DE3872151T2 - Immobilisierung einer bioaktiven substanz an einer lipidzusammensetzung, enthaltend eine modofizierte lipidverbindung. - Google Patents
Immobilisierung einer bioaktiven substanz an einer lipidzusammensetzung, enthaltend eine modofizierte lipidverbindung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lipidverbindung, die durch eine funktionelle Gruppe modifiziert ist, welche in geeigneter Weise an biologisch aktive Substanzen wie ein Antigen, einen Antikörper und ein Enzym gebunden werden kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Lipidzusammensetzung bzw. -masse, die zumindest die obige Lipidverbindung enthält und sich für die Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen eignet.
- Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zum Immobilisieren biologisch aktiver Substanzen an die oben genannte Lipidzusammensetzung bzw. -masse sowie die Lipidmasse mit den durch dieses Verfahren immobilisierten biologisch aktiven Substanzen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Liposomreagens, erhalten durch Immobilisieren eines Antigens oder Antikörpers auf der Oberfläche eines Liposoms, das aus der obigen Lipidzusammensetzung bzw. -masse hergestellt ist. Dieses Liposom ist im Immunoassay wirksam.
- Immunoassay ist ein analytisches Verfahren zum Identifizieren und quantitativen Bestimmen eines spezifischen Antigens oder Antikörpers, das bzw. der in einer Probe enthalten ist, wobei die hohe Spezifität und Empfindlichkeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion genutzt wird.
- Bekannte Beispiele für ein quantitatives Analysenverfahren gemäß dem Immunoassay sind Radioimmunoassay (der hier im folgenden als RIA bezeichnet wird) und Immunelektrophorese. Beim RIA muß jedoch, da ein radioaktives Element verwendet wird, eine spezielle Ausrüstung für den Umgang mit dem radioaktiven Element verwendet werden, und die Bedienung der Apparatur muß durch einen Mitarbeiter erfolgen, die hierfür eine Genehmigung besitzt. Außerdem ist das RIA-Abfallmaterial schwierig zu handhaben, da ein radioaktives Element benutzt wird.
- Unterdessen kann die Immunelektrophorese wegen ihrer niedrigen Empfindlichkeit dann nicht zum Einsatz gelangen, wenn die Konzentration der zu ermittelnden bzw. zu messenden Substanz deutlich niedrig ist. Zusätzlich ist ein langer Zeitraum-für die Messung erforderlich.
- Vor kurzem wurden Immunoassays durchgeführt, bei denen eine Lipidmembran, beispielsweise ein Liposom oder eine LB- Membran, auf deren Oberfläche ein Antigen oder Antikörper immobilisiert ist, verwendet und dann Komplement zugegeben wurde. In diesem Immunoassay wird das Komplement durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem immobilisierten Antigen oder Antikörper und der zu ermittelnden bzw. zu messenden Substanz in der Probe aktiviert, und schließlich erfolgt die Lyse der Lipidmembran durch eine Kaskadenreaktion des aktivierten Komplements. Als Reagens für die Ausführung eines Immunoassays unter Einsatz einer solchen Komplementreaktion haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung in z. B. der japanischen Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 60- 117159 ein Liposomreagens offenbart, auf dessen Oberfläche ein hydrophiles Antigen oder ein solcher Antikörper immobilisiert ist und in dem eine hydrophile Markersubstanz eingeschlossen ist. Dieses Liposomreagens wird durch die obige Reaktion in einer Probe zerstört, in der ein Antigen oder Antikörper vorhanden ist, und die darin eingeschlossene Markersubstanz wird freigesetzt. Die Menge an freigesetzter Markersubstanz kann mit der der zu messenden Substanz in Korrelation gesetzt werden. Deshalb kann die zu messende Substanz durch quantitative Bestimmung der freigesetzten Markersubstanz mit Hilfe eines vorbestimmten Analysenverfahrens (beispielsweise Fluoreszenzanalyse) quantitativ bestimmt werden.
- In einem anderen gängigen Verfahren wird eine LB (Langmuir Blodgett) Membran verwendet, auf deren Oberfläche ein Antigen oder Antikörper immobilisiert ist, und eine zu messende Substanz in einer Probenlösung wird durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion und eine Reaktion von Komplement in der gleichen Weise quantitativ bestimmt, wie wenn das Liposomreagens verwendet wird.
- Darüberhinaus kann eine andere Analyse anstelle eines Immunoassays durchgeführt werden, indem eine andere biologisch aktive Substanz als ein Antigen oder Antikörper, beispielsweise ein Enzym, an eine Lipidmembran, z. B. ein Liposom oder eine LB Membran, gebunden wird.
- Gängige Verfahren zum Immobilisieren von biologisch aktiven Substanzen wie z. B. einem Enzym und einem Antikörper auf der Oberfläche einer Lipidmembran sind die folgenden:
- Ein Verfahren unter Verwendung von Phosphatidylethanolamin (DTP-DPPE), modifiziert durch N-Hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) (z. B.: L.D.Leserman, H. Barnet, F. Kourilski und J.N. Weinstein; Nature, 288, Seiten 602-604 (1980), und F.J. Martin, W.L. Hubbell und D. Papahadjopoulos; Biochemistry, 20, Seiten 4229-4238 (1981));
- Ein Verfahren unter Verwendung eines Lipids, in das eine Thiomaleinimidogruppe eingeführt wurde (H. Hashimoto, M. Sugawara und H. Endoh; J. Immunol. Methods, 62, Seiten 155- 162 (1983)); und
- Ein Verfahren unter Verwendung eines Lipids, in das eine Disulfidgruppe eingeführt wurde (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-45775).
- Die obigen Immobilisierungsverfahren weisen jedoch die folgenden Schwierigkeiten auf. So wird in diesen Verfahren, wenn ein Immunoassay unter Verwendung einer Lipidmembran eingesetzt wird, an der ein Antigen oder Antikörper immobil gemacht worden ist, die Lipidmembran manchmal zerstört, wenn sie mit Blut oder Serum vermischt wird, unabhängig davon, ob eine zu messende Substanz ("Target-Substanz") vorhanden ist. Beispielsweise wird das Liposomreagens (das in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 60-117159 offenbart ist) mit einem auf seiner Oberfläche immobilisierten Antikörper sofort in bedeutender Menge zerstört, wenn es mit Blut oder Serum als Probe vermischt wird, und die Freisetzung einer eingeschlossenen Verbindung wird festgestellt. Aus diesem Grund ist es unmöglich, die zu messende Substanz im Blut genau quantitativ zu bestimmen, da das Hintergrundrauschen hoch ist. Es wird angenommen, daß eine solche Schwierigkeit dadurch verursacht wird, daß zusätzlich zu der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der zu messenden Substanz und dem Liposom eine unspezifische Reaktion zwischen einem anderen Protein oder einer untergeordneten chemischen Verbindung im Blut oder Serum und dem Liposom stattfindet.
- Um solche nachteiligen Wirkungen der unspezifischen Reaktion zu eliminieren, wird eine Serum oder Protein enthaltende Probe verdünnt, zum Beispiel etwa hundertfach. In diesem Verfahren wird jedoch eine zu messende Substanz, die ursprünglich nur in geringer Konzentration enthalten ist, vor der Analyse weiter verdünnt. Deshalb ist es manchmal sehr schwierig, bestimmte Arten von zu messenden Substanzen präzise quantitativ zu bestimmen.
- Die EP-A-0144084, die sich mit der Herstellung von durch Antigen (Antikörper) empfindlich gemachten, also sensibilisierten Liposomen befaßt, erwähnt in ihrer allgemeinen Offenbarung die Möglichkeit, O-Bromacetyl-N-hydroxy-succinimid als möglichen Lipidaktivator einzusetzen, sie schlägt jedoch nicht vor, daß durch die Verwendung eines einzelnen Aktivators ein aktivierender Effekt erzielt werden könnte.
- Es ist deshalb ein erster Gegenstand der Erfindung, eine Lipidverbindung zur Verfügung zu stellen, an welcher biologisch aktive Substanzen in geeigneter Weise immobilisiert werden können. Spezifischer ist es Ziel der Erfindung, eine Lipidverbindung zur Verfügung zu stellen, die als Mittel zum Immobilisieren eines Antigens oder Antikörpers auf der Oberfläche einer Lipidmembran dienen kann, beispielsweise auf der eines Liposoms, das die Lipidverbindung enthält, wobei das gewonnene Liposomreagens oder dergleichen für den Immunoassay frei von unspezifischer Reaktion ist.
- Die Lipidverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die folgende Formel (I) dargestellt, worin X ein Halogenatom ist, Y -NHCO-, -COO- oder -O- bedeutet, R einen Phospholipidrest darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist:
- R-Y-(CH&sub2; )n-X . . . (I)
- Das durch die Formel (I) dargestellte Lipid reagiert mit einer biologisch aktiven Substanz an der funktionellen Gruppe -Y-(CH2)n-X und kann an die biologisch aktive Substanz gebunden werden.
- Es ist ein zweiter Gegenstand der Erfindung, eine Lipidzusammensetzung bzw. -masse, die sich für das Immobilisieren biologisch aktiver Substanzen eignet, und spezifischer, eine Lipidzusammensetzung bzw. -masse bereitzustellen, die zur Herstellung einer Lipidmembran verwendet werden kann, auf der ein Antigen oder Antikörper immobilisiert vorliegt, beispielsweise ein Liposomreagens für einen Immunoassay. Das erhaltene Liposomreagens ist stabil und frei von einer unspezifischen Reaktion in der Probe.
- Diese Lipidzusammensetzung bzw. -masse enthält mindestens die obige Lipidverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und kann weiteres Lipid enthalten. Mit dieser Lipidmasse kann leicht eine Lipidmembran, beispielsweise ein Liposom oder eine LB-Membran, oder ein anderer aus Lipid gebildeter Körper erhalten werden. Da auf der Oberfläche der Membran eine funktionelle Gruppe der Lipidverbindung vorhanden ist, können die biologisch aktiven Substanzen über die funktionelle Gruppe immobilisiert werden. Wenn ein Antigen oder Antikörper immobilisiert wird, kann eine Zusammensetzung bzw. Masse für den Immunoassay gewonnen werden, die keine unspezifische Reaktion in der Probenlösung wie Blut oder Serum verursacht, beispielsweise in Form einer Membran.
- Es ist ein dritter Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um in geeigneter Weise biologisch aktive Substanzen an der Lipidmasse zu immobilisieren, sowie eine Lipidmasse, an der gemäß diesem Verfahren biologisch aktive Substanzen immobilisiert sind. In diesem Verfahren werden die biologisch aktiven Substanzen dadurch an der Lipidmasse immobilisiert, daß die biologisch aktiven Substanzen, in die eine SH-Gruppe eingeführt ist, unter geeigneten Bedingungen mit der Masse vermischt werden. Bei diesem Verfahren reagiert die funktionelle Gruppe -Y-(CH&sub2;)n-X der Masse mit der SH-Gruppe, die in die biologisch aktiven Substanzen eingeführt wurde, so daß die biologisch aktiven Substanzen durch eine Thioether-Bindung (-S-C-) stabil immobilisiert sind.
- Es ist ein vierter Gegenstand der Erfindung, ein Liposomreagens zur Verfügung zu stellen, das als Immunoassay-Reagens verwendet werden kann. Dieses Liposomreagens besteht aus einem Liposom, das aus der Lipidmasse, einem Antigen oder Antikörper, der auf der Oberfläche des Liposoms immobilisiert ist, und einer Markersubstanz besteht, die im Liposom eingeschlossen ist. Im Vergleich zu konventionellen Liposomreagentien ist mit dem Liposomreagens der vorliegenden Erfindung die Häufigkeit einer in einer Probenlösung wie Blut oder Serum auftretenden unspezifischen Reaktion signifikant gering. Deshalb kann mit diesem Liposomreagens der Immunoassay mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit durchgeführt werden.
- Diese Erfindung läßt sich anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen genauer verstehen, worin:
- Fig. 1 ein Querschnitt ist, der eine Ausführungsform einer Immunoassay-Vorrichtung mit einer LB-Membran zeigt, welche aus einem Lipid gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und auf deren Oberfläche eine biologisch aktive Substanz immobilisiert ist;
- Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die ein Infrarot-Absorptionsspektrum von in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung hergestelltem BrAc-DPPE zeigt;
- Fig. 3 eine graphische Darstellung ist, die ein ¹H-NMR-Spektrum des in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung hergestellten BrAc-DPPE zeigt;
- Fig. 4 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an Carboxyfluorescein (CF) zeigt, den man erhält, wenn ein in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung hergestelltes, BrAc-DPPE-haltiges Liposom mit einer Meerschweinchenserum-Lösung vermischt wird;
- Fig. 5 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn ein BrAc-DPPE-haltiges Liposom, auf dem menschliches IgG immobilisiert ist, mit einer gegen menschliches IgG gerichteten Kaninchen-Antikörper-Lösung vermischt wird;
- Fig. 6 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt' den man erhält, wenn ein im Vergleichsbeispiel 1 hergestelltes DTP-DPPE-haltiges Liposom mit einer Meerschweinchenserum-Lösung vermischt wird;
- Fig. 7 eine graphische Darstellung ist, die-den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn ein im Vergleichsbeispiel 2 hergestelltes MPB-DPPE-haltiges Liposom mit einer Meerschweinchenserum-Lösung vermischt wird;
- Fig. 8 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn ein in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung hergestelltes, BrAc- DPPE-haltiges Liposom, auf dem ein monoklonaler Antikörper immobilisiert ist, mit einer Lösung von menschlichem AFP vermischt wird;
- Fig. 9 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn ein ClAc-DPPE, BrAc-DPPE oder IAc-DPPE enthaltendes Liposom, auf dem ein monoklonaler Antikörper immobilisiert ist, mit einer Lösung von menschlichem AFP vermischt wird;
- Fig. 10 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn ein im Vergleichsbeispiel 3 hergestelltes Liposom-Reagens mit einer Lösung von menschlichem AFP vermischt wird;
- Fig. 11 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn menschliches Serum mit einem Liposom vermischt wird, auf dem ein monoklonaler Antikörper immobilisiert ist, hergestellt unter Verwendung des Lipids der vorliegenden Erfindung, gemäß Beispiel 4; und
- Fig. 12 eine graphische Darstellung ist, die den freigesetzten Anteil an CF zeigt, den man erhält, wenn das gleiche menschliche Serum, das in Fig. 11 verwendet wird, mit einem Liposom vermischt wird, auf dessen Oberfläche mit Hilfe eines gängigen Verfahrens ein monoklonaler, gegen menschliches AFP gerichteter Antikörper durch eine Disulfidbrücke immobilisiert ist.
- Die Lipidverbindung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgende Formel (I) dargestellt, worin X ein Halogenatom ist, Y -NHCO-, -COO- oder -O- bedeutet, R einen Phospholipidrest darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist:
- R-Y-(CH&sub2;)nX . . . . (I)
- Wie oben beschrieben, ist die Lipidverbindung (I) ein modifiziertes Lipid mit einer über Y verknüpften halogenierten Alkylgruppe. In diesem Fall ist Y vorzugsweise -NHCO-.
- Die Lipidverbindung (I), in welcher Y -NHCO- bedeutet, kann beispielsweise durch Umsetzen eines aminogruppenhaltigen Lipids mit halogenierter Carbonsäure unter geeigneten Bedingungen gewonnen werden, um Kondensation unter Wasserabspaltung zu erzielen, wobei eine Peptidbindung zwischen den Gruppen gebildet wird.
- Bevorzugte Beispiele für das aminogruppenhaltige Phospholipid sind Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Cytidylphosphoglycerid, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylethanolamin, Palmitoyl-stearoyl-glycerophosphoethanolamin, Glycerophosphonoethylamin und Ceramidphosphoethanolamin.
- Die in der obigen Umsetzung verwendete halogenierte Carbonsäure wird durch Halogenieren einer Carbonsäure mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen gewonnen und ist vorzugsweise eine halogenierte Essigsäure. In diesem Fall ist das Halogenatom vorzugsweise Cl, Br oder I.
- Die obige Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Katalysators wie N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid und Triethylamin durchgeführt.
- Die Lipidverbindung (I), worin Y -COO- bedeutet, kann beispielsweise durch Umsetzen eines hydroxylgruppenhaltigen Lipids mit einer halogenierten Carbonsäure unter geeigneten Bedingungen gewonnen werden, wobei eine Esterbindung zwischen den Gruppen gebildet wird.
- Beispiele für die hydroxylgruppenhaltigen Lipide sind Glycerinphosphoglycerid, Phosphatidylinositol und Sulfolipid I.
- Die Lipidverbindung (I), worin Y -O- bedeutet, kann beispielsweise durch Umsetzen eines der oben aufgezählten, hydroxylgruppenhaltigen Lipide mit Halohydrincarbonsäure unter geeigneten Bedingungen gewonnen werden, wobei eine Etherbindung zwischen den Gruppen gebildet wird.
- Das durch Formel (I) dargestellte Lipid kann an einem Teil der funktionellen Gruppe -Y-(CH&sub2;)n-X mit einer biologisch aktiven Substanz zur Umsetzung gebracht und an sie gebunden werden. Ein reaktiver Teil der biologisch aktiven Substanz ist eine nukleophile funktionelle Gruppe wie z. B. -NH&sub2; und -SH, die auf ihrer Oberfläche vorliegt. Wenn die Lipidverbindung und die biologisch aktive Substanz unter geeigneten Bedingungen vermischt und miteinander zur Reaktion gebracht werden, wird X in der Lipidverbindung durch die nukleophile funktionelle Gruppe der biologisch aktiven Substanz substituiert, so daß die biologisch aktive Substanz an die Lipidverbindung gebunden wird.
- In diesem Fall ist die funktionelle Gruppe auf Seiten der biologisch aktiven Substanz vorzugsweise -SH. Der Grund hierfür ist, daß die Nukleophilie von -SH größer ist als die anderer funktioneller Gruppen. Beispielsweise kann ein monoklonaler Antikörper nicht ohne die -SH-Gruppe gebunden werden.
- Wenn die biologisch aktive Substanz keine -SH-Gruppe aufweist, kann die -SH-Gruppe durch Modifizierung der biologisch aktiven Substanz mit SPDP und Reduktion ihrer -S-S-Bindung erzeugt werden. Ein Immunglobulin, beispielsweise ein monoklonaler Antikörper, kann als F(ab')-Fragment mit -SH- Gruppe eingesetzt werden, indem die -S-S-Bindung an einer Scharnier-Stelle reduziert wird.
- Die Lipidverbindung (I) kann zusammen mit anderen Lipiden als Lipidzusammensetzung bzw. -masse für die Immobilisierung bioaktiver Substanzen verwendet werden. Beispiele für andere-Lipide als das durch Formel (I) dargestellte sind Cholesterin und Dipalmitoylphosphatidylcholin. Diese Lipidmasse kann in Form einer Lipiddoppelschicht-Membran eingesetzt werden, beispielsweise eines Liposoms oder einer LB-Membran. In diesem Fall kann die Stabilität des Liposoms oder der LB-Membran durch den Zusatz von Cholesterin verbessert werden. Darüberhinaus weist ein Liposom, welches Cholesterin und Dipalmitoylphoshatidylcholin enthält, im Vergleich zu einem Liposom, welches andere ungesättigte oder gesättigte Fettsäuren enthält, eine ausgezeichnete Langzeit-Lagerungsstabilität auf. Der Gehalt an durch Formel (I) dargestelltem Lipid in dieser Lipidmasse beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Mol-%.
- Eine biologisch aktive Substanz kann auf der Lipidmasse durch eine Bindungsreaktion zwischen der in der Masse enthaltenen Lipidverbindung (I) und der biologisch aktiven Substanz immobilisiert werden. Beispiele für die zu immobilisierende, biologisch aktive Substanz sind ein Protein oder Peptid (z. B. ein Immunglobulin wie IgG, IgE, IgD, IgA und IgM; ein Enzym wie z. B. Transaminase, Lactatdehydrogenase und Creatinphosphokinase; ein Tumormarker wie z. B. AFP und CEA; ein Peptidhormon wie z. B. Insulin und Wachstumshormon (GH)), ein Glucid (z. B. verschiedene Lewis-Antigene, Forssman Antigene und Polysaccharide aus den Zellwänden von Mikroorganismen), eine mit Nucleinsäure verwandte Substanz (z. B. Polynucleotid, Nucleotid und Nucleosid), ein Lipid (z. B. Lipoprotein und Cardiolipin) und andere Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht (z. B. Coenzym, Steroidhormon, Thyroxin und verschiedene Arzneimittel).
- Um die Lipidmasse der vorliegenden Erfindung in Form eines Liposoms herzustellen, kann ein gängiges Liposom-Herstellungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise wird die Lipidmasse in einem Lösungsmittel gelöst, und dann wird das Lösungsmittel entfernt, wobei sich eine dünne Membran der Masse bildet. Dann wird eine Lösung (z. B. eine wäßrige Lösung) zugefügt, wobei ein Solvens verwendet wird, das die Lipidmasse nicht lösen kann, und es wird geschüttelt, um das Liposom herzustellen.
- Um die Masse in Form einer Lipiddoppelschicht-Membran herzustellen, kann ein gängiges Doppelschicht-Herstellungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise wird bei Verwendung der Langmuir-Blodgett-Technik die Masse auf einer Wasseroberfläche in die Form einer monomolekularen Membran gebracht, und die gebildete monomolekulare Membran wird auf einer Haltevorrichtung angeordnet, wobei sich die Lipiddoppelschicht ausbildet.
- Die Lipidmasse der vorliegenden Erfindung ist auf dem Gebiet des Immunoassays wirksam. Das bedeutet, daß ein im Immunoassay wirksames Liposomreagens aus der Lipidmasse- erzeugt werden kann. Dieses Liposomreagens besteht aus einem Liposom, das unter Verwendung der Lipidmasse hergestellt wurde, einer biologisch aktiven Substanz (in diesem Fall einem Antigen oder Antikörper), der auf der Oberfläche des Liposoms immobilisiert ist, und einer Markersubstanz, die im Liposom eingeschlossen ist. Das Antigen oder der Antikörper wird unter den oben beschriebenen biologisch aktiven Substanzen ausgewählt. Beispiele für die im Liposomreagens verwendete Markersubstanz sind eine fluoreszierende Verbindung wie Carboxyfluorescein, eine absorptionsfähige Verbindung wie z. B. Rhodamin B und eine lumineszierende Verbindung wie z. B. Luminol.
- Das Liposomreagens kann wie folgt zubereitet werden:
- Als erstes wird nach dem obigen Verfahren ein Liposom aus der Lipidmasse der vorliegenden Erfindung hergestellt. Hierbei kann ein Liposom, in welches eine Markersubstanz eingeschlossen ist, hergestellt werden, und zwar unter Verwendung einer wäßrigen Lösung der Markersubstanz als Lösung mit einem Solvens, das die Lipidmasse nicht lösen kann. Derweil wird ein Antigen oder Antikörper mit einer funktionellen Gruppe wie z. B. -NH&sub2; oder -SH hergestellt. Das Antigen oder der Antikörper wird zu der Liposomsuspension gegeben und dann eingemischt, und unter geeigneten Bedingungen wird die Umsetzung der Reaktionsteilnehmer bewirkt. Als Folge davon wird das Antigen oder der Antikörper mit der auf der Oberfläche des Liposoms vorhandenen funktionellen Gruppe (-Y-(CH&sub2;)nX) umgesetzt und auf der Liposomoberfläche gebunden und immobilisiert. Wenn die in das Antigen oder den Antikörper eingeführte funktionelle Gruppe -SH ist, wird das Antigen oder der Antikörper über eine Thioether-Bindung (-S-C-) stabil auf dem Liposom immobilisiert.
- Das Liposom mit dem darauf immobilisierten Antigen oder Antikörper, d. h. das Liposomreagens, kann in einer Probe spezifisch mit dem Antigen oder dem Antikörper reagieren und kann deshalb im Immunoassay eingesetzt werden. Aus diesem Grund wird die Reaktion der Immobilisierung des Antigens oder Antikörpers Sensibilisierung genannt. Der Wirkungsgrad der Sensibilisierung beträgt nicht 100% und ist im allgemeinen nicht so hoch. Deshalb verbleibt selbst im Liposomreagens, das der Sensibilisierung unterworfen worden ist, noch eine freie funktionelle Gruppe (in dieser Erfindung -Y-(CH&sub2;)nX), die nicht an das Antigen oder den Antikörper gebunden ist. Es wird angenommen, daß in einem gängigen Liposomreagens diese freie funktionelle Gruppe eine unspezifische Reaktion verursacht, basierend auf der Aktivierung von Komplement durch den bzw. einen alternativen Reaktionspfad. Ähnlich verbleiben in der vorliegenden Erfindung einige funktionelle Gruppen (-Y- (CH&sub2;)n-X) nach der Sensibilisierung frei im Liposom. Eine derartige funktionelle Gruppe wird jedoch unter einem geeigneten pH (einem pH von 8 bis 11) hydrolysiert und zu -Y-(CH&sub2;)n-OH umgesetzt. Nach der Umsetzung ist ein Einwirken der funktionellen Gruppe und die daraus resultierende unspezifische Reaktion deutlich niedrig. Deshalb kann bei der Verwendung des Liposomreagens, der vorliegenden Erfindung die unspezifische Reaktion ausgeschaltet werden, so daß Immunoassays mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden können.
- Zu bemerken ist, daß die Sensibilisierung vorzugsweise unter einem pH von 7 bis 11 durchgeführt wird, wenn die -SH- Gruppe in das Antigen oder den Antikörper eingeführt wird. Wenn der pH niedriger als 7 ist, ist der Wirkungsgrad der Sensibilisierung nicht ausreichend. Wenn der pH 11 übersteigt, ist das Liposom, auf dem die biologisch aktive Substanz immobilisiert ist, instabil. Unter dieser Bedingung wird das Liposom beispielsweise in Blut oder Serum zerstört.
- Wenn ein durch einen spezifischen Antikörper sensibilisiertes Liposomreagens verwendet werden soll, wird der Immunoassay wie folgt durchgeführt. Das Liposomreagens wird zu einer Probe zugesetzt, die eine zu messende Substanz (Antigen) enthält, und für eine vorbestimmte Zeit zur Umsetzung gebracht, wobei eine Antigen-Antikörper-Reaktion bewirkt wird. Dann werden geeignete Mengen eines zweiten Antikörpers gegen die zu messende Substanz zusammen mit einer geeigneten Menge Komplement zugegeben und für eine vorbestimmte Zeit umgesetzt. In diesem Fall kann nicht nur ein isoliertes und gereinigtes Komplement verwendet werden, sondern es kann als Quelle für das Komplement auch eine Körperflüssigkeit wie z. B. Meerschweinchenserum mit einer hohen Komplementkonzentration verwendet werden. Dann wird diejenige Menge der Markersubstanz durch geeignete Mittel gemessen, die aus dem durch Einwirkung des Komplements zerstörten Liposom freigesetzt wurde. Da die freigesetzte Markersubstanz mit der zu messenden Substanz in der Probe korreliert werden kann, kann die zu messende Substanz durch quantitative Bestimmung der freigesetzten Markersubstanz quantitativ erfaßt werden. Bei der tatsächlich ausgeführten quantitativen Bestimmung wird auf Basis einer Kalibrierungskurve, die zuvor unter Verwendung einer zu messenden Substanz bekannter Konzentration erstellt worden ist, die Menge der zu messenden Substanz gemäß einem Meßwert der Markersubstanz ermittelt, der unter den selben Bedingungen wie denen, unter denen die Kalibrierungskurve erstellt wurde, gemessen wurde.
- Die Zeit, die für das Bewirken einer ausreichenden Reaktion zwischen dem Liposomreagens der vorliegenden Erfindung und der zu messenden Substanz (Targetsubstanz) benötigt wird, schwankt je nach Art der zu messenden Substanz, den Eigenschaften des Liposoms und den Reaktionsbedingungen und mit der Art, Reinheit und Bindungsform der biologisch aktiven Substanz, die Bestandteil des Liposomreagens' ist. Aus diesem Grund wird vorzugsweise ein Vortest unter Verwendung einer Probe durchgeführt, die eine mit der zu messenden Substanz identische Substanz enthält und mit einer bekannten Konzentration hergestellt ist; hierbei wird eine optimale Reaktionszeit für das Liposomreagens und die zu messende Substanz festgestellt.
- Beispiele für die zu messende Substanz, die durch einen Immunoassay unter Verwendung des Liposomreagens' quantitativ bestimmt werden kann, sind ein Tumormarker (z. B. AFP, BFP, CEA und POA), ein Immunglobulin (z. B. IgG, IgE, IgD, IgA, IgM), ein Hormon (z. B. Insulin und T&sub3;) und Arzneimittel. Der Umfang der Substanzen, die gemessen werden können, ist weit.
- Die erfindungsgemäße Lipidmasse für die Immobilisierung der bioaktiven Substanzen kann in Form einer LB-Membran verwendet werden. So zeigt beispielsweise Fig. 1 eine Immunoassay-Apparatur, in der eine LB-Mmbran mit einem darauf immobilisierten Antikörper eingesetzt ist. In Fig. 1 weist ein Halter aus Harz 1 in seinem zentralen Teil ein durchgehendes Loch auf. Eine scheibenartige Silberelektrode 2 mit einer Ag/Agcl-Elektrode 3 auf ihrer oberen Oberfläche, ein ringförmiger Keramik-Abstandshalter 4, ein Keramikfilter 6 mit der LB-Membran 7, auf deren oberer Oberfläche ein Antikörper immobilisiert worden ist, und eine ringförmige Silberelektrode 8 mit einer Ag/Agcl-Elektrode 9 auf ihrer inneren Oberfläche sind aufeinander folgend vom Bodenteil ausgehend im durchgehenden Loch des Halters 1 übereinander angeordnet. Salzlösung 5 wird in einen Hohlteil auf die Elektrode 3 gefüllt. Die Salzlösung 5 steht durch die Poren des Filters 6 in Kontakt mit der unteren Oberfläche der Membran 7. Die Meßableitungen 10 bzw. 11 sind mit den Elektroden 3 bzw. 8 verbunden. Anzumerken ist, daß eine Gleichstromquelle und ein Widerstandsmesser (die beide nicht gezeigt sind) mit den Ableitungen 10 und 11 verbunden sind. Bezugszeichen 12 bezeichnet eine Probenlösung, die eine zu messende Substanz enthält.
- Diese Apparatur nutzt eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der zu messenden Substanz in der Lösung 12 und der biologisch aktiven Substanz, die auf der Membran 7 immobilisiert ist, und eine damit verbundene Reaktion, in welcher in der Membran 7 durch Einwirkung eines separat zugesetzten Komplements eine große Anzahl von Poren gebildet wird. Wenn eine große Anzahl von Poren in der Membran 7 gebildet wird, fließt kräftig Elektrolyt, und der Membranwiderstand der Membran 7, der zwischen den Meßableitungen 10 und 11 gemessen wird, wird verringert. Die Menge an zu messender Substanz in der Probenlösung kann mit der Anzahl der Poren in Korrelation gebracht werden, und die Anzahl der Poren kann mit den Veränderungen des Membranwiderstands in Korrelation gebracht werden. Deshalb kann die zu messende Substanz in der Probenlösung durch das Messen von Veränderungen des Membranwiderstands quantitativ bestimmt werden.
- Beispiele der vorliegende Erfindung werden nachfolgend im einzelnen beschrieben.
- 70 mg Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), zu beziehen von Sigma Inc., 25 mg Bromessigsäure, zu beziehen von Wako Pure Chemicals Inc., und 20 mg Hydroxysuccinimid, zu beziehen von Peptide Institute Co., Ltd., wurden in etwa 30 ml Chloroform suspendiert. Nachdem 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid, zu beziehen von Peptide Institute Co., Ltd., und 40 ul Triethylamin, zu beziehen von Wako Pure Chemicals Inc., zu der gebildeten Lösung zugegeben worden waren, wurde die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht der Reaktion überlassen. Nachdem das Lösungsmittel aus der erhaltenen Lösung entfernt worden war, wurden 30 ml Ethylacetat zugesetzt. Der erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert, und dann wurde das Lösungsmittel erneut entfernt. Das gebildete Material wurde in 2 ml Chloroform gelöst, und das Produkt wurde durch eine Dünnschichtchromatographie #5717 (Handelsname), zu beziehen von Merck Schuchardt, abgetrennt, wobei eine Lösungsmittelmischung aus Chloroform/Methanol/Wasser = 65/25/4 als Laufmittel verwendet wurde. Ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erhaltenen BrAc-DPPE ist in Fig. 2 dargestellt, und sein ¹H- NMR-Spektrum ist in Fig. 3 abgebildet. In Fig. 2 treten verschiedene charakteristische Absorptionen zusätzlich zu der charakteristischen Absorption bei 1170 cm&supmin;¹ auf, die von -CH&sub2;Br verursacht wird. In Fig. 3 wird zusätzlich zu den Peaks, die auf DPPE hinweisen, ein Peak gefunden, der ein Proton einer CH&sub2;-CO-Gruppe anzeigt. Durch Vergleichen dieser Spektren mit Spektren einer Substanz (DPPE) wurde bestätigt, daß das Produkt die folgende Formel aufwies:
- Das BrAc-DPPE wurde auf 1 mM verdünnt und bei -20ºC aufbewahrt.
- Alle eingesetzten Lipide wurden in Chloroform oder einer Solvensmischung aus Chloroform/Methanol (2/1) gelöst.
- 200 ul 5 mM Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), zu beziehen von Sigma Inc., 100 ul 10 mM Cholesterin, zu beziehen von Sigma Inc., und 50 ul 1 mM BrAc-DPPE wurden in einen birnenförmigen Kolben mit einem Volumen von 10 ml gegeben. Nachdem 2 ml Chloroform zugesetzt worden waren, wurde die Lösung gut gemischt. Dann wurde das Lösungsmittel unter Verwendung eines Rotationsverdampfers in einem Wasserbad bei einer Temperatur von etwa 40ºC entfernt. Zum gebildeten Rückstand wurden 2 ml Chloroform zugesetzt. Dann wurde die Mischung ausreichend in Bewegung gehalten, und das Solvens wurde wiederum mit Hilfe des Rotationsverdampfers entfernt. Durch mehrmaliges Wiederholen dieser Behandlung wurde auf der Oberfläche der Kolbenwand eine dünne Lipidmembran ausgebildet. Der Kolben wurde in einen Exsiccator eingebracht und mittels einer Vakuumpumpe etwa eine Stunde lang evakuiert, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen.
- Dann wurden 100 ul 0,2 M Carboxyfluorescein (Eastman Kodak Inc., pH = 7,4: hier im folgenden mit CF bezeichnet) zugegeben, und das Innere des Kolbens wurde durch Stickstoff ersetzt. Ohne Unterbrechung wurde der Kolben verschlossen und in ein Wasserbad von etwa 60 C etwa eine Minute lang eingetaucht. Danach wurde der Kolben mit einem Vortex-Mischer kräftig geschüttelt, bis die dünne Lipidmembran auf der Oberfläche der Kolbenwand vollständig verschwunden war. Im Ergebnis war eine Liposomsuspension hergestellt worden. Eine kleine Menge 0,01 M HEPES-Puffer (enthaltend 0,85% NaCl, pH = 7,45: hier im folgenden mit HBS bezeichnet) wurde zu der Liposomsuspension gegeben, und dann wurde das gesamte gebildete Material in ein Zentrifugenröhrchen überführt und wiederholt 20 Minuten lang bei 4ºC und 15 000 Upm zentrifugiert. Das gewonnene Liposom wurde in 2 ml HBS suspendiert.
- Das in (2) hergestellte, BrAc-DPPE-haltige Liposom wurde mit einem Gelatine-Veronal-Puffer (GVB&spplus;, pH = 7,2) um den Faktor 10 verdünnt. Inzwischen wurde ein Meerschweinchenserum mit dem GVB&spplus; um Faktoren zwischen 1 und 80 auf vorbestimmte Verdünnungswerte gebracht. Gleiche Mengen dieser Materialien wurden vermischt und bei 37ºC gehalten, und die Fluoreszenz-Intensität des nach 30 Minuten freigesetzten CF wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer MTP-32 (Handelsname), zu beziehen von Corona Electronic Co., Ltd., mit einer Anregungswellenlänge von 490 nmm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 530 nm gemessen.
- Die freigesetzte Anteil an Markersubstanz wurde auf Basis der obigen Messung und gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
- Freigesetzter Anteil (%) = (Fe - Fo)/(Fa - Fo) · 100
- worin Fe die gemessene Fluoreszenzintensität ist, Fo die Fluoreszenzintensität ist, die man erhielt, wenn GVBÖ zugesetzt wurde (in diesem Fall wurde das Liposom überhaupt nicht zerstört), und Fa die Fluoreszenzintensität ist, die man erhielt, wenn entionisiertes Wasser zugesetzt wurde, um das Liposom vollständig zu zerstören. Es ist anzumerken, daß Fluoreszenzintensitäten von 10&supmin;&sup7; und 10&supmin;&sup8; M CF-Lösungen als Standardwerte verwendet wurden.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Aus Fig. 4 geht hervor, daß das Liposom mehr oder weniger zerstört wurde, wenn die Serumlösung mit einer Verdünnung mit einem Faktor von 10 oder weniger zugegeben wurde, daß aber das Liposom nicht zerstört wurde, wenn die Serumlösung mit einem Verdünnungswert mit Faktor 20 oder mehr zugesetzt wurde.
- Das in (3) hergestellte BrAc-DPPE enthaltende Liposom wurde in 1 ml einer Lösung, enthaltend 3 mg/ml menschliches IgG/HBS, suspendiert, und dann wurde die Suspension bei 20ºC 43 Stunden lang vermischt und in Bewegung gehalten, um die Immobilisierungsreaktion zu bewirken. Nach der Umsetzung wurde das gebildete Material dreimaligem Zentrifugen-Waschen mit GVB&supmin; (GVB&spplus;, das kein Ca&spplus;² und Mg²&spplus; enthält) unterworfen. Schließlich wurden 2 ml GVB&supmin; zugesetzt, und die Mischung wurde in einem Kühlschrank konserviert.
- Das in (4) erhaltene Liposom, an dem menschliches IgG immobilisiert war, wurde mit GVB&spplus; um einen Faktor 10 verdünnt. Derweil wurde ein Kaninchen-Antikörper gegen menschliches IgG mit GVB&spplus; auf vorbestimmte Konzentrationen zwischen 10&supmin;&sup6; und 10&supmin;¹ mg/ml verdünnt. Gleiche Mengen dieser Materialien wurden bei 37ºC vermischt und zur Umsetzung gebracht, und die Fluoreszenz-Intensität des nach 30 Minuten freigesetzten CF wurde mit dem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen. Auf Basis der Meßergebnisse wurde der freigesetzte Anteil auf ähnliche Weise wie oben beschrieben erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Anzumerken ist, daß in Fig. 5 0 auf der Abszisse den Zusatz einer Lösung darstellt, die durch Verdünnen von Meerschweinchenserum mit GVB&spplus; um den Faktor 40 erhalten wurde. Wie man Fig. 5 entnehmen kann, läßt sich in Abhängigkeit von der Konzentration des Kaninchen- Antikörpers gegen menschliches IgG eine Antwort durch das BrAc-DPPE enthaltende Liposom mit immobilisiertem menschlichem IgG gewinnen, und deshalb können Messungen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden.
- DTP-DPPE ist ein DPPE-Derivat mit darin eingeführtem Dithiopyridylpropionsäureamid.
- DPPE und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) wurden in Gegenwart von Triethylamin miteinander zu DTP-DPPE umgesetzt. Ein DTP-DPPE enthaltendes Liposom wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Änderung, daß DTP-DPPE anstelle von BrAc-DPPE verwendet wurde. Dann wurde das DTP-DPPE enthaltende Liposom mit Meerschweinchenserum vermischt, um den freigesetzten Anteil an CF zu erhalten, wobei das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, wurde das DTP-DPPE enthaltende Liposom auch durch Meerschweinchenserum mit einer hohen Verdünnungsrate zerstört und war dementsprechend sehr instabil.
- (gängiges Immobilisierungsreagens) und Meerschweinchenserum MPB-DPPE ist ein DPPE-Derivat mit darin eingeführtem Maleinimidophenylbutylat (MPB).
- Gemäß einem Verfahren von Hashimoto et al. wurden DPPE und Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butylat (SMPB), zu beziehen von Pierce Co., miteinander in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Triethylamin zu MPB-DPPE umgesetzt. Ein MPB-DPPE enthaltendes Liposom wurde nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Änderung., daß anstelle von BrAc-DPPE das MPB-DPPE verwendet wurde. Dann wurde das MPB-DPPE enthaltende Liposom mit Meerschweinchenserum vermischt, um den Freisetzungsanteil an CF zu erhalten, wobei die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, wurde das MPB-DPPE enthaltende Liposom auch durch Meerschweinchenserum mit einer hohen Verdünnungsrate zerstört und war also sehr instabil.
- 1 Millimol halogenierter Essigsäure (Chloressigsäure, Bromessigsäure und Iodessigsäure wurden unabhängig voneinander verwendet) wurde in 30 ml Chloroform gelöst. Nachdem 1,2 Millimol N-Hydroxysuccinimid und 1,2 Millimol Dicyclohexylcarbodiimid zu der gebildeten Lösung zugesetzt worden waren, wurde die Lösung bei Raumtemperatur 3 Stunden lang der Umsetzung überlassen. Danach wurde das gebildete Material mit Hilfe eines Rotationsverdampfers getrocknet, und 30 ml Ethylacetat wurden zugesetzt. Nachdem der gebildete weiße Niederschlag abfiltriert worden war, wurde das Solvens nochmals entfernt, und das entstandene Material wurde wiederum in 10 ml Chloroform gelöst. Dann wurden 100 Mikromol DPPE in 30 ml Chloroform suspendiert, 2 ml der obigen Lösung und 50 ul Triethylamin wurden hierzu zugesetzt, und die gebildete Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht der Umsetzung überlassen. Danach wurde das Lösungsmittel kondensiert, und das Produkt wurde abgetrennt und durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Lösungsmittel-Mischung aus Chloroform/Methanol 70/30 als Entwickler bzw. Laufmittel gereinigt. Die Ausbeute an DPPE, in das eine halogenierte Acetylgruppe eingeführt war, betrug ungefähr 50%. Das Endprodukt wurde mit Chloroform auf eine Konzentration von 1 mM verdünnt und bei -20ºC aufbewahrt.
- Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 wurde Liposom (in welchem das CF als Markersubstanz eingeschlossen war) hergestellt, das das DPPE mit der daran gebundenen halogenierten Acetylgruppe enthielt.
- 10 mg eines monoklonalen, gegen menschliches a-Fetoprotein (AFP) gerichteten Antikörpers wurde in einem Essigsäurepuffer mit pH 3,5 gelöst, 100 pg Pepsin wurden zugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde lang bei 37ºC umgesetzt. Danach wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie nur eine F(ab')&sub2;-Fraktion fraktioniert. Die F(ab')&sub2;-Fraktion wurde in einer mit 0,1 M Phosphat gepufferten Salzlösung (pH6) gelöst, 10 mg Mercaptoethylamin-Hydrochlorid wurden zugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC 90 Minuten lang umgesetzt. Danach wurde das gebildete Material einer Gelfiltration unterworfen, die auf Sephadex G-25 (Handelsname), zu beziehen von Pharmasia Fine Chemicals Inc., durchgeführt wurde und wobei eine mit 0,01 M Borat gepufferte Salzlösung (pH 8,0) als Laufmittel verwendet wurde, wodurch nur eine Protein-Fraktion (Fab') fraktioniert wurde. Die OD 280 nm dieser Fab'-Fraktion betrug etwa 1. Die Fab'-Fraktion enthielt eine freie SH-Gruppe.
- Die in (2) hergestellte Liposomsuspension und die in (3) erhaltene Fab'-Fraktion wurden vermischt und unter Rühren bei 20ºC 44 Stunden lang umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das gebildete Material dreimal mit dem GVB&supmin; gewaschen und schließlich in 2 ml GVB&supmin; suspendiert und bei 4ºC gelagert.
- Das in (4) hergestellte Liposom mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper wurde durch Zusatz von GVB&spplus; um den Faktor 10 verdünnt, was eine Liposom-Suspension ergab. Derweil wurde ein menschliches AFP durch Zusatz von GVB&spplus; verdünnt, wodurch man Lösungen menschlichen AFP's erhielt, deren jede eine vorbestimmte Konzentration aufwies. Die Konzentrationen der Lösungen des menschlichen AFP's fielen in den Bereich von 0,1 bis 10&sup4; ng/ml und waren jeweils unterschiedlich. 10 ul der Liposom-Suspension und der Lösung des menschlichen AFP's einer jeden Konzentration wurden miteinander vermischt und bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert. 25 ul der Lösung eines Kaninchen-Antikörpers gegen menschliches AFP (Dako Inc.), verdünnt um den Faktor 50, und 25 ul einer Komplement-Lösung (Meerschweinchenserum), verdünnt um den Faktor 20, wurden zu der gebildeten Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC 30 Minuten lang der Umsetzung überlassen. Dann wurde die Reaktion durch 100 ul eines 0,01 M EDTA- Veronal-Puffers gestoppt, und die Menge an freigesetztem CF wurde für jede Variante der Lösungen des menschlichen AFP's gemessen, wobei man die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 anwandte. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. Bei dieser Messung wurde BrAc-DPPE als funktionalisiertes Lipid eingesetzt. Es ist anzumerken, daß in Fig. 8 L auf der Abszisse bedeutet, daß nur Liposom-Suspension verwendet wurde, und 0 darauf gibt den Zusatz von GVB&spplus; anstelle von AFP an. Wie aus Fig. 8 ersichtlich ist, kann mit diesem Liposom mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper menschliches AFP innerhalb des Konzentrationsbereichs von 1 bis 10³ ng/ml mit sehr hoher Genauigkeit gemessen werden.
- Unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in (3) wurde eine Fab'-Fraktion eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliches AFP fraktioniert, und seine Konzentration wurde auf die Hälfte der obigen Konzentration eingestellt, d. h. auf OD 280 nm = 0,5. Daraufhin wurden unter Einsatz der gleichen Verfahren wie in (4) ClAc-DPPE, BrAc-DPPE und IAc-DPPE mit der gebildeten Lösung umgesetzt, um Liposom mit daran immobilisiertem Antikörper herzustellen.
- Unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in (5) wurden jeweils die Suspension von Liposom mit daran immobilisiertem Antikörper und die Lösung von menschlichem AFP mit jeweils vorbestimmter Konzentration vermischt und miteinander zur Umsetzung gebracht. Danach wurden 25 ul einer Lösung von Kaninchen-Antikörper gegen menschliches AFP, die um den Faktor 50 verdünnt worden war, und 25 ul einer Komplement- Lösung, die um den Faktor 20 verdünnt worden war, zu der vermischten Lösung gegeben und mit dem Antigen-Antikörper-Komplex umgesetzt. Dann wurde die aus jeder der Lösungen des menschlichen AFP's freigesetzte CF-Menge gemäß den Verfahren des Beispiels 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt. Es ist anzumerken, daß Lip auf der Abszisse einen Wert darstellt, der erhalten wurde, wenn nur die Liposom-Suspension verwendet wurde, und daß Lip+C darauf ein Wert war, der erhalten wurde, wenn nur die Komplement-Lösung zur Liposom-Suspension gegeben wurde. Wie aus Fig. 9 ersichtlich ist, zeigte jedes Liposom eine gute Antwort auf menschliches AFP. Es ist anzumerken, daß die Antwort in der Reihenfolge Cl< Br< I besser ist.
- Das obige Liposom mit daran immobilisiertem monoklonalem Antikörper (das funktionalisierte Lipid war BrAc-DPPE) und 10 Proben von normalem Serum, durch Zusatz von GVB&spplus; um den Faktor 10 verdünnt, wurden jeweils vermischt. 25 ul einer um den Faktor 20 verdünnten Komplement-Lösung wurden zur gebildeten Mischung gegeben und bei 37ºC 30 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die Werte der Freisetzungsanteile hierfür sind in Tabelle 1 dargestellt. Es sei bemerkt, daß das Vergleichsbeispiel 3 in Tabelle 1 das Ergebnis bei Verwendung eines in der japanischen Patentanmeldung Nr. 58-224509 offenbarten Liposoms mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper (funktionalisiertes Lipid war DTP-DPPE) darstellt. Tabelle 1 Relative Freisetzungsrate Probe Beispiel Vergleichsbeispiel
- Aus Tabelle 1 ersieht man, daß das Liposom mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper dieses Beispiels hohe Stabilität in Serum und überlegene Eigenschaften im Vergleich zu einem gängigen Liposom mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper besitzt.
- Nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 wurden unreduzierte monoklonale Antikörper (ganz oder F(ab')&sub2;) mit einem Liposom umgesetzt, und die Antwort auf das menschliche AFP wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Wie aus Fig. 10 zu ersehen ist, ergab das Liposom, an dem die ganzen oder die F(ab')&sub2;-Antikörper immobilisiert waren, keinerlei Antwort auf das menschliche AFP.
- Nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 wurde ein funktionalisiertes Lipid unter Verwendung von Bromessigsäure als halogenierter Essigsäure hergestellt. Den gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 folgend wurde unter Einsatz des erhaltenen funktionalisierten Lipids eine Liposomsuspension hergestellt. Eine kleine Menge eines 0,01 M HEPES-Puffers (enthaltend 0,85 % NaCl, pH 7,45) wurde zur erhaltenen Liposom-Suspension zugegeben, und dann wurde das gesamte Material in ein Zentrifugenröhrchen überführt und wiederholt bei 4ºC und 15 000 Upm 20 Minuten lang mehrmals zentrifugiert.
- Schließlich wurde der Puffer entfernt, und man erhielt ein Pellet des Liposoms.
- Eine Protein-Fraktion (Fab'), die eine freie SH-Gruppe enthielt, wurde aus einem monoklonalen Antikörper gegen menschliches AFP fraktioniert (jeweils 1 ml), wobei die gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 angewendet wurden, mit der Ausnahme, daß ein Puffer mit einem vorbestimmten pH im Bereich von 6 bis 12 als Lösungsmittel für die auf Sephadex G-25 durchgeführte Gelfiltration verwendet wurde.
- Das in (1) erhaltene Liposom-Pellet und jeweils 1 ml der in (2) erhaltenen Fab'-Fraktionen wurden jeweils vermischt und unter Rühren bei 20ºC 44 Stunden miteinander umgesetzt. Nach der Reaktion wurde jede Mischung dreimal mit GVB gewaschen und dann in 2 ml GVB&supmin; suspendiert und bei 4ºC aufbewahrt.
- Den Verfahren des Beispiels 2 folgend wurde die freigesetzte CF-Menge mit dem MTP-32-Fluoreszenzspektrophotometer gemessen, wobei die unter verschiedenen pH-Bedingungen in (3) hergestellten Liposomen mit daran immobilisiertem monoklonalem Antikörper verwendet wurden. Der freigesetzte Anteil wurde auf der Grundlage des Meßwertes der Fluoreszenzintensität und gemäß der oben beschriebenen Gleichung erhalten. Tabelle 2 zeigt Bereiche der meßbaren Konzentration und die aus den Liposomen freigesetzten Anteile, erhalten bei Verwendung der Liposomen mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper, die unter Einsatz der Puffer mit den jeweiligen pH-Werten als Lösungsmittel für die Gelfiltration hergestellt worden waren. Tabelle 2 Bereich der meßbaren Konzentration von AFP aus dem Liposom freigesetzter Anteil
- In Tabelle 2 steigt der aus dem Liposom freigesetzte Anteil, wenn der pH innerhalb des pH-Bereichs von 6 bis 8 angehoben wird, und er bleibt im pH-Bereich von 8 bis 11 im wesentlichen konstant. Wie aus Tabelle 2 deutlich wird, wird die Immobilisierung des monoklonalen Antikörpers am Liposom vorzugsweise bei einem pH von 7 bis 11 durchgeführt. Wenn ein Liposom verwendet wird, an das innerhalb dieses pH-Bereichs ein monoklonaler Antikörper immobilisiert worden ist, kann der Immunoassay mit höherer Meßgenauigkeit und einem größeren Bereich der meßbaren Konzentration durchgeführt werden.
- Den gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 folgend wurde die Interaktion zwischen einem Liposom und menschlichem Serum untersucht.
- Zuerst wurden 50 Proben menschlichen Serums in zwei Gruppen eingeteilt, und eine der Gruppen wurde durch Zusatz von GVB&spplus; um den Faktor 10 verdünnt. Derweil wurde ein Liposom mit daran immobilisiertem monoklonalem Antikörper, an dem die Immobilisierung bei pH 8 erfolgt war, durch Zusatz von GVB&spplus; um den Faktor 10 verdünnt. 10 ul der verdünnten Liposom-Suspension wurde mit jeweils 10 ul der verdünnten Serum-Lösungen vermischt und bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert. Dann wurden 25 ul des GVB&spplus; und 25 ul einer Komplement-Lösung, die um den Faktor 20 verdünnt worden war, zu jeder gebildeten Lösung zugegeben und bei 37ºC 30 Minuten lang der Reaktion überlassen.
- 50 Proben menschlichen Serums der anderen Gruppe wurden 30 Minuten lang auf 56ºC erhitzt und in der gleichen ,Weise wie oben beschrieben umgesetzt.
- Unter Anwendung der Verfahren wie in Beispiel 2 erhielt man für jede Probe den freigesetzten Anteil. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt.
- Zum Vergleich wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren die Interaktion zwischen einem Liposom, an dem mittels eines gängigen Verfahrens ein monoklonaler Antikörper gegen menschliches AFP über eine Disulfidbrücke immobilisiert war, und den menschlichen Seren (50 Proben) untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt.
- Wie aus Fig. 11 ersichtlich ist, war das Liposom der vorliegenden Erfindung in den menschlichen Seren sehr stabil. Es ist anzumerken, daß, obwohl in einem Serum unspezifische Lyse beobachtet wurde, diese durch Erhitzen des Serums beseitigt wird.
- Wie aus Fig 12 zu ersehen ist, war dagegen das gängige Liposom in den menschlichen Seren sehr instabil.
Claims (23)
1. Modifizierte Lipidverbindung der folgenden Formel (I):
R-Y-(CH&sub2;)n-X . . . (I)
dadurch gekennzeichnet, daß bedeuten:
X ein Halogenatom;
Y einen Rest aus der Gruppe -NHCO-, -COO- und -O-;
R einen Phospholipidrest und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
R für einen aminogruppenhaltigen Phospholipidrest steht.
3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für einen Phosphatidylethanolaminrest steht und
X einen Rest aus der Gruppe Cl, Br und J darstellt.
4. Lipidmasse zum Immobilisieren einer biologisch aktiven
Substanz, umfassend ein oder mehrere Lipid(e), von
denen zumindest eines aus einer modifizierten
Lipidverbindung der folgenden Formel (I):
R-Y-(CH&sub2;)n-X . . . (II)
worin bedeuten:
X ein Halogenatom;
Y einen Rest aus der Gruppe -NHCO-, -COO- und -O-;
R einen Phospholipidrest und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6
besteht.
5. Masse nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R
für einen aminogruppenhaltigen Phospholipidrest steht.
6. Masse nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R
für einen Phosphatidylethanolaminrest steht und X
einen Rest aus der Gruppe Cl, Br und J darstellt.
7. Masse nach Anspruch 4, enthaltend Cholesterin und/oder
Phosphatidylcholin.
8. Masse nach Anspruch 4, enthaltend Cholesterin und
Dipalmitoylphosphatidylcholin.
9. Verfahren zum Immobilisieren einer biologisch aktiven
Substanz durch Umsetzen einer Lipidmasse mit einem oder
mehreren Lipid(en), von denen mindestens eines aus einer
modifiiierten Lipidverbindung der folgenden Formel (I):
R-Y-(CH&sub2;)n-X . . . (I)
worin bedeuten:
X ein Halogenatom;
Y einen Rest aus der Gruppe -NHCO-, -COO- und -O-;
R einen Phospholipidrest und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6
besteht, mit einer biologisch aktiven Substanz mit einer
zum Ersatz von X der modifizierten Lipidverbindung (I)
fähigen funktionellen Gruppe zur chemischen Bindung der
biologisch aktiven Substanz an die Lipidverbindung (I).
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die zum Ersatz von X fähige funktionelle Gruppe aus
einer 5H-Gruppe besteht.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7 - 11 durchgeführt
wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der Lipidmasse um eine ein Liposom bildende
Lipidmembran handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der Lipidmasse um eine Langmuir-Blodgett-
Membran handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der biologisch aktiven Substanz um einen
Bestandteil aus der Gruppe Proteine, Peptide, Glucide,
nukleinsäureverwandte Substanzen und Coenzyme handelt.
15. Masse mit einer immobilisierten biologisch aktiven
Substanz, umfassend eine Lipidmasse mindestens einer
modifizierten Lipidverbindung der folgenden Formel (I):
R-Y-(CH&sub2;)n-X . . . (I)
worin bedeuten:
X ein Halogenatom;
Y einen Rest aus der Gruppe -NHCO-, -COO- und -O-;
R einen Phospholipidrest und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6,
und eine auf der Lipidmasse durch Ersatz von X der
Lipidverbindung (I) über eine Bindung der folgenden Formel
(II):
R-Y-(CH&sub2;)n-Zb-Bac . . . (II)
worin R, Y und n die bei Formel (I) angegebene Bedeutung
besitzen, Zb für ein(e) zu der biologisch aktiven
Substanz gehörende(s) Atom oder Atomgruppe steht und Bac
die biologisch aktive Substanz darstellt,
immobilisierte biologisch aktive Substanz.
16. Masse nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß
Bac in Formel (II) aus einem Bestandteil aus der Gruppe
Antikörper, Teil eines Antikörpers und Antigen besteht
und daß nach der Sensibilisierung nicht durch Bac
ersetztes X in Formel (I) durch eine OH-Gruppe ersetzt
ist.
17. Masse nach Anspruch 15 in Form eines aus einer
Lipidmasse mindestens einer modifizierten Lipidverbindung
der folgenden Formel (I):
R-Y-(CH&sub2;)n-X . . . (I)
worin X, Y, R und n die in Anspruch 15 angegebene
Bedeutung besitzen,
einem Bestandteil aus der Gruppe Antikörper, Teil eines
Antikörpers und Antigen, der auf der Oberfläche des
Liposoms durch Ersatz von X der Lipidverbindung (I)
über eine durch folgende Formel (III):
R-Y-(CH&sub2;)n-Zb-Ant . . . (III)
worin Zb für ein(e) zu einem Antikörper, Teil eines
Antikörpers oder Antigen gehörende(s) Atom oder
Atomgruppe steht, Ant einen Bestandteil aus der Gruppe
Antikörper, Teil eines Antikörpers und Antigen
darstellt und Y, R und n die bei Formel (I) angegebene
Bedeutung besitzen,
darstellbare Bindung auf der Oberfläche des Liposoms
immobilisiert ist,
und einer (in dem Liposom) eingeschlossenen
Markersubstanz zubereiteten Liposoms.
18. Liposomreagens nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antigen um einen Bestandteil
aus der Gruppe Proteine, Peptide, Glucide,
nukleinsäureverwandte Substanzen und Coenzyme handelt.
19. Liposomreagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß nach der Sensibilisierung nicht durch Ant ersetztes
X durch eine OH-Gruppe ersetzt ist.
20. Liposomreagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß Zb in der Formel (III) aus einem 5-Atom besteht.
21. Liposomreagens nach Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, daß Ant für einen monoklonalen Antikörper steht.
22. Liposomreagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß die Markersubstanz aus einer fluoreszierenden
Verbindung besteht.
23. Liposomreagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß die Liposommasse Cholesterin enthält.
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