JPH02189463A - 免疫分析試薬及び免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を特異的
に定量分析するための免疫分析試薬及びこの試薬を利用
した免疫分析方法に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが操
作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等にも注
意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動が
知られている。しかし、免疫電気泳動では測定に長時間
を要するうえ、感度が低く被検物質がごく微量しか含ま
れていない場合には適用することができないという問題
がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭６０−１１７１５９号
において、内部に親水性の標識物質を封入し、ジスルフ
ィド結合を介して親水性の抗体又は抗原を固定化した免
疫分析試薬を開示した。この試薬を用いた免疫分析方法
は以下のようなものである。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記免疫分
析試薬を加え、これと別に補体を加えると、抗原−抗体
反応及びそれに伴う補体の作用によってリボソームが破
壊され、封入されていた標識物質（例えば蛍光性化合物
）が流出する。この流出した標識物質の量と、試料中の
被検物質の量との間には相関関係があるので、流出した
標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分析）によって
定量することにより、被検物質を定量することができる
。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような問題が生じるこ
とはなく、免疫分析の簡便化が期待できる。

しかし、この免疫分析試薬を用いて実際に血清やタンパ
ク質を含有する試料の分析を行うと、抗原−抗体反応以
外に非特異反応が起り、これに起因してリボソームが破
壊されてしまう場合があることが明らかとなった。これ
は、試料中のタンパク質や微量化学物質とリボソームと
の反応によると考えられる。このため、従来は血清やタ
ンパク質を含有する試料を希釈して分析を行っていた。

例えば、リボソームに抗ヒトα−フェトプロティン抗体
（以下、抗−ヒトＡＦＰ抗体と記す）を固定化した免疫
分析試薬を用いてヒト血清中のＡＦＰを分析する場合、
非特ｙｄ反応の影響を除去するためにヒト血清を１００
倍希釈していた。ところが、正常人の血清中のＡ　Ｆ　
Ｐ　濃度はＩＱ−’ｇ／ｍｌ以下である。したがって、
正常人の血清を１００倍希釈すると、１Ｏ−１°ｇ　／
　ｍ！以下の濃度のＡＦＰを例えば蛍光分析でａＰ１定
しなければならず、精密な定量が困難になるという問題
があった。

本発明者の研究によれば、前述した非特異反応は試料と
免疫分析試薬とを混合しただけでは起らず、この後に補
体を加えたときに初めて生じることがわかった。そこで
、免疫分析試薬と試料とを反応させた後に、何らかの操
作により未反応の試料を除去できれば非特異反応を抑制
できるものと考えられる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は前記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ安定な分析が行える免疫分析試薬及びこれ
を用いた免疫分析方法を提供することを目的とする。

【発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の免疫分析試薬は、リン脂質及び糖脂質のうち少
なくともいずれか一方を組成とするリボソームの内部に
標識物質及び磁性体粒子を封入し、該リボソーム表面に
抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化したことを特
徴とするものである。

また、本発明の免疫分析方法は、前記免疫分析試薬と試
料とを反応させた後、磁界を印加して前記免疫分析試薬
を回収し、更に回収された免疫分析試薬に補体を作用さ
せてリボソームを破壊することを特徴とするものである
。

本発明の免疫分析試薬において、リボソームの主要構成
成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともい
ずれか一方が用いられる。本発明で用いられるリン脂質
及び糖脂質は特に限定されるものではなく、例えばジパ
ルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステ
アロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　
Ｅ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＯＰＥ）　、シミリストイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエ
タノールアミン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｅ）などが挙げられる。

これらリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数
が１２〜Ｉ８であることが好ましく、更に偶数であるこ
とがより好ましい。なお、必要に応じてリン脂質、糖脂
質に対してコレステロールを１０〜５００モル％の割合
で加えてもよ（、これによって安定な脂質２重層膜を調
製することができる。

本発明の免疫分析試薬において、リボソーム内に封入さ
れる標識物質としては、親水性でリボソーム外に流出し
た際に定量可能な物質が選択される。このような物質と
しては、例えば高濃度では、自己消光により蛍光を示さ
ないが、低濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光を
発するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質；
リボソーム外で酸化反応により発光するルミノールやル
シフェリンのような発光性物質：可視域又は紫外域に特
異的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；
酸化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化水
素生成をもたらすグルコース、シュークロース等の糖類
；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイ
オン性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（Ｎ　Ａ　Ｄ、）のような補酵素類；メチルビオロゲン
などのラジカル化合物などが挙げられる。これらの化合
物は、検出方法、感度及びリボソームの安定性等の因子
を考慮したうえで適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬において、リボソーム内に封入さ
れる磁性体粒子としては、リボソームの粒子径より小さ
いマグネタイト粒子、フェライト粒子などが選択される
。例えば、平均粒径が数−の多重層リボソームの場合に
は、通常１００〜２００ｎｎ＋の粒径を有するマグネタ
イト粒子が用いられる。

本発明の免疫分析試薬において、リボソーム上に固定化
される抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、ＩｇＧ、　
　夏ｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどいかなるタンパ
ク質であってもよい。なお、感度の向上という点からは
、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。また
、抗体の一部を分離して得たＦ　（ａｂ’）ｚ抗体でも
よい。

本発明の免疫分析試薬は、前記リボソームを構成するリ
ン脂質又は糖脂質に、抗原又は抗体もしくは抗体の一部
を共有結合を介して固定化した構造をａする。このよう
な本発明の免疫分析試薬は以下のようにして製造するこ
とができる。

まず、所望のリン脂質又は糖脂質のアミノ基と、例えば
ハロゲン化酢酸のサクシンイミドエステルとを反応させ
、抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定化するための
官能基を導入する。このようにして合成された脂質の精
製には、分取用薄層クロマトグラフィーを用いると簡便
である。

次に、前記のようにして得られたハロゲン化アセチル基
をＨするリン脂質や糖脂質、及び必要に応じてコレステ
ロールや他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加
えて溶解・混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥する
。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。つ
づいて、フラスコ内に標識物質及び磁性体粒子を含有す
る水溶ｉ（ｌを加え、密栓して振とうすることにより、
リボソームの懸濁液を調製する。

一方、抗原又は抗体もしくは抗体の一部については、ペ
プシンなどによる酵素処理又は還元処理を施してａ離の
ＳＨ基を付与するか、又は５ＰＤＰ（Ｎ−サクシンイミ
ジルー３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）な
どの二官能性試薬と反応させた後に還元して千オール基
を導入する。

更に、前記リボソーム懸濁液と前記抗原又は抗体もしく
は抗体の一部とを適当な緩衝液中で反応させることによ
り、リボソームに共有結合を介して抗原又は抗体もしく
は抗体の一部を固定化させる。

以上のような本発明の免疫分析試薬は、以下のようにし
て使用される。すなわち、まず被検物質を含有する試料
に本発明の免疫分析試薬を加えて一定時間反応させた後
、磁界を印加して免疫分析試薬のみを分離・回収し、未
反応の試料を除去する。場合によっては、回収した免疫
分析試薬を適当な緩衝液で洗浄してもよい。次に、被検
物質に対する第２抗体及び補体を加えて一定時間反応さ
せ、補体作用により破壊されたリボソームから流出する
標識物質（例えば蛍光性化合物）の量をΔＰ１定する。

この流出した標識物質の量と、試料中の被検物質の量と
の間には相関関係があるので、流出した標識物質を適当
な分析方法（例えば蛍光分析）によって定量することに
より、被検物質を定量することができる。

そして、実際の定量分析においては、予め既知の濃度の
被検物質を用いて検量線を作成しておき、同一条件で未
知の濃度の被検物質を含む試料との反応により流出した
標識物質の量を測定し、前記検量線に基づいて被検物質
の濃度を定量する。

本発明の免疫分析試薬と被検物質を含む試料との充分な
反応に要する時間は、被検物質の種類、リボソームの特
性、反応条件、更にはリン脂質又は糖脂質に化学結合さ
れた抗原又は抗体もしくは抗体の一部の種類、量、純度
などにより異なる。

このため、個々の場合に応じて前述した検量線の作成の
際に、特定の濃度に調整された被検物質を含む試料を用
いて予ｆｉａＰｌ定を行い、最適反応時間を設定するこ
とが望ましい。

本発明の免疫分析試薬によって定量が可能な被検物質と
しては、腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＢＦＰ。

ＣＥＡ、ＰＯＡなど）、免疫グロブリン（ＩｇＧ。

ＩｇＥ、ＩｇＤＳ　ＩｇＭなど）、ホルモン（インシュ
リン、Ｔ、など）及び薬物などが挙げられ、その対象は
広範囲にわたる。

（作　用） 本発明にかかる免疫分析試薬を用いる免疫分析方法では
、血清などの試料中に含まれるリボソームを非特異的に
破壊する因子を、補体反応に先立って予め除去できるの
で、試料を希釈する必要がな（なり、分析操作が簡便に
なるばかりでなく、相対的にＤＩ定感度も向上し、高感
度かつ高精度に被検物質を測定することが可能になる。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

本実施例において用いた試薬のうちジパルミトイルホス
ファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、コレステロー
ルはシグマ社製のものを用いた。池の試薬は市販品（特
級）を精製せずに用いた。なお、水は全てイオン交換水
を用いた。

（Ａ）モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体の固定化 ■ブロモ酢酸サクシンイミドエステルの合成ブロモ酢酸
１４０ｍｇ［１ミリモル］をクロロホルム３０ｍ　Ｏに
溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ペプチド研究
新製）　１４０　ｍ　ｇ　［１，２ミリモルコ及びＮ、
Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ペプチドｔｉ
ｔ究所製）　２５０　ｍ　ｇ　［１，２ミリモル］を添
加し、室温で３時間反応させた後、ロータリーエバポレ
ータで溶媒を除去し、酢酸エチル３０ｍ　Ｏを加えた。

生じたブロモ酢酸サクシンイミドエステルの白色沈殿を
ろ別し、再び溶媒を除去した後、クロロホルムｌＯｍ、
Ｑに再溶解させた。

■ブロモアセチル（Ｂ　ｒＡｃ）−ＤＰＰＥの合成り　
Ｐ　Ｐ　Ｅ７０ｍ　ｇ　［１００ｕモル］をクロロホル
ム２０ｒｒｌに懸濁し、これに前記ブロモ酢酸サクシン
イミドエステル溶液１．５　ｍｌ及びトリエチルアミン
（ＴＥＡ）５０Ｍｇを加え、２０℃で１晩撹拌した。

反応後、メタノール及び３２６クエン酸水溶液を用いて
ＴＥＡを抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、エバポ
レータを用いて溶媒を除去した。次いで、シリカゲルの
分取用薄層クロマトグラフィー（＃　５７１７、Ｍｃｒ
ｃｋ社製）を用い、クロロホルム／メタノール−７／３
混合溶媒を展開溶液として、生成物を精製した。なお、
最終生成物は１ｍＭの濃度となるようにクロロホルムで
希釈した。

■リボソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／ｌ）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ２００ｕｌ　、　１０ｍＭのコ
レステロール１００μｇ１及び■で調製した１ｍＭのＢ
　ｒＡｃ−ＤＰＰＥ５０μｌを、ｌＯｍ　ｌ容量のナシ
型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍ１ｌを加えて
よく混合した。次に、約４０℃の水浴中でロータリーエ
バポレータにより溶媒を除去した。ｉＭびクロロホルム
２ｍｌを加えて充分に撹拌した後、再度ロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。この操作を数回繰返す
と、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。つづいて、
フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで約１時間
吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２　Ｍのカルボキシフルオレセイン（イー
ストマンコダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦ　ト記
？）　１００　ｕ　１　及ＣＪ　１　％（Ｖ／Ｗ）　超
ｆａｔｅ子水分散型マグネタイト（ＦＦＴ−４０、ｐ　
Ｈ７，４：岡村製油■製）　１０（ｌμｇを添加し、フ
ラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して約Ｇθ℃の水
浴中に約１分間浸漬した。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミ
キサーヲ用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失す
るまで、（約１０分間）、フラスコを激しく振とうした
。この操作によりリボソーム懸濁液が調製された。更に
、リボソーム懸濁液に、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
（０，８５％ＮａＣｆＩ含有、ｐＨ７，４５：以下、Ｈ
ＢＳと記す）を少Ｑ添加した後、全て遠心チューブに移
し、４℃において１５０００　ｒｐｍで２０分間遠心す
る操作を数回繰返した。最後に、０．０１Ｍのホウ酸緩
衝液（０，８５％ＮａＣΩ含６、ｐＨ９：以下、ＢＢＳ
と記す）でセラムチューブ（コーニング社製）にリボソ
ームを移し、１度遠心分離して上澄を除去した後、後述
するモノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体固定化反応に使
用するまで冷蔵庫に保存した。

■モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体の修飾モノクロー
ナル抗−ヒトＡＦＰ抗体１０ｍ　ｇをｐＨ４，５の酢酸
緩衝液に溶解し、ペプシン（シグマ社製）１００μｇを
添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、高速液体ク
ロマトグラフィーによりＦ　（ａｂ’）２分画のみを分
取した。このＦ　（ａｂ’）２分画（ｐＨ０，０，０，
１Ｍリン酸緩衝液中）にメルカプトエチルアミン・塩酸
塩１０ｍ　ｇを加え、３７℃で９０分間反応させ、ゲル
ろ過（セファデックスＧ−２５使用、ＢＢＳ）により遊
離のＳＨ基を含１７するタンパク分画（Ｆ　ａｂ’）の
みを分取した。このタンパク分画の溶液については、Ｏ
Ｄ　２８０μｍ　−１であった。

■モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体のリボソームへの
固定化 前記リボソーム懸濁液とＦａｂｏの溶液とを混和し、２
０℃で４４時間撹拌・反応させた。反応後、ゼラチン−
ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記す）で３回洗浄
した。最後に、得られた免疫分析試薬をＧＶＢ　　２ｒ
ｒｌに懸濁させて４℃で保存した。

（Ｂ）免疫分析試薬のヒトＡＦＰ漂阜液による評価 ヒトＡＦＰ　（日本バイオテスト研究新製）を予めＧＶ
Ｂ”（ＧＶＢ−にＭ　ｇ　Ｃ（１２０，５ｍＭを添加し
たもの）で希釈し、０．１−１０’　ｎ　ｇ／ｍＮの濃
度のは■液を１週製した。これらの溶液各１０μｇに、
前記免疫分析試薬の１０倍希釈液ｌＯμｇを加え、３７
℃で１０分間反応させた。次に、ウサギ抗−ヒトＡＦＰ
抗体（Ｄａｋｏ社製）の５０倍希釈溶液２５μｆｌ及び
補体（モルモット血清；補体価（ＣＨｓｏ）＝２５０）
の２０倍箱釈溶液２５１ｚｊ７を添加し、３７℃で更に
３０分間反応させた。この後、０　、０　＋、　ＭのＥ
ＤＴＡベロナール緩衝液１００μｇで反応を停止させ、
各濃度のヒトＡＦＰ溶液について、流出したＣＦ量を蛍
光分光光度計（ＭＴＰ−３２、コロナ電気製）により励
起波長４９０　ｎｎ、蛍光波長５２０　ｎ１１の条件で
ｄｐｊ定した。

そして、次式に基づいて相対蛍光強度をシ１算した。

ここで、Ｆｅ：実ΔＦＩ　した蛍光強度、Ｆｏ　：ヒト
ＡＦＰの代わりにＧＶＢ２＋を加えたとき（リボソーム
が全く破壊されていないとき）の蛍光強度、Ｆａ：脱イ
オン水を添加してリボソームを全て破壊した時の蛍光強
度である。なお、標準値として１Ｏ−７及び１０−８Ｍ
のＣＦ溶液の蛍光強度を用いた。

この測定結果を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、この免疫分析試薬を用いて１〜１０’ｎ　ｇ　／　
ｍ　１の範囲でヒトＡＦＰの定量が可能であることがわ
かる。

（Ｃ）免疫分析試薬のヒト血清による評価（Ｂ）のＡＦ
Ｐ標準液の代わりに、ヒト血清を用いて反応させた。

すなわち、２００検体のヒト血清各ＩＯμｇと、前記免
疫分析試薬の１０倍希釈液１０μｇとを混合し、３７℃
で１０分間インキュベートした。次に、磁石により免疫
分析試薬のみを回収した後、Ｇ　Ｖ　Ｂ　２”１００μ
ｇで１回洗浄した。次いで、ウサギ抗−ヒトＡＦＰ抗体
（Ｄａｋｏ社製）の５０倍希釈溶液２５ｕ！！及び補体
（モルモット血清；補体価（ＣＨ２Ｏ）−２５０）の２
０倍希釈溶液２５μｇを添加し、３７℃で更に３０分間
反応させた。この後、０．０１ＭのＥＤＴＡ−ベロナー
ル緩衝液ＩＯμｇで反応を停止させ、前記と同様に、各
ヒト血清について、流出したＣＦ量を蛍光分光光度計に
より励起波長４９０　ｎｉ蛍光波長５２０　ｎＩＩの条
件で測定した。各ヒト血清についてｉｌｌ定された相対
蛍光強度、及びヒ１−ＡＦＰ標準液による検量線から、
各ヒト血清中のヒトＡＦＰａ度を決定した。

一方、これらの！ｉｌＪ定値と比較するために、リボソ
ーム中に磁性体粒子を封入していないほかは本発明の免
疫分析試薬と同様なｆ＋’４成を有する免疫分析試薬を
用い、各ヒト血清について前記と全く同様なａＦＩ定を
行った。

また、これらに対する標準値として、各ヒト血清につい
てＲＩＡにより各ヒト血？ｈ　中のヒトＡＦＰａ度を決
定した。

本発明方法による測定値を、ＲＩＡによる測定値と比較
したところ、ＲＩＡによる測定値から２３Ｄ　（標準偏
差の２倍）を超えて季離したものは、２０Ｄ検体中３検
体のみであった。［ＲＩＡによる測定値との相関係数；
　０．９ｇ］。

一方、リボソーム中に磁性体粒子を封入していない従来
の免疫分析試薬を用いた方法によるΔ１定値を、ＲＩＡ
による測定値と比較したところ、ＲＩＡによる１１１１
１定値から２３Ｄ　（標準偏差の２倍）を超えて垂離し
たものは、２０Ｄ検体中１８検体もあり、しかもそのう
ち５検体については、第２抗体を添加しなくてもリボソ
ームが破壊されてしまった。［ＲＩＡによる測定値との
相関係数、　０．８８］。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析試薬及び免疫分析
方法によれば、血清などによるリボソームの非特異反応
を回避することができ、精密かつ簡便な分析を行うこと
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る免疫分を斤試薬と各種濃度のヒト
ＡＦＰ標章液との反応によるト１ノ対蛍光強度を示す特
性図である。 出願人代理人　弁理士　鈴江武彦

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方を組成とするリボソームの内部に標識物質及び磁性体
   粒子を封入し、該リボソーム表面に抗原又は抗体もしく
   は抗体の一部を固定化したことを特徴とする免疫分析試
   薬。
2. （２）請求項（１）記載の免疫分析試薬と試料とを反応
   させた後、磁界を印加して前記免疫分析試薬を回収し、
   更に回収された免疫分析試薬に補体を作用させてリボソ
   ームを破壊することを特徴とする免疫分析方法。