JPS63118658A - 免疫分析方法及び免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量分
析するための免疫分析方法及び免疫分析用試薬に関する
。

（従来の技術） 本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号公報記載
の発明において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化
し、内部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬
を開示した。この試薬を用いた免疫分析法は以下のよう
なものである。すなわち、抗原又は抗体が存在する試料
中に前記リポソーム試薬を加え、これと別に補体を加え
ると、抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の作用によっ
て、リポソームが破壊され、封入されていた標識物質（
例えば蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物
質の量と試料中の被検物質の量との間には相関関係があ
るので、流出したＪｆ！４諏物貿を所定の分析方法（例
えば蛍光分析）によって定量する事により被検物質を定
量することがで曇る。この試薬を用いれば、ＲＩＡのよ
うな問題が生じる事なく免疫分析の簡便化が期待できる
。

しかし、このリポソーム試薬を用いて血清やタンパク貿
含有試料の分析を行なう場合、抗原−抗体反応以外に非
特異反応が起り、これに起因してリポソームが破壊され
ることがわかってきた。これは、試料中のタンパク質や
微量化学物質と、リポソームとの反応によるものと考え
られる。このため、従来の血清や、タンパク質含有試料
を希釈して分析を行なっていた。

例えばリポソームに抗ヒトα−フェトプロティン抗体（
以下抗ヒトＡＦＰ抗体と記す）を固定化した試薬を用い
て、ヒト血清中のＡＦＰを分析する場合、非特異反応の
影響を除去するために、ヒト血清を１００倍希釈してい
た。ところが正常人の血清中にはＡＦＰが１０−”ｇ／
−以下しか含有されていない、したがって正常人の血清
を１００倍希釈すると、ＡＦＰ濃度１１０−１ａ／−以
下に対応する測定（例えば蛍光分析）となり精密な定量
が困難となるという問題があった。

（発明が解決しようとする問題点） 以上のようにリポソームを用いた免疫分析法では精密な
定量が困難であるという問題点があった。

本発明はこのような問題点に鑑みなされたもので看ｊ あり、規定感度が良好な免疫分析方法及び免疫分析用試
薬を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

（問題点を解決するための手段） まず第１の発明は、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一
方とコレステロールとからなるリポソーム上に、架橋法
により被検物質に対するモノクロナール抗体もしくはモ
ノクロナール抗体の一部が固定化され、さらに前記リポ
ソーム内部には親水性の標識物質が封入されている第１
のリポソーム免疫分析用試薬とリン脂質及び糖脂質の少
なくとも一方とコレステロールとからなるリポソーム上
に、架橋法により被検物質に対する第２のモノクロナー
ル抗体もしくはモノクロナール抗体の一部が固定化され
、さらに該リポソーム内部には親水性の標識物質が封入
されている第２のリポソーム免疫分析用試薬を、前記被
検物質を含有する試料に予め接触し反応させる第１の工
程と、その後に補体を作用させる第２の工程を具備する
ことを特徴とする免疫分析方法である。

第２の発明は （ａ）　リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレス
テロールとからなるリポソーム上に、架橋法により被検
物質に対するモノクロナール抗体もしくはモノクロナー
ル抗体の一部が固定化され、さらに前記リポソーム内部
には親水性の標識物質が封入されている第１のリポソー
ム免疫分析用試薬（ｂ）　リン脂質及び糖脂質の少なく
とも一方とコレステロールとからなるリポソーム」二に
、架橋法により被検物質に対する第２のモノクロナール
抗体もしくはモノクロナール抗体の一部が固定化され。

さらに該リポソーム内部には親水性のｆｆＡｍ物質が封
入されている第２のリポソーム免疫分析用試薬（ｃ）緩
衝液を含有したことを特徴とする免疫分析用試薬である
。

第１の発明及び第２の発明で用いられる第１及び第２の
リポソーム免疫分析用試薬のリポソームは、リン脂質及
び糖脂質のうち、少なくともいずれか一方を組成とする
ものである。

必要に応じて、リン脂質、糖脂質に対して・コレステロ
ールを１０〜５００モル％を加えてもよく、これによっ
て安定なリポソームを得ることができる。

またリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が
１２〜１８である事が好ましく、更に偶数であることが
より好ましい。

リポソーム内に封入されるｖＡｍ物質としては、親水性
でリポソーム外に流出した際に定量可能な物質が選択さ
れる。このような物質としては例えば、高濃度では自己
消光により蛍光を示さないが、低濃度（１０−”　Ｍ以
下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレセイ
ンのような蛍光性物質；リポソーム外で酸化反応により
発光するルミノールや、ルシフェソンのような発光性物
質；可視域又は紫外線に特異的な吸収帯を有する吸光性
化合物（水溶性色素等）：酸化酵素の作用により分解さ
れ、酸素消費又は過酸化水素生成をもたらすグリコース
、シュークロース等の糖類；テトラペンチルアンモニウ
ムのような比較的大きなイオン性化合物、ニコチンアミ
ドアゾシンヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補酵素類；
メタルビオロゲン等のラジカル化合物等が挙げられる。

これらの化合物は検出方法、感度及びリポソームの安定
性等の因子を考慮した上で適宜選択される。

リポソーム上に固定化される抗体もしくは抗体の一部又
は抗原はＩｇＧ、　ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等
いかなるタンパク質であってもよい。

リポソームに固定化用官能基を導入するために脂質分子
との反応が行なわれる架橋剤、また必要に応じた抗体も
しくは抗体の一部又は抗原に架橋基を導入するための架
橋剤としては例えばＮ−サクシンイミジル３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サク
シンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト（ＳＭＰＢ）　、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マ
レイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−サク
シンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）プロピオ
ネート（ＳＭＰＰ）　、Ｎ−（ｒ−マレイミドブチリル
オキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（Ｅ−マレ
イミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣ８）
、ジサクシンイミジルスペレート（ＤＳＳ）、グリタル
アルデヒド（ＯＡ）フタルアルデヒド、テレフタルアル
デヒド、フタル酸、テレフタル酸。

ＨＯＯＣ−（ＣＨ，）ｎ−〇〇０Ｈ（ｎ＝１〜１０）の
化学式で表わされる脂肪ジカルボン酸等が挙げられる。

例えば５ＰＤＰは次式 で示され、温和な条件下で反応するチオール化及び分子
間（架橋）共役体生成のためのへテロ−２官能試薬であ
る。

なお抗体もしくは抗体の一部又は抗原に架橋剤を反応さ
せて架橋基を導入した場合、上述した様に還元処理によ
り架橋基を修飾することが必要となる場合がある。

第１の発明及び第２の発明で用いられる第１及び第２の
リポソーム免疫分析用試薬は例えば以下のような方法に
より製造することができる。

まず所望の脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させる事によ
り、脂質分子に官能基を導入して官能性脂質とする。こ
の官能基がリポソーム上における抗体もしくは抗体の一
部又は抗原を固定化するための官能基として作用する１
次に得られた官能性脂質と必要であればコレステロール
及び他の脂質の適当量をフラスコに入れ溶媒を加えて溶
解・混合させた後溶媒を吸引除去して乾燥する。この結
果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。つづいてフ
ラスコ内に標識物質を含有する水溶液を加え、密栓して
振とつする事により、リポソームの懸濁液を調製する。

一方、リポソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部又は抗原には必要ならば架橋剤との反応により架橋基
を導入した後、必要に応じて還元剤で処理して修飾する
。

てリポソームに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定
化させる６以上のようにして本発明のリポソーム免疫分
析用試薬を製造する事ができる。

第２の発明の免疫分析用試薬で用いられる緩衝液は種々
の要因に鑑み適宜選択することができるが、一般的には
ＨＥＰＥＳＩ１１Ｗ液が好ましい。

本発明の免疫分析試薬と被検物質との充分な反応に要す
る時間は被検物質の種類、リポソームの特性１反応条件
、さらにはリポソームに固定化された抗体もしくは抗体
の一部又は抗原の種類、純度、固定化形態等によって異
なる、このため個々の場合に応じて予め、特定の濃度に
調製された被検物質と同種の物質を含む試料を用いて予
備測定を行う事により、免疫分析試薬と被検物質との最
適反応時間を設定する事が望ましい。

本発明の免疫分析試薬によって定量が可能な被検物質は
、腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＢＦＰ、ＣＥＰ、ＰＯＡ等）
免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ。

ＩｇＡ、ＩｇＭ等）、ホルモン（インシュリン、Ｔ３等
）、そ 及び薬物等が挙げられ、Ｘの対象は広範囲にわたる。

（作　　用） まず第１の発明では被検物質を含有する試料に本発明の
免疫分析試薬を１種類加え、これと別に補体と、もう一
種類の免疫分析試薬を加える。この結果、被検物質とリ
ポソーム上に固定化された抗体もしくは抗体の一部又は
抗原との抗原−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用に
より、２つのリポソームが破壊されて、封入されている
標識物質が流出する。この流出した標識物質の量と試料
中の被検物質の量との間には相関関係があるので、流出
した標識物質を適当な分析方法（例えば蛍光分析）によ
って定量することにより、被検物質を定量することがで
きる。２つの試薬に含まれる標識物質が両方共流量する
ので高感度の測定を行なうことができる。

（実　施　例） ｉ）実施例１ 以下第１の発明の詳細な説明する６ 〈ヒトＡＦＰの測定〉 本実施例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアシン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（Ｄｐｐｃ）コレステロー
ル及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製のも
のを用いた。またＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びセファデ
ックスＧ−２５フアインはファルマシア社製のものを用
いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用した
。なお水は全てイオン交換水を用いた。

■　官能性リン脂質；ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロピ
オン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の調クロロホルム／
メタノール（５：　１）混合溶媒２５−に溶解した０次
にトリエタノールアミン、６０μａ及びＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐ
５０ｍｇを添加し、窒素置換した後。

室温で１時間反応させて、ジチオピリジルプロピオン酸
アミド（ＤＴＰ）を導入した。つづいてロータリエバポ
レータにより溶媒を除去した６次いで乾燥物をクロロホ
ルム／メタノール（１０：１）混合溶媒に溶解した後シ
リカゲルカラムを用いて精製しＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画
を回収した。更にロータリーエバポレータで約５１１Ｉ
ｌまで濃縮した。

ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０〜９５％であった。こ下 れを窒素封入モー２０℃で保存した。

この反応によりＤＰＰＥに導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■　リポソームの！！１４Ｉ！ 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５　ｍＭ（７）　Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ２００ｐ　１２．１０
＋＋＋Ｍ　：Ｉレステ０−／ｌ／１００ｕＱ及び１ｍＭ
のＤＰＰＥ−ＤＴＰ（■で得られた官性能すン脂［）５
０μａを１０−容量のナス型フラスコに入れ、更にクロ
ロホルム２Ｉ！ＩＱを加えてよく混合した６次に約４０
℃の水浴中でロータリーエバポレータにより溶媒を除去
した。再びクロロホルム２−を加えて十分にカクハンし
た後、再度ロータリーエバポレータにより溶媒を除去し
た。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄
膜が形成された。つづいてフラスコをデシケータ中に移
して真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去し
た。

次いで、０．２Ｍのカルボキシルフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社製、Ｐ　Ｈ７，４；以下ＣＦと記
す）１００μｉを添加し、フラスコ内部を窒素で置換し
た後、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間浸漬した。

つづいてＶｏｒｔａｘミキリングを用い、フラスコ壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振と
うした。この操作によりリポソーム懸濁液が調製された
。さらにこれに０．ＯＩＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（
０，８５％ＮａＣ４含有、Ｐ　Ｈ７，４５：以下、ＨＢ
Ｓと記す）を少量添加した後、全て遠心チューブに移し
、４℃において１５００Ｏｒｐｍで２０分間遠心する操
作を数回繰り返した。最後に１　ｍｉのＨＢＳに懸濁さ
せた。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体、及び第２抗体の修飾１＋＊ｇ／
＠ｉの抗ヒトＡμｓＰ抗体又は第２抗体（以下Ｐ抗体と
記す）２ｄをＨＢＳで希釈し、１０ｍＭの５ＰＤＰエタ
ノール溶液１０μｉを添加して窒素置換した後、室温で
３０分間反応させ、Ｐ抗体にジチオピリジル基を導入し
た０次に予め０．１Ｍ酢酸ｔＩｉ衝液（０，８５％Ｎａ
ＣＱ含有、ＰＨ４，５）で平衡化したセブアデックスＧ
−２５ファインカラム（ゲル体積約１５ｄ）を用いたゲ
ルろ過により未反応の５ＰＤＰを除去して精製し、タン
パク質分画のみを回収した。

次いでこの分画にＤＴＴ約２０＋ｗｇを加え窒Ｊ［換後
、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基を用いた
ゲルろ過により未反応のＤＴＴを除去して精製し、タン
パク質分画のみを回収した。

■　Ｐ抗体固定化リポソーム免疫分析用試薬の調製 ■で得られたリポソーム懸濁液ＩＩＬＱを４０℃におい
て１５０００ｒｐ履で２０分間遠心したリポソーム沈査
と。

■で得られた０、１ｇタンパク質／ｍｔＱの修飾された
Ｐ抗体溶液２ＩＩＱとを混合し、窒素置換した後、密栓
して２０℃でゆっくり振とうしながら１晩反応させた。

次にＨＢ　’Ｓで洗浄して未反応の抗体を除去した。

■　Ｐ抗体固定化リポソーム免疫分析用試薬に葭 よるヒトＡＦＰ濃度の検量４作成 遊離のウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を用いたサンドイッチア
ッセイにより以下のようにしてヒトＡＦＰ濃度を定量し
、検量線を作成した。

０．０１〜１１０００ｎ／ｌｌＱの範囲で濃度を変化さ
せたヒトＡＦＰ溶液ｚｓμｇに予めＧＶＢ”　（ＧＶＢ
−に０．５一 、′鱈の阿ｇＣら水溶液及び０．１５ｍＭのＣａＣＱ、
水溶液を添加したもの）で３０倍に希釈した第１のリポ
ソーム免疫分析用試薬５μａを添加し３７℃において１
０分間反応させた。次に第２のリポソーム免疫分析用試
薬５μ２を添加し３７℃において５分間反応させた。

つづいて補体（５ＣＨ，。）２５μａを添加し３７℃に
おいて３０分間反応させた。次いで０．ＯＩＭのＥ　Ｄ
ＴＡ−ベロナール緩衝液１００μｉで反応を停止させ、
各濃度のヒトＡＦＰ溶液について流出したＣＦ量をＭＴ
Ｐ−３２蛍光分光器（コロナ電気層）により励起波長４
９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で測定した。

この測定に基づいて抗体固定化リポソームの免疫分析用
試薬の補体に対する安定性の影響を除去するために次式
により相対蛍光強度を計算した。

ここでＦｅ：実測した蛍光強度、Ｆｑ：抗原を除いた時
（リポソームが全く破壊されていない時）の蛍光強度、
Ｆｅ：脱イオン水を添加してリポソームを全て破壊した
時の蛍光強度である。なお標準値として１０−７Ｍ及び
１０−’ＨのＣＦ溶液の蛍光強度を用いた。

このようにしてヒトＡＦＰｉ１１度と相対蛍光強度との
関係を示す検量線を得た。

■　ヒトＡＦＰ濃度の実測 患者血清１０試料それぞれ２５μＱに予めＧＶＢ＋で３
０倍に希釈したリポソーム第１試薬５μａを添加し。

３７℃において１０分間反応させた０次にリポソーム第
２試薬５μａを添加し３７℃において５分間反応させた
。つづいて補体（５ＣＨ，。）２５μ２を添加し、３７
℃におい卸商分間反応させた１次いで０．ＯＩＭのＥＤ
ＴＡ−ベロナール緩衝液１００μ２で反応を停止させ、
流出したＣＦ量をＭＴＰ−３２蛍光分光器により励起波
長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で測定した。

その蛍光強度から、■で予め得られた検量線を用いてＡ
ＦＰ濃度を算出した。この結果を第１表に示す。なお第
１表中参照例はＲＩＡによる測定値である。

用いずに、予めＧＶＢ＋で２００倍に希釈したウサギ抗
ヒトＡＦＰ抗体（ＤａＫｏ社製）２５μ４を添加する以
外は実施例１と全く同様にして各操作を行ない、免疫分
析試薬を！ｉＩｌ製し、ヒトＡＦＰ濃度の検量線を作成
し、実施例１と同一の試薬についてヒトＡＦＰ濃度を実
測した。その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 第１表から明らかなように実施例１の免疫分析試薬では
ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ、低
濃度での値までよく一致している。

これに対して比較例１の免疫分析試薬では低濃度での値
の一致が悪く、感度が悪い事がわがる。

ｉｔ）実施例２ 次に第２の発明の詳細な説明する。

第１の発明で用いた抗ヒトＡＦＰ抗体固定化すポソーム
免疫分析用試薬１体積及び第２抗体固定化リポソーム免
疫分析用試薬１体積をＨＥＰＥＳ緩衝液１緩衝液１濁積
、ＡＦＰ免疫分析用試薬とする。

第１の発明の実施例で用いた患者血清Ｎｏ１２５μａに
、前述のＡＦＰ免疫分析用試薬１μｌ添加し、３７℃に
おいて１０分間反応させた。続いて補体（５０ＣＨ，。

）２５μＱを添加し、３７℃において３０分間反応させ
た１次に０．０１ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１０
０μ２で反応を停止させ、流出したＣＦ：ｆｔｉ−ＭＴ
Ｐ−３０蛍光分光器により励起波長４９０ｎｍ、蛍光波
長５２０　ｎｍの条件で測定した。その蛍光強度がら予
め作成しておいた検量線を用いてＡＦＰ濃度を算出した
。その結果、第１の発明の実施例と同一の値が得られた
。

〔発明の効果〕

本発明によれば測定感度が良好な免疫分析方法及び免疫
分析用試薬を提供することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステ
   ロールとからなるリポソーム上に、架橋法により被検物
   質に対するモノクロナール抗体もしくはモノクロナール
   抗体の一部が固定化され、さらに前記リポソーム内部に
   は親水性の標識物質が封入されている第１のリポソーム
   免疫分析用試薬とリン脂質及び糖脂質の少なくとも一方
   とコレステロールとからなるリポソーム上に、架橋法に
   より被検物質に対する第２のモノクロナール抗体もしく
   はモノクロナール抗体の一部が固定化され、さらに該リ
   ポソーム内部には親水性の標識物質が封入されている第
   ２のリポソーム免疫分析用試薬を、前記被検物質を含有
   する試料に予め接触し反応させる第１の工程と、その後
   に補体を作用させる第２の工程を具備することを特徴と
   する免疫分析方法。
2. （２）前記第１の工程が、第１のリポソーム免疫分析用
   試薬をまず反応させ、次に第２のリポソーム免疫分析用
   試薬を反応させる２段階からなることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。
3. （３）前記第１の工程が、第１のリポソーム免疫分析用
   試薬と第２のリポソーム免疫分析用試薬を同時に反応さ
   せる工程であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の免疫分析方法。
4. （４）（ａ）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコ
   レステロールとからなるリポソーム上に、架橋法により
   被検物質に対するモノクロナール抗体もしくはモノクロ
   ナール抗体の一部が固定化され、さらに前記リポソーム
   内部には親水性の標識物質が封入されている第１のリポ
   ソーム免疫分析用試薬 （ｂ）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステ
   ロールとからなるリポソーム上に、架橋法により被検物
   質に対する第２のモノクロナール抗体もしくはモノクロ
   ナール抗体の一部が固定化され、さらに該リポソーム内
   部には親水性の標識物質が封入されている第２のリポソ
   ーム免疫分析用試薬 （ｃ）緩衝液を含有したことを特徴とする免疫分析用試
   薬