JPH0235362A

JPH0235362A - リポソーム上への生理活性物質の固定化方法

Info

Publication number: JPH0235362A
Application number: JP6226488A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Ishimori; 石森　義雄
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1988-03-16
Filing date: 1988-03-16
Publication date: 1990-02-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的コ（産業上の利用分野）本発明はリポソーム上への生理活性物質の固定化方法に
関する。

（従来の技術）従来、酵素を不溶性担体上に固定化するために種々の方
法が研究されている。例えば、ＧＮＢｒで担体中の糖の
水酸基を活性化し、酵素中のアミン基と反応させる方法
、カルボジイミド誘導体な用いて担体と酵素とを脱水縮
合させる方法等がある。また、ブロモアセチル基を担体
上に導入し酵素のアミ７基・水酸基・イミダゾール基等
と反応させる方法が知られている（講談社刊、“実験と
応用　アフィニティクロマトグラフィー　、千畑一部他
著、１９７６年、ｐ、５９）。この際、反応ｐＨは６〜
９の範囲で行うという記載がある。

また、従来、リポソームやＬＢ膜のような脂質からなる
膜の表面に酵素や抗体等の生理活性物質を固定化する方
法としては以下のようなものが知られている。

■Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル３〜（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾したホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）を用い
る方法（Ｌ、Ｄ、Ｌｅｓｅｒｍａｎ、Ｊ、Ｂａｒｎｅｔ
、Ｆ、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｉ　ａｎｄＪ、Ｎ、Ｗｅｉｎｓ
ｔｅｉｎ；Ｎａｔｕｒｅ、　２８Ｂ　、ｐｐ、ＢＯ２−
８０４（１９８０）。

Ｆ、Ｊ、Ｍａｒｔｉｎ、Ｗ、Ｌ、Ｈｕｂｂｅｌｌ　ａｎ
ｄ　Ｄ、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ；　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２０．ｐｐ、４２２９−４２３８
（１９８１）等）。

■チオマレイミド基を導入した脂質を用いる方法（Ｈ，
ｌｌａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｍ、Ｓｕｇａｗａｒａ　ａｎｄ
　）１．Ｅｎｄｏｈ；　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、８２．ｐｐ、１５５
−１６２（１９８３）　　）　　。

■ジスルフィド基を導入した脂質を用いる方法（特公昭
８１−４５７７５号公報）。

これらの方法によれば、例えばリポソーム上に多量の抗
体を固定化することができる。

しかし、本発明者らの研究によれば、こうした従来の方
法で調製された抗体固定化リポソームは血液又は血清と
混合するだけで著しく崩壊してしまうことが判明した。

そこで、木発明者はハロゲン化アルキル基を導入した脂
質を開発し、これを含むリポソームがヒト血清中で安定
であることを見出した。しかしながら、場合によっては
このリポソーム上に抗体等の生理活性物質を固定化する
ことが困難であることも判明した。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、リポソーム上に安定に生理活性物質を固定化する方
法を提供することを目的とする。

［発明の構成コ（課題を解決するための手段と作用）本発明のリポソーム−にへの生理活性物質の固定化方法
は、ハロゲン化アルキル基を含有するリン脂質及び糖脂
質のうち少なくとも一方を組成の一部とするリポソーム
に、遊離のＳＨ基を含有する生理活性物質を固定化する
際に、反応時のｐＨを７〜１１の範囲に調整することを
特徴とするものである。

以下、本発明方法をより詳細に説明する。

まず、ハロゲン化アルキル基を含有する脂質は例えば以
下のようにして合成することができる。

すなわち、ハロゲン化酢酸等をＮ−ヒドロキシサクシン
イミド、ジシクロへキシルカルボジイミド、Ｉ・リエチ
ルアミンの存在下で適当なアミン基含有脂質（例えばジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン等）と反
応させることにより合成することができる。この脂質の
精製には分取用薄層クロマトグラフィーな用いると良い
。

次に、こうして合成されたハロゲン化アルキル基を含有
するリン脂質や糖脂質を組成の一部とするリポソームは
例えば以下のようにして調製することができる。すなわ
ち、こうした脂質、及び必要に応じてコレステロールや
他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解
・混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥させる。この
結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。つづいて
、フラスコ内に標識物質を含有する水溶液を加え、密栓
して振とうすることによりリポソームの懸濁液を調製す
る。

一方、生理活性物質には、酵素（ペプシン等）処理や還
元処理を施して遊離のＳＨ基を付与するか、２官能性試
薬（例えば５ＰＤＰ）と反応させた後に還元してＳＨ基
を導入する。生理活性物質としては、抗体（免疫グロブ
リン）、抗原、酵素、補酵素、ホルモン等が挙げられる
。

更に、リポソーム懸濁液と生理活性物質とをｐＨ７〜１
１の条件で混合することにより、リポソームのハロゲン
化アルキル基と生理活性物質に導入されたＳ）Ｉ基とが
反応し、リポソーム」二にチオエーテル結合（−Ｓ−Ｃ
−）を介して安定に生理活性物質を固定化することがで
きる。

この際、ｐＨを７〜１１の範囲に規定したのは、ｐＨが
７未満ではリポソーム」−に固定化される生理活性物質
の量が少なく、一方ｐ）Ｉが１１を超えると生理活性物
質が固定化されたリポソームが血液や血清中で崩壊する
等不安定になるためである。

本発明方法によれば、リポソーム上に生理活性物質を安
定に固定化することができ、しかも両者の化学結合は血
液や血清中でも不活性でリポソームが崩壊するようなこ
とはない。

（実施例）以下、本発明の詳細な説明する。

実施例１：リポソーム」−へのモノクローナル抗ヒトα
−ノエトプロテイン（ｏｐｐｃ）の固足化本実施例で用
いた試薬のうち、ジパルミトイルホスファチジルコリン
（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＰＰＥ）　、　コレステロールはシグマ社
製のものを用いた。また、セファデックスＧ−２５はフ
ァルマシア社製のものを用いた。他の試薬は市販品（特
級）を精製せずに使用した。なお、水は全てイオン交検
水を用いた。

■ハロゲン化アルキル基含有リン脂質の合成１ｍモルの
ブロモ酢酸をクロロホルム３０ｍ１に溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミド１．２ｍモル及びジシクロへキシ
ルカルボジイミド１．２ｍモルを添加し、室温で３時間
反応させた後、ロータリーエバポレーターで乾燥し、酢
酸エチル３０ｍ１を加えた。

生成した白色沈殿を日別した後、再び溶媒を除去し、ク
ロロホルム１０ｍ１に再溶解させた。次に、１００、モ
ルのＤＰＰＥをクロロホルム３０１に懸濁させ、これに
上記溶液２ｍｌ及びトリエチルアミン５０．１　を加え
、室温で１晩反応させた。更に、溶媒を濃縮した後、分
取用薄層クロマトグラフィーにより、展開溶媒としてク
ロロホルム／メタノール＝７０／　３０の混合溶媒を用
い、生成物を分離精製した。収率は約５０％であった。

なお、最終生成物はクロロホルムで１　ｍＭ濃度に希釈
して一２０°Ｃで保存した。

■リポソームの調製使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）　ｉ合溶媒に溶解した。

５　ｍＭノＤＰＰｃ　２００角１　、　ｉｆ）ｍＭのコ
１／ステロール１００ｇ＋及び１　ｍ！ｂ７）　ＢｒＡ
ｃ−［］ＰＰＥ　（■で得られたハロゲン化アルキル基
含有リン脂質）５０ｇ＋を１０ｍ１容量のナシ型フラス
コに入れ、更にクロロホルム２Ｉｌ１１を加えてよく混
合した。次に、約４０℃の水浴中テロータリーエバポレ
ータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム２ｍｌを
加えて充分攪拌した後、再度ロータリーエバポレーター
により溶媒を除去した。この操作を数回繰り返すと、フ
ラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。つづいて、フラス
コをデシケータ中に移し、真空ポンプで約１時間吸引し
て溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦと記す
）１００ル１を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後、密栓して約６０°Ｃの水浴中に約１分間浸漬した。

つづいて、Ｖｏｒｔｅ＋ｖミキサーを用い、フラスコ壁
面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振
とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が調製され
た。更に、リポソーム懸濁液に０．０１Ｈの１（ＥＰＥ
Ｓ　＠衝液（０，８５％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７，４５：
以下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後、全て遠心チュ
ーブに移し、４°Ｃにおいて１５０００　ｒｐｍで２０
分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に緩衝液を捨
て、リポソームのベレットを得た。

■モノクローナル抗体の修飾モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体１０ｍｇをｐ）１４
．５の酢酸緩衝液に溶解し、ペプシン（シグマ社製）１
００ｇｇを添加し、３７°Ｃで１時間反応させた後、高
速液体クロマトグラフでＦ（ａｂ’）２分画のみを分取
した。このＦ（ａｂ’）２分画１ｍｇをｐＨ６，０，Ｉ
Ｍのリン酸緩衝液中に溶解し、これにメルカプトエチル
アミン・塩酸塩１０ｍｇを加え、３７°Ｃで９０分間反
応させた。その後、セファデックスＧ−２５を用い、ｐ
Ｈ６〜１２までの緩衝液（１０１０ｆｆ１でゲル口過し
、遊離のＳＨ基を含有したタンパク分画（Ｆａｂ’）の
みを分取した。このＦ　ａｂ’ｂ’のＯＤ　２８０ｎｍ
は約１であった（各１ｍ１）。

■リポソームへのモノクローナル抗体の固定化■で調製
したリポソームペレットと■で得うれた各ｐＨのＦ　ａ
ｂ’分画分画１七ｌ混合し、２０°Ｃで４４時間攪拌・
反応させた。反応後、それぞれゼラチンベロナール緩衝
液（以下、ＧＶＢ−と記す）で３回洗浄し、最後にＧＶ
Ｂ　　２ｍｌに懸濁して４℃で保存した。

■モノクローナル抗体固定化リポソームによるヒトＡＦ
Ｐの測定ヒトＡＦＰをＧＶＢ”　（ＧＶＢ−に０．５ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ：Ｉ　２及び０．５ｍＭ　ＣａＣｌ　２を添加したも
の）で予め０．１〜１０’ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に希釈
した。一方、■において各ｐＨで調製されたモノクロー
ナル抗体固定化リポソームをＧＶＢ＋で１０倍に希釈し
た。これらを１０．１ずつ混合して３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。

次に、５０倍希釈のウサギ抗−ヒ１−ＡＦＰ抗体（Ｄａ
ｋ。

社製）溶液２５ルｌ及び２０倍希釈の補体（モルモット
血清）溶液２５．１　を添加し、更に３７°Ｃで３０分
間反応させた。次いで、０．０１にＥ［１ＴＡ−へロナ
ール緩衝液　１００ＪＬ＋で反応を停止させ、各濃度の
ヒトＡＦＰ溶液について遊出したＣＦ量をＭＴＰ−３２
蛍光分光光度計（コロナ電気製）により、励起波長４８
０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で測定した。

この測定に基づいて次式によりリポソームの最大溶出率
を計算した。

第　　１表ここで、Ｆｅ　：実測した蛍光強度、Ｆｏ：抗原を添加
していない時（リポソームが全く破壊されていない時）
の蛍光強度、Ｆａ：脱イオン水を添加してリポソームを
全て破壊した時の蛍光強度である。なお、標準値として
１Ｏ−７及び１０−８ＭのＣＦ溶液の蛍光強度を用いた
。

第１図にｐＨ８で抗体を固定化したリポソームを用いた
場合の測定結果を示す。第１図から、１〜１０３ｎｇ／
　ｌｌ１ｌの範囲でＡＦＰを測定できることがわかる。

同様に、各ｐＨで抗体を固定化したリポソームを用いた
場合の測定濃度範囲及びリポソームの最大溶出率を第１
表に示す。

第１表から、リポソームの最大溶出率は、ｐＨ６〜８の
範囲ではｐＨの十Ａに伴い増大し、ｐＨ８〜１１の範囲
でほぼ一定である。そして、ｐＨ６ではリポソーム」−
に固定化される抗体量が少なくリポソームの最大溶出率
が低すぎるため測定精度か悪く、しかも測定濃度範囲も
狭い。なお、ｐＨ１２ではリポソームが補体に対して不
安定であり、事実」二同−条件下でのＡＦＰの測定がで
きなかった。このことから、ｐＨ７〜１１で固定化反応
を行えばよいことがわかる。

実施例２：ｐＨ８でモノクローナル抗−ヒ）　ＡＦＰ抗
体を固定化したリポソームとヒト血清との相互作用実施例１と同様にして、リポソームとヒト血清との相互
作用を調べた。すなわち、５０検体のヒト血清を　ＧＶ
Ｂ＋で１０倍に希釈した。一方、ｐＨ８で調製されたモ
ノクローナル抗体固定化リポソームをＧＶＢ＋で１０倍
に希釈した。これらを１０ｐＬｌずつ混合して３７°Ｃ
で１０分間インキュベートした。次に、ＧＶＢ＋　２５
ル１及び２０倍希釈の補体溶液２５ル１を楕加し、更に
３７°Ｃで３０分間反応させた。

また、５０検体のヒト血清に５８℃、３０分の血清熱処
理を行った後、上記と同様に反応させた。

各場合について、実施例１と同様にして最大溶出率を測
定した結果を一括して第２図に示す。

これと比較するために、従来の方法により、ジスルフィ
ド結合を介してモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体を固定
化したリポソームを用い、上記と同一の５０検体のヒト
血清との相互作用を」１記と全く同様にして調べた。そ
の結果を第３図に示す。

第２図から、本発明方法により調製されたリポソームは
血清に対して非常に安定であることがわかる。なお、１
検体についてはリポソームの非特異溶解が認められるが
、血清熱処理を行えば非特異溶解が解消されることがわ
かる。これに対して、第３図から明らかなように、従来
のリポソームは血清皆対して非常に不安定である。

［発明の効果］以上詳述したように本発明方法によれば、リポソーム」
二に生理活性物質を安定に固定化することができ、血液
や血清中でもリポソームが崩壊するようなことはない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法により調製されたリポソームを用い
てヒトＡＦＰを測定した時のヒ）　ＡＦＰ濃度と最大溶
出率との関係を示す特性図、第２図は本発明方法により
調製されたリポソームとヒト血清及び補体とを混合した
時の最大溶出率を示す特性図、第３図は従来の方法によ
り調製されたリポソームとヒト血清及び補体とを混合し
た時の最大溶出率を示す特性図である。

Claims

【特許請求の範囲】

ハロゲン化アルキル基を含有するリン脂質及び糖脂質の
うち少なくとも一方を組成の一部とするリポソームに、
遊離のＳＨ基を含有する生理活性物質を固定化する際に
、反応時のｐＨを７〜１１の範囲に調整することを特徴
とするリポソーム上への生理活性物質の固定化方法。