JP2007101339A - 電解発光物質を内包するリポソームによるイムノアッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 タンパク質の簡便で高感度のイムノアッセイ方法の提供。
【解決手段】 被検タンパク質と、該タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとを、電極基盤上に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させ、ついで、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させ、電解液を添加して、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電解発光を測定し、その発光強度に基づいて被検タンパク質を定量することを特徴とするイムノアッセイ方法。
【選択図】なし
【解決手段】 被検タンパク質と、該タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとを、電極基盤上に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させ、ついで、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させ、電解液を添加して、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電解発光を測定し、その発光強度に基づいて被検タンパク質を定量することを特徴とするイムノアッセイ方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、微量なタンパク質の高感度な分析を可能とする電解発光物質を内包するリポソームによるイムノアッセイ方法に関する。
タンパク質の分析は迅速高感度分析方法が望まれている。現在、様々な分析方法があるが、抗体または抗原を酵素で標識化したものを用いるＥＬＩＳＡ法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）が広く使用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法の感度は概ねタンパク質０．００１〜０．１μｇといわれており、分析ステップとしては被検物質のタンパク質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されており（例えば、特許文献１および２参照）、リポソームによる感度増幅が知られている（非特許文献１参照）。
しかし、２つの抗原抗体反応と１つの酵素反応が必要であるため比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法より更に短時間で簡便な分析方法が望まれている。
また、最終ステップとして、発色反応の他に蛍光および化学発光があるが、最近では温和な条件での発光が可能である電解発光法が利用されている。電解発光する化学物質としてトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体を基本構造とするものが最も多く用いられ、タンパク質のアミノ基と結合できる反応活性な側鎖を有するルテニウム錯体も報告されている（非特許文献１参照）。
しかし、従来のルテニウム錯体を利用した電解発光によるタンパク質の定量はやはり反応時間が長く、感度も十分ではないという問題がある。そのため高価で特殊な検出器が必要となる。
特開昭６３−５０２９５８号公報
特表２０００−５−９４９４号公報
Danke Xu, Quan Cheng, J. Am. Chem. Soc., 124, 14314-14315 (2002)
Gary F. Blackburn, Haresh P. Shah, John H. Kenten, Jonathan Leland, Ralph A. Kamin, John Link, Jeff Peterman, Michael J. Powell, Arti Shah, David B. Talley, Surendera K. Tyagi, Elizabeth Wilkins, Tai-Guang Wu, and Richard J. Massey, Clin. Chem. 37（9）, 1534-1539 (1991)
しかし、２つの抗原抗体反応と１つの酵素反応が必要であるため比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法より更に短時間で簡便な分析方法が望まれている。
また、最終ステップとして、発色反応の他に蛍光および化学発光があるが、最近では温和な条件での発光が可能である電解発光法が利用されている。電解発光する化学物質としてトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体を基本構造とするものが最も多く用いられ、タンパク質のアミノ基と結合できる反応活性な側鎖を有するルテニウム錯体も報告されている（非特許文献１参照）。
しかし、従来のルテニウム錯体を利用した電解発光によるタンパク質の定量はやはり反応時間が長く、感度も十分ではないという問題がある。そのため高価で特殊な検出器が必要となる。
本発明は、ＥＬＩＳＡ法における分析ステップを簡略化し、タンパク質の簡便で高感度のイムノアッセイ方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ね、リポソームによる感度増幅に着目し、ルテニウム錯体を内包したリポソームを用い、かつルテニウム錯体として金電極への吸着が強い錯体を合成し、これを使用することによりさらに電解発光の感度増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）被検タンパク質と、該タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとを、電極基盤上に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させ、ついで、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させ、電解液を添加して、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電解発光を測定し、その発光強度に基づいて被検タンパク質を定量することを特徴とするイムノアッセイ方法、
（２）ルテニウム（ＩＩ）錯体が、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体である上記（１）記載の方法、
（３）ルテニウム（ＩＩ）錯体が、側鎖を有するビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体である上記（１）記載の方法、
（４）リポソームの破壊を、炭素数１〜４のアルコールの添加により行う上記（１）記載の方法、
（５）アルコールが、エタノールまたはプロパノールである上記（４）記載の方法、
（６）電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーで行う上記（１）１記載の方法、および
（７）トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包するイムノアッセイ用リポソーム試薬を提供するものである。
（１）被検タンパク質と、該タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとを、電極基盤上に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させ、ついで、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させ、電解液を添加して、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電解発光を測定し、その発光強度に基づいて被検タンパク質を定量することを特徴とするイムノアッセイ方法、
（２）ルテニウム（ＩＩ）錯体が、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体である上記（１）記載の方法、
（３）ルテニウム（ＩＩ）錯体が、側鎖を有するビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体である上記（１）記載の方法、
（４）リポソームの破壊を、炭素数１〜４のアルコールの添加により行う上記（１）記載の方法、
（５）アルコールが、エタノールまたはプロパノールである上記（４）記載の方法、
（６）電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーで行う上記（１）１記載の方法、および
（７）トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包するイムノアッセイ用リポソーム試薬を提供するものである。
本発明によれば、リポソームと金電極に強い吸着を示すルテニウム錯体を組み合わせることにより、ＥＬＩＳＡ法における抗原抗体反応ステップを簡略化でき、タンパク質の簡便で高感度の、生化学、医学、薬学等の分野で有用な、また、環境汚染物質の分析にも有用なイムノアッセイ方法（被検タンパク質にもよるが、一般に、所要時間は６〜２４時間、感度はタンパク質０．１〜１０ｎｇ）が提供できる。
本発明のイムノアッセイ方法は、検体液またはそれから調製した被検タンパク質含有液と、被検タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソーム含有液を、電極基盤上で、電極基盤に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させることにより実施できる。競合反応により、リポソームは、被検タンパク質濃度に依存して電極表面に結合される。ついで、電極上に結合したリポソームを破壊すると、リポソームに内包されたルテニウム（ＩＩ）錯体が漏れ出し、電極に吸着する。好ましくは、吸着の促進のため、電極を加熱する。その後、電極表面に残るリポソームの残骸を緩衝液で洗浄して除去し、吸着されたルテニウム（ＩＩ）錯体に電解液を加え、電圧を印加して電解発光させて発光強度を測定し、予め被検タンパク質の標準品を用いて同様な操作により作成した検量線により検体中のタンパク質を定量する。
検体および被検タンパク質は特に限定するものではなく、検体は、特殊な前処理を必要とせず、要すれば、適宜濃縮または蒸留水、各種緩衝液［例、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、トリスー塩酸緩衝液等]で分散、溶解、希釈して使用する。被検タンパク質は抗原たるタンパク質でも、抗体たるタンパク質（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む）でもよい。
本発明ではルテニウム（ＩＩ）錯体として、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体を基本骨格とする、金電極への吸着能が高いチオール基、ジスルフィド基およびアミノ基を有する側鎖を持つ錯体を使用する。アミノ基側鎖を１〜６個有し、側鎖の炭素数が１〜６の錯体、特に水溶性が高く取り扱いが容易なアミノ基を２個有する錯体が好ましい。これらのルテニウム（ＩＩ）錯体は、公知であるか、例えば、後の参考例に示す方法により製造することができる。
本発明において使用するルテニウム（ＩＩ）錯体の具体例としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体が挙げられる。
本発明において使用するルテニウム（ＩＩ）錯体の具体例としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体が挙げられる。
本発明で使用するリポソームは、多重層膜リポソーム、一枚膜リポソームいずれでもよく、好ましくは一枚膜リポソームである。リポソームは、所望により修飾された不活性または負に帯電したリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等を使用し、ルテニウム（ＩＩ）錯体含有液の存在下、常法により調製することができ、各種架橋剤を使用し、ハプテン化、さらにはリガンドを会合させ、被検タンパク質を表面に結合させて調製する。ハプテン化、リガンドの会合は、被検タンパク質に応じて自体公知の方法により行うことができる。
本発明の方法は、通常、金作用電極（図１参照）を用いたチップリーダーで電解発光（ＥＣＬ）強度を測定することが好ましく、この電極基盤上に、被検タンパク質と抗原抗体反応する物質、例えば、被検タンパク質が抗原であれば、それに対する抗体、被検タンパク質が抗体であれば、それに対する抗原を固定する。この固定も、固定すべき物質に応じて自体公知の方法により行うことができる。
本発明における電極基盤上での被検タンパク質と、被検タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとの電極基盤に固定した抗原または抗体に対する競合反応は、被検タンパク質の種類にもよるが、通常、４℃〜室温において、５〜１２０分間行うことにより完了する。
ついで、上記のような緩衝液で電極を洗浄後、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させる。リポソームの破壊は、炭素数１〜４のアルコール、好ましくはエタノールまたはプロパノール、特にプロパノールを添加することにより行う。好ましくは、電極を３０〜６０℃に加熱し、５〜６０分間静置し、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電極への吸着を促進する。吸着後、同様な緩衝液で洗浄し、リポソームの残骸を除去する。
洗浄後、トリエチルアミンを含有する上記の緩衝液のような電解液を添加して、電極に電圧を印加し、吸着したルテニウム（ＩＩ）錯体を電解発光させ、その発光強度を測定し、それに基づいて、別途作成した検量線を用いて被検タンパク質を定量する。
以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の実施例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体を被検タンパク質とした例であるが、他のタンパク質についても同様に測定することができる。
参考例、実施例中で使用する略号は以下の意味を有する。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＤＰＰＥ：ホスファチジルエタノールアミンジパルミトイル
ＤＰＰＣ：ホスファチジルコリンジパルミトイル
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＤＴＰ−ＤＰＰＥ：Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニル ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン
ＤＴＴ：ジチオソレイトール
ＷＳＣ：水溶性カルボジイミド
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の実施例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体を被検タンパク質とした例であるが、他のタンパク質についても同様に測定することができる。
参考例、実施例中で使用する略号は以下の意味を有する。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＤＰＰＥ：ホスファチジルエタノールアミンジパルミトイル
ＤＰＰＣ：ホスファチジルコリンジパルミトイル
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＤＴＰ−ＤＰＰＥ：Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニル ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン
ＤＴＴ：ジチオソレイトール
ＷＳＣ：水溶性カルボジイミド
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
４，４’−ビス〔（フタルイミノブチル）−２，２’-ビピリジンの合成
反応装置内を窒素置換し、加熱乾燥した後に４，４’−ビス（４−ブロモブチル）−２，２’−ビピリジン１．９４ｇ（４．５４×１０−３ｍｏｌ）、フタルイミドカリウム１．８５ｇ（１．００×１０−２ｍｏｌ）を入れ、上記反応式に従って反応させた。窒素置換したシリンジを用いてＤＭＦ（脱水）を２０ｍＬ測り取り、注入した（黄色溶液）。１６０〜１７０℃で加熱還流し、ＴＬＣで反応を追跡した。
５時間後に反応を終了した（濃茶色溶液）。反応溶液をクロロホルムと飽和食塩水から抽出した後、クロロホルム層に０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０ｍＬを加えて抽出する操作を２回行った。蒸留水で３〜４回洗浄した後、硫酸ナトリウムを加えて撹拌し、自然ろ過をした。エバポレーターでクロロホルムを留去し、得られた黄土色物質をクロロホルムとジエチルエーテルを用いて再結晶した後、真空乾燥（６０℃、３時間）し、黄土色針状結晶の式：
で表される標記化合物を得た。収量：１．８５ｇ、収率：７２．５５％、融点：２１２．６〜２１５．７℃
５時間後に反応を終了した（濃茶色溶液）。反応溶液をクロロホルムと飽和食塩水から抽出した後、クロロホルム層に０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０ｍＬを加えて抽出する操作を２回行った。蒸留水で３〜４回洗浄した後、硫酸ナトリウムを加えて撹拌し、自然ろ過をした。エバポレーターでクロロホルムを留去し、得られた黄土色物質をクロロホルムとジエチルエーテルを用いて再結晶した後、真空乾燥（６０℃、３時間）し、黄土色針状結晶の式：
ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス〔フタルイミノブチル−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体の合成
反応装置を加熱乾燥、窒素置換させた後に、参考例１で得られた４，４’−ビス〔フタルイミノブチル〕−２，２’−ビピリジン５０３．４０ｍｇ（８．９９×１０−４ｍｏｌ）を入れた。窒素置換したシリンジを用いてエタノール８０ｍＬを注入した。１２０〜１３０℃で加熱還流して４，４’−ビス〔（フタルイミノブチル〕−２，２’−ビピリジンを溶解させた後、室温まで冷却してビス（２，２’ビピリジン）ルテニウム錯体４８０．９０ｍｇ（９．９３×１０−４ｍｏｌ）を加えて１２０〜１３０℃で加熱還流し（黒色溶液）、上記式に従って反応させた。
ＴＬＣで反応を追跡し、５時間後に反応を終了した（深赤色溶液）。エタノールをエバポレーターで留去し、蒸留水を１５０ｍＬ加えて自然ろ過した（深赤色溶液）。ろ液に１．０Ｍ過塩素酸溶液を加え、撹拌した。得られた橙色沈殿物を吸引ろ過により採取した後、メタノールとテトラヒドロフランを用いて再結晶し、真空乾燥（４５℃、５時間）し、赤色針状結晶の式：
で表される標記化合物を得た。収量：８８７．９０ｍｇ、収率：８４．５６％ 表１に標記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの帰属を示す。
ＴＬＣで反応を追跡し、５時間後に反応を終了した（深赤色溶液）。エタノールをエバポレーターで留去し、蒸留水を１５０ｍＬ加えて自然ろ過した（深赤色溶液）。ろ液に１．０Ｍ過塩素酸溶液を加え、撹拌した。得られた橙色沈殿物を吸引ろ過により採取した後、メタノールとテトラヒドロフランを用いて再結晶し、真空乾燥（４５℃、５時間）し、赤色針状結晶の式：
ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’-ビピリジン]ルテニウム（ＩＩ）錯体の合成
反応装置に、参考例２で得られたビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス〔（フタルイミノブチル〕−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体７０３．７０ｍｇ（６．００×１０−４ｍｏｌ）、ヒドラジン一水和物１２０ｍＬ（２．４０×１０−３ｍｏｌ）を入れた。シリンジを用いてメタノール３０ｍＬを注入した。１００〜１１０℃で加熱還流し、上記式に従って反応させ、ＴＬＣで反応を追跡した。
６時間加熱還流した後、室温まで冷却した。蒸留水１５ｍＬを加え、メタノールをエバポレーターで留去した。反応液（赤褐色溶液）に濃塩酸１．１ｍＬ（３．５８×１０−２ｍｏｌ）を加えた。３時間加熱還流した後、室温まで冷却し、氷中で一晩冷却した。析出した白色沈殿物を自然ろ過により除去し、ろ液（赤褐色溶液）の塩酸を炭酸水素ナトリウムで気泡が出なくなるまで中和した後、２Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ１１に調整し、氷中で一晩冷却した。析出した褐色物質を自然ろ過により除去し、ろ液（赤褐色溶液）の水をエバポレーターで留去した。アセトニトリルを加え、析出した褐色物質を吸引ろ過して除去し、エバポレーターでアセトニトリルを留去した。得られた粗生成物を少量のアセトニトリルに溶解し、シリカゲルを充填したカラム（φ１．５×１０ｃｍ）２本を用いて、アセトニトリル：蒸留水：飽和硝酸カリウム水溶液＝４５：４：１で展開した。採取したフラクション（各１０ｍＬ）をＴＬＣ（アセトニトリル：蒸留水：飽和硝酸カリウム水溶液＝１０：４：１）で分析し、生成物が確認されたフラクションを濃縮した。これをアセトニトリルに溶解し、吸引ろ過により硝酸カリウム、シリカゲルを除去した。エバポレーターを用いてアセトニトリルを留去し、残渣をアセトンに溶解し、吸引ろ過により除去しきれなかったシリカゲルを除いた。エバポレーターを用いてアセトンを留去し、真空乾燥（５０℃、１５時間）を行い、式：
で表される標記化合物を得た。収量：２８０．２０ｍｇ、収率：４９．４８％
表２にビス(2,2'-ビピリジン)- [4,4'-ビス(4-アミノブチル)-2,2'-ビピリジン]ルテニウム錯体の１Ｈ−ＮＭＲの帰属を示す。
６時間加熱還流した後、室温まで冷却した。蒸留水１５ｍＬを加え、メタノールをエバポレーターで留去した。反応液（赤褐色溶液）に濃塩酸１．１ｍＬ（３．５８×１０−２ｍｏｌ）を加えた。３時間加熱還流した後、室温まで冷却し、氷中で一晩冷却した。析出した白色沈殿物を自然ろ過により除去し、ろ液（赤褐色溶液）の塩酸を炭酸水素ナトリウムで気泡が出なくなるまで中和した後、２Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ１１に調整し、氷中で一晩冷却した。析出した褐色物質を自然ろ過により除去し、ろ液（赤褐色溶液）の水をエバポレーターで留去した。アセトニトリルを加え、析出した褐色物質を吸引ろ過して除去し、エバポレーターでアセトニトリルを留去した。得られた粗生成物を少量のアセトニトリルに溶解し、シリカゲルを充填したカラム（φ１．５×１０ｃｍ）２本を用いて、アセトニトリル：蒸留水：飽和硝酸カリウム水溶液＝４５：４：１で展開した。採取したフラクション（各１０ｍＬ）をＴＬＣ（アセトニトリル：蒸留水：飽和硝酸カリウム水溶液＝１０：４：１）で分析し、生成物が確認されたフラクションを濃縮した。これをアセトニトリルに溶解し、吸引ろ過により硝酸カリウム、シリカゲルを除去した。エバポレーターを用いてアセトニトリルを留去し、残渣をアセトンに溶解し、吸引ろ過により除去しきれなかったシリカゲルを除いた。エバポレーターを用いてアセトンを留去し、真空乾燥（５０℃、１５時間）を行い、式：
表２にビス(2,2'-ビピリジン)- [4,4'-ビス(4-アミノブチル)-2,2'-ビピリジン]ルテニウム錯体の１Ｈ−ＮＭＲの帰属を示す。
リポソームの調製
（１）ホスファチジルエタノールアミンジパルミトイルの活性化（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ調製）
１０μｍｏｌのＤＰＰＥ（６．９２ｍｇ／７００μＬ（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝９：１））と１２μｍｏｌのＳＰＤＰ（３．７５ｍｇ／３００μＬ（ＣＨ３ＯＨ））さらに３０μｍｏｌのトリエチルアミン（２．８μＬ／２００μＬ（ＣＨＣｌ３））を加え、室温で２時間撹拌しながら反応させた。ついで、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ加え、撹拌後、振とうすると２層に分かれるので、その水層を除去した。この操作を３回繰り返した後、得られた下層（クロロホルム層）をＮ２気流下でエバポレートし溶媒を留去した。得られた活性型のＤＴＰ−ＤＰＰＥを濃度が４ｍＭになるようにクロロホルム：メタノール＝９：１溶液で溶解した。
（２）ＤＴＰ−ＤＰＰＥを含むリポソームの調製
ＤＰＰＣ１０μｍｏｌ、コレステロール５μｍｏｌ、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ０．１５μｍｏｌから脂質フィルムを形成し、参考例３で合成したルテニウム（ＩＩ）錯体（５ｍＭ）を含む１ｍＬＰＢＳ加え水和し、多重層リポソーム（ＭＬＶ）を得た。超音波を１０分間照射し、さらに遠心によりチタンを取り除いた後、ゲルろ過クロマトグラフィー、蛍光強度測定蛍光強度測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を行い目的の一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を得た。
（３）抗体の活性化
１ｍｇ（５．２×１０−９ｍｏｌ）／１ｍＬ（ＰＢＳ）のＢＳＡ抗体（コスモ・バイオ株式会社製）に、１．３μＬ（２．６×１０−８）の２０ｍＭＳＰＤＰ架橋剤を加え（ｍｏｌ比でＳＰＤＰ：ＢＳＡ抗体＝５：１）、室温で３０分間インキュベートした。この反応溶液を３日間４℃で透析した（再生セルロース分画分子量：１０００ダルトン）。透析外液は酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）で行った。
ついで、５０ｍＭのＤＴＴ還元剤５００μＬと、ＳＰＤＰ修飾抗体１ｍＬを混ぜ、室温３０分間インキュベートし、ＳＰＤＰ部位を還元した。ゲルろ過クロマトグラフィー（セファデックスＧ−２５）に付し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出してＤＴＴ、ピリジン−２−チオンを除去して活性化抗体を得た。
（４）活性部位をもつリポソームと活性化ＢＳＡ抗体の結合
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥとして５×１０−５Ｍ）と活性化ＢＳＡ抗体（２００μｇ／ｍＬ＝１．３３×１０−６Ｍ）を窒素雰囲気下、室温で２４時間反応させた。ついで、ゲルろ過クロマトグラフィー（セファロース４Ｂ）に付し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出して遊離した抗体を除去し、ＢＳＡ抗体結合リポソームを得た。
（１）ホスファチジルエタノールアミンジパルミトイルの活性化（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ調製）
１０μｍｏｌのＤＰＰＥ（６．９２ｍｇ／７００μＬ（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝９：１））と１２μｍｏｌのＳＰＤＰ（３．７５ｍｇ／３００μＬ（ＣＨ３ＯＨ））さらに３０μｍｏｌのトリエチルアミン（２．８μＬ／２００μＬ（ＣＨＣｌ３））を加え、室温で２時間撹拌しながら反応させた。ついで、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ加え、撹拌後、振とうすると２層に分かれるので、その水層を除去した。この操作を３回繰り返した後、得られた下層（クロロホルム層）をＮ２気流下でエバポレートし溶媒を留去した。得られた活性型のＤＴＰ−ＤＰＰＥを濃度が４ｍＭになるようにクロロホルム：メタノール＝９：１溶液で溶解した。
（２）ＤＴＰ−ＤＰＰＥを含むリポソームの調製
ＤＰＰＣ１０μｍｏｌ、コレステロール５μｍｏｌ、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ０．１５μｍｏｌから脂質フィルムを形成し、参考例３で合成したルテニウム（ＩＩ）錯体（５ｍＭ）を含む１ｍＬＰＢＳ加え水和し、多重層リポソーム（ＭＬＶ）を得た。超音波を１０分間照射し、さらに遠心によりチタンを取り除いた後、ゲルろ過クロマトグラフィー、蛍光強度測定蛍光強度測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を行い目的の一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を得た。
（３）抗体の活性化
１ｍｇ（５．２×１０−９ｍｏｌ）／１ｍＬ（ＰＢＳ）のＢＳＡ抗体（コスモ・バイオ株式会社製）に、１．３μＬ（２．６×１０−８）の２０ｍＭＳＰＤＰ架橋剤を加え（ｍｏｌ比でＳＰＤＰ：ＢＳＡ抗体＝５：１）、室温で３０分間インキュベートした。この反応溶液を３日間４℃で透析した（再生セルロース分画分子量：１０００ダルトン）。透析外液は酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）で行った。
ついで、５０ｍＭのＤＴＴ還元剤５００μＬと、ＳＰＤＰ修飾抗体１ｍＬを混ぜ、室温３０分間インキュベートし、ＳＰＤＰ部位を還元した。ゲルろ過クロマトグラフィー（セファデックスＧ−２５）に付し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出してＤＴＴ、ピリジン−２−チオンを除去して活性化抗体を得た。
（４）活性部位をもつリポソームと活性化ＢＳＡ抗体の結合
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥとして５×１０−５Ｍ）と活性化ＢＳＡ抗体（２００μｇ／ｍＬ＝１．３３×１０−６Ｍ）を窒素雰囲気下、室温で２４時間反応させた。ついで、ゲルろ過クロマトグラフィー（セファロース４Ｂ）に付し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出して遊離した抗体を除去し、ＢＳＡ抗体結合リポソームを得た。
イムノアッセイ
（１）ＢＳＡの電極基盤上への固定
図１に示す金電極基盤を室温で、ピラニア液（濃Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２（３０％）＝３：１）４μＬで１分間洗浄し、金電極表面を清浄にした。その後、蒸留水で洗浄した。この金電極をジチオジブチリック酸溶液（７１．５ｍｇ／３０ｍＬエタノール）に浸漬し、１２時間室温で撹拌することにより金表面にＡｕ−Ｓ結合を形成した。その後エタノールで洗浄した。金電極表面に結合したカルボキシル基を活性化するために、ＷＳＣ５０ｍｇおよびＮＨＳ３０ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳの溶液に室温で６０分間電極基盤を浸漬し、その後ＰＢＳで洗浄した。ＢＳＡ０．２ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液に電極基盤を加え、４℃で１５時間反応させ、ＢＳＡを金電極表面に化学結合させ、ついでＰＢＳ溶液で洗浄した。金電極上の未反応の活性化カルボキシル基をつぶすために電極基盤を０．１Ｍ ２−アミノエタノール（６１．０ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳ）溶液に４℃で、１時間浸漬した。室温で１５分間静置した後、０．０２％Tween２０含有ＰＢＳ溶液で洗浄して、ＢＳＡ固定電極基盤を得た。
（２）ＢＳＡ抗体の定量
以上のようにして調製した電極基盤に、実施例１で調製したＢＡＳ抗体結合リポソームＰＢＳ溶液５μＬと各種濃度のＢＳＡ抗体ＰＢＳ溶液２５μＬを加え、室温１で時間インキュベートして競争的な抗原抗体反応を行った。その後ＰＢＳで電極洗浄し、ＰＢＳ溶液をマイクロピペットで吸いだした。
この電極基盤にエタノール（７μＬ）を加えることにより電極上に結合したリポソームを破壊した後、６０℃で１０分間加熱した。この電極基盤を室温で１０分間放置し、ＰＢＳで洗浄した。
電極基盤に電解液（０．０５Ｍトリエチルアミン含有０．１Ｍ ＰＢＳ）を６０μＬ加えた後、＋１．２Ｖ（ｖｓ．金参照電極）を印加し、電解発光測定を行った。
種々のＢＳＡ抗体濃度について測定した電解発光強度から図２に示す検量線を得た。
この検量線を用い、同様にして、検体中のＢＳＡ抗体を定量することができる。
（１）ＢＳＡの電極基盤上への固定
図１に示す金電極基盤を室温で、ピラニア液（濃Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２（３０％）＝３：１）４μＬで１分間洗浄し、金電極表面を清浄にした。その後、蒸留水で洗浄した。この金電極をジチオジブチリック酸溶液（７１．５ｍｇ／３０ｍＬエタノール）に浸漬し、１２時間室温で撹拌することにより金表面にＡｕ−Ｓ結合を形成した。その後エタノールで洗浄した。金電極表面に結合したカルボキシル基を活性化するために、ＷＳＣ５０ｍｇおよびＮＨＳ３０ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳの溶液に室温で６０分間電極基盤を浸漬し、その後ＰＢＳで洗浄した。ＢＳＡ０．２ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液に電極基盤を加え、４℃で１５時間反応させ、ＢＳＡを金電極表面に化学結合させ、ついでＰＢＳ溶液で洗浄した。金電極上の未反応の活性化カルボキシル基をつぶすために電極基盤を０．１Ｍ ２−アミノエタノール（６１．０ｍｇ／１０ｍＬ ＰＢＳ）溶液に４℃で、１時間浸漬した。室温で１５分間静置した後、０．０２％Tween２０含有ＰＢＳ溶液で洗浄して、ＢＳＡ固定電極基盤を得た。
（２）ＢＳＡ抗体の定量
以上のようにして調製した電極基盤に、実施例１で調製したＢＡＳ抗体結合リポソームＰＢＳ溶液５μＬと各種濃度のＢＳＡ抗体ＰＢＳ溶液２５μＬを加え、室温１で時間インキュベートして競争的な抗原抗体反応を行った。その後ＰＢＳで電極洗浄し、ＰＢＳ溶液をマイクロピペットで吸いだした。
この電極基盤にエタノール（７μＬ）を加えることにより電極上に結合したリポソームを破壊した後、６０℃で１０分間加熱した。この電極基盤を室温で１０分間放置し、ＰＢＳで洗浄した。
電極基盤に電解液（０．０５Ｍトリエチルアミン含有０．１Ｍ ＰＢＳ）を６０μＬ加えた後、＋１．２Ｖ（ｖｓ．金参照電極）を印加し、電解発光測定を行った。
種々のＢＳＡ抗体濃度について測定した電解発光強度から図２に示す検量線を得た。
この検量線を用い、同様にして、検体中のＢＳＡ抗体を定量することができる。
電極基盤に吸着されたリポソームの破壊条件の検討
実施例１（１）および（２）と同様にして調製した、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包するリポソームを含む水溶液を図１に示すごとき作用電極に滴下し、室温で３０分間静置後、洗浄、乾燥し、種々のアルコールを滴下し、発光強度を測定した。
結果を表３に示す。
表３から明らかなごとく、プロパノールによる破壊が最も効率がよい。
実施例１（１）および（２）と同様にして調製した、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包するリポソームを含む水溶液を図１に示すごとき作用電極に滴下し、室温で３０分間静置後、洗浄、乾燥し、種々のアルコールを滴下し、発光強度を測定した。
結果を表３に示す。
ルテニウム（ＩＩ）錯体の電極への吸着能の比較
種々のルテニウム（ＩＩ）錯体溶液（１．０×１０−６Ｍ）に作用電極を５分間浸漬し、洗浄後の吸着による発光強度を測定した。
結果を表４に示す。
表４から明らかなごとく、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体を基本骨格とする、チオール基、ジスルフィド基およびアミノ基を有する側鎖を持つ錯体が金電極への吸着能が高い。
種々のルテニウム（ＩＩ）錯体溶液（１．０×１０−６Ｍ）に作用電極を５分間浸漬し、洗浄後の吸着による発光強度を測定した。
結果を表４に示す。
表４から明らかなごとく、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体を基本骨格とする、チオール基、ジスルフィド基およびアミノ基を有する側鎖を持つ錯体が金電極への吸着能が高い。
本発明によれば、タンパク質の簡便で高感度の、生化学、医学、薬学等の分野で有用な、また、環境汚染物質の分析にも有用なイムノアッセイ方法が提供できる。
Claims (7)
- 被検タンパク質と、該タンパク質を表面に結合させた、ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包したリポソームとを、電極基盤上に固定した該タンパク質と抗原抗体反応する物質と競合反応させ、ついで、電極基盤に結合したリポソームを破壊してルテニウム（ＩＩ）錯体を漏出させ、電極に吸着させ、電解液を添加して、ルテニウム（ＩＩ）錯体の電解発光を測定し、その発光強度に基づいて被検タンパク質を定量することを特徴とするイムノアッセイ方法。
- ルテニウム（ＩＩ）錯体が、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体である請求項１記載の方法。
- ルテニウム（ＩＩ）錯体が、側鎖を有するビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体である請求項１記載の方法。
- リポソームの破壊を、炭素数１〜４のアルコールの添加により行う請求項１記載の方法。
- アルコールが、エタノールまたはプロパノールである請求項４記載の方法。
- 電解発光強度の測定を、金作用電極を用いたチップリーダーで行う請求項１記載の方法。
- トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノアミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）錯体を内包するイムノアッセイ用リポソーム試薬。
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|---|---|---|---|
| JP2005290995A JP2007101339A (ja) | 2005-10-04 | 2005-10-04 | 電解発光物質を内包するリポソームによるイムノアッセイ方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108743533A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 温州生物材料与工程研究所 | 一种脂质体包封的钌多吡啶配合物及其应用 |
| CN114705742A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-07-05 | 南京理工大学 | 一种基于锌卟啉有机笼的仿生膜结构及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06207939A (ja) * | 1992-12-21 | 1994-07-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | リポソーム膜溶解方法及びそれを利用した抗原又は抗体の定量方法 |
| JPH09184841A (ja) * | 1992-07-02 | 1997-07-15 | Becton Dickinson & Co | 異なった検出可能な物質を含む微粒子を用いた免疫検定における信号の強化方法 |
| JP2002214231A (ja) * | 2000-11-02 | 2002-07-31 | Satake Corp | 試料中のダイオキシン類の濃度を測定する方法及びその装置 |
-
2005
- 2005-10-04 JP JP2005290995A patent/JP2007101339A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH09184841A (ja) * | 1992-07-02 | 1997-07-15 | Becton Dickinson & Co | 異なった検出可能な物質を含む微粒子を用いた免疫検定における信号の強化方法 |
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| CN108743533A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 温州生物材料与工程研究所 | 一种脂质体包封的钌多吡啶配合物及其应用 |
| CN108743533B (zh) * | 2018-05-30 | 2021-08-06 | 温州生物材料与工程研究所 | 一种脂质体包封的钌多吡啶配合物及其应用 |
| CN114705742A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-07-05 | 南京理工大学 | 一种基于锌卟啉有机笼的仿生膜结构及其应用 |
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