JPH02504672A - 単量体性フタロシアニン試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単量体性フタロシアニン試薬 発明の分野 本発明は、イムノアッセイおよびフローサイトメトリー　（Ｉｌｏｗ　ｃｙｔｏ ｍｅｌｒｙ）操作における検出試薬または一重項酸素産生による殺細胞を目的と した治療用試薬として使用するための水溶性金属フタロシアニン化合物で、抗体 または酵素で切断可能なリガンドのような生化学的成分に単量体で複合している 水溶性金属フタロシアニン化合物を提供する。

発明の背景 フタロシアニン色素はイソインドール基（Ｃ６Ｈ４’）Ｃ２Ｎ４個がチッ素原子 ４個で結合され環状複合鎖となっている耐光性有機色素の一団である。フタロシ アニン（青−緑）、銅フタロシアニン（青）、塩化銅フタロシアニン（緑）およ びスルホン化銅フタロシアニン（緑）が挙げられる。これらの色素は一般にエナ メル類、プラスチック類、リノリウム、インク類、壁紙、繊維９紙およびゴム製 品に用いられている。

遊離塩基フタロシアニン、およびアルミニウム、カドニウム、マグネシウム、シ リコン、スズおよび銅の金属フタロシアニン類は蛍光性であると報告されている （Ｔｈｅ　Ｐｈ１ｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ　　］　：　１２７．１９８３）　 ｏ　１個以上のこれらの種が、半導体、有機色素、しみ抜き剤、殺菌剤および光 学的コーティングに利用されておりまた提言されてきた。

ヨーロッパ特許公報系１４２．３６９号は、特に好塩基球を他の血液細胞から識 別する血清学におけるフタロシアニン誘導体の使用を開示している。

フタロシアニン類は種々のイムノアッセイにおける使用の可能性が報告されてき た。米国特許第４．１６０．６４５号（１８段、１８〜２２行）、米国特許第４ ．１９３．９８３号（１６段。

３６〜３９行）、米国特許第４．２２０．４５０号（１７段、２３〜２６行）、 米国特許第４．２３３．４０２号（２４段、５３〜５６行）、米国特許第４．２ ３５．８６９号（１１段、　６行〜１２段２行）、米国特許第４．２５６．８３ ４号（２１段、３４〜３６行）、米国特許第４，２７７゜４３７号（１７段、１ １〜１４行）、米国特許第４．３１８．７０７号（９段、１４〜１６行）、米国 特許第４．４８３．９２９号（６段。

３６〜３９行）、米国特許第４．５４０．６６［１号、米国特許第４，５４０、 ６７０号（１１段、４０〜５９行）、米国特許第４．５６０．５３４号（５段６ ７行〜６段７行）、米国特許第４．６５０；　７７（１号（１８段、２２〜２５ 行）、米国特許第４．６５６．１２９号および米国特許第４．６５９．６７６号 （２段、４０〜４６行）を参照されたい。

フタロシアニン誘導体は化学発光イムノアッセイ系で触媒として用いられてきた 。ハラ（Ｂａｒｓ、Ｔ、　）ら、日本化学学会誌（ｂｉｔ、ＣｂｅＩＩｌ、　Ｓ ｏｔ、Ｊｐｎ、　）　５６　二２９６５−２９６８．１９８３　；ハラ（Ｈａｒ ａ、Ｔ、　）ら９日本化学学会誌（Ｂｕｌｌ、　Ｃｂｅｔｎ、　Ｓｏｃ。

Ｊｐｎ、　）　５６　：　２２６７−２２７１．１９８３　；ハラ（Ｄａｔａ、 Ｔ、）ら２日本化学学会誌（Ｂｕｌｌ、　Ｃｂｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｊｐｎ、　） 　５７　：　５Ｂ？−５８８，１９８４；ハラ（Ｄａｔａ、Ｔ、　）ら９日本化 学学会誌（Ｂｕｌｌ、Ｃｂｅｍ、　Ｓｏｅ。

Ｊｐｎ、　）　５７　：　３（１０９−３０１０，１９８４；　ハラ（Ｄａｔａ 、Ｔ、　）ら９日本化学学会誌（Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、　Ｊｐｎ、　 ）　５７　：　３００９−３０１０．１９１１４　；およびハラ（）１ｍｔａ、 Ｔ、　）ら１日本化学学会誌（Ｂｕｌｌ、Ｃｈｔｍ、　Ｓｏｃ、　Ｊｐｎ、　） 　５８１２９９−１３０３．１９８５を参照されたい。これらの文献において、 鉄フタロシアニンをルミノールと過酸化水素の化学発光反応の触媒として用いる 化学発光錯体触媒イムノアッセイについて、ハラは記載している。化学発光シグ ナルを定量化し検査試料中に存在する分析物の量と相関させる。ハラは幾つかの フタロシアニン（Ｆｅ、Ｃｏ）およびポルフィリン（Ｆｅ、　　Ｐｔ、　Ｍｎ、 　　Ｓｎ）錯体を調べ、鉄フタロシアニンが最高の触媒活性を示しかつこの種の アッセイで最高感度を付与することを報告した。

このフタロシアニン類は、また、光力学的療法（ＰＤＴ）における使用も提言さ れており、この療法は、光感受性の薬剤（増感剤）と照射線源としての可視光を 利用する癌照射療法である。増感剤は選択的に癌組織に運搬されなければならな い。例えば、モノクローナル抗体・ヘマトポルフィリン複合体が報告されている （Ｍｅｔ　、　Ｄ。

ら、　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．　１３０（３）：１４７３−１４７７．１９Ｈ）　 、その後に可視光線によって増感剤を活性化し、−重積酸素産生に伴う光力学的 反応によって細胞を殺す。フタロシアニン類、特にアルミニウムおよび亜鉛テト ラスルホン酸誘導体は、培養哺乳類細胞に対する光増感剤しての使用に基づき、 ＰＤＴにおいて使用することが示唆されている。

これに関しては、Ｂｅｎ−Ｈｅｒ　、　Ｅおよび１．　Ｒｏｓｅｎｌｈａｌ　。

Ｉｎ１．　Ｊ、　Ｒｉｄｉａｔ、　Ｂｉｏｌ、　４７：１４５−１４７．１９８ ５　；　Ｂｅｎ−０ｕｒ　、　Ｅおよび１．Ｒｏｓｅｎｔｂａｌ　、　Ｐｈｏｊ ｏｃｈｅｍ、ｘｎｄ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、　　４２：１２９−１３３，１９１ １５　；　Ｂｅｎ−Ｈｕｔ　、　ＥおよびＩ、　Ｒｏｃｅｎｔｈａｌ　、　Ｒａ ｄｉａｌ、　Ｒｅｓ、　　１０３：４０３−４０９．１９８５　；　Ｂｒａｓｓ ｅｕｔ、　　Ｎ、ら、　　Ｐｈｏｔｏｃｂｅ＋ｎ、ａｎｄ　Ｐｂｏｌｏｂｉｏｌ 、４２：５１５−５２１．１９８５　　；　Ｂｅｎ−Ｈｕｔ　、　Ｅおよび１． 　Ｒｏｓｅｎｆｂａｌ　、　Ｌａ５ｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓ１ニア９−８６．１９８６　；　Ｂｅｎ−Ｈｌｌｒ　、　Ｅおよび１． 　Ｒｏａｅｎｌｈａｌ　、　Ｐｈｏｌｏｃｂｅｍ　ａｎｄ　Ｐｂｏｊｏｂｉｏｌ 、　４３：６１５−６２１　；　Ｃｈａｎ、　　Ｗ、　Ｓ、ら、　　Ｂｔ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ　５３：２５５−２６３，１９８６　　；　１．Ｒｏｓｅｍｌｈｚ ｌ　　ら、　　Ｒａｄｉａｌ、　Ｒｅｘ、　３０７：１３６−０２．２９８６　 　；　５ａＩｔｎａｎ、　Ｓ、　Ｂ、　　ら、　　Ｊ、Ｉ）ｒａｌｏＨ。

１３６：１４１−１４５．１９８６およびＢｅｎ−Ｂｕｒ、　Ｅ、　　ら、　　 Ｉｎｌ、Ｊ、Ｒａｄｉａｌ。

Ｂｉｏｌ、　５１：４６７−４７６．１９８７を参照されたい。

蛍光化合物類（蛍光団類：フルオロホアズ）は、イムノアッセイ、フローサイト メトリーおよび蛍光顕微鏡で広く用いられてきた。さらに、最高感度の酵素免疫 測定法は、比色基質よりもむしろ蛍光原基質を用いる。周知の蛍光原酵素基質組 み合わせ３種は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と４−メチルウンベリフェリ ルリン酸（ＭｕＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）と４−メチルウンベ リフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭｕＧ）、および西洋わさびペルオキシ ダーゼ（Ｉ（ＲＰ）とｐ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰ　Ａ）である。

一般に、このＡＰ系・β−Ｇａｌ系およびＨＲＰ系は、１０−】５Ｍを超える濃 度の分析物質の検出に有用である。

現在では、これらの系の感度は生成された蛍光団のスペクトル特性によって限定 されている。

発明の要約 この発明は、フタロシアニン誘導体を抗原・抗体またはオリゴヌクレオチドに単 量体で複合させる蛍光試薬および／または色素原試薬を提供する。二量体または さらに高度の凝集体に対してこのフタロシアニン部分の単量体としての性質は、 試薬中のフタロシアニンの発光および／または吸収を保ち、さらにそれによって この主題試薬類を用いるアッセイの信号強度と感度を保つ上で極めて重要である 。

蛍光団として使用するために、遊離塩基フタロシアニンは、アルミニウム、シリ コン、リン、カリウム、ゲルマニウム、カドミウム、マグネシウム、スズまたは 亜鉛で金属化できる。色素原として使用するためには、フタロシアニンを金属化 することもしないでおくこともできる。水溶液中で使用するために、大環状フタ ロシアニン７は、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、カルボン酸塩、リン 酸、リン酸塩、ホスホン酸塩、ヒドロキシ。

フェノキシ、アミノ、アンモニウムおよびピリジニウム置換基のような水溶性置 換基で誘導体とするべきである。

さらに凝集解除を促進するために３価以上の原子で金属化することが推奨される 。その結果、フタロシアニンは水溶液中で軸配位子（リガンド）を取る。凝集（ および非特定結合）を防止するもうひとつの方法は、ウシ血清アルブミンのよう な実質的にフタロシアニン単量体を包含する親水性成分て試薬を複合することで ある。

主題試薬はイムノアッセイの検出マーカーとして有用である。酵素免疫測定およ びｃＤＮＡアッセイで使用するために、単量体のフタロシアニン誘導体を酵素で 切断可能な結合を介して抗原、抗体またはオリゴヌクレオチドに複合させるのが 典型的である。別のフタロシアニン、つまり重金属種または常磁性種に蛍光性フ タロシアニン単量体を切断可能な結合でつなぐ可逆的に消光された実施例もまた このようなアッセイで報告されているグループとしての使用のために挙げられて いる。

モノクローナル抗体に単量体で結合した蛍光性フタロシアニン類は、蛍光顕微鏡 、フローサイトメトリーおよび光力学的療法に使用する上で特別の利点を持った 試薬を提供する。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、水中におけるアルミニウムフタロシアニン三スルホン酸の蛍光放出 スペクトルを示す。第１Ｂ図は、ジメチルスルホキシド（プロットａ）および水 （プロットＣ）におけるアルミニウムフタロシアニンに比較し、水（プロットａ ）におけるアルミニウムフタロシアニン三スルホン酸の可視吸光スペクトルを示 す。第２図および第３図は、実施例８て開示した補助用ディツプスティックの代 表的実施例を示す。第４図から第８図は、実施例９で開示した競合的結合ディツ プスティックの代表的実施例を示す。第９図から第１２図は、実施例９で開示し たイムノアッセイ装置の別の実施例を示す。

好適な実施例の詳細な説明 本発明は、化学分析物質、生化学分析物質または生物分析物質の存在と典型的に はその量を血液血漿または尿のような生理的液体中で頻繁に測定するイムノアッ セイ、ｃＤＮＡアッセイおよびセルソーティングのような分析操作で用いられる 改良された蛍光試薬を提供する。このようなアッセイに理想的な蛍光物質は、高 蛍光量子収率、大きいストークス（Ｓｔａｋｅｓ）シフト（＞５ｈｍ）および６ ００ｎｍを超える波長における発光を有する。高量子収率は、上記操作で用いた 励起光が効率的に検出可能な発光に変換されるよう確保する。ストークス（Ｓｔ ｏｋｅｓ）シフトが大きいことによって、実際の信号とラマン（Ｒａｍａｎ　） 、レーレイ（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）およびチンダル（Ｔｙｎｄａｌｌ　）光散乱由 来の混入信号を識別できる。６００ｎｍを超える波長における発光は、生理的液 体中に存在する内因性蛍光物質類（例えば、血清タンパク類、ビリルビン、ＮＡ ＤＨ）および試薬やセル不純物に起因するバックグラウンド蛍光（典型的には約 ３５０ｎｍから約６００ｎｍ　）を消失させる。

例示のために以下の表で、このような分析操作で用いられてきた蛍光物質４種、 っまり６，６′　−ジヒドロキシ−（Ｌ　　１’−ジフェニル）−３，３’　　 −二酢酸（ＤＢＤＡ）　、４−メチルウムベリフエロン（ＭＵＮ）　、フルオレ セイン（Ｆ）およびローダミンＢ（Ｒ−Ｂ）の励起波長（ＥＸ）、発光波長（Ｅ Ｍ）　、ストークスシフト、および量子収率を比較する。

蛍光物質　　ＥＸ　　　ＥＭ　　ストークスシフト　ＱＹＤ　Ｂ　Ｄ　Ａ　　　 ３２０ｎｍ　　４１０ｎｍ　　　　９０ｎｍ　　　　　　−−−Ｍ　Ｕ　Ｎ　　 　　３６０ｎｍ　　４４８ｎｍ　　　　８８ｎｍ　　　　　　Ｏ，５Ｆ　　　　 　　４９５ｎｍ　　５２５ｎｍ　　　　３０ｎｍ　　　　　　（１，５Ｒ−Ｂ　 　　　５９６ｎｍ　　６２０ｎｍ　　　　２４ｎｍ　　　　　　（１，６表につ いて言及すると、ＤＢＤＡおよびＭＵＮは双方ともに５００ｎｍ未満の波長で発 光するので、生理学的アッセイで使用するための至適蛍光特性を欠如している。

フルオレセインも同様に６００ｎｍよりはるかに短い波長で発光し、さらに５Ｇ ｎｍ未満のストークスシフトを有する。ローダミンＢは６００ｎｍより長い波長 で発光するが、５ｈｍ未満のストークスシフトを有する。より良好なスペクトル 特性の蛍光物質の使用は、既存のアッセイ系をより高感度にする。

本発明は、構造式（１）の水溶性でかつ単量体で連結可能なフタロシアニン誘導 体の形態の改良された蛍光試薬を提供する。

下記に記載のように式中Ｍは２つの水素原子またはアルミニウム、シリコン、リ ン、ガリウム、ゲルマニウム。

カドミウム、マグネシウム、スズおよび亜鉛から選択された金属原子を示す。Ｒ ７は水溶性を付与する置換基を示す。置換基Ｒ２は同様に水溶性を増強しそして 別の試薬部位への複合に適当な連結性の結合を付与するか、または、このような 結合の切断残基である。しは軸リガンドである。

色素物質の一族としてメタロフタロシアニン類は６７０ｎｍを中心とする赤色帯 （ｒｅｄ　ｅｎｖｔｌｏｐｅ）の極めて狭く強度の吸収（Ｅ、　＝２３０，００ ０　”）と３５Ｏｎ＋ｎ周辺の幅の広くそれ程強くない吸収（Ｅ、　＝５（１， ０００）によって特徴付けられる。第１図に関して述べれば、アルミニウムフタ ロシアニン（１）の三スルホン酸誘導体の発光波長（６８０ｎｉ　）は３５０ｎ ｍにおける励起によって誘起され、生理溶液中の内因性蛍光物質の発光から赤色 にシフトする。アルミニウムフタロシアニン類の主な利点は３３０１のストーク スシフトであり、バックグラウンドレベルの低下により理論的検出限界に近づく ことを可能とする。蛍光測定からアルミニウムフタロシアニン三スルホン酸（１ ）はＩＱ−１５Ｍの低い濃度でも検出可能であることが示され、理論的計算から およそＩ　Ｘ　１０−コロＭの検出限界が示されている。

アルミニウムフタロシアニン化合物（１）はＤＢＤＡ。

ＭｔＪＮＳＦ、およびＲ−Ｂで観察されるよりも良好なスペクトル特性を有する ので、アルミニウムフタロシアニン種の使用は上記種を用いるアッセイよりも高 感度のアッセイを潜在的に付与する。しかし、生物系における有効プローブであ るためには、このアルミニウムフタロシアニン誘導体（１）は水溶性環境におい て溶解性で凝集を解除した状態としておかねばならず、さらにこの試薬において 単量体形態で複合しなければならない。

大環状フタロシアニン（１）に結合した下記の“Ｒ”置換基（Ｒ１および／また はＲ２）は、適切な水溶性部分、すなわちスルホン酸基（−８ｏ３Ｈ）　、スル ホネート基（５Ｃｈ−、Ｘ’）、カルボン酸基（ＣＯ２Ｈ）、カルボキシレート 基（−ＣＯ２−、Ｘ“）、リン酸基（−Ｐ０４Ｈ２）、ホスフェート基（−ＰＯ ４−，２Ｘ”）、ホスホネート基（−ＰＯ，Ｈまたは−ＰＯ，−。

Ｘ゛）、ヒドロキシまたはフェノキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、およ びアンモニウム・ピリジニウム基（−ＮＲ４’　、Ｘ−）である。誘導体（１） のＲ基の数が大きければ大きい程、生ずる水溶解性も大きくなる。

特にスルホネート基Ｒ，とＲ２は、広範囲のｐＨ（ｐＨ＝２〜１２）にわたり化 合物（１）を溶解性とする。。

下記の検討で、水溶性および高度に発光性のアルミニウムフタロシアニン三およ び四スルホン酸が蛍光性の水溶性金属化フタロシアニン誘導体（１）の主題群の 代表的モデルとして挙げられる。下記の実施例１で述べる如くスルホン化アルミ ニウムフタロシアニン類は、アルミニウムフタロシアニンのスルホン化、遊離塩 基フタロシアニンの金属化または全合成によって調製できる。三および四スルホ ン化誘導体は、他の誘導体１の多くを調製する水溶性前駆体として作用できる。

大環状フタロシアニンの疎水性のため、はとんどの水溶性フタロシアニン種は強 い凝集傾向を示す。例えば、親代合物アルミニウムフタロシアニン（１）（式中 、Ｒ１とＲ２はＨであり、ＬはＯＨである）はピリジン、ジメチルホルムアミド （ＤＭＦ）　、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノールのような溶 媒中で良好な単量体であるが、水中では強度に凝集し溶解性不良である。それに 比し、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸は水溶液中でほとんど凝集しな い。第１Ｂ図に関しにおける親アルミニウムフタロシアニンの可視吸収スペクト ルを水中（ａ）における三スルホン酸誘導体（１）に比較している。プロットａ とｂが近接し合流していることは、主題の誘導体（１）が水溶液中で本質的に単 量体であることを示唆している。二つの因子が関与していると考えられる。まず 第一に、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸が水溶液中で高い電荷を有し 、これが静電気的に自己会合を阻害する傾向がある。第二に、アルミニウムフタ ロシアニン三スルホン酸中のアルミニウム原子は、メタロ（ＩＩ）フタロシアニ ン類およびポルフィリン類に良く起こる“平板状”スクッキングを防止する軸リ ガンド″Ｌ″　（おそらく水中では−ＯＨである）を有する。さらに、アルミニ ウムフタロシアニン三スルホン酸の水溶解性が高く実質的に疎水性が小さいこと の結果、プラスチック、金属およびセルロース表面への非特異的結合が小さい。

溶解性に及ぼす軸リガンド（Ｌ）の効果が、塩化アルミニウムフタロシアニンで はなく水酸化アルミニウムフタロシアニンがメタノールのような極性プロトン性 溶媒で可溶であるという観察によって示唆されている。水溶性を高めるためには 、Ｚを水素、アルキル、アシルおよびシリル基から選択し後者の３基を好適には 荷電させ、Ｌを−ＯＺまたは−ＮＺ、とすべきである。

アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸の量子収率は単量体状態でおよそ０， ６であり、凝集した場合には本来の値の４％未満（０，０２）に減少する。この アルミニウムフタロシアニン試薬の二量体（またはさらに高度に凝集したもの） に対する単量体の性質は、蛍光発光にこのように極めて重要で、したがって本ア ッセイの信号強度および感度に対しても極めて重要である。

要点を繰り返し述べると、分子（１）の高量子収率と単量体としての性質は上述 のＲ基と中央のアルミニウム原子にも部分的に依存し、このアルミニウム原子は 溶解性を高め凝集開始を阻害するのに役立つ軸リガンドとなる。

さらに、中央のアルミニウムは全く目立った重金属効果を示さず、これは他分子 で蛍光を減少させることが示されている。＋３価以上の他の金属原子（Ｍ）は大 環状フタロシアニンで軸リガンドとなり、これによって水溶液中における凝集に 対する同様の抵抗力を与えると考えられている。蛍光量と１，７て使用する際に は、重金属消光効果を回避するために上記金属は反磁性で臭素よりも小さい原子 量を有するべきである。後者の目的のために適切な金属原子としてはアルミニウ ム、シリコン、リン、ガリウム、ゲルマニウムおよびスズが挙げられる。比較例 として、銅（ｎ）フタロシアニン三スルホン酸の蛍光量子収率はアルミニウム（ ＩＩＩ）フタロシアニン三スルホン酸の蛍光量子収率の２００分の１以下である ことが挙げられる。この差は凝集および銅の常磁性によるスピン軌道カップリン グの増大から生じる。両過程は非照射でも励起状態不活化を生じ、蛍光量子収率 を減少させるのに役特表平２−５０４６７２（５） 立つ。

商業的に利用する際には、アルミニウムフタロシアニン種は化学的にも光化学的 にも安定であるべきである。

フタロシアニン類は極めて安定な化学的化合物群であり、さらにアルミニウムフ タロシアニンは特にそうである。

このフタロシアニン類は熱に安定で、４００℃を超える温度で昇華によって頻繁 に精製される。化学的には、このフタロシアニン類は酸加水分解または塩基によ る加水分解、酸化および還元に対し耐性である。幾つかのメタロフタロシアニン 類と対照的にアルミニウム（ｍ）フタロシアニンは酸化状態における変化が起こ らず、測定可能な脱金属化傾向を示さない。アルミニウムフタロシアニン三スル ホン酸はまた光化学的にも不活性である。その高蛍光量子収率によって、はとん ど全ての励起状態エネルギーが発光によって消散する。さらに、アルミニウムフ タロシアニンスルホン化アナログの相対的吸光度および蛍光作用の研究から、広 範囲のｐＨ条件（ｐ　Ｈ’＝　４〜１３）で変動のない物理特性が示唆された。

直線的ダイナミックレンジ研究から、有効レンジが９０以上でありフルオレセイ ンおよびローダミンＢに比し検出限界が優れていることが示唆された。

アルミニウムフタロシアニンおよび関連化合物は、商業的に入手可能な材料から 容易に調製できる。親代合物（アルミニウムフタロシアニンクロリドとして）は 、コダック（Ｋｏｄａｋ　）　、ＶＷＲサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉ ｌｉｃ）　、およびストレムケミカルカンパニー（ＳｉｒｅｎＣｈｅｍｉｃｉｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できる。遊離塩基フタロシアニン四スルホン酸は、 ポルフィリンプロダクツ（Ｐｏｒｐｂｙｒｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｇ）　　（Ｐ、 ０．Ｂｏｒ　３１．　　Ｌｏｇａｎ　、　ＵＴ８４３２１　、　Ｕ。

Ｓ、＾、）で購入できる。全合成の前駆体は、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ　 ）　、）ダック（Ｋｏｄａｋ　）　、）−キョーケミカルインダストリーカンパ ニー　（Ｔｏｋｙｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　１ｎｄｎｓ！ｒ７　Ｃｏｍｐａｎ７　 ）　　（）−キョーカセイ）、ボートランド（Ｐ。

目１ａｎｄ、　Ｏｒｅｇｏｎ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を含め多種多様の供給源から購 入できる。

水媒体中で単量体であるアルミニウムフタロシアニン誘導体は、大環状官能基Ｒ のタイプと数を選択することによって調製できる。例えば、スルホン酸のような 極性または高電荷の官能基の導入は、対応するカルボキシル化または水酸基化さ れた種よりもアルミニウムフタロシアニンを水溶性とし凝集を低下させる傾向が ある。一般に、極性官能基（Ｒ１およびＲ２）の数が大きくなればなるほど、対 応するアルミニウムフタロシアニン誘導体の凝集は低下する。例えば、三または 四スルホン化アルミニウムフタロシアニンは、対応する一スルホン化またはニス ルホン化種よりも小さい凝集傾向を示す。誘導体が均一である程、凝集傾向は大 きくなる。例えば、アルミニウムフタロシアニン四スルホン酸の単一異性体は、 この四スルホン酸誘電体の４つの異性体混合物よりも凝集する。

アルミニウムフタロシアニンコア（１）は容易かつ再現性良く官能基で置換でき 、タンパク類およびその他の試薬部位に複合するための水溶性で反応性の種を生 成することができる。この目的のため、スルホンアミド、アミド、エーテルおよ びチオエーテル結合が好適である。言い換えれば、置換基Ｒ２はいずれのアミノ 、カルボキシ。

チオールまたはヒドロキシ官能基性質を有することができる。またはＲ２は、連 結された分析物質または他の試薬部分を直接に有することができる。この単量体 アルミニウムフタロシアニン種（１）が単量性を維持し続けることを確実とする ために、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような凝集解除性有機溶媒を含有する媒体中に この試薬部分を複合させるべきである。タンパク複合のためにはこのような有機 溶媒は、媒体の約１０％未満となるようにするべきであり、好適には約５％未満 である。より小さい有機分子への結合では、媒体の１０％を超え１００％までが 有機溶媒（類）であるべきである。アルミニウムフタロシアニンのスルホン化ア ナログを連結するための代表的合成プロトコールを実施例２に開示する。

このような反応性アルミニウムフタロシアニンを複合させることができる代表的 部位として、薬物（治療用および乱用）、薬物代謝物（例、コチニン）、ホルモ ン類。

ペプチド類、ヌクレオチド類、神経゛伝達物質類、コレステロール等が挙げられ る。代表的合成を実施例３で述べる。典型的な中間的大きさの生理的分析物質と しては、ホルモン類（例、甲状腺刺激ホルモン）、成長因子類（例、神経成長因 子）、オリゴヌクレオチド類（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび合成オリゴヌク レオチド断片類）およびペプチド類が挙げられる。本主題のフタロシアニン類も 同様に抗体、抗原結合断片、血清タンパク。

酵素、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞内オルガネラ、細胞表面抗原 等のような大型の試薬部位に単量体で複合できる。

使用に際しては、主題の単量体フタロシアニン試薬のすぐれた蛍光特性によりこ の試薬をイムノアッセイで検出マーカーとして有効に用いることができる。実施 例８と実施例９に代表的プロトコールを掲げる。その大きなストークスシフトは 、下記の理由によって、イムノアッセイ（およびｃＤＮＡプローブアッセイでも 同様）での使用に際しアルミニウムフタロシアニンを極めて有用な報告グループ とするのは注目すべきである。比較すると、フルオレセインを用いる不均一イム ノアッセイは、光散乱およびラマン（Ｒｚｍａｎ　）効果による高バックグラウ ンドの妨害によって感度が限定される。アルミニウムフタロシアニンの大きいス トークス（Ｓｊｏｋｅｓ）シフトは実質的にこの問題を縮小させ、アルミニウム フタロシアニンを用いるアッセイは極めて低濃度の分析物質を定量化できる。さ らに、フルオレセインは多くの蛍光性血液構成成分と同波長で発光する。したが って、フルオレセインを主成分としたイムノアッセイでは、機械的すなわち信号 処理によって自然バックグラウンド蛍光を消失させなければならない。これと対 照的に、アルミニウムフタロシアニンは、血液成分の蛍光発光の範囲を超えた波 長の光を発光する。アルミニウムフタロシアニンを用いる高感度アッセイは、こ のようにほとんどバックグラウンド−」 妨害もなく血液存在下でも行うことができる。

分光法によるデータから、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸が５ｎｓの 蛍光発光寿命とＯ，［１０５の偏光度を有することが示されており、このことか ら我々は、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸を薬物代謝物のような小抗 原に連結すると化合物（１）は抗原・抗体反応上の蛍光偏光変化を用いる均一系 を基本としたアッセイにも同様に適切であると結論する。

蛍光酵素測定の最終的感度は、生成した蛍光物質のスペクトル特性で決まる。水 溶性単量体アルミニウムフタロシアニン種は、現在入手可能な蛍光物質類（例、 ＤＢＤＡ、ＭＵＮ、Ｆ、Ｒ−Ｂ）よりも優れたスペクトル特性を示す。前にも述 べたように、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸は、高量子効率の発光（ ＱＹ＝０．６）、大きイストークス’　（Ｓｔｏｋｅｓ）シフト（３３５ｎｍ　 ）　、および内因性蛍光物質発光から赤色にシフトした発光波長（６８０ｎｍ　 ）を有する。したがって、試験溶液中に単量体アルミニウムフタロシアニンを酵 素的に産生ずる酵素・基質カップルを使用することは、現在技術の改良を意味す る。

酵素基質としてアルミニウムフタロシアニンを使用スるひとつの方法は、酵素切 断によって発光性となる非発光性種にそれを変換することである。蛍光分子は、 ヨウ素のような重原子を含有する小分子に共有結合することによって非発光性（ 消光された）とすることができる。

例えば、フルオレセインイソシアナート（ＦＩＴＣ）はチロキシンに共有結合的 に付着することによってより発光性が低下する。チロキシンの芳香環に結合した ヨウ素はこのフルオレセインの蛍光発光を１０分の１に低下させる。フタロシア ニンは、重原子の存在によって消光できる。ヨウ素含有小分子の共有結合的な付 着は、アルミニウムフタロシアニン誘導体を本質的に非発光性とする。

このような非発光性アルミニウムフタロシアニン酵素基質合成のための代表的プ ロトコールを実施例４に掲げる。

この単量体フタロシアニンは、酵素によっていったん切断されると溶液中で充分 に発光性となる。このような試薬は、例えばイムノアッセイまたはｃＤＮＡプロ ーブアッセイのような従来の酵素アッセイに利用でき、実施例４に開示するよう に報告グループとしても利用できる。

蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリ一応用においても、アルミニウムフタロシ アニンの水溶性単量体形態が同様に必要とされる。水溶解性は、上記に述べたス ルホン酸（ＳＯ３Ｈ）のような部分でアルミニウムフタロシアニンを誘導体とす ることによって付与される。水溶性アルミニウムフタロシアニンを誘導体とし、 抗体またはアビジンのようなタンパクに結合する反応性官能基を付与する。例え ば、水溶性アルミニウムフタロシアニンは、実施例５に述べるようにこのような 付着のために活性化され得る。

アルミニウムフタロシアニンは、フローサイトメトリー用標識として特に有利と なる幾つかの特性を持っている。３５０ｎｍの吸収極大は、フローサイトメトリ ーで現在広く用いられているアルゴンレーザーおよびより新しく廉価なヘリウム ・カドミウムおよびヘリウム・ネオンレーザ−によってもアルミニウムフタロシ アニン試薬が効率的に励起できることを意味する。６８０ｎｍの発光は、アルミ ニウムフタロシアニン試薬では既存の色素と発光スペクトルが重なることがなく 、ラマン（Ｒａｍａｎ　）　、　　レーレイ（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）またはチンダ ル（Ｔｙｎｄａｌｌ　）光散乱による妨害が皆無で、しかも自己由来（ａｕｔｏ ）またはバックグラウンド蛍光がないことを意味する。アルミニウムフタロシア ニン・抗体複合体は、マルチパラメータ分析に対して幾つかの独得な機会を与え る。まず第一に、最初にアルミニウムフタロシアニン・フルオレセインおよびフ ィコエリトリンを同時に用いることは、単一アルゴンレーザーを用いる３次元細 胞表面分析を行う方法を提供する。第二に、アルミニウムフタロシアニン・抗体 複合体とＤＮＡ染色染色剤スキストｌｏｔｃｂｓｔ　）　３３３４２は、ヘリウ ム・カドミウムレーザーを用いて細胞表面・細胞周期同時解析に行うために使用 できる。

本発明は、もうひとつの面で、比色イムノアッセイに使用する色素原性単量体フ タロシアニン試薬を提供する。

このような応用ではフタロシアニン（１）を銅で金属化するのが好適であるが、 しかし、他の金属類（Ｍ）、特にアルミニウムまたはシリコンを用いることがで きる。凝集はフタロシアニン種の吸光係数を低下させるので、凝集を低下させる 前記手段（軸リガンドの付与など）のいずれでもさらに吸収性の種を与えるため に用いることができる。実施例６は、このような試薬を調製するための代表的プ ロトコールを示す。

本発明はさらに治療用単量体フタロシアニン試薬を提供する。光免疫療法では、 腫瘍指向性抗体または結合断片に複合後も光増感剤が光力学的活性を保持するこ とが極めて重要である。この基準は、フタロシアニン試薬を抗体に単量体で結合 させることを確実にすることによってメタロフタロシアニン増感剤の場合に満足 される。なぜならば、そのようにしないと凝集種の自己消光が生体内における一 重項酸素の産生を弱めるからである。この目的に好適な金属（Ｍ）は、アルミニ ウムと亜鉛である。

フタロシアニンを抗体に単量体で結合する適切なプロトコールが実施例に述べら れている。

本発明は以下の代表的実施例によってさらに例示されスルホン化フタロシアニン 化合物類の合成に関し幾つかの方法が報告されている。例えば、フタロシアニン を発煙硫酸、硫酸１水和物と２０％発煙硫酸、塩化スルホン酸と加水分解、また はイオウ三酸化物・ピリジンで処理することができる。発煙硫酸でアルミニウム フタロシアニン（ＡＱＰｃ）をスルホン化することは、主に三スルホン化物を含 有するアルミニウムフタロシアニン化合物類の混合物を生成する。代表的合成プ ロトコールを示す。

塩化スルホン酸法：代表的合成においては、塩化スルホン酸３．０．ＴＩＬを撹 拌棒を付けた２５ｍ　Ｌの丸底フラスコ中の塩化アルミニウムフタロシアニン３ ９６ｍｇ　　（０，０６９ｍｍ。

１）に添加した。混合物を溶解させるため撹拌しアルゴン下に密封後、既に平衡 とした１４５℃の油浴に浸漬した。

この溶液を１４５℃で２時間撹拌し０℃に冷却後、氷２５ｇを漸次添加すること によって消光させた。生成したスラリー内部に含有される固体を吸引ろ過によっ て採取し、］０００ｍのＨ２０，３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ１！２で洗浄後、数時 間部分真空下で乾燥させた。結果として生ずる青色固体を元素分析によって特性 解析し、アルミニウムフタロシアニントリスルホニルクロリドで予測される比と 一致するＮ：Ｓ比を有することが示された。’ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ）分析か ら、この物質がスルホン化物質の混合物であることが明らかとなった。スルホン 化に要した温度と時間は、生成物分布に大きな影響を及ぼす。

アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸への変換ニアルミニウムフタロシアニ ントリスルホニルクロ′リドが主である２００ｍｇに対し、ｌＮＮａＯＨ１，Ｏ ｍＬを添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌し真空下で濃縮後、分離用Ｔ ＬＣ（１０％ＮＨ４０ＨＩ　：メタノール３）で精製した。生成した青色固体を 元素分析で分析し、アルミニウムフタロシアニン三スルホン酸と一致するＮ：Ｓ 比物質がスルホン化合物の混合物であることが明らかである。

上記に述べたアルミニウムフタロシアニンのスルホン化はフタロシアニン類の混 合物を生じ、フタロシアニン当たりの平均スルホネート基の数は３である。

遊離塩基フタロシアニン四スルホン酸の金属化：遊離塩基フタロシアニン類はポ ルフィリンと同様さまざまな種によって金属化でき、対応するメタロアナログを 生成する。金属化は、トリメチル金属および三塩化金属を含むさまざまな反応性 金属源によって行うことができる。

例えば、遊離塩基テトラフエニボルフィリンは（ＣＨ３）、ＡＱで金属化され対 応するアルミニウム誘導体を生成する。今日まで、スルホン化遊離塩基フタロシ アニンを反応性アルミニウム誘導体で金属化することは報告されていない。こう した理由から、下記の新規合成法を述べる。

撹拌棒を付けた１０ｍ　Ｌの乾燥丸底フラスコに遊離塩基フタロシアニン四スル ホン酸５０ｍｇ　（０，０６ｍｍｏｌ）を添加した。このフラスコをアルゴン下 に密封し、次いでこの内容物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１．０　ｍＬで 希釈した。溶解をすすめるために室温で１０分間撹拌後、この溶液を（ＬＨ９） 　３Ａｍ　（）ルエン中でＩＭ）０．７ｍＬ（１，３ｍｍｏｌ　）で処理し２５ ℃で１２時間撹拌し、真空下で濃縮した。メタノール抽出後真空下でこのメタノ ール性溶液を濃縮し、メチルアルミニウムフタロシアニン５ｆｆ１ｇヲ単離した 。

全合成：メタロフタロシアニン類は、金属塩とフタロニトリル類の反応（フタロ ニトリル法）、尿素および金属塩とフタル酸誘導体の反応（尿素法）、または金 属塩とジイミノイソインドリン誘導体の反応によって調製できる（Ｔｈｅ　Ｐｂ ｊｂａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ　、　　２巻Ｆ、　Ｈ，ＭａｓｅｒおよびＡ。

Ｌ、Ｔｂｏｍａ５　　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　、　Ｂｏｃａ　Ｒａｄｏｎ、　ＰＬ、 　　１９８３を参照されたい）。四スルホン化アルミニウムフタロシアニンの真 の全合成は報告されていない。上記の尿素法は、Ｗｅｂｅｒ、ＬＨ，およびり、 Ｈ，Ｂｕｔｃｈ　、　　Ｉｎｏｒｇ、ｃｈｅｍ、　　４　：　４６９，１９６５ ；Ｂａｎｍａｎ、　Ｆ、、米国特許第２．６１３．１２８号およびＦｕｋｘｄｉ 。

Ｎ、１日本化学雑誌（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｋｉｇａｋｕ　２ａｓｓｈｉ）　、　７５ ：　１１４１゜１９５４に記載されている。このような反応の産物は、必然的に 四スルホン化アルミニウムフタロシアニンの４つの異性体の混合物である。典型 的なアルミニウムフタロシアニン四スルホン酸の全合成を示す。

融解を介した合成：三塩化アルミニウム１３３ｍｇ　　（１，０ｍｍｏｌ）、４ −スルホフタル酸三ナトリウム塩］、２５ｇ　　（４゜９ｍｍｏｌ　）　、尿素 １．２ｈ　　（２０ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム１０７ｍｇ　　（２，０ｍｍ ｏｌ　）およびモリブデン酸アンモニウム１５ｍｇ（０，０１２ｍｍｏｌ　）の 混合物を細かく粉砕後チッ素下で２．５時間、２８０℃で加熱した。冷却後、粗 生成物を５０ｍ　Ｌメタノールで抽出後濃縮した。この生成物を蒸留水２０ｍ　 Ｌに取り、蒸留水に対して徹底的に透析した（３．５００　ＭＷカットオフ透析 チューブ）。アルミニウムフタロシアニン四スルホン酸が収率約１０％で生成し 、ＩＨＮＭＲｌＵＶ−ＶＩＳ吸収、および蛍光分光法で特性を解析した。

溶液を介した合成二上記反応物の１０ｍＬニトロベンゼン溶液をチッ素下で４時 間、１８０℃で加熱し、同様に、およそ同収率でアルミニウムフタロシアニン四 スルホン酸を生成した。ニトロベンゼンを粗反応混合物からデカントし、残渣を ベンゼンで洗浄し残存する微量ニトロベンゼンを除去した。この固体を蒸留水に 取り、上記の如く透析によって精製した。

上記製法における出発物質はスルホフタル酸であり、これは、その三ナトリウム 塩がアルドリッチケミカルカンパニー　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｍｐａｎｙ）から商業的に入手可能であり、また、その三アンモニウム塩が トーキヨーケミカルインダストリーズカンパニー（７ｏｋ７ｏ　Ｃｈｅｍｉｃｍ ｌ　ＩｎｄｎｓＨ７Ｃｏｍｐａｎり　　（Ｔｅ　ｌ）から商業的に入手可能であ る。両製品ともに、３−スルホフタル酸と４−スルホフタル酸の混合物である。

アルドリッチの物質は、３：１の混合物で４−スルホフタル酸が主であり、Ｔｅ ｌの製品はおよそ１：１である。これらの出発物質から生成された四スルホン化 フタロシアニン類異性体の数は、したがって、４個を超えている。

アルミニウムフタロシアニンのスルホン化アナログをつなぐための代表的合成プ ロトコールを下記に開示する。

反応性スルホン酸誘導体を介した直接結合：反応性アルミニウムフタロシアニン スルホン酸誘導体を共有結合で直接、反応性求核試薬（例、Ａ−ＮＨｚ、　Ａ− ＯＨ。

Ａ−３Ｈ，等）を含有する全ての生理的分析物質（Ａ）に結合できる。例えば、 いずれのアミノ化合物でもアルミニウムフタロシアニントリスルホニルクロリド に結合できる。下記の代表的プロトコールはｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）に 対するカップリングを示す。Ｎａ２Ｃ０３４２ｍｇ　（０，４ｍｍｏｌ　）のＨ ２０１，ＱｍＬ溶液をｇｏ”ｃで撹拌した溶液にＰ　Ａ　Ｂ　Ａ２７ｍｇ　（０ ，２ｍｎ＋ｏｌ　）を添加した。８０℃で５分間撹拌後、アルミニウムフタロシ アニントリスルホニルクロリド］００ｍｇ　　（０，］ｍｍｏｌ　）を撹拌しな がらゆっくりと添加した。８０℃で１２時間保った後、この混合物を２５℃には 冷却し真空下で濃縮した。生成した青色固体をアセトンで徹底的に細粒化し、対 応するモノＰＡＢＡスルホンアミドを得た。

別法として、ＰＡＢＡをアルミニウムフタロシアニン三スルホン酸に結合する下 記のプロトコールにおいてと同様に、スルホン酸残基の活性化によって試薬部分 を水溶性アルミニウムフタロシアニン誘導体にカップルさせることができる。ア ルミニウムフタロシアニン三スルホン酸１５θＴＤＷ　　（（１，１’１１＋１ １７１（１１）の２．［１ｍＬベンゼン撹拌溶液０．７５ｍＬ　（８，６ｍｍｏ ｌ　）を滴下しながら添加する。室温で６時間保った後、この溶媒を真空下に蒸 発させ、アルミニウムフタロシアニントリスルホニルクロリドを暗青色固体とし て得た。Ｎ　ａ　２　Ｃ０３６］ｍｇ　（０，５８ｍｍｏｌ）の１．０ｍＬＨ２ ０撹拌溶液（８０℃）にＰ　Ａ　Ｂ　Ａ　３］ｍｇ　（０，２３ｍｍｏｌ）を添 加した。８０℃で５分後、アルミニウムフタロシアニントリスルホニルクロリド ５５ｍｇ　（（１，（１６＋ｎｍｏｌ）を添加した。

この混合物を８０℃で６時間撹拌し、溶媒を真空下で濃縮し除去した。フラスコ の内容物をメタノール中１０％ＮＨ４ＯＨで希釈後真空下で再濃縮し、次にアセ トンで徹底的に細かく砕いた後、モノＰＡＢＡスルホニルアルミニウムフタロシ アニンニスルホン酸を得た。

アミノアルミニウムフタロシアニン誘導体を介した分析物質の付着：スルホン化 アルミニウムフタロシアニンは、対応するスルホン酸塩化物とジアミノ化合物の 反応によってアミノ誘導体に変換できる。例えば、Ｎａ２Ｃ（ｈ２４ｍｇの］、 ＯｍＬＨ，Ｏ溶液（８０℃）に２，２′　　−オキシビス（エチルアミノ）塩酸 塩１５ｍｇを添加した。８０℃で５分後、アルミニウムフタロシアニンスルホニ ルクロリド５００ｇを添加しこの混合物をさらにＨ２Ｏ０，５ｍＬで希釈、８０ ℃で１２時間加熱後対応するモノアミノ誘導体を得た。

カルボキシアルミニウムフタロシアニン誘導体を介した分析物質の付着：スルホ ン化アルミニウムフタロシアニンを活性化後にアミノ酸で処理し、モノ−、ジー 、トリーまたはテトラカルボキシ官能基を有するスルホン化アルミニウムフタロ シアニンを得る。生成した種を、トリエチレンおよびジメチルホルムアミド中で エチルクロロホルム処理によって無水混合物に活性化するか、または、分析物質 上の反応性求核試薬（Ａ−ＮＨ２，等）に直接カップルさせる。典型的合成法を 実施例３で述べる。

（ＰＡＢＡ））−（ＳＯ２）−ＡＱ、ＰＣ−（ＳＯ２ＣＱ”）　２５０ｍｇの０ ．５ｍＬ）リエチルアミン撹拌溶液（０℃）にエチルクロロホルム７μｅを添加 した。０℃で５分後、３−　（４−アミノブチル）モルフイン２９Ｂを添加した 。

反応混合物を室温まで温め８時間撹拌し、対応するモノモルフインを有する誘導 体を得た。

上記で述べたアルミニウムフタロシアニン−モルフイン複合物は、ＵＶ−ＶＩＳ および蛍光技術によって分光学的に検討した。これらのデータがら、複合したモ ルフインアナログが親化合物（量子収率０．４６）の７６％の発光性を有し、か つ、小ハプテンに直接アルミニウムフタロシアニン分子を単量体で複合させても 発光効率にはほとんど影響がないことが示唆される。

モルフイン、上記アミノモルフインアナログ、およびモノＰＡＢＡスルホニルア ルミニウムフタロシアニンジスルホネートアミノモルフイン誘導体の相対的免疫 親和性を、抗モルフインモノクローナル抗体とトリチウム標識モルフインによる 競合実験で求めた。これらの種のそれぞれが示した前記抗体に対する相対的親和 性を以下の表に示した。

これらの結果は、連結可能アナログを生成するためにモルフインを作用させても 抗体認識を妨害することがなく、アルミニウムフタロシアニン誘導体１個にモル フインアナログ約１個を付着させることでイムノアッセイにおいて親化合物と同 等の競合性を持つ種が生成することを示蛍光原アッセイ改良法を、分析物質およ び分析物質・酵素複合物の双方を認識するこの分析物質に特異的な抗体とともに 、分析物質および分析物質・酵素複合物をインキュベートする不均一競合酵素ア ッセイとして構成した。競合は抗体上の結合部位で起こる。検査溶液中に存在す る分析物質の量が増加するに伴い、抗体に結合する分析物質・酵素複合物の量が 低下する。インキュベーション後、抗体結合分析物質と分析物質・酵素結合試薬 を例えば分析物質に特異的な抗体に対して作製された固相固定化抗体を添加する ことによって、溶液から除去する。

抗体結合分析物質および分析物質・酵素複合物をこのようにして面相には固定化 後洗浄し、微量の遊離分析物質および分析物質・酵素複合物を総て除去する。そ の後、酵素的に切断可能な非発光性アルミニウムフタロシアニン複合物とインキ ュベートし、検査溶液中に高発光性の単量体アルミニウムフタロシアニン誘導体 を得る。もしこの固相に分析物質・酵素複合物が含有されているとフタロシアニ ン誘導体単量体が産生され、その結果生成する蛍光信号は試験溶液中に存在した 分析物質の量に間接的に比例するであろう。

酵素切断によって発光性となる非発光性のアルミニウムフタロシアニン誘導体は 、重原子効果・二量体化（自己消光）または電荷移動の利点を生かした幾つかの 方法に構成できる。

ヨウ素のような重原子はフタロシアニン類の蛍光発光を消光させることが公知で ある。したがって、このアッセイのための試薬複合物は、酵素で切断可能な結合 を介して共有結合したヨウ素原子を１個有するアルミニウムフタロシアニン誘導 体の形態を取ることができるｉこのヨウ素原子は軸方向（Ｌ）でアルミニウムフ タロシアニン誘導体に結合することができるし、または大環状またはその上の置 換基（Ｒ）に結合することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼは芳香環ヨウ 化物および脂肪族ヨウ化物を切断することが公知であるので、代表的種（２）〜 （４）（式中“−Ｃ８，１”はアルキルヨウ化物またはアシルヨウ化物を有する 全ての結合子を意味する）は西洋ワサビペルオキシダーゼ基質として機能できる 。

これとは別に、重金属原子または常磁性種（例−銅または鉄原子、ニトロキシド 、またはその他のスピンラベル）は酵素切断可能な結合の数の如何にかかわらず このアルミニウムフタロシアニン誘導体に結合できる。例えば、代表的種（５） および（６）で例示したように、ガラクトシダーゼ酵素基質が生成する。

アルミニウムフタロシアニンの共有結合性二量体は、別法として、軸結合または 大環状二量体化によっても産生できる。３つの典型的な実施例（７）　、　　（ ８ａ）および（８ｂ）を例示する。例中酵素切断可能な結合（Ｅ　ｃ）は可逆的 にこの単量体を互いに結合するために働く。

例えば、この２つの種をガラクトース部分で連結し、それによってβ−ガラクト シダーゼ基質を付与する。

特表千２−５０４６７２（１２） Ｃ （８ａ） （８ｂ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはアビジンのようなタンパク分子にアルミニ ウムフタロシアニンを直接結合すると、予想外に低い発光性のタンパク結合物が 生ずることがわかった。その結果、我々は、最高発光度のアルミニウムフタロシ アニンタンパク結合物は中間連結物を用いた間接的カップリングから生じたもの であろうと結論した。このような結合性連結物は、長さが少なくとも２原子、好 適には約４から約１２原子であるはずである。

２つの異なるタイプの連結物を用いる合成プロトコールを以下に示す。

第一のプロトコールでは、アルミニウムフタロシアニン（Ａ　Ｑ　Ｐ　ｃ）を塩 化スルホン酸で処理後水による冷却を行い単離すると、アルミニウムフタロシア ニントリスルホニルクロリドの形成につながる。有機溶媒中でトリスルホニル誘 導体と種々のアミノ酸のいずれかを反応させると、カルポル酸が官能基として入 り込んだ誘導体が生成する。カルボン酸の官能基としての作用を活性化させた後 に１０％未満の有機溶媒を含有する解離溶液中でストレプトアビジンまたは抗体 のいずれかのアミノ基に対して活性誘導体を直接カップリングさせると、希望す る単量体アルミニウムフタロシアニン・タンパク複合物が生成する。

第二の合成プロトコールでは、アルミニウムフタロシアニントリスルホニルクロ リドをジアミン類の個数に関係なくこのジアミン類で処理するとアミノ誘導体が 形成される。スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン −１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をアミノ誘導体にカップリングさせ、対応 するマレイミドを得る。抗体またはストレプトアビジンのいずれかのアミノ基を リン酸ナトリウム緩衝液中でＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸と別々に反応 させ消光後セファデックス精製を行うと、チオール化された種が生成する。

解離溶液中でチオール化タンパクをマレイミド誘導体に結合させると希望の単量 体アルミニウムフタロシアニン・タンパク複合物ができる。

ル・ヒパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐｘｑｕｅ）グラジェントで分離する。飽和 濃度の抗体で３０分間、４℃でインキュベートし、細胞をアルミニウムフタロシ アニン結合抗体またはビオチン化抗体のいずれかで標識後、リン酸緩衝生理食塩 水中で洗浄する。ビオチン標識細胞を次にアルミニウムフタロシアニン複合スト レプトアビジン１０日ｇ／ｍＱと３０分間、４℃でインキュベート後、洗浄する 。２色および３色蛍光分析では、この細胞をアルミニウムフタロシアニン結合抗 体またはビオチン結合抗体と同時にＦＩＴＣ結合抗体およびフィコエリスリン結 合抗体で標識す°る。生存細胞のＤＮＡ染色を含むアッセイでは、細胞をヘキス ）　（Ｈｏｅｃｈｓｔ　）　３３３４２色素１０ｕｇ／　ｍＱで３０分間、３７ ℃でインキュベートした後に４℃で抗体標識を行う。

アルミニウムフタロシアニン標識細胞のフローサイトメトリー分析は、グイレー ザー、ヘリウム・ネオンレーザ−１またはアルゴンイオンレーザ−またはヘリウ ム・カドミウムレーザーのいずれかのＵＶ線よる励起で行うことができる。発光 は６ＢＯｒ＋ｍ周辺で検出される。ＦＩＴＣおよびフィコエリスリンは４８８ｒ ｌＩＩ＋のアルゴンイオンレーザ−の空間的に分離したビームで励起され、蛍光 発光は５２０−５４０ｎｍおよび５６３−５８７＋＋ｍでそれぞれ検出される。

ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ　）ダイ（ＤＮＡ特異的）蛍光はアルゴンイオンレー ザ−の３５１−３６４　ｔＪＶレーザー線によって誘発され、発光は４２０ｎｍ 以上で検出される。

以下の実施例は、イムノアッセイで使用する代表的色素原性分析物質複合物およ びその調製プロトコールを開示する。これらの代表的分析複合物は、高分子担体 としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる。このＢＳＡコアに単量体銅フタ ロシアニンマーカー成分と分析物質成分（この場合、テオフィリン）を結合させ る。ここではＢＳＡを担体として記載するが、同様の機能を持った担体種いずれ でも良い。

マーカー成分の選択および複合：銅フタロシアニン（９）は、その高分子吸光係 数（λｍｕ　＝６７８．５ｎｍ　、　　ｇ＝２１１１゜５００、クロロナフタレ ン中）により分析物質複合物の可能なマーカー成分として選択したものである（ Ｊ、Ｃｈｅｍ。

ＳＯｅ、　、　２４６６、１９５７）。スルホン化によって水溶性としかつジク ロロトリアジニルアミノエタンスルホンアミドに変換することによって反応性と した改変型（１０）は、幾つかの色素製造業者（例えば、ＭＸ−Ｇ　；　Ｐｒｏ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＤｙｅ、　Ｉｎｃ、、　Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、　ＭＡ 、　Ｕ、　Ｓ、＾、）から粗生成物とじて親である銅フタロシアニン化合物（９ ）の高分子吸光係数にもかかわらず、このジクロロトリアジニルエチレンジアミ ンスルホンアミド誘導体（１Ｇ）　（以後“ＣｕＰｃ”特表千２”５０４６７２ 　（１４） と呼ぶ）は、ｐＨ＝８のリン酸緩衝液中でλｍａｔ　６６６ｎｍにおいてεが３ ４．６１５を示すことを我々は見い出した。カラムクロマトグラフィ　（シリカ 、　Ｄｏｗｅｘ　、セルロースセファデックス）または高速液体クロマトグラフ ィ　（ＨＰＬＣ）による精製はεを１５％しか増加させなかったが、これは不純 物以外の因子が分子吸光係数（ε）低下が観察されたことに関与していることを 示唆している。関連化合物を種々のｐＨおよび温度の水溶液に溶解すると、二量 体および／またはそれより大きいオリゴマーを形成して凝集し、εが劇的に低下 することが示唆されている（Ａｕｓｊ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　　２５：］６６］ −１６６７、１９７２）　、これらの凝集物のほとんどは二量体（ＣｕＰｃ）２ であり、以後そのように呼ぶ。

化合物（１０）は、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセインのＩｇＧへの至 適結合条件を述べたＪ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｊｈ、　　１３：３０５．１ ９７６の記載条件と同様の反応条件下でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合さ せた。ｐＨ＝８のリン酸緩衝液（２，０ｍＬ）中ＢＳＡ　（２５ｍｇ、　３．６ 　×ＩＯ−’＋ｎｍ０１）の撹拌溶液に化合物（Ｉｎ）　（１００ｎ＋ｇ　、　 ３．６　Ｘｌ０−２＋ｎｍｏ、ｌ）を添加した。この混合物を２５℃で２２時間 撹拌し次にセファデックｘ　（Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ）　Ｇ−２５でｐＨ＝８のリ ン酸緩衝液（１０，０ｍ　Ｌ）を用いろ過した。このろ液をアミコン（Ａｍｉｃ ｏｎ）限外ろ過（５０に；６００ｍＬ　　ｐＨ＝８リン酸緩衝波緩衝液０ｍＬ蒸 留水）で濃縮後凍結乾燥し、青色固体の複合物（１１）　（２２ｍｇ）　　（ε ｍｏｌ　＝４００．０００　）を得たが、このことから複合物（１１）のＭＷが ８０でアルミニウムと推定される。

ＢＳＡ　　　［（ＣｕＰｃ）　２　］　ｒｏ　　　　　　　　　（ＩＩ）関連複 合物は以下の表に示したように調製した。

表に関して言えば、Ｂ５Ａｌ分子当たりの化合物（１０）の二量体の数ＥＱ　　 （１０）／ＢＳＡは、精製後二量体−個当たりε＝４０，０００とし分子量を７ ０，０００と想定して求めた。

この複合物は総て極めて水溶性（■）であり、表に最後に示したもの（Ｓ）は例 外であった。およそ１９個の二量体を結合すると、ＢＳＡ担体の水溶性は実質的 に低下した。

二量体結合ＢＳＡ　（二量体単位当たりと＝４０，０００に基づく）を含有する 検査溶液中の治療用薬物分析物質のほとんどを簡単に視覚化する（Ａ＞０．１） ためには、担体−個当たり（１０）の二量体を少なくとも８個結合することが必 要である。このような感度によってテオフィリン（１０−１００ｎｇ　／　ｍＥ 血清）のような分析物質の検出ができるが、ジゴキシン（０，５−２ｎｇ／　ｍ Ｑ）のような１０ｎｇ／ｒｒｈＱオーダー以下の検査液中濃度の分析物質は検出 できない。これに比し、対応する単量体結合ＢＳＡ　（単量体８個結合と１単量 体単位当たりε＝　２００．０００に基づく；以下参照）は検出限界下限値を５ 分の１に下げ（ε単量体＝５ε二量体）、２から２０ｎｇ／　ｍ４範囲の濃度で 生じる分析物質を包含する。

凝集銅フタロシアニン誘導体は尿素およびチオ尿素を含有する水溶液中（Ａｕｓ ｔ、　Ｊ、　Ｃｂｅｍ、　　２６：１５４５．１９７３　）またはアセトンのよ うな溶媒中（Ａｎｓｔ、Ｊ、Ｃｂｅｍ、　２５：１６６１−１６６７．１９７２ ）で凝集を解除することが報告されている。（１１）（１１）の単量体アナログ を調製する我々の試みは、尿素中で不成功であった。しかし、あるアセトン：緩 衝液媒体中でのＢＳＡの（１０）への結合は、２　Ｘ　１０６を超えるεｓｓあ の単量体銅フタロシアニン結合ＢＳＡを主に生成するに至った。

Ｂ　ＳＡ　−（Ｃｕ　Ｐ　ｃ）　ｚｏ　　　　　　　　（１２）アセトン：緩衝 液の比率と同様添加の順序も複合物の発色の最適化に極めて重要であることがわ かった。乾燥ＢＳＡを漸次添加する前に、ｐＨ＝８のリン酸緩衝液に対し５０％ を超えるアセトンで構成される溶媒系に銅フタロシアニン誘導体（ｌＯ）を添加 すると至適発色が得られた。

代表的な合成法を示す。アセトン（８７，０ｍＬ）およびｐＨ＝８のリン酸緩衝 液（３７，０ｍＬ）の７０：３ｎ混合物中化合物（１０）の撹拌溶液（］００９ １ｇ　　１．ｌＸ１０−’ｍｍｏｌ）に対し、ゆっくりとＢ　Ｓ　Ａ　（７５ｍ ｇ、　　１．１Ｘ　］（１−’ｍｍｏｌ）を添加した。

この混合物を２５℃で４８時間撹拌し２４時間放置後、ｐＨ＝８のリン酸緩衝液 （３０，０ｍ　Ｌ）を用いてセファデックス（Ｓｅｐｂａｄｅｘ）　Ｇ−２５で ろ過した。ろ液を精製後アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外ろ過（５０に；３．ＯＬ 　　ｐＨ＝８リン酸緩衝液、２．ＯＬ蒸留水）で濃縮し、凍結乾燥後、暗青色固 体としてεｌ１ａｌ　＝２，１００，１００の複合物（１２）　（１７＋ｎｇ） を得た。この（１２）のＭＷは８０．０００と推定された。

単量体フタロシアニン類は、抗体および抗原のようなその他のアミン保有タンパ ク類に同様に結合でき、イムノアッセイに有用な着色試薬を一般に提供する。ア ルミニウムフタロシアニン誘導体は、適当な色素原であることに加えて発光性で あるという利点もある。

配位子成分のビオチン化：マーカー標識複合物（１１）と（１２）は、以下の代 表的プロトコールに述べるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチン（Ｎ ＨＳ−ビオチン）テビオチン化された。ｐＨ＝７ＰＢＳ　（１００ｕＱ）中復合 物（１１）　（５，０ｍｇ　、　６．３　Ｘｌ０−’ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に対 し、ＮＨ３−ビオチン（［１，４ｍｇ　、　１．３　Ｘｌ０−’ｍｍｏｌ）およ ヒシメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１００ｎｅ）とｐ）（＝７ＰＢＳ　（２０ ｕＥ）中３Ｈ−ＮＨ８−ビオチン微量を添加した。混合物を２５℃で２時間撹拌 し蒸留水（６００ｕ　Ｑ　）を用いセファデックス（Ｓｅｐ）＋ａｄｅｘ）　Ｇ −２５でろ過しビオチン化複合物（１３）を透明青色溶液として得た。放射性標 識取り込み度は、（１３）の各分子が平均１０個のビオチン分子でビオチン化さ れていることが示唆された。

（ビオチン）ｚｏ　　ＢＳＡ　　　［（ＣｕＰｃ）２コ、ｏ　　（１３）このよ うに高度にビオチン化された（１１）および（１２）の複合物を用いて行った予 備実験は、いずれの種も全くアビジン結合効果を持たないことを明らかとした。

我々は上記に述べた方法を用いて商業的に入手可能な鎖伸長化ビオチン（スルホ スクシンイミジル−６−ピオチンアミドルヘキサナー）　；　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃ ｂｅｍｉｃｉ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）で複合物（１１）と（１ ２）をビオチン化し、ビオチン１５個および１２個をそれぞれ有するビオチン化 アナログ種を作製した。結果として生じた複合種は、アビジン用に必要な親和性 を有していることがわかった。

分析物質成分連結テオフィリン誘導体：血清中テオフィリンアッセイのための分 析物質複合体で使用するため、連結されたテオフィリン誘導体をタンパクとの複 合のため調製した。まず第一に、テオフィリン酸（１４）をＲｅｔ、Ｃ。

ｍｍ、ｃｂｅｍ、Ｐａｔｈ、Ｐｈｕｍ、　　１３：４９７，１９７６に記載の如 く調製した。５．６−ジアミツー１．３−ジメチルウラシル水和物］、　Ｏｇ　 （５，’９ｍｍｏｌ　）と無水グルタル酸１．３４ｇ　　（Ｉｌ、８ｍｍｏｌ） のＮ、Ｎ−ジメチルアニリン１０．０ｍ　Ｌ溶液をチッ素下で３時間、２００℃ で加熱した。室温に冷却後生成した結晶をろ過によって採取した。この結晶をベ ンゼンで洗浄し水から再結晶した。テオフィリン酸（１４）が白色顆粒として７ ＤＯ＋ｎｇ　　（４５％）単離された。

酸（１４）　５０ｍｇ（０，１８８＋ｎ＋ｎｏｌ　）　、ピリジン４．０ｍＱお よびジオキサン１．ｏｍ！溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミド４３．２ｍｇ　（０，２２５ｍｍｏｌ　）を添加した。この 溶液を室温で１時間撹拌した。１，３−ジアミノプロパンのモノ−ｔ−ブチルカ ルバメート３５ｍｇ　（０，２０ｍｍｏｌ）の１．ｏｍｅジオキサン溶液を添加 し、生成した溶液を一晩撹拌した。この反応混合物をメチレンクロリドＩＯｍｅ で希釈し、希釈塩酸水溶液で洗浄後硫酸ナトリウム上で乾燥し濃縮した。化合物 （１５）は白色結晶固体として？’Ｏｉｎｇ単離された（８８％）。

カルバメー）　（１５）　　５０ｍｇ　（０，ＩＩ８ｍｍｏｌ　）に水冷したト リフルオロ酢酸／メチレンクロリド（１：　３）　１．ＯｍＥを添加した。この 溶液を０℃で１時間撹拌した。溶媒を除スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミ ド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）４０゜８　　 （Ｄ、ＩＩ８ｍｍｏｌ　）の１．ＯｍｅＤＭＦ溶液に１．ＯｍＱＤＭＦ中アミン （＋６）　３６ｍｇ（０，１１釦ｍ０１）を添加した。生成した溶液を室温で一 晩撹拌した。この反応混合物をメチレンクロリドｌＯｎ＋Ｑで希釈後３〜１０１ ＴＩＱ、の水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を除去し、白色固 体としてマレイミド（１７）を３８＋ｎｇ　（６３％）得た。

テオフィリン誘導体（１７）は、下記で調製するＢ、ＳＡ誘導体のようなスルフ ヒドリル保有種を複合するために適切である。分析物質複合体のテオフィリン（ 分析物質）成分と抗体（分析物質結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒｎｅｒ）　） との相互作用を最大とするため、この連結部に充分な長さをもうけた。この抗体 によるテオフィリン・タンパク複合体の認識を確実とするため、免疫原は分析物 質複合体を模倣すべきである。すなわち、テオフィリンに対する連結部は両目的 に合致しているべきである。

ｍｇ　（７，５８Ｘ　１０−’ｍｍｏｌ）の１．０ｍ１ｉ！ＰＢＳ　（ｐＨ７） 溶液に対し、希望する当量数のＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ オ）−プロピオン酸（Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ）の無水エタノール溶液を添加した。室温 で１時間後、この溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５でろ過 した。

生成したＢＳＡ／５ＰＤＰ複合体溶液に対し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　 １．２ｍｇ　　（７，５８ＸｌＯ−３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分後、 ３４３■における２−チオピリドンの吸光度を測定することによってこのタンパ クのスルフヒドリル（ＳＨ）含量をアッセイした。代表的結果を以下に示す。

５ＰＤＰ当量　　　　　　　ＳＲ／Ｂ５Ａ分析物質成分のＢＳＡに対する複合： 遊離スルフヒドリル基を持つ上記のＢＳＡ−３ＰＤＰ複合体を以下の如くテオフ ィリンアナログ（１７）と反応させた。ＢＳＡ−８ＰＤＰ複合体（ＳＨ／ＢＳＡ は３と求められた）３０■（４，５５Ｘ　１０−’ｍｍａｌ）溶液に対し、３０ 当量（１，ＨＸ　１０−２ｍｍｏｌ）のテオフィリンマレイミド（１７）を添加 した。室温で一晩撹拌後反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｂａｄｅｘ）　Ｇ −２５でろ過し蒸留水に対し透析した。凍結乾燥でＢＳＡ・テオフィリン複合体 ２５ｍｇを得た。Ｂ５Ａ１個当たりテオフィリンハプテンが３個であることの決 定は、λ２８０■における吸光度測定によって行われた。

典型的分析物質複合体の構築二分析物質複合体において、分離マーカー・リガン ドおよび分析物質成分を単一担体分子に直接結合することができる。以下に図示 した代表的分析物質複合体（１８）は、好適には単量体フタロシアニン類をＢＳ Ａに共有結合させＢＳＡのビオチン化およびテオフィリン類のＢＳＡへの複合に よって形成される。これら総てについては上記で述べた通りである。

ビオチンまたはその他の指定したリガンド成分は、もちろん分析物質複合体から 除外される。

二対の担体分子を用いる分析物質複合体についての２つの実施例を以下に示した 。

これらの分析物質複合体の調製は、上記に述べるプロトコールに従う。すなわち 、色素結合、ビオチン化、およびＢＳＡに対するテオフィリン複合である。分析 物質複合体（１９）の形成は、ＢＳＡ保有フタロシアニン成分をＢＳＡ保有ビオ チン類およびテオフィリン類に結合させることで行われる。同様に、複合体（２ ０）は、ビオチン化色素標識ＢＳＡをテオフィリン類を複合させたＢＳＡに結合 させることによって形成される。ＢＳＡ−ＢＳＡ結合は、上記に述べた如＜ＢＳ Ａ成分のひとつにスルフヒドリル基を導入すること、およびスルフヒドリルに反 応性の官能基、例えばアルファーヨード酢酸またはマレイミド類のような官能基 をその他のＢＳＡ成分中に取り込むことによって達成される。

この方法を拡張すると、以下に示したようにモジュール式の分析物質複合体（２ １）が生ずる。

個々のＢＳＡ複合体およびＢＳＡ結合の構成は上記の如く調製される。

物質複合体はアビジンリガンド成分を含有できる。２つの代表的アビジン化分析 物質複合体を以下に示す。

（２２）と（２３）の調製は上述の化学手法に基づいて調製される。（２２）に ついては、上述のＢＳＡ複合体結合に類似の方法で、色素−ＢＳＡ複合体がアビ ジン・テオフィリン複合体に共有結合で結合されている。（２３）の形成では、 アビジンをＢＳＡ保有色素およびテオフィリン類の双方に結合させる。

体の銅フタロシアニン成分の疎水性によって、この複合体がポリエチレンおよび その他のプラスチック類のようなある表面に非特異的に結合することがある。こ の潜在的問題は色素・ＢＳＡ錯体を別のＢＳＡで覆うことによって軽減される。

色素・ＢＳＡ複合体のＢＳＡ保護型（２４）は、ＢＳＡ複合体とＢ　ＳＡ・アビ ジン複合体を結合するための上述の化学を利用する。特に、色素・ＢＳＡ錯体を ＳＭＣＣで処理し、マレイミド基を有する色素・ＢＳＡ複合体を得る。

この錯体に対し、色素・ＢＳＡ複合体上のマレイミド基とともに過剰のＢＳＡス ルフヒドリル基を添加し２つの種の共有結合が生じ、（２４）のようなりＳＡ保 護色素・ＢＳＡ複合体が生成する。これはサイズ排除クロマトグラフィによって 簡単に精製でき、ビオチンのようなりガントおよび（１７）のような分析物質を これ（精製物）に結合させこの分析物質複合体を作る。

（２４）のようなりＳＡ被覆複合体はまた、発光の酸素クエンチングを消滅させ るのに用いることができる。例えば、メタロポルフィリン類は、このようなマー カー類（“色素”）を周囲の酸素と接触しないよう隔離することによって、マー カー成分として用いられる。例えば、タンパク質性複合体（２４）の疎水性コア 内部にプラチナポルフィリンのような酸素消光性の発光マーカーを遮蔽する（実 施例７参照）ことによって、酸素は物理的に励起状態金属と干渉しないよう遮断 される。ランタニドポルフィリンで発生することが公知であるような振動による 不活化による発光シグナルクエンチングは、例えば（２４）のような保護性複合 体内部にイッテルビウムポルフィリンを錯体化することによって同様に低下され る。

実施例７ プラチナ（Ｐｔ）およびイッテルビウム（Ｙｂ）ポルフィリン誘導体に特有の発 光特性は、それらをイムノアッセイ系で注目を集める報告グループとしている。

アルミニウムフタロシアニンと同様に、プラチナおよびイッテルビウムポルフィ リンは大きいストークス（Ｓｊｏｋｅｓ）シフトを示し、かつ、内因性生理的蛍 光物質より大きい波長（それぞれ６５０ｒ＋ｍと９７５ｎｍ　）で発光する。ア ルミニウムフタロシアニンと異なり、ｐｔおよびＹｂポルフィリンの発光は長寿 命でさらに溶液中で選択的に消光できる。テオフィリンのような分析物質に直接 または間接的にカップルさせると、このポルフィリン誘導体は均一系または不均 一系イムノアッセイにおける分析物質複合体として用いることができる。このよ うな使用のために、ポルフィリンピロール環は既述の水溶解性基Ｒで置換するべ きである。代表的実施例は、テトラカルボキシルテトラフェニルポルフィリンお よびテトラスルホテトラフェニルポルフィリンである。

均一イムノアッセイ：このＰｔまたはＹｂポルフィリン分析物質複合体のいずれ かを抗体に結合することで、メタロポルフィリンの保護が行われる。Ｐｔ種につ いては、抗体はリン光の酸素消光に対する保護を付与する。

ｙｂ誘導体の場合には、励起金属を振動により不活化することによって、抗体は このプローブを水環境および発光クエンチングから保護する。その結果、溶液中 に存在する遊離（および消光）分析物質複合体と対照的に、この抗体結合分析物 質複合体は発光性である。発光の度合いを測定し、検査試料中に存在する分析物 質の量と関連リン類の分析物質複合体は発光クエンチングを受けないように構築 される。発光性誘導体類は、Ｐｔの場合には酸素およびｙｂの場合には水と相互 作用することを立体的に妨害する部分によってその金属中心が取り囲まれること が必要である。分析物質複合体（２４）の典型的な保護型は、酸素存在下におい て水溶液中で発光性である。本アッセイの定量化のため、次に、抗体結合および 遊離の分析物質複合体を分離することが必要である。

時間分解：ＰｔおよびＹｂポルフィリン試薬はマイクロ秒オーダーの発光時間を 有している。長時間発光はこれらのプローブを時間分解系に対する理想的候補と している。実質的に長い時間これらの試薬を時間をゲートとしく目ｍｅ−ｇａｌ ｅ＋Ｉ）検出することでマトリックスからのバックグラウンド蛍光（ナノ秒の時 間枠で）と励起関連錯乱事象を消滅させる。本質的にバックグラウンドゼロに対 し発光信号を測定することは、アッセイ感度を有意に上昇させる。

実施例８ 単量体メタロシアニン試薬を用いることができる代表的競合イムノアッセイで、 未反応分析物質複合体を示す一定量を含有する検査液を既定量だけサンプリング するのに便利でかつ分析物質複合体濃度検出用に採取した液体部分を付与するた めの補助的ディツプスティックが提供される。このようなアッセイに可溶性単量 体メタロフタロシアニン誘導体含有色素化分析物質複合体を用いることで、採取 した液体部分のマーカー濃度を直接口で読み取るかまたは簡単な機器による読み 取りができ、信号の増幅もなくまたは精巧な電子ハードウェアを頼ることもない 。

第２図について言えば、改変されたディツプスティック１０は競合的イムノアッ セイにおいて使用するために提供されている。下記で詳細に述べるように、ディ ツプスティック１０は遊離分析物質含有検査液の一定量を採取し検出可能な分析 物質複合体の添加と不溶性分析物質特異的結合対との競合反応を行うため、そし て未反応分析物質複合体の存在と濃度を検査・検出するための採取液体部分を提 供するために用いられる。ディツプスティック１０はプラスチックのような不溶 性の非吸収材料１２で出来ており、水溶性検査液を吸収することのできるパッド １４を特徴的に有している。パッド１４に用いるために適切な吸収性すなわち吸 水性の代表的材料として、フィルター紙、ニトロセルロース膜およびシリカゲル が挙げられる。

パッド１４を構成する吸収性材料または材料類は白色でかつ好適には検査液で湿 潤した時透明にならないものとすべきである。パッド１４は、組み込まれている （ｔｎｊｒａｉｎｅｄ）分析物質複合体も含めて検査液試料の測定可能量に対応 する既定量の検査液を吸収するように設計されている。代表的実施例では、ディ ツプスティック１ｏは、例えば不溶性粘着剤で一端近くを固定したＩＣＩＩＸ　 １／２　ＣｌｌＸ２〜４ｍｍ厚フィルター紙パッド１４を有する１０ｃｍｘ　１ ／２ｃｍＸ１ｍｍのポリスチレン台紙１２から成る。ディツプスティック１０の 他端は、操作可能なつまみとして作用する。

支持体１２の色は、反射計または蛍光計によるように機器によってパッド１４を 調べるならばそれほど重要でないが、湿潤パッド１４を肉眼でカラーチャートと 比較するならば白色または別の対照的色彩とするべきである。

使用に際しては、ディツプスティック１０は競合的イムノアッセイに用いられ、 未反応分析物質複合体含有検査液の一部分を採取しかつ分析物質複合体濃度を肉 眼または機器で検出するための採取液体一定量を提供する。例えば、患者血流中 のテオフィリン濃度は以下のようにこの開示にしたがって測定される。まず第一 に、５ｏがら５゜（ｌｎｆのオーダーの患者血液測定量を採取する。この液体試 料に対し、開示された単量体メタロフタロシアニン類のような着色色素または蛍 光色素に連結されたテオフィリン分子で構成される検出可能な分析物質複合体の 測定量を添加し混合する。一定量の不溶性抗テオフィリン抗体またはＦａｂフラ ッグメントのようなその他のテオフィリン特異的結合対の測定量を保持するビー ズ（直径０．１から５ミクロンのオーダー）の如き不溶性基質または担体にこの 混合溶液を接触させる。このようなビーズは液体試料の底に沈殿するように実質 的に密な物質で構成するのが好適であり、不溶性プラスチック、ガラス、多糖類 またはラテックスで作ることができる。テオフィリン特異的結合対は、公知の共 有結合技術を用いてビーズまたは他の基質に典型的に結合させる。実際には、上 記で示したテオフィリン複合体や不溶性とした結合対の量は、遊離テオフィリン が全く液体試料中に存在しない時には実質的に総ての複合体がこのビーズに結合 し、遊離テオフィリンが存在する時には試料中の遊離テオフィリン濃度に比例し いくらかの複合体が未結合で残るように経験的に選択する。

このビーズをインキュベート後典型的には液体試料中に混合し、テオフィリン複 合体と総ての遊離テオフィリン間でビーズ上の特異的結合対に対する競合的結合 反応を起こさせる。その後このビーズを液体試料の底に沈殿させる。次に、ディ ツプスティック１ｏを操作して、六ツド１４が総ての未反応テオフィリン複合体 を示す部分を含有する液体試料の予め定められた一定量を吸収するために充分な 秒のオーダーの時間、パッド１４をビーズ上清に接触させる。ディツプスティッ ク１０は液体試料から取り出しく試料は後にビーズとともに捨てる）、パラ下１ ４上のマーカー活性を検出し定量化するための反射計・または蛍光計同様の機器 へ挿入できる。

第３図に関して言えば、別の実施例のディツプスティック１０′上のパッド１４ ′　は、非特異的または特異的分析物質複合体結合部位を提供する多孔性外膜１ ６および吸水性材料の内芯１８から成るラミネートで、多孔性膜１６が吸水性芯 １８を被覆しており、その結果、芯１８と液体の接触が膜１６を介して確立され ねばならない。例えば、膜１６は、一般にほとんどのタンパクに見られる官能基 を吸着できるニトロセルロースのような材料から作ることができる。

したがって、組み込まれた分析物質複合体のいずれも（液体試料中の他のタンパ ク質性物質とともに）、芯１８が既定量の検査液をパッド１４中に抜き取るに伴 いニトロセルロース外包Ｉ５に結合し外包１５上で濃縮される。

好適な実施例では、第３図に示した外膜１６は検査液体の分析物質複合体成分を 特異的に結合することができる。

例えば、外膜１６をアビジン化することができ、その場合、ビオチン化分析物質 複合体は、芯１８が予め定められた量の検査液体をパッド１４′中に抜き取るに 伴い外膜１６に特異的に結合し外膜１６上で濃縮される。このような膜１６の適 切な材料として、紙、ニトロセルロース、ナイロン。

フッ化ポリビニリデンおよび同様の材料が挙げられるが、これらは分析物質複合 体特異的結合対に共有結合できるように誘導体化されているかまたは誘導体化す ることができ、その後この膜１６は溶液中タンパクに対し低い非特異的結合を示 さねばならない。膜１６上の特異的結合部位によって、パッド１４′の外表面上 における組み込まれた分析物質複合体の結果としての濃度は、肉眼または機器に よる検出を迅速化しかつ開示されたアッセイの感度を上昇させる。

関連実施例では、ディツプスティック１０上のパッド１４に分析物質複合体特異 的結合対を付けることができる。

上記に述べたように、分析物質複合体は、検出マーカー成分に結合するかそうで ない場合にはこのマーカー成分と複合体とした分析物質成分を有する複合分子で ある。

この分析物質成分は、遊離分析物質の誘導体かまたはアナログとすることができ る。この分析物質複合体はその分析物質成分によって、ビーズ上の不溶性とした 抗分析物質結合対に対する遊離分析物質と実質的に同じ結合活性を有するべきで ある。ディツプスティック１０′の代表的実施例では、競合的結合反応が起こる ビーズまたはその他の不溶性基質と同じ分析物質に特異的な結合対が、パッド１ ４′上の膜１６に着いている。しかし、結合対濃度を慎重に調節したビーズと異 なり、この膜１６は、予備的インキュベーション処理後に予測された遊離分析物 質および未反応分析物質複合体の濃度に比し、１〜数ｌｏｇオーダーの過剰分析 物質特異的結合対を有するべきである。

これとは別に、膜１６またはパッド１４に分析物質複合体を特異的に結合し遊離 分析物質を結合できない結合対を付けることができる。このような目的のため、 この分析物質複合体は、リガンド／マーカーに結合するかまたはそうでない場合 には錯体とした分析物質成分であり、膜１６またはパッド１４はこの分析物質と 交差反応しないリガンド／マーカー結合対を有する。ここで用いるように“リガ ンド／マーカー”という用語は、分析物質部位が複合する時少なくとも二つの機 能を果たす分子または分子類または複合分子を意味する。つまり、リガンド／マ ーカーはリガンドとして作用し、組み込まれた分析物質複合体を膜１６またはパ ッド１４上のリガンド／マーカー結合対に特異的に結合する。また、リガンド／ マーカーは、リガンド／マーカーまたはリガンド／マーカー１こ酵素が含まれる 場合にはこのリガンド／マーカーの反応生成物のいずれかによる吸収・反射また は放出光の測定のような従来技術で検出できるマーカーとして作用する。ある実 施例では、このリガンド／マーカーはまた、酸素または振動による不活化から消 光可能な発光マーカー成分を保護するリガンドまたは担体成分を取り込むことに よって、もう一つの三個目の機能を果たすことができる。

上述の機能は、単一分子・マーカー成分に結合したリガンド成分複合体またはリ ガンド成分に結合した担体成分とマーカー成分の複合体のいずれかから成るリガ ンド／マーカー類を適切に選択することによって果たすことができる。もう一つ の別法として、リガンド成分とマーカー成分を一つの分析物質成分の離れた部位 に複合させ、分析物質複合体を作ることができる。例として、蛍光フィコビリプ ロティン分子は、１個の分子中で上述のリガンドとマーカー機能を有効に結合し た便利なリガンド／マーカーとして作用することができる。別の例として、リガ ンド／マーカーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰ　Ｏ）マーカー成分をビ オチンのようなリガンド成分に複合することによって作ることができる。

このマーカー成分は、その存在がパッド１４または膜１６上で特異的に検出でき る分子であればどれでもよく、それによってパッド１４または１４′　によって 吸収された液体中分析物質複合体の存在および好適には濃度も示される。

適切なマーカー成分として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー ゼ、グルコースオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素；発色 団または有機色素、特にここに開示した単量体フタロシアニン類；単量体アルミ ニウムフタロシアニン、フルオレセイン、フィコビリプロティンおよびローダミ ンのような蛍光物質；プラチナおよびイッテルビウムポルフィリン誘導体のよう な発光性メタロポルフィリン類、特にテトラフェニルポルフィリン類およびテト ラカルボキシテトラフェニルポルフィリン類、ＦＡＤのような補酵素；ルシフェ リンのような化学発光性物質：ホスホン酸類のような酵素阻害剤；および放射性 核種が挙げられる。もしこのマーカー成分が比色アッセイで有用な酵素であるな らば、マーカー活性がパッド１４または膜１６上で隔離−されるように反応生成 物を不溶性とするべきである。ペルオキシダーゼ基質はこの要件を満足する。こ のような酵素基質および補因子はパッド１４または膜１６上に不溶化するのが好 適である。これとは別に、酵素連結分析物質複合体含有検査液採取後にパッド１ ４′をこのように着色展開剤を含有する別の溶液に浸すことができる。

適切なリガンド成分として、ビオチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、合成ペ プチド類、フィコビリプロティン類およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられ、° これらのいずれも容易に利用可能なリガンド／マーカー結合対を有している。

適切な巨大分子担体成分として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および、例えば 分子量１万を超える他のタンパク類が挙げられる。公知のへテロ−およびホモ２ 官能基結合化合物を含めてより小さい合成ペプチドおよび他のスペーサ一群は、 また、分析物質複合体上で分析物質成分とリガンド／マーカー成分（類）を特定 の方向に集めるための担体成分として用いることができる。

遊離分析物質が免疫原性分子である実施例では、分析物質複合体の分析物質成分 はアッセイするこの分析物質と同じ分子構造を有することができるし、または、 その代謝による誘導体または合成または生成したアナログであってもよい。例え ば、分析物質と分析物質複合体がこれらの結合部位に対し同様の結合活性を有し ているならば、この分析物質成分はビーズまたは他の基質上の分析物質特異的結 合部位に対する抗イデイオタイプ抗体であることもできる。遊離分析物質が抗体 である実施例においては、この分析物質成分は、分析物質および分析物質複合体 の双方によって競合的に結合されるエピトープを有しビーズ上に結合部位をもつ 同一または異なる抗体であることができる。

最適立体化学のためには、分析物質および総ての明らかなマーカー成分のそれぞ れの活性を維持しつつ可能な限り多くのリガンド成分をこの分析物質複合体上で 置換させるべきである。さらに、分析物質複合体は、実質的に均等な数のマーカ ー成分を保持するようにするべきである。分析物質複合体を作るために、リガン ド／マーカって、利用可能なカルボキシル基およびアミノ基を利用することによ って、および２官能性化合物と当技術で公知のその他の化学結合を介して、強イ オン結合または共有結合で分析物質成分に複合できる。

膜１６またはパッド１４に不可逆的に固定化されたリガンド／マーカー結合対は 、典型的にモノクローナルまたはポリクロナール抗体であるかまたは分析物質複 合体のリガンド／マーカー成分（しかし分析物質成分ではない）に特異的親和性 を有する抗体フラグメントである。例えば、もしＢＳＡがリガンド／マーカーの リガンド成分として作用するならば、抗ＢＳＡはリガンド／マーカー結合対とし て作用できる。好適実施例では、ビオチンがリガンド／マーカー中のリガンド成 分として作用し、不溶化アビジンがリガンド／マーカー結合対として作用する。

本発明実施用検査キットには、前述のディツプスティック１０または１０′が前 述の分析物質複合体試薬の測定量および関連する量の不溶化分析物質特異的結合 対を有するビーズまたは不溶性基質と組み合わせて入れられている。分析物質複 合体試薬と分析物質特異的不溶性担体による液中接触において、測定量の検査液 体を受は入れ含有することのできる反応容器も同様に典型的に提供されており、 ここに開示した競合的イムノアッセイ改良法において上述の成分を用いるための 手引き文書も添えられている。開示された単量体フタロシアニン類のような着色 マーカー成分がキット添付の分析物質複合体の一部である場合において、パッド １４または１４′の色彩度をマーカー濃度に関連させたチャートもまた提供され る。ディツプスティックのパッド１４または１４′上におけるマーカー成分の反 射率、吸光度またはルミネサンスを読み取る装置も同様に含めることができる。

ディツプスティック１０または１０’　は、吸収性パッド１４または１４′が検 査液を通り道の双方に挿入できるよう設計される。ビーズの代用で分析物質特異 的結合部位を有する不溶性基質は、例えばスクリーンまたはメツシュの形状を取 ることができ、および／または、例えば反応容器の底面および／または側壁に一 体化することができる。

好適な実施例では、単量体メタロシアニン誘導体類、好適には可溶性銅、シリコ ン、およびアルミニウム誘導体類は、非常に希釈された分析物質複合体濃度をさ らに信号増幅を行うことなく意義深い直接測定を行うに充分な吸光係数を有する 色素化（および、アルミニウムまたはシリコンフタロシアニンの場合には発光性 ）分析物質複合体を提供するために、化学的に分析物質成分に結合される。さら に、この単量体銅フタロシアニン誘導体類は、グルコスキャン（ＧＬＵＣＯ３Ｃ ＡＮ　）という商標の下にライフスキャン社（Ｌｉ！ｅｓｃａｎ、　Ｉｎｃ、、 　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ　、　ＣＡ９４０３２、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、　）よ って販売されているような入手可能なハンド型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ　）レフレ フトメーターで直接読み取り可能な波長で吸収する。

実施例９ ここで第４図から第８図について述べると、開示された単量体メタロフタロシア ニン類で使用するために適切な競合結合用ディツプスティック４４′　に１個以 上の反応チャンバー２０′が付いている。下記で述べるように、反応チャンバー ２０′　は、目標分析物質（例、薬物代謝物またはアレルゲン）の含有検査液（ 例、尿または血漿）を予め定められた量（例、１０から］０ｈＱ）受は入れ、第 １反応表面２２および第２反応表面２４を順次通り好適には通過させるよう設計 されている。

第５図から第７図に示した代表的実施例では、複数の第２反応表面２４が不溶性 支持体４８の検査表面４６に沿い間隔をおいて配置されている。ここで、各第２ 反応表面２４は好適には多孔性結合基質より成り、実質的に第２反応表面２４と 同じ大きさの親水性膜７０が好ましくは多孔性反応表面２４と検査表面４６０間 に挟まれている。各第２反応表面２４とその下にある膜７０が、不溶性で非透過 性の反応チャンバーハウジング７２によって覆われている。ハウジング７２は、 検査表面４６上に位置し検査表面４６上で取り外し可能なように据え付けた側壁 ７４を有する。この側壁７４はまた、少なくとも第２反応表面２４の側面部７６ に境を接しそれによって基底膜７０を独立した区画に入れる。その結果、膜７０ による液体接触が多孔性第２反応表面２４を介して確立されるだけとなる。

第１反応表面２２はハウジング７２の末端（検査表面４６から離れていることを 意味する）に配置し、予め設定された容積の空洞７８によって第２反応表面２４ から分離される。

試薬膜８０を第１反応表面２２の外側のハウジング７２内に置く。膜８０の端面 にハウジング７２は環境に開放する開口部８２を有する。第１反応表面２２と試 薬膜８０は第２反応表面２４のように、溶解または組み込まれた分析物質を含め て検査液の通過に対し透過性である。側壁７４は同様に第１反応表面２２と試薬 膜８０の側面の縁部７６を覆っている。したがってハウジング７２の末端は、空 洞７８による液体接触が開口部８２を介し次に順次試薬膜８０および第１反応表 面２２を介する検査液の通過でのみ行われるように設計されている。

この検討の目的のためでは、分析物質はもしも他に述べられていないならば、抗 原またはハプテンのような免疫原性分子と考えられており、分析物質結合対は分 析物質に特異的な結合部位を有する抗体であると考えられている。しかし、分析 物質は、分析物質結合対が存在するかまたは生成させることができるかまたは合 成できるいずれの分子でもよい。したがって、分析物質は抗体であることもでき そして分析物質結合対は抗原またはハプテンであることもでき、この場合、分析 物質および分析物質複合体の分析物質成分は双方ともに、第１反応表面２２に固 定化された免疫原性分析物質結合対に特に反応性である結合部位を有する。

検査液試料はいずれの分析物質の水溶性試料でもよい。

例えば、抗凝固血液、血漿、尿７組織抽出物または唾液のような生理液体であり 、この場合、分析物質は、ホルモンまたは治療用または乱用薬物およびそれらの 代謝物のようないずれの内因性または外因性分子であることができる。検査液は 水性または大部分水性でなければならず、分析物質結合対および分析物質複合体 が検査液試料中で突然解離しないよう少量のみの有機溶媒を含有する。

この点に関し、分析物質はまた、分析物質結合対に結合するために水性溶液で入 手できなければならない。したがって、コルチゾールのような血清タンパク結合 ホルモン類を検出するために、界面活性剤を検査液試料に添加することができ、 プロティン担体からホルモン分析物質を放出させそれによってフルチゾール特異 的結合部位を有する分析物質結合対に対しそれを充分利用可能にする。

適用される場合にこうした界面活性剤およびその他の薬剤は、開示されたアッセ イプロトコールの簡便性を維持するため、反応チャンバー２０′　に詰める前に 例えば蒸発または含浸によって内側壁７４上に置くことができる。

反応チャンバー２０′　は検査液試料を受は入れインキュベーション期間中同試 料（総ての置換された分析物質複合体を含める）を保持するよう設計されている 。化学量論的分析物質濃度測定のため、均一容量の反応チャンバーを提供するべ きである。反応チャンバー２０’　内部に検査液試料を含有するハウジング７２ は、例えばプラスチッり、ナイロン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルまたはポ リビニルカーボネートのような分析物質または置換された分析物質複合体のいず れとも反応しないいずれの不溶性物質でも作ることができる。この反応チャンバ ー２０′　は、下記に述べるように、検査チューブまたはマイクロタイターウェ ルの形態をとることもできる。

第１反応表面２２と第２反応表面２４は、分析物質結合対およびリガンド／マー カー結合対がそれぞれ第１反応表面２２および第２反応表面２４にそれぞれ非可 逆的に固定化されるような共有結合または強イオン結合を介して反応物を結合す る能力を有する結合基質からそれぞれ構成される。この目的のために適当な結合 基質として、ニトロセルロース、ブロムアセチルセルロース、臭化シアン活性化 セルロースのようなセルロース誘導体およびナイロン誘導体、プラスチック誘導 体およびその他の活性化ポリマー類が挙げられる。

分析物質結合対は、分析物質に対しおよび分析物質成分に対し特異的に反応性で ある結合部位を少なくとも１個有するモノクローナル抗体であるのが好適である 。分析物質結合部位は、複数の分析物質特異的結合部位を有する二価の抗体また は抗体ポリマー（高分子化Ｆａｂフラグメント）であることができる。しかし、 有効分析物質特異的結合部位間の立体障害は化学量論的定量目的のため最小とす べきであり、この場合、−価抗体またはＦｘｂフラグメントが好適な分析物質結 合対である。分析物質結合対は従来技術で第１反応表面２２に共有結合によって 結合できる。例えば、カルボニル基、カルボキシル基。

リシンのと一アミノ酸グループ、システィンのＳ−Ｈに関係する従来の反応９強 イオン性相互作用およびプロティンＡの特異的相互作用による。複数の分析物質 結合対が第１反応表面に結合され、その結果、分析物質特異的結合部位がその後 、検査液試料中の分析物質予測濃度に対しｌｏｇ過剰に分析物質または分析物質 成分に結合するように利用できるようになる。この目的のため、不均一２官能性 化学物質を介しさらに当技術で公知のその他の化学反応を介し、分析物質特異的 結合部位を分析物質複合体の分析物質成分および検査液試料中の分析物質１こ対 し利用可能とするために、分析物質結合対を特定の方向に第１反応表面２２上に 固定化することができる。さらに、利用可能な分析物質特異的結合部位の立体障 害から見た接近可能性は、第１反応表面２２上に分析物質結合対を選択的に分散 させることによって高めることができる。特定の分析物質結合対の至適密度は、 第１反応表面２２の選択的な化学的活性化によって、または、例えば、バイオダ イン（ＢＩＯＤＹＮＥ　）免疫親和性膜（ＰＡＬＬ、　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｄｉｖ ｉｓｉｏｎ、　Ｇｌｅｎ　Ｃａｖｅ　、　ＮＹ、Ｉｌ、Ｓ、Ａ、　）のような商 業的に入手可能な免疫親和性膜２２を用いることによって達成することができる 。

分析物質複合体は複合分子である。分析物質成分はリガンド／マーカーに結合し ている。リガンド／マーカーは、２つの機能を行う分子または分子類または複合 分子である。リガンド／マーカーはリガンドとして作用し、第２反応表面２４で リガンド／マーカー結合対に対し排除された分析物質複合体を特異的に結合する 。リガンド／マーカーは、酵素的発色のような従来技術で検出できるマーカーと しても作用する。ある応用では、排除された分析物質複合体の反応チャンバー２ ０′内における保持を確実とするために巨大分子担体として作用することによっ て、リガンド／マーカーはまた３個目の機能を行うことができる。

上述の機能は、単一分子、マーカー成分結合リガンド成分複合体、リガンド成分 およびマーカー成分の双方に結合した担体成分複合体またはリガンド成分のいず れかから成るリガンド／マーカーによって行われ、マーカー成分はそれぞれ、分 析物質成分に対し離れた位置で複合できる。総ては実施例８に述べた通りである 。

リガンド／マーカー結合対は、分析物質複合体のリガンド／マーカー成分（しか し、分析物質成分に対してではない）に対して特定の親和性を有するモノクロー ナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ＢＳＡがリガンド／マ ーカーにおけるリガンド成分として作用するならば、抗ＢＳＡはリガンド／マー カー結合対として作用することができる。もう一つの例として、ビオチンがリガ ンド／マーカーにおけるリガンド成分として作用するならば、リガンド／マーカ ー結合対は不溶化アビジンであることができる。他の代表的ではあるが非限定的 なリガンド／マーカー結合対の実施例として、活性化不均一２官能基置換リガン ド／マーカー類の２個目の結合対が挙げられる。リガンド／マーカー結合対は第 ２反応表面２４に不可逆的に固定化され、その結果、検査液試料中における分析 物質の予測濃度にｌｏｇ過剰に（および排除された分析物質複合体の予測濃度に 比例して）リガンド／マーカーに特異的な結合部位がリガンド／マーカー結合に 有効となる。

分析物質結合対とリガンド／マーカー結合対がそれぞれ第１反応表面２２および 第２反応表面２４に結合される。

競合的結合反応チャンバー２０′で使用するため、遊離分析物質および分析物質 複合体の分析物質成分に関する結合対の会合定数は全く同じであり得る。反応表 面２２．２４は適当な多孔性結合基質として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏ＋ｐｏ ｒａｌｉ。

ｎにより商標ＩＭＭＯＢＩＬＯＮの名で販売されている活性微小孔膜類が挙げら れる。

試料膜８０は可溶化できる分析物質複合体を含有する。

上記で述べたように、この分析物質複合体は、例えばマーカー（例、着色色素） およびリガンド（例、ビオチン）で構成されるリガンド／マーカーと分析物質の 複合体であるのが好適である。

使用に際しては少なくとも一つの反応チャンバー２０′を含むディツプスティッ ク４４′を未知の分析物質を含有する検査液中に浸漬する。チャンバー２０′　 は、検査液が薄膜８０．２２および２４に接触しかつ順次通過するだけに充分な 分未満のオーダーの短時間、インキュベートされる。

吸水性膜８０は、この一方向への流れをすすめる芯として作用する。トラップさ れた気体を放出するために、側壁７４には１個以上の補助開口部８４を付けるこ とができ、それぞれは疎水性ではあるが気体透過性のメツシュで仕切られている 。分析物質複合体は、検査液が薄膜８０を通過すると可溶化される。第１反応表 面２２で分析物質と分析物質複合体間の分析物質特異的結合部位に対する競合が 、検査液中の分析物質濃度に比例して分析物質アナログを通過させ第２反応表面 ２４と接触させる。分析物質複合体のリガンド／マーカー成分は第２反応表面２ ４上のリガンド／マーカー特異的結合部位に結合され、検査液中の分析物質存在 を示唆する検出可能な特徴を持つ表面を作る。

読み取りは、例えばタブ８６を引き、ハウジング７２を壊し、第２反応表面２４ を肉眼または機器で検査することによって迅速に行うことができる。

別法として第８図に示したように、吸収、反射または放出光により隔離されたマ ーカーを調べ検出するため、開口部または透明な窓８８をディツプスティック４ ４′　の第２反応表面２４の中心部に設けることができる。このような実施例で は、第２反応表面２４は末端表面をアビジン化し半透明および好適には透明のニ トロセルロースまたはフィルター紙のシートの形態を取ることができる。第１表 面２２に結合した総てのマーカーを窓８８による視界から遮るために、二つの反 応表面２２．２４の間に不透明、および好適には白色またはそうでない場合には 反射性の多孔性膜９０を配置することができる。

予め測定した量の分析物質複合体と分析物質結合部位を多孔性薄膜８０と２２に それぞれ付与することによって、および均一の液体容量の複数のチャンバー２０ ’を付与することによって、第２反応表面２４に結合する分析物質複合体の濃度 を検査液体中の分析物質濃度定量に用いることができる。

このディツプスティック４４′　には、同一の第２反応表面２４を持ちながら異 なる分析物質結合部位と分析物質複合体を有する複数のチャンバー２０′を有効 に付けることもできる。ディツプスティック４４′　はこのように、好適な陽性 および陰性対照を含めて迅速、ワンステップ、複数分析物質読み取り器となるこ とができる。

ここで第９図と第１０図に関して言えば、１００から２００μｅの検査液容量を 有する改変マイクロタイターウェル９２は、また、反応チャンバー２０′　とし て作用することができる。第１反応表面２２はウェル９２の側壁９４上で同軸方 向に配置することができ、そして平面の第２応表面２４はウェル９２の底９６の 全体または部分を被覆するように配置できる。競合的結合チャンバー２０′内で 分析物質複合体は、反応表面２２．２４から離れてウェルの側壁９４または底９ ６上に溶解された形態で可逆的に隔離される。このような反応チャンバー２０′ 　には、自動ピペットを用いて便利に検査液試料を入れることができる。インキ ュベーション時間後第２反応表面２４上の総てのマーカー活性を、例えばＥＬＩ ＳＡプレートリーダーを用いて便利に読み取ることができる。側壁９４の基部に おいて容器壁２１をリング状とすることができ、第１反応表面２２に接触するこ となく第２反応表面２４を被覆するように基質を添加することができる。この実 施例のチャンバー２０′　は、精巧な機器を用いた技術職員による検査室での反 復検査に特に良く適合している。例えば、プレート９８にはアッセイする各検査 液用に複数の反応チャンバー２０′　を付けることができる。幾つかの反応チャ ンバーには反復して検査液試料を満たすことができ、他の反応チャンバーには、 既知濃度のアッセイする分析物質または分析物質類を含有する対照溶液を満たす ことができる。

第１１図と第１２図に関して言えば、関連実施例の改変検査用試験管１００は、 また、反応チャンバー２０’　として作用することができる。例えば、第１反応 表面２２および第２反応表面２４は検査用試験管１００の内壁１０２上で折り重 ならないような位置に配置することができる。競合的結合チャンバー２０′では 、分析物質複合体はどちらの反応。

表面２２．２４からも離れて内壁１０２上に可逆的に隔離できる。インキュベー ション時間中この検査液試料（図示せず）は、試薬および反応表面２２．２４の 接触を効率化するために定期的に撹拌するかまたは振とうできる。もし第１反応 表面２２および第２反応表面２４が検査用試験管壁１０２上で直径上反対位置に ない場合には、第２反応表面２４上の比色または蛍光マーカー活性は、試験管１ ００を標準的分光光度計または蛍光計に挿入することによって便利に読み取るこ とができる。

本発明の好適実施例を例示し記載してきたが、付属の請求の範囲内でさまざまな 変更をその中で行うことができることを了解すべきである。したがって、本発明 は本文で特に記載した以外の方法で実施することができる。

吸１Ｌ 今一３・ 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原、抗体、またはオリゴヌクレオチドに単量体で複合したフタロシアニン 誘導体から成る試薬組成物。
2. ２．前記フタロシアニン誘導体がアルミニウム，銅，シリコン，リン，ガリウム ，ゲルマニウム，カドミウム，マグネシウム，スズ，または銅で金属化されてい る請求項第１項に記載の試薬組成物。
3. ３．前記フタロシアニン誘導体がスルホン酸，スルホン酸塩，カルボン酸，カル ボン酸塩，リン酸，リン酸塩，ホスホン酸塩，ヒドロキシ，フェノキシ，アミノ ，アンモニウム，およびピリジニウム置換基中から選択された１個以上の置換基 から成る請求項第１項に記載の試薬組成物。
4. ４．前記単量体フタロシアニン誘導体が前記抗原、抗体、またはオリゴヌクレオ チドと酵素的に切断可能な結合を介して複合している請求項第１項に記載の試薬 組成物。
5. ５．前記単量体フタロシアニン誘導体が前記試薬組成物の親水性成分によって実 質的に包まれている請求項第１項に記載の試薬組成物。
6. ６．約８０を超える原子量を有する原子、常磁性原子、または常磁性基から成る 部分の切断可能結合を介して複合している単量体フタロシアニン誘導体から成り 、酵素アッセイで有用な試薬組成物。
7. ７．２個目のフタロシアニンに切断可能な結合を介して複合している１個の単量 体フタロシアニンから成る酵素アッセイで有用な試薬組成物。
8. ８．発光性化合物を実質的に周辺酸素に無反応とするためこの発光化合物を包む 担体分子で複合する酸素消光性発光化合物から成る試薬組成物。
9. ９．周辺小分子と発光性化合物の衝突を実質的に防止するためにこの発光性化合 物を包む担体分子で複合している振動消光性発光化合物から成る試薬組成物。
10. １０．液体試薬中で分析物質の存在を検出するために有用なキットであって、 分析物質成分および検出可能マーカー成分から成る分析物質複合体の測定量、そ の上に固定化された分析物質特異的結合対測定量を有する第１不溶性担体、測定 量の分析物質複合体および第１不溶性担体の液体中接触において分析物質を含有 する疑いのある液体試料の測定量を受け入れておくことのできる反応容器、およ び操作可能な第１端と既定容量の前記液体試料を吸収することができる吸水性材 料のパッドを有する第２端を有し、この第２端が前記パッドを前記液体試料と接 触させるために前記の反応容器に受け入れられるように形成されている第２不溶 性担体から成るキット。
11. １１．吸水性材料の前記パッドが前記分析物質複合体を結合することのできる請 求項第１０項に記載のキット。
12. １２．吸水性材料の前記パッドが前記分析物質複合体を結合することのできる多 孔性膜によって包まれる請求項第１０項に記載のキット。
13. １３．前記分析物質複合体が単量体フタロシアニン誘導体から成る請求項第１０ 項に記載のキット。
14. １４．折り重ならない第１、第２および第３試薬表面を有する反応チャンバーか ら成る検査液中分析物質を検出する装置で、前記反応チャンバーが前記試薬表面 の液体中接触においてある容量の前記検査液を受け入れ保持するのに適合してお り、この第１試薬表面が可逆的に結合された分析物質複合体を有しており、この 分析物質複合体が一つの分析物質成分に複合したリガンド／マーカーから成り、 この第２試薬表面が固定化された分析物質結合対を有しており、およびこの第３ 試薬表面が固定化されたリガンド／マーカー結合対を有する装置。
15. １５．前記反応チャンバーが前記検査液体を受け入れ、順次第１、第２および第 ３試薬表面を通過させるように適合させた請求項第１４項に記載の装置。
16. １６．前記分析物質複合体が単量体フタロシアニン誘導体から成る請求項第１４ 項に記載の装置。