓して約６０℃の水浴中に
約１分間浸漬した。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサー
を用い、フラスコ内壁の脂質薄膜が完全に消失するまで
、フラスコを激しく振とうした。この操作により多重層
膜のリポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソーム
懸濁液に、０、０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（　０．８５
％ＮａＣ１含有、ｐＨ７．４５：以下、ＨＢＳと記す）
を少量添加した後、全て遠心チューブに移し、４℃にお
いて１５０００　ｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回
繰り返した。最後に、リポソームをＨＢＳ２ｍｌに懸濁
させた。

■抗ヒトＡＦＰ抗体のＦ　（ａｂ’）２フラグメントの
調製 １０ｎｇ／ｍ＋の抗ヒトＡＦＰ抗体１　ｍｌを０．１Ｍ
の酢酸緩衝液（ｐＨ３，５：以下、ＡＢＳと記す）を用
いて限外ろ過膜カラム（アミコン社製セントリコン３０
）で溶媒置換濃縮し、ペプシン０．３ｍｇを混入し、３
７℃のインキュベータ中で１時間にわたって攪拌した。

この操作により、抗体はＦ　（ａｂ’＞２７ラグメント
に分解された。これを全Ｑ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−ｇｃｉＧ　
３０００Ｓ　Ｗ　Ｘ　２のゲルろ過カラム（東洋四速）
中に投入し、リン酸緩衝液（１）Ｈ７，１：０．Ｉ　Ｍ
。

０．０５％ＮａＮ、　含有：以下、ＰＢＳと記す）約１
ｍｌ　／分で溶離してＦ　（ａｂ’）２分画のみを回収
した。

次いで、限外ろ過膜カラムを用いてＦ　（ａｂ’）２分
画をＰＢＳ　（ｐＨ７，０：　ＮａＣｌを添加して浸透
圧２７７ｍ０５ｍに設定）で溶媒置換し、０．５ｍｌに
濃縮した。

■抗ヒトＡＦＰ抗体固定化免疫分析試薬の調製■で得ら
れたリポソーム懸濁液５００μｌにＰＢＳ　（ｐＨ７，
２７７ｍＯｓｍ）　１．５　ｍｌを添加し、４℃におい
て１５０００　ｒｐＩＩｌで１０分間遠心してリポソー
ム沈査を得た。これに■て得られた抗ヒトＡＦＰ抗体の
Ｆ　（ａｂ’）２フラグメント濃縮液０．５ｍｌを混合
し、密栓して２０℃でゆっくり振とうしながら３日間反
応させた。次に、これを４℃において１５０００　ｒｌ
）ＩＩで１０分間遠心してリポソーム沈査を得た後、Ｈ
Ｂ　Ｓ　２　ｍｌで３回、同様の遠心洗浄を行った。最
後にリポソーム沈査をＨＢ　Ｓ　１　ｍｌに分散させ、
４℃で保存した。

■残存チオール基のアルキル化 ■で得られたリポソーム懸濁液１ｍｌを４℃において１
５０００　ｒｐｍで１０分間遠心してリポソーム沈査を
得た。これとは別に、ヨードアセトアミドのホウ酸緩衝
ｉ＆　（ｐ　Ｈ９：　　０．２Ｍ）約２　ＩＩｇ　／　
ｍｌを調製し、この溶液１　ｍｌで上記リポソーム懸濁
液沈査を懸濁させ、密栓して２０℃でゆっくり振とうし
ながら２０間反応させた。

次に、これを４℃において１５０００　ｒｐｌで１０分
間遠心してリポソーム沈査を得た後、ＨＢＳ２ｍｌで３
回、同様の遠心洗浄を行った。最後に、リポソーム沈査
を１　ｍｌのＧＶＢ−に分散させ、４℃で保存した。

以上のようにして本発明に係る免疫分析試薬が製造され
た。

以上の方法で製造された免疫分析試薬を用い、以下のよ
うにしてヒトＡ　Ｆ　Ｐ　ｉＱ度のΔＩＩＩ定を行った
。

（ａ）抗ヒトＡＦＰ固定化リポソーム試薬によるヒトＡ
ＦＰ濃度の検量線作成 ｔ１＃のウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を用いたサンドイッチ
アッセイにより以下のようにしてヒトＡＦＰ濃度を定量
し、検量線を作成した。

０．０１−１１０００ｎ／　ｍｌの範囲で濃度を変化さ
せたヒ）ＡＦＰ溶液２５μｍ１：、予めＧＶＢ＋で３０
倍に希釈した免疫分析試薬５μｌを添加し、３７℃にお
いて１０分間反応させた。次に、予めＧＶＢ＋で２００
倍に希釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体（ｄａｋｏ社製）
２５μｌを添加し、３７℃において５分間反応させた。

つづいて、補体（５ＣＨｓｏ）　２５μ＋を添加し、３
７℃において３０分間反応させた。次いで、０．０１Ｍ
のＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００ｕｌで反応を停止
させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液について、流出したＣＦ
ｍを蛍光分光器でａｌｌ定した。

このようにしてヒトＡＦＰ濃反と相対蛍光強度との関係
を示す検量線を得た。

（ｂ）ヒトＡＦＰ濃度の実測 （ａ）でｒめ得られた検量線を用いて、患者血清１０試
料についてヒトＡ　Ｆ　Ｐ　濃度を実１ｌｐＩＬだ。こ
の結果を第１表に示す。なお、第１表中、参照例はＲＩ
ＡによるＪＦＩ定値である。また、比較例はリポソーム
の残存チオール基をアルキル化処理しなかった免疫分析
試薬を用いて分析したＡ１１定値である。

第１表から、実施例の免疫分析試薬では、ＲＩＡと同様
に、非特異溶解なしに患者血清中のＡ　Ｆ　Ｐ　；６度
を高感度で４Ｐ１定できることがわかる。

第　　　　１　　　　表 ［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析試薬によれば、精
密かつ簡便な分析を行うことができる。

出願人代理人　弁理士　鈴江武彦

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方、並びにリン脂質、糖脂質又は脂肪酸を組成とするリ
   ポソームに、抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化
   し、標識物質を封入した免疫分析試薬において、上記抗
   原又は抗体もしくは抗体の一部が固定化されたリポソー
   ム上に残存するチオール基をアルキル化したことを特徴
   とする免疫分析試薬。（２）リン脂質及び糖脂質のうち
   少なくともいずれか一方に、チオール基を有するリン脂
   質、糖脂質又は脂肪酸を混入し、標識物質を添加して、
   標識物質が封入されたリポソームを調製する工程と、上
   記リポソームに抗原又は抗体もしくは抗体の一部を反応
   させて固定化する工程と、上記抗原又は抗体もしくは抗
   体の一部が固定化されたリポソーム上に残存するチオー
   ル基にハロゲン化アルキル基含有化合物を反応させる工
   程とを具備したことを特徴とする免疫分析試薬の製造方
   法。