JP2509636B2 - 生理活性物質固定化組成物 - Google Patents
生理活性物質固定化組成物Info
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- JP2509636B2 JP2509636B2 JP23778087A JP23778087A JP2509636B2 JP 2509636 B2 JP2509636 B2 JP 2509636B2 JP 23778087 A JP23778087 A JP 23778087A JP 23778087 A JP23778087 A JP 23778087A JP 2509636 B2 JP2509636 B2 JP 2509636B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は酵素、抗体等の生理活性物質を脂質膜表面に
固定化した生理活性物質固定化組成物に関する。
固定化した生理活性物質固定化組成物に関する。
（従来の技術） 従来、リポソームやLB膜のような脂質からなる膜の表
面に酵素や抗体等の生理活性物質を固定化する方法とし
ては以下のようなものが知られている。
面に酵素や抗体等の生理活性物質を固定化する方法とし
ては以下のようなものが知られている。
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（SPDP）で修飾したホスファチ
ジルエタノールアミン（DTP-DPPE）を用いる方法（L.D.
Leserman,J.Barnet,F.Kourilski and J.N.Weinstein;Na
ture,288,pp.602-604（1980）,F.J.Martin,W.L.Hubbell
and D.Papahadjopoulos;Biochemistry,20,pp.4229-423
8（1981）等）。
ジチオ）プロピオネート（SPDP）で修飾したホスファチ
ジルエタノールアミン（DTP-DPPE）を用いる方法（L.D.
Leserman,J.Barnet,F.Kourilski and J.N.Weinstein;Na
ture,288,pp.602-604（1980）,F.J.Martin,W.L.Hubbell
and D.Papahadjopoulos;Biochemistry,20,pp.4229-423
8（1981）等）。
チオマレイミド基を導入した脂質を用いる方法（H.Ha
shimoto,M.Sugawara and H.Endoh;J.Immunol.Methods,6
2,pp.155-162（1983））。
shimoto,M.Sugawara and H.Endoh;J.Immunol.Methods,6
2,pp.155-162（1983））。
ジスルフィド基を導入した脂質を用いる方法（特公昭
61-45775号公報）。
61-45775号公報）。
これらの方法によれば、例えばリポソーム上に多量の
抗体を固定化することができる。本発明者らも、先に特
願昭58-224509号において、表面に親水性の抗体又は抗
原を固定化し、内部に親水性の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬を開示した。しかし、本発明者らの研究によ
れば、こうした従来の方法で調製された抗体固定化リポ
ソームは血液又は血清と混合するだけで著しく崩壊して
しまい、封入物（例えば標識物質として用いられる蛍光
性化合物）が遊出することが認められた。このため、血
液中の被検物質を分析しようとしても、バックグラウン
ドノイズが上昇して正確な測定が不可能であった。これ
は、抗原−抗体反応以外に血液又は血清中のタンパク質
や微量化学成分とリポソームとの非特異的な反応が起る
ためであると考えられる。
抗体を固定化することができる。本発明者らも、先に特
願昭58-224509号において、表面に親水性の抗体又は抗
原を固定化し、内部に親水性の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬を開示した。しかし、本発明者らの研究によ
れば、こうした従来の方法で調製された抗体固定化リポ
ソームは血液又は血清と混合するだけで著しく崩壊して
しまい、封入物（例えば標識物質として用いられる蛍光
性化合物）が遊出することが認められた。このため、血
液中の被検物質を分析しようとしても、バックグラウン
ドノイズが上昇して正確な測定が不可能であった。これ
は、抗原−抗体反応以外に血液又は血清中のタンパク質
や微量化学成分とリポソームとの非特異的な反応が起る
ためであると考えられる。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記問題点を解決するためになされたもので
あり、血液や血清との反応が起らず、血液中の被検物質
の分析が正確に行なえる生理活性物質固定化組成物を提
供することを目的とする。
あり、血液や血清との反応が起らず、血液中の被検物質
の分析が正確に行なえる生理活性物質固定化組成物を提
供することを目的とする。
［発明の構成］ （問題点を解決するための手段と作用） 本発明の生理活性物質固定化組成物は、脂質膜表面に
固定化用試薬を介して生理活性物質を固定化した生理活
性物質固定化組成物において、上記固定化用試薬が一般
式 Ｒ−Ｙ−(CH2)n−Ｘ （ただし、Ｘはハロゲン原子、Ｙは−NHCO−、−COO−
又は−Ｏ−、Ｒは脂質残基、ｎは１〜６）で表わされる
ことを特徴とするものである。
固定化用試薬を介して生理活性物質を固定化した生理活
性物質固定化組成物において、上記固定化用試薬が一般
式 Ｒ−Ｙ−(CH2)n−Ｘ （ただし、Ｘはハロゲン原子、Ｙは−NHCO−、−COO−
又は−Ｏ−、Ｒは脂質残基、ｎは１〜６）で表わされる
ことを特徴とするものである。
本発明において、ハロゲン原子としてはCl、Br又はＩ
が用いられる。また、脂質残基としては例えばホスファ
チジルエタノールアミン残基が用いられる。
が用いられる。また、脂質残基としては例えばホスファ
チジルエタノールアミン残基が用いられる。
本発明において、脂質膜表面に固定化される生理活性
物質としては、蛋白質又はペプチド（例えばIgG、IgE、
IgD、IgA、IgM等の免疫グロブリン；トランスアミナー
ゼ、乳酸脱水素酵素、クレアチンホソホキナーゼ等の酵
素類;AFP、CEA等の腫瘍マーカー；インシュリン、成長
ホルモン等のペプチドホルモン等）、糖質（例えば各種
ルイス抗原、フォルスマン抗原、微生物細胞壁多糖）、
核酸関連物質（例えばポリヌクレオチド、ヌクレオチ
ド、ヌクレオシド等）、脂質（例えばリポ蛋白質、カル
ジオピリン等）、その他の低分子物質（例えばステロイ
ドホルモン、チロキシン、各種薬物等）が挙げられる。
物質としては、蛋白質又はペプチド（例えばIgG、IgE、
IgD、IgA、IgM等の免疫グロブリン；トランスアミナー
ゼ、乳酸脱水素酵素、クレアチンホソホキナーゼ等の酵
素類;AFP、CEA等の腫瘍マーカー；インシュリン、成長
ホルモン等のペプチドホルモン等）、糖質（例えば各種
ルイス抗原、フォルスマン抗原、微生物細胞壁多糖）、
核酸関連物質（例えばポリヌクレオチド、ヌクレオチ
ド、ヌクレオシド等）、脂質（例えばリポ蛋白質、カル
ジオピリン等）、その他の低分子物質（例えばステロイ
ドホルモン、チロキシン、各種薬物等）が挙げられる。
これらの生理活性物質は未処理でもよいが、SH基を導
入しておくことが望ましい。このようにSH基を導入する
には、酵素（ペプシン等）による処理、還元処理、二官
能性試薬（例えばSPDP）による処理等を行なえばよい。
入しておくことが望ましい。このようにSH基を導入する
には、酵素（ペプシン等）による処理、還元処理、二官
能性試薬（例えばSPDP）による処理等を行なえばよい。
本発明の生理活性物質固定化組成物では、脂質膜表面
にはハロゲン化アルキル基が導入され、生理活性物質は
この官能基を介して安定な化学結合で固定化でき、しか
もこの官能基は比較的不活性であり血液又は血清中のタ
ンパク質や微量化学成分との非特異反応が起ることが少
ない。したがって、バックグラウンドノイズのレベルが
低下して正確な測定を行なうことができるとともに、被
検物質の希釈度を低く抑えて高感度化を図ることができ
る。
にはハロゲン化アルキル基が導入され、生理活性物質は
この官能基を介して安定な化学結合で固定化でき、しか
もこの官能基は比較的不活性であり血液又は血清中のタ
ンパク質や微量化学成分との非特異反応が起ることが少
ない。したがって、バックグラウンドノイズのレベルが
低下して正確な測定を行なうことができるとともに、被
検物質の希釈度を低く抑えて高感度化を図ることができ
る。
（実施例） 以下、本発明の実施例を説明する。
実施例１ 官能性脂質：ブロムアセチル−ジパルミトイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（BrAc-DPPE）の合成 ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DP
PE、シグマ社製）70mg、ブロモ酢酸（和光純薬製）25mg
及びヒドロキシサクシンイミド（ペプチド研究会製）20
mgをクロロホルム約30mlに懸濁した後、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ペプチド研究会製）30mg及びトリエ
チルアミン（和光純薬製）40μｌを添加して室温で１晩
反応させた。得られた液から溶媒を除去した後、酢酸エ
チル30mlを添加した。生成した白色沈殿をロ別した後、
再び溶媒を除去した。これをクロロホルム2mlに溶解
し、薄層クロマトグラフ（＃5717、メルク社製）によ
り、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水＝65
/25/4の混合溶媒を用い、生成物を分離精製した。得ら
れたBrAc-DPPEの赤外吸収スペクトルを第１図に示す。
第１図では、−CH2Brに起因する1170cm-1の特性吸収の
ほか、各種特性吸収が出現し、原料（DPPE）のIRスペク
トルと比較することにより、生成物が下記構造式を有す
ることが確認された。
ァチジルエタノールアミン（BrAc-DPPE）の合成 ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DP
PE、シグマ社製）70mg、ブロモ酢酸（和光純薬製）25mg
及びヒドロキシサクシンイミド（ペプチド研究会製）20
mgをクロロホルム約30mlに懸濁した後、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ペプチド研究会製）30mg及びトリエ
チルアミン（和光純薬製）40μｌを添加して室温で１晩
反応させた。得られた液から溶媒を除去した後、酢酸エ
チル30mlを添加した。生成した白色沈殿をロ別した後、
再び溶媒を除去した。これをクロロホルム2mlに溶解
し、薄層クロマトグラフ（＃5717、メルク社製）によ
り、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水＝65
/25/4の混合溶媒を用い、生成物を分離精製した。得ら
れたBrAc-DPPEの赤外吸収スペクトルを第１図に示す。
第１図では、−CH2Brに起因する1170cm-1の特性吸収の
ほか、各種特性吸収が出現し、原料（DPPE）のIRスペク
トルと比較することにより、生成物が下記構造式を有す
ることが確認された。
このBrAc-DPPEをクロロホルムで1mM濃度に希釈して−20
℃で保存した。
℃で保存した。
BrAc-DPPE含有リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／
メタノール（2/1）混合溶媒に溶解した。
メタノール（2/1）混合溶媒に溶解した。
5mMのジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC、
シグマ社製）200μｌ、10mMのコレステロール（シグマ
社製）100μｌ及び1mMのBrAc-DPPE 50μｌを10ml容量の
ナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム2mlを加えて
よく混合した。次に、約40℃の水浴中でロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム2ml
を加えて充分攪拌した後、再度ロータリーエバポレータ
ーにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返すと、
フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。つづいて、フラ
スコをデシケータ中に移し、真空ポンプで約１時間吸引
して溶媒を完全に除去した。
シグマ社製）200μｌ、10mMのコレステロール（シグマ
社製）100μｌ及び1mMのBrAc-DPPE 50μｌを10ml容量の
ナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム2mlを加えて
よく混合した。次に、約40℃の水浴中でロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム2ml
を加えて充分攪拌した後、再度ロータリーエバポレータ
ーにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返すと、
フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。つづいて、フラ
スコをデシケータ中に移し、真空ポンプで約１時間吸引
して溶媒を完全に除去した。
次いで、0.2Mのカルボキシフルオレセイン（イースト
マン・コダック社製、pH7.4:以下、CFと記す）100μｌ
を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して
約60℃の水浴中に約１分間浸漬した。つづいて、Vortex
ミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失
するまでフラスコを激しく振とうした。この操作により
リポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソーム懸濁
液に0.01MのHEPES緩衝液（0.85％NaCl含有、pH7.45:以
下、HBSと記す）を少量添加した後、全て遠心チューブ
に移し、４℃において1500rpmで20分間遠心する操作を
数回繰り返した。最後に、2mlのHBSに懸濁させた。
マン・コダック社製、pH7.4:以下、CFと記す）100μｌ
を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して
約60℃の水浴中に約１分間浸漬した。つづいて、Vortex
ミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失
するまでフラスコを激しく振とうした。この操作により
リポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソーム懸濁
液に0.01MのHEPES緩衝液（0.85％NaCl含有、pH7.45:以
下、HBSと記す）を少量添加した後、全て遠心チューブ
に移し、４℃において1500rpmで20分間遠心する操作を
数回繰り返した。最後に、2mlのHBSに懸濁させた。
BrAc-DPPE含有リポソームとモルモット血清との反応 で調製したBrAc-DPPE含有リポソームをゼラチン−
ベロナール緩衝液（GVB+、pH7.2）で10倍に希釈した。
一方、モルモット血清をGVB+で１〜80倍の所定の希釈率
で希釈した。これらを等量ずつ混合して37℃に保持し、
30分後に遊出したCFの蛍光強度を蛍光分光光度計（MTP-
32、コロナ電気製）で測定した。
ベロナール緩衝液（GVB+、pH7.2）で10倍に希釈した。
一方、モルモット血清をGVB+で１〜80倍の所定の希釈率
で希釈した。これらを等量ずつ混合して37℃に保持し、
30分後に遊出したCFの蛍光強度を蛍光分光光度計（MTP-
32、コロナ電気製）で測定した。
血清溶液の代りにGVB+を加えた場合の蛍光強度を０
％、血清溶液の代りに水を加えた場合の蛍光強度を100
％として、各倍数で希釈した血清溶液を加えた場合の蛍
光強度の相対値を計算し、これを相対遊出率として第２
図に示す。第２図から明らかなように希釈率が10倍以下
の血清溶液を加えた場合には若干リポソームの崩壊が認
められるが、希釈率が20倍以上の血清溶液を加えてもリ
ポソームは全く破壊されない。
％、血清溶液の代りに水を加えた場合の蛍光強度を100
％として、各倍数で希釈した血清溶液を加えた場合の蛍
光強度の相対値を計算し、これを相対遊出率として第２
図に示す。第２図から明らかなように希釈率が10倍以下
の血清溶液を加えた場合には若干リポソームの崩壊が認
められるが、希釈率が20倍以上の血清溶液を加えてもリ
ポソームは全く破壊されない。
BrAc-DPPE含有リポソームへのヒトIgGの固定化 で調製したBrAc-DPPE含有リポソームを3mg/mlのヒ
トIgG/HBS溶液1mlに懸濁し、20℃で43時間混合攪拌し
た。反応後、GVB-（Ca2+及びMg2+を含まないGVB+）で３
回遠心洗浄した。最後に、GVB- 2mlを加え、冷蔵庫中で
保存した。
トIgG/HBS溶液1mlに懸濁し、20℃で43時間混合攪拌し
た。反応後、GVB-（Ca2+及びMg2+を含まないGVB+）で３
回遠心洗浄した。最後に、GVB- 2mlを加え、冷蔵庫中で
保存した。
ヒトIgG固定化リポソームによるウサギ抗−ヒトIgG抗
体の測定 で得られたヒトIgG固定化リポソームをGVB+で10倍
に希釈した。一方、ウサギ抗−ヒトIgG抗体をGVB+で10
-6〜10-1mg/mlの所定の濃度に希釈した。これらを等量
ずつ混合して37℃で反応させ、30分後に遊出したCFの蛍
光強度を蛍光分光光度計で測定し、上記と同様にして相
対遊出率を求めた結果を第３図に示す。なお、第３図に
おける横軸の０はモルモット血清をGVB+で40倍に希釈し
た溶液を加えた場合である。第３図から明らかなよう
に、ヒトIgG固定化BrAc-DPPE含有リポソームにより、ウ
サギ抗−ヒトIgG抗体の濃度に依存した応答が得られ、
正確な測定が可能であることがわかる。
体の測定 で得られたヒトIgG固定化リポソームをGVB+で10倍
に希釈した。一方、ウサギ抗−ヒトIgG抗体をGVB+で10
-6〜10-1mg/mlの所定の濃度に希釈した。これらを等量
ずつ混合して37℃で反応させ、30分後に遊出したCFの蛍
光強度を蛍光分光光度計で測定し、上記と同様にして相
対遊出率を求めた結果を第３図に示す。なお、第３図に
おける横軸の０はモルモット血清をGVB+で40倍に希釈し
た溶液を加えた場合である。第３図から明らかなよう
に、ヒトIgG固定化BrAc-DPPE含有リポソームにより、ウ
サギ抗−ヒトIgG抗体の濃度に依存した応答が得られ、
正確な測定が可能であることがわかる。
比較例１ ジチオピリジルプロピオン酸アミドを導入したDPPE
（DTP-DPPE、従来の固定化用試薬）を含有するリポソー
ムとモルモット血清との反応 DPPEとＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）とトリエタノールアミンの
存在下に反応させ、DTP-DPPEを調製した。このDTP-DPPE
をBrAc-DPPEの代りに用い、上記実施例１と同様にしてD
TP-DPPE含有リポソームを調製した。更に、DTP-DPPE含
有リポソームとモルモット血清とを混合してCFの相対遊
出率を測定した結果を第４図に示す。第４図から明らか
なように、DTP-DPPE含有リポソームは希釈率の高いモル
モット血清に対しても崩壊してしまい、著しく不安定で
あることがわかる。
（DTP-DPPE、従来の固定化用試薬）を含有するリポソー
ムとモルモット血清との反応 DPPEとＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）とトリエタノールアミンの
存在下に反応させ、DTP-DPPEを調製した。このDTP-DPPE
をBrAc-DPPEの代りに用い、上記実施例１と同様にしてD
TP-DPPE含有リポソームを調製した。更に、DTP-DPPE含
有リポソームとモルモット血清とを混合してCFの相対遊
出率を測定した結果を第４図に示す。第４図から明らか
なように、DTP-DPPE含有リポソームは希釈率の高いモル
モット血清に対しても崩壊してしまい、著しく不安定で
あることがわかる。
比較例２ マレイミドフェニルブチレート（MPB）を導入したDPP
E（MPB-DPPE、従来の固定化用試薬）を含有するリポソ
ームとモルモット血清との反応 Hashimotoらの方法に従い、DPPEとサクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB、ピ
アース社製）とをジシクロヘキシルカルボジイミド及び
トリエチルアミン共存下で反応させ、MPB-DPPEを調製し
た。このMPB-DPPEをBrAc-DPPEの代りに用い、上記実施
例１と同様にしてMPB-DPPE含有リポソームを調製した。
更に、MPB-DPPE含有リポソームとモルモット血清とを混
合してCFの相対遊出率を測定した結果を第５図に示す。
第５図から明らかなように、MPB-DPPE含有リポソームは
希釈率の高いモルモット血清に対しても崩壊してしま
い、著しく不安定であることがわかる。
E（MPB-DPPE、従来の固定化用試薬）を含有するリポソ
ームとモルモット血清との反応 Hashimotoらの方法に従い、DPPEとサクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB、ピ
アース社製）とをジシクロヘキシルカルボジイミド及び
トリエチルアミン共存下で反応させ、MPB-DPPEを調製し
た。このMPB-DPPEをBrAc-DPPEの代りに用い、上記実施
例１と同様にしてMPB-DPPE含有リポソームを調製した。
更に、MPB-DPPE含有リポソームとモルモット血清とを混
合してCFの相対遊出率を測定した結果を第５図に示す。
第５図から明らかなように、MPB-DPPE含有リポソームは
希釈率の高いモルモット血清に対しても崩壊してしま
い、著しく不安定であることがわかる。
実施例２ 官能性脂質（ClAc-DPPE、BrAc-DPPE及びIAc-DPPE）の
合成 1mMのハロゲン化酢酸（別個にクロロ酢酸、ブロモ酢
酸及びヨード酢酸の３種を使用）をクロロホルム30mlに
溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド1.2mM及びジシ
クロヘキシルカルボジイミド1.2mMを添加し、室温で３
時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで乾燥
し、酢酸エチル30mlを加えた。生成した白色沈殿をロ別
した後、再び溶媒を除去し、クロロホルム10mlに再溶解
させた。次に、100μＭのDPPEをクロロホルム30mlに懸
濁させ、これに上記溶液2ml及びトリエチルアミン50ml
を加え、室温で１晩反応させた。更に、溶媒を濃縮した
後、薄層クロマトグラフにより、展開溶媒としてクロロ
ホルム／メタノール＝70/30の混合溶媒を用い、生成物
を分離精製した。各ハロゲン化アルキル基を導入したDE
EPの収率は約50％であった。なお、最終生成物はクロロ
ホルムで1mM濃度に希釈して−20℃で保存した。
合成 1mMのハロゲン化酢酸（別個にクロロ酢酸、ブロモ酢
酸及びヨード酢酸の３種を使用）をクロロホルム30mlに
溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド1.2mM及びジシ
クロヘキシルカルボジイミド1.2mMを添加し、室温で３
時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで乾燥
し、酢酸エチル30mlを加えた。生成した白色沈殿をロ別
した後、再び溶媒を除去し、クロロホルム10mlに再溶解
させた。次に、100μＭのDPPEをクロロホルム30mlに懸
濁させ、これに上記溶液2ml及びトリエチルアミン50ml
を加え、室温で１晩反応させた。更に、溶媒を濃縮した
後、薄層クロマトグラフにより、展開溶媒としてクロロ
ホルム／メタノール＝70/30の混合溶媒を用い、生成物
を分離精製した。各ハロゲン化アルキル基を導入したDE
EPの収率は約50％であった。なお、最終生成物はクロロ
ホルムで1mM濃度に希釈して−20℃で保存した。
リポソームの調製 実施例１と全く同様にして、各ハロゲン化アルキル基
を導入したDEEPを含有するリポソーム（標識物質として
CFを封入）を調製した。
を導入したDEEPを含有するリポソーム（標識物質として
CFを封入）を調製した。
モノクローナル抗体の修飾 モノクローナル抗−ヒトAFP抗体10mgをpH4.5の酢酸緩
衝液に溶解し、ペプシン（シグマ社製）100μｇを添加
し、37℃で１時間反応させた後、高速液体クロマトグラ
フでＦ（ab′）２分画のみを分取した。このＦ（ab′）
２分画をpH6、0.1Mのリン酸緩衝液中に溶解し、これに
メルカプトエチルアミン・塩酸塩10mgを加え、37℃で90
分間反応させた。その後、セファデックスG-25（ファル
マシア社製）により、pH8.0、0.01Mのホウ酸緩衝液を用
いてゲルロ過し、タンパク分画（Fab′）のみを分取し
た。このFab′分画のOD280nmは約１であった。また、こ
のFab′分画は遊離のSH基を含有している。
衝液に溶解し、ペプシン（シグマ社製）100μｇを添加
し、37℃で１時間反応させた後、高速液体クロマトグラ
フでＦ（ab′）２分画のみを分取した。このＦ（ab′）
２分画をpH6、0.1Mのリン酸緩衝液中に溶解し、これに
メルカプトエチルアミン・塩酸塩10mgを加え、37℃で90
分間反応させた。その後、セファデックスG-25（ファル
マシア社製）により、pH8.0、0.01Mのホウ酸緩衝液を用
いてゲルロ過し、タンパク分画（Fab′）のみを分取し
た。このFab′分画のOD280nmは約１であった。また、こ
のFab′分画は遊離のSH基を含有している。
リポソームへのモノクローナル抗体の固定化 で調製したリポソーム懸濁液とで得られたFab′
分画とを混合し、20℃で44時間攪拌・反応させた。反応
後、GVB-で３回洗浄し、最後にGVB- 2mlに懸濁して４℃
で保存した。
分画とを混合し、20℃で44時間攪拌・反応させた。反応
後、GVB-で３回洗浄し、最後にGVB- 2mlに懸濁して４℃
で保存した。
モノクローナル抗体固定化リポソームによるヒトAFP
の測定 で調製されたモノクローナル抗体固定化リポソーム
をGVB+で10倍に希釈した。一方、ヒトAFPをGVB+で0.1〜
104ng/mlの濃度範囲に希釈した。これらを10μｌずつ混
合して37℃で10分間インキュベートした。次に、50倍希
釈のウサギ抗−ヒトAFP抗体（Dako社製）溶液25μｌ及
び20倍希釈の補体（モルモット血清）溶液25μｌを添加
し、更に37℃で30分間反応させた。次いで、0.01M EDTA
−ベロナール緩衝液100μｌで反応を停止させ、各濃度
のヒトAFP溶液について遊出したCF量を実施例１と同様
に測定した。この結果を第６図に示す。ただし、第６図
は官能性脂質としてBrAc-DPPEを用いた場合の測定結果
である。なお、第６図の横軸のＬはリポソーム懸濁液単
独の場合、０はGVB+のみを添加した場合である。第６図
から、１〜103ng/mlの濃度範囲では極めて正確にヒトAF
Pを測定できることがわかる。
の測定 で調製されたモノクローナル抗体固定化リポソーム
をGVB+で10倍に希釈した。一方、ヒトAFPをGVB+で0.1〜
104ng/mlの濃度範囲に希釈した。これらを10μｌずつ混
合して37℃で10分間インキュベートした。次に、50倍希
釈のウサギ抗−ヒトAFP抗体（Dako社製）溶液25μｌ及
び20倍希釈の補体（モルモット血清）溶液25μｌを添加
し、更に37℃で30分間反応させた。次いで、0.01M EDTA
−ベロナール緩衝液100μｌで反応を停止させ、各濃度
のヒトAFP溶液について遊出したCF量を実施例１と同様
に測定した。この結果を第６図に示す。ただし、第６図
は官能性脂質としてBrAc-DPPEを用いた場合の測定結果
である。なお、第６図の横軸のＬはリポソーム懸濁液単
独の場合、０はGVB+のみを添加した場合である。第６図
から、１〜103ng/mlの濃度範囲では極めて正確にヒトAF
Pを測定できることがわかる。
官能性脂質のハロゲンの種類の影響 と全く同様にモノクローナル抗−ヒトAFP抗体のFa
b′分画を分取し、その濃度をOD280nm＝0.5と上記の約
半分に調整した後、と同様にそれぞれClAc-DPPE、BrA
c-DPPE及びIAc-DPPEと反応させてモノクローナル抗体固
定化リポソームを調製した。
b′分画を分取し、その濃度をOD280nm＝0.5と上記の約
半分に調整した後、と同様にそれぞれClAc-DPPE、BrA
c-DPPE及びIAc-DPPEと反応させてモノクローナル抗体固
定化リポソームを調製した。
次に、と同様に各モノクローナル抗体固定化リポソ
ームと所定濃度のヒトAFPとを反応させ、更に50倍希釈
のウサギ抗−ヒトAFP抗体溶液25μｌ及び20倍希釈の補
体溶液25μｌを添加して反応させて、各濃度のヒトAFP
溶液について遊出したCF量を実施例１と同様に測定し
た。この結果を第７図に示す。なお、第７図の横軸のLi
pはリポソーム懸濁液のみの場合、Lip＋Ｃはリポソーム
懸濁液に補体溶液のみを添加した場合である。第７図か
ら、いずれのリポソームでもヒトAFPに対して良好な応
答を示すことがわかる。ただし、応答性はCl＜Br＜Ｉの
順に良好である。
ームと所定濃度のヒトAFPとを反応させ、更に50倍希釈
のウサギ抗−ヒトAFP抗体溶液25μｌ及び20倍希釈の補
体溶液25μｌを添加して反応させて、各濃度のヒトAFP
溶液について遊出したCF量を実施例１と同様に測定し
た。この結果を第７図に示す。なお、第７図の横軸のLi
pはリポソーム懸濁液のみの場合、Lip＋Ｃはリポソーム
懸濁液に補体溶液のみを添加した場合である。第７図か
ら、いずれのリポソームでもヒトAFPに対して良好な応
答を示すことがわかる。ただし、応答性はCl＜Br＜Ｉの
順に良好である。
実血清との反応 実血清10検体をGVB+で10倍に希釈したものと上記モノ
クローナル抗体固定化リポソーム（官能性脂質はBrAc-D
PPE）とを混合し、20倍に希釈した補体溶液25μｌを添
加して37℃で30分間反応させた時の相対遊出率を第１表
に示す。なお、第１表中、比較例３は特願昭58-224509
号において開示したモノクローナル抗体固定化リポソー
ム（官能性脂質はDTP-DPPE）についての結果である。
クローナル抗体固定化リポソーム（官能性脂質はBrAc-D
PPE）とを混合し、20倍に希釈した補体溶液25μｌを添
加して37℃で30分間反応させた時の相対遊出率を第１表
に示す。なお、第１表中、比較例３は特願昭58-224509
号において開示したモノクローナル抗体固定化リポソー
ム（官能性脂質はDTP-DPPE）についての結果である。
第１表から、本実施例のモノクローナル抗体固定化リ
ポソームは血清に対して高い安定性を示すことがわか
る。
ポソームは血清に対して高い安定性を示すことがわか
る。
なお、以上の実施例では脂質膜としてリポソームを用
い、生理活性物質として抗体を固定化した場合について
説明したが、脂質膜として例えばLB膜を用いてもよい
し、生理活性物質として酵素等を用いてもよいことは勿
論である。
い、生理活性物質として抗体を固定化した場合について
説明したが、脂質膜として例えばLB膜を用いてもよい
し、生理活性物質として酵素等を用いてもよいことは勿
論である。
［発明の効果］ 以上詳述したように本発明によれば、血液や血清に対
して安定で、被検物質に対して高精度かつ高感度な測定
が可能な生理活性物質固定化組成物を提供できる。
して安定で、被検物質に対して高精度かつ高感度な測定
が可能な生理活性物質固定化組成物を提供できる。
第１図は本発明の実施例１において合成されたBrAc-DPP
Eの赤外吸収スペクトル図、第２図は本発明の実施例１
におけるBrAc-DPPE含有リポソームとモルモット血清溶
液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特性図、第
３図は本発明の実施例１におけるヒトIgG固定化BrAc-DP
PE含有リポソームとウサギ抗−ヒトIgG抗体溶液とを混
合したときのCFの相対遊出率を示す特性図、第４図は比
較例１におけるDTP-DPPE含有リポソームとモルモット血
清溶液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特性
図、第５図は比較例２におけるMPB-DPPE含有リポソーム
とモルモット血清溶液とを混合したときのCFの相対遊出
率を示す特性図、第６図は本発明の実施例２におけるモ
ノクローナル抗体固定化BrAc-DPPE含有リポソームとヒ
トAFP溶液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特
性図、第７図は本発明の実施例２におけるモノクローナ
ル抗体を固定化したClAc-DPPE、BrAc-DPPE又はIAc-DPPE
含有リポソームとヒトAFP溶液とを混合したときのCFの
相対遊出率を示す特性図である。
Eの赤外吸収スペクトル図、第２図は本発明の実施例１
におけるBrAc-DPPE含有リポソームとモルモット血清溶
液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特性図、第
３図は本発明の実施例１におけるヒトIgG固定化BrAc-DP
PE含有リポソームとウサギ抗−ヒトIgG抗体溶液とを混
合したときのCFの相対遊出率を示す特性図、第４図は比
較例１におけるDTP-DPPE含有リポソームとモルモット血
清溶液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特性
図、第５図は比較例２におけるMPB-DPPE含有リポソーム
とモルモット血清溶液とを混合したときのCFの相対遊出
率を示す特性図、第６図は本発明の実施例２におけるモ
ノクローナル抗体固定化BrAc-DPPE含有リポソームとヒ
トAFP溶液とを混合したときのCFの相対遊出率を示す特
性図、第７図は本発明の実施例２におけるモノクローナ
ル抗体を固定化したClAc-DPPE、BrAc-DPPE又はIAc-DPPE
含有リポソームとヒトAFP溶液とを混合したときのCFの
相対遊出率を示す特性図である。
Claims (2)
- 【請求項１】脂質膜表面に固定化用試薬を介して生理活
性物質を固定化した生理活性物質固定化組成物におい
て、上記固定化用試薬が一般式 Ｒ−Ｙ−(CH2)n−Ｘ （ただし、Ｘはハロゲン原子、Ｙは−NHCO−、−COO−
又は−Ｏ−、Ｒは脂質残基、ｎは１〜６）で表わされる
ことを特徴とする生理活性物質固定化組成物。 - 【請求項２】Ｘのハロゲン原子がCl、Br又はＩであり、
Ｒがホスファチジルエタノールアミン残基であることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生理活性物質固
定化組成物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23778087A JP2509636B2 (ja) | 1987-09-22 | 1987-09-22 | 生理活性物質固定化組成物 |
| US07/246,092 US5080833A (en) | 1987-09-21 | 1988-09-19 | Immobilization of bioactive substance on lipid composition containing modified lipid compound |
| DE8888308701T DE3872151T2 (de) | 1987-09-21 | 1988-09-20 | Immobilisierung einer bioaktiven substanz an einer lipidzusammensetzung, enthaltend eine modofizierte lipidverbindung. |
| EP88308701A EP0312212B1 (en) | 1987-09-21 | 1988-09-20 | Immobilization of bioactive substance on lipid composition containing modified lipid compound |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23778087A JP2509636B2 (ja) | 1987-09-22 | 1987-09-22 | 生理活性物質固定化組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6479660A JPS6479660A (en) | 1989-03-24 |
| JP2509636B2 true JP2509636B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=17020321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23778087A Expired - Lifetime JP2509636B2 (ja) | 1987-09-21 | 1987-09-22 | 生理活性物質固定化組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2509636B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2718809B2 (ja) * | 1989-07-06 | 1998-02-25 | 株式会社サム研究所 | 修飾生物活性蛋白 |
-
1987
- 1987-09-22 JP JP23778087A patent/JP2509636B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6479660A (en) | 1989-03-24 |
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