JPH01311276A - 免疫分析試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を特異的
に定量分析するための免疫分析試薬及びその製造方法の
改良に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッッセイ（以下、ＲＩＡと記す）
が用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いる
ため、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが
操作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等にも
注意を要するきいう問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫ｔ気泳動が
知られている。しかし、免疫電気泳動では測定に長時間
を要するうえ、感度が低く被検物質がごく微量しか含ま
れていない場合には適用することができないという問題
がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬を開示
した。この試薬を用いた免疫分析方法は以下のようなも
のである。すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に
上記リポソーム試薬を加え、これと別に補体を加えると
、抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の作用によってリ
ポソームが破壊され、封入されていた標識物質（例えば
蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の量
と、試料中の被検物質の量との間には相関関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分
析）によって定量することにより、被検物質を定量する
ことができる。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような問
題が生じることはなく、免疫分析の簡便化が期待できる
。

しかし、このリポソーム試薬を長期間保存した後、試料
の分析を行う場合、初期に比べて検出感度が低下し、精
密な？１１）定ができないことがわかってきた。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは上述したリポソーム試薬の感度低下につい
て鋭意研究を重ねた結果、従来のリポソーム試薬におい
てリポソームと抗体の結合に用いているジスルフィド結
合部分が、合成の際に用いていた還元剤の残留分により
還元されて、抗体が脱離することに起因していることを
究明した。

すなわち、リポソーム上に一旦固定化されたはずの抗体
が脱離して少なくなることと、脱離した抗体が試料溶液
中に遊離し、試料との反応に際してリポソーム上の抗体
よりも先に遊離抗体が被検物質と反応してしまうという
２つの原因により、大量の被検物質が存在しない場合に
は、リポソームが破壊されなくなって感度が低下する。

本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行える免疫分析試薬及びその
製造方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の免疫分析試薬は、リン脂質及び糖脂質のうち少
なくともいずれか一方、並びにリン脂質、糖脂質又は脂
肪酸を組成とするリポソームに、抗原又は抗体もしくは
抗体の一部を固定化し、標識物質を封入した免疫分析試
薬において、上記リポソームを構成するリン脂質、糖脂
質又は脂肪酸に、抗原又は抗体もしくは抗体の一部を、
−ＳＣ−Ｒ−Ｃ５−結合（ただし、Ｒはアルキル基含有
化合物）を介して固定化したことを特徴とするものであ
る。

また、本発明の免疫分析試薬の製造方法は、リン脂質及
び糖脂質のうち少なくともいずれか一方に、チオール基
を有するリン脂質、糖脂質又は脂肪酸を混入し、標識物
質を添加して、標識物質が封入されたリポソームを、凋
製する工程と、チオール基をＨする抗原又は抗体もしく
は抗体の一部に、二官能性ハロゲン化アルキル基含有化
合物を反応させて抗原又は抗体もしくは抗体の一部に／
％ロゲン化アルキル基を導入する工程と、上記リポソー
ムと上記ハロゲン化アルキル基が導入された抗原又は抗
体もしくは抗体の一部とを反応させる工程とを具備した
ことを特徴とするものである。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームの主要構成
成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともい
ずれか一方が用いられる。本発明で用いられるリン脂質
及び糖脂質としては分子量が小さいものｔζけてなくど
のようなものであってもよく、特に限定されない。例え
ばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰ
ＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
（ＤＯＰＥ）　、シミリストイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＭＰＥ）　、ジステアロイルホスファチ
ジルエタノールアミン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｅ）等が挙げられ
る。これらリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原
子数が１２〜１８であることが好ましく、更に偶数であ
ることがより好ましい。なお、必要に応じてリン脂質、
糖脂質に対してコレステロールを１０〜５００モル％の
割合で加えてもよく、これによって安定な脂質２重層膜
を調製することができる。

本発明の免疫分析試薬においては、リポソームの構成成
分として、固定化用官能基としてチオール基を有するリ
ン脂質、糖脂質又は脂肪酸が用いられる。通常、リン脂
質、糖脂質又は脂肪酸には、試薬との反応によりチオー
ル基が導入される。ここで用いられる試薬としては、例
えばチオールカルボン酸としてβ−メルカプトプロピオ
ン酸、チオラフ酸、チオ酢酸、その他チオール基を有す
る芳香族カルボン酸が挙げられる。また、二官能性試薬
として代表的なＮ−サクシンイミジルー３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を還元したも
のも利用できる。なお、活性な官能基としては、実質上
チオール基だけを含めばよいが、アミノ基が同程度含ま
れていてもよい。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム内に封入さ
れる標識物質としては、親水性でリポソーム外に流出し
た際に定量可能な物質が選択される。このような物質と
しては、例えば高濃度では自己消光により蛍光を示さな
いが、低濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発
するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質：リ
ポソーム外で酸化反応により発光するルミノールやルシ
フェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に特異
的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸
化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化水素
生成をもたらすグリコース、シュークロース等の糖類；
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物；ニコチンアミドアデニンヌクレチド（ＮＡ
Ｄ）のような補酵素類−メチルビオロゲンなどのラジカ
ル化合物等が挙げられる。これらの化合物は、検出方法
、感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮したうえ
で適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム上に固定化
される抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等いかなるタンパク質で
あってもよい。感度の向上という点からは、モノクロー
ナル抗体であることが好ましい。また、抗体の一部を分
離して得たＦ　（ａｂ’）２抗体でもよい。ただし、こ
れら抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、活性な官能基
としてチオール基のほかにアミノ基、カルボキシル基、
インドール基、イミダゾール基、フェノール性水酸基、
グアニジル基及び水酸基の群より選ばれる少なくとも１
つの基だけを含むものが望ましい。

官能基として上記以外のジチオピリジル基、スクシンイ
ミジル基、マレイミド基などを含有する場合、非特異反
応が生起して精密な測定を行うことができなくなるおそ
れがある。これらの抗原又は抗体もしくは抗体の一部に
は、二官能性ハロゲン化アルキル基含有化合物との反応
により、ハロゲン化アルキル基が導入される。上記二官
能性ハロゲン化アルキル基含有化合物としては、１，３
−ジブロモアセトン、１，４−ジブロモ−２，３−ブタ
ンジオン、その他ジハロゲン化アセチル化合物が挙げら
れる。

本発明の免疫分析試薬は、上記リポソームを構成するリ
ン脂質、糖脂質又は脂肪酸に、抗原又は抗体もしくは抗
体の一部を、−５Ｃ−Ｒ−ＣＳ−結合（ただし、Ｒはア
ルキル基含有化合物）を介して固定化した構造を有する
。

以下、本発明の免疫分析試薬の製造方法をより詳細に説
明する。

まず、所望のリン脂質、糖脂質又は脂肪酸とチオールカ
ルボン酸等の試薬とを溶媒中で反応させることにより、
リン脂質分子等にチオール基を導入する。このチオール
基がリポソーム上における抗原又は抗体もしくは抗体の
一部を固定化するための官能基として作用する。次に、
得られたチオール基を有するリン脂質、糖脂質又は脂肪
酸と、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
方（更に必要であればコレステロール）の適当量をフラ
スコに入れ、溶媒を加えて溶解・混合させた後、溶媒を
吸引除去して乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂質
薄膜が構成される。つづいて、フラスコ内に標識物質を
含有する水溶液を加え、密栓して浸とうすることにより
、リポソームの懸濁液を１調製する。

一方、抗原又は抗体もしくは抗体の一部と上述した二官
能性ハロゲン化アルキル基含有化合物とを反応させて、
抗原又は抗体もしくは抗体の一部にハロゲン化アルキル
基を導入する。

次いで、上記リポソーム懸濁液と上記ハロゲン化アルキ
ル基が導入された抗原又は抗体もしくは抗体の一部とを
適当なａｔ液液中反応させて、リポソームに一３Ｃ−Ｒ
−Ｃ３−結合（ただし、Ｒはアルキル基金ａ化合物）を
介して抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化させる
。なお、リポソームに抗原又は抗体もしくは抗体の一部
を固定化させた後、リポソームに残存しているチオール
基にハロゲン化アルキル基含ａ化合物を反応させてアル
キル化させてもよい。このような反応を起させれば、非
特異反応をより効果的に防止することができる。

以上のような本発明の免疫分析試薬は、以下のようにし
て使用される。すなわち、まず被検物質を含有する試料
に本発明の免疫分析試薬を加え、これと別に補体を加え
る。なお、この際被検物質に対する第２抗体を加え、被
検物質を挟みこむ方法を用いてもよい。この結果、被検
物質とリポソーム上に固定化された抗原又は抗体もしく
は抗体の一部との抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の
作用により、リポソームが破壊されて封入されている標
識物質（例えば蛍光性化合物）が流出する。

この流出した標識物質の量と、被検物質の量との間には
相関関係があるので、流出した標識物質を適当な分析方
法（例えば蛍光分析）によって定量することにより、被
検物質を定量することができる。

（作用） 本発明にかかる免疫分析試薬では、測定に際して、リポ
ソームに一３Ｃ−Ｒ−Ｃ３−結合を介して固定化された
抗原又は抗体もしくはその一部が脱離することがなく、
感度低下を招くことなしに、安定かつ精密な免疫分析が
可能となる。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

■チオール基の導入による官能性リン脂質の合成りＰＰ
Ｅ１００μモル、β−メルカプトプロピオン酸１５０μ
モル、ジシクロへキシルカルボジイミド　１１０μモル
及びＮ−ヒドロキシザクシンイミド１１０μ チルアミン５０ｍ１を添加した後、室温で一晩攪拌・反
応させた。反応後、溶媒を除去し、酢酸エチル３０ｍ１
を加え、生じた白色沈殿をろ過して除いた。

再び溶媒を除去し、次いで１Ｍクエン酸酸性下でクロロ
ホルム／メタノール／水−７０／　３０／　１０の混自
溶媒を用い、脂質成分のみを抽出した。無水硫酸ナトリ
ウムで脱水後、所定濃度のクロロホルム溶液を調製した
。収率は６ｏ９６であった。この反応によりＤＰＰＥに
導入されたチオール基が固定化用の活性な官能基となる
。

■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（１／２）Ｕ全溶媒に溶解した。

４０ｍ　ＭのＤＰＰＣ　　２００μｌ，　４０ｍＭのコ
レステロール２００μｍ　、　２０ｍ　Ｍのチオール基
導入ＤＰＰＥ（■で得られた官能性リン脂質）２００μ
ｌを２５ｍ１容量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロ
ホルム４　ｍｌを加えてよく混合した。次に、約４０℃
の水浴中でロータリーエバポレータにより溶媒を除去し
た。この操作でフラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。

つづいて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプ
で約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．１　Ｍのカルボキシフルオレセイン（イー
ストマンコダック社製、ｐＨ７．４：以下、ＣＦと記す
）３００μｌを添加し、フラスコ内壁の脂質薄膜にまん
べんなく付着させた後、密栓して約６０℃の水浴中に約
１分間浸漬した。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサーを
用い、フラスコ内壁の脂質薄膜が完全に消失するまで、
フラスコを激しく振とうした。この操作により多重層膜
のリポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソーム懸
濁液に、０、０１ＭのＨＥＰＥＳｍ衝液（　０．８５９
６　Ｎ　ａ　Ｃ　ｌ含有、ｐＨ７，４５：以下、ＨＢＳ
と記す）を少量添加した後、全て遠心チューブに移し、
４℃において１５０００　ｒｐｍで２０分間遠心する操
作を数回繰り返した。最後に、リポソームをＨＢＳ２ｍ
ｌに懸濁させた。

■抗ヒトＡＦＰ抗体のＦａｂ’フラグメントの調製１１
０ｌｌ１／ｍｌの抗ヒトＡＦＰ抗体１　ｍｌを０．１Ｍ
の酢酸緩衝液（ｐＨ３，５：以下、ＡＢＳと記す）を用
いて限外ろ過膜カラム（アミコン社製セントリコン３０
）で溶媒置換ａ縮し、ペプシン０．３＋ｎｇを混入し、
３７℃のインキュベータ中で１時間にわたって攪拌した
。この操作により、抗体はＦ　（ａｂ’）２フラグメン
トに分解された。これを全ｆｍＴＳＫ−ｇｅｌ−Ｇ　３
０００Ｓ　Ｗ　Ｘ　２　（７）ゲル７）　過７’７−ｙ
　ム（東洋’ＪＭ　達）中に投入し、リン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，１：　０．１　Ｍ。

０．０５％ＮａＮ、含育：以下、ＰＢＳと記す）約１ｍ
ｌ／分で溶離してＦ　（ａｂ’）２分画のみを回収した
。

次いで、限外ろ過膜カラムを用いてＦ　（ａｂ’）２分
画をＰＢＳ　（ｐＨ６，０，１Ｍ）約１ｍｌに濃縮した
。次に、これにジチオスライドール１０ｍｇを加え、３
７℃で１時間インキュベートした。その後、この反応混
合物をミニチュアディスポーザブルゲルろ過カラムＰ　
Ｄ　−１０・５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−２５Ｍ　（ファル
マシア社製ニホウ酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡にしておく
）に負荷し、ｐＨ８のホウ酸緩衝液で１　ｍｌずつ展開
した。この４〜５　ｍｌ目のフラクション１　ｍｌを回
収し保存した。

■ブロムアセチル基導入・抗ヒトＡＦＰ抗体・Ｆａｂ’
フラグメントの調製 ■で得られた抗ヒトＡＦＰ抗体のＦａｂ’フラグメント
のホウ酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに１．３−ジブロモア
セトン２　ｍｇを加え、密栓して２０℃でゆっくり振と
うしながら２日間反応させた。

つづいて、この反応混合物をミニチュアディスポーザブ
ルゲルろ過カラムＰ　Ｄ　−１０１０−８ｃｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡にしておく）
に負荷し、ｐＨ８のホウ酸緩衝液で１　ｍｌずつ展開し
た。この４〜５　ｍｌ目のフラクション１　ｍｌを回収
し保存した。

■抗ヒＩ−ＡＦＰ抗体固定化免疫分析試薬の調製■で得
られたリポソーム懸濁液５００μｌ　１．：　Ｐ　ＢＳ
　（ｐＨ７，２７７ｍｏｓｍ）　　１．５ｍｌを添加し
、４℃において１５０００　ｒｐｍで１０分間遠心して
リポソーム沈査を得た。これに■で得られたブロムアセ
チル基導入抗ヒトＡＦＰ抗体Ｆａｂ’　フラグメント液
１　ｍｌを混合し、密栓して２０℃でゆっくり振とうし
ながら２日間反応させた。次に、これを４℃において１
５０００　ｒｐｍて１０分間遠心してリポソーム沈査を
得た後、２　ｍｌのＨＢＳで３回、同Ｆｌの遠心洗浄を
行った。最後にリポソーム沈査を１　ｍｌのＨＢＳで分
散させ、４℃で保存した。

以上のようにして本発明に係る免疫分析試薬が製造され
た。

以上の方法で製造された免疫分析試薬を用い、以下のよ
うにしてヒトＡ　Ｆ　Ｐ　ｉ震度のＡｐｌ定を行った。

（ａ）抗ヒトＡＦＰ固定化リポソーム試薬によるヒトＡ
　Ｆ　Ｐ　（ｆｉ度の検量線作成 ａＭのウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を用いたサンドイッチア
ッセイにより以下のようにしてヒトＡＦＰ　ｉＱ度を定
量し、検量線を作成した。

０．０１＝　ｌｏ００ｎｇ／　ｍｌの範囲で濃度を変化
させたヒ）ＡＦＰ溶液２５μｌに、予めＧＶＢ’で３０
倍に希釈した免疫分析試薬５μｌを添加し、３７℃にお
いて１０分間反応させた。次に、予めＧＶＢ＋で２００
倍に希釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体（ｄａｋｏ社製）
２５μｍを添加し、３７℃において５分間反応させた。

つづいて、補体（５ＣＨ，。）２５μｌを添加し、３７
℃において３０分間反応させた。次いで、０　、０１　
ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００μｍで反応を停
止させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液について、流出したＣ
Ｆｕを蛍光分光器で４Ｐ１定した。

このようにしてヒトＡＦＰ濃度と相えｌ蛍光強度との関
係を示す検量線を得た。

（ｂ）ヒトＡＦＰ濃度の実ＡＰｊ （ａ＞で予め得られたｔＡｆｆｆ線を用いて、患者血清
１０試料についてヒトＡＦＰ濃度を実測した。この結果
を第１表に示す。なお、第１表中、参照例はＲＩＡによ
るｄｐＪ定値である。また、比較例はリポソームと抗体
とをジスルフィド結合を介して結合した免疫分析試薬を
用いて分析した４ヤ１定値である。

第１表から、実施例の免疫分析試薬では、ＲＩＡと同様
に患者血清中のＡ　Ｆ　Ｐ　Ｊ度を高感度で測定できる
ことがわかる。

第　　　　１　　　　表 ［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析試薬によれば、精
密かつ簡便な分析を行うことかできる。

出願人代理人　弁理士　鈴江武彦

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方、並びにリン脂質、糖脂質又は脂肪酸を組成とするリ
   ポソームに、抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化
   し、標識物質を封入した免疫分析試薬において、上記リ
   ポソームを構成するリン脂質、糖脂質又は脂肪酸に、抗
   原又は抗体もしくは抗体の一部を、−ＳＣ−Ｒ−ＣＳ−
   結合（ただし、Ｒはアルキル基含有化合物）を介して固
   定化したことを特徴とする免疫分析試薬。
2. （２）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方に、チオール基を有するリン脂質、糖脂質又は脂肪酸
   を混入し、標識物質を添加して、標識物質が封入された
   リポソームを調製する工程と、チオール基を有する抗原
   又は抗体もしくは抗体の一部に、二官能性ハロゲン化ア
   ルキル基含有化合物を反応させて抗原又は抗体もしくは
   抗体の一部にハロゲン化、アルキル基を導入する工程と
   、上記リポソームと上記ハロゲン化アルキル基が導入さ
   れた抗原又は抗体もしくは抗体の一部とを反応させる工
   程とを具備したことを特徴とする免疫分析試薬の製造方
   法。