JPS58500084A - 免疫化学のための化学ルミネセンス増巾基質システム - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫化学のための化学ルミネセンス 増巾基質システム 本発明は対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたミクロカプセル 封入フルオレサーと、フルオレサーを放出するべくそのミクロカプセルを破壊す る手段と、フルオレサーを活性化しうる電磁放射以外のエネルギーラ原とを含有 する。、対象とする生物的分析物を検出するためのシステムに関する。

発　明　の　背　景 臨床家は、多様の分析技術を用いて、種々の基質の存在を検出し定量している。

もつとも一般的に用いられる技術は、可視部および紫外部波長の吸光法である。

しかし、紫外部波長、光放出、明光吸光法および放射活性もふつうに用いられる 。化学の分野ではこれまで比較的に未開拓であるが、ひとつの新しい技術として 、ルミネセンスの現象がある。

放出される光の測定を基礎とする分析は、従来の方法に比していくつかの著しい 利点を有する。つまり、高感度、広い直線関係の範囲、試験当りのコストが低い 、そして比較的に簡単で、安価な装置ですむ。

ルミネセンス、そして特に化学ルミネセンスは、臨床分析の２つの主要な分野に 大きな影響を有する。第１に、オキシダーゼおよびデヒドｏｒナーゼの基質の分 析において従来の比色法または吸光法のインディケータ−反応に代わる重要な役 割を有する。この型の分析で、ルミネセンスインディケータ−反応の感度を、従 来の技術で測定困難の基質の定量化に用いうる。たとえば、プロスタグランジン およびビタミンがある。

ルミネセンスの第２の主な臨床的応用例は、イムノアッセイにおける放射活性ま たは酵素ラベルに代わるルミネセント分子の利用にあるにちがいない。

これらの主な臨床的応用のそれぞれにおいて、化学ルミネセント反応は、高レベ ルの分析感度を達成する手段を提供する。

化学ルミネセンスは、簡単には、光の化学的生成と定義される。文献では、しば しば螢光と混同されている。これら２つの現象のあいだの差は、分子を励起状態 に高めるエネルギー源に存する。化学ルミネセンスでは、このエネルギー源は化 学反応の結果で生ずる非放射性エネルギーである。励起状態から基底状態への分 子のひきつづく低下に伴なって光が放出されこれがルミネセンスである。これと 対照的に、螢光は、入射する放射が、分子を励起状態に励起するエネルギー源で ある。

分析的立場から、もつとも興味を持たせるルミネセンスの型は、化学ルミネセン スおよび生物ルミネセンスである。後者は、触媒作用のある蛋白質がルミネセン ス反応の効率を高める、生物系に見出だされる、化学ルミネセンスの特別の型に 与えられた名称である。

酵素的はたるの発光プロセスのような生物ルミネセンス反応は、分析的に非常圧 有用で、８８憾の量子効率で化学エネルギーを光エネルギーに変える。

はたるの発光の持続性および効率とは対照的忙、化学ルミネセンス（以降ＯＬと 称する）、特に非水系におこるそれの歴史は非常に短かい。重要な水性ＯＬ物質 ルミノールおよびルンｒニンは、それぞれ、１９２８年および１９３５年に見出 だされた。いくつかオギデレート化合物のルミネセンス反応の研究を基礎として １９６０年代の初めに、１連の有機可溶性ＣＬ材料が開発された。ＣＬＫ有用な 代表的有機システムは、Ｂｏｌｌｙｒｙ等によりｕ、ｓ、特許／１６３，５９７ ，３６２に記載され、もつともよく知られている使用しうる水性系の約３憾に比 して約２３％の量子効率を呈する。

化学ルミネセンスは、臨床実験室での可能性、特にいくつかの数の生物的にずい 伴する物質の分析への使用に関して魅力あるものとなって来ており、それの知ら れている応用については、くわしい総説がある。たとえば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ 等（１９７９）　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　：　工ｔｓ 　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　、２５　、９　１５３１−１５４６；　ＧＯｒ ｕＥｌ等（１９７９）　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　０ｆＢｉｏ　−Ｃｈｅｍｉｌ ｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ　Ｘｎ　Ｔｈｅ　（！’１ｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、＋　２５　＋　４　５１２−５１９　；　 ｌ５ａｃｓｓｏｎ等（１９７４）　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｓ　−臨床分析 的応用は、効率が割いが、しかしよく知られているジアシルヒドラジド、アクリ ジニウム塩、ピロがロールまたはロフィン（１ｏｐｈｉｎｅ　）構造物を用いて いる。過酸化水素またはＨ２Ｏ２発生機の存在での上記化学ルミネセント構造の 化学的分解の性質にもとづき、ジアリールオキずレート構造の酸化反応に比較す ると、後者の方が過酸化水素要求量が前者より大であるが、後者が２０倍を超え る化学ルミネセンス量子収量を有していることを考慮することが重要である。

多くの化学ルミネセンス反応での本質的成分である過酸化水素は、興味ある分析 対象の検出に用いるために選択された種である。たとえば、グルコースの定量に おいて、Ａｕ５ｅ６等（１９７５）は、　Ｏｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ　−ｃｅｎ ｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｆ（１１’　Ｇｌｕｃｏｓｅ　、　Ａｎａｌ ｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

４７、腐２，２４４−２４８で、Ｈ２Ｏ２の由来源としてグルコースオキシダー ゼの存在でのグルコース酸化を行ない、ついでＨ２Ｏ２はルミノールと反応させ て、最初のグルコース濃度に比例した化学ルミネセンスを生じさせている。この システムで、８　Ｘ　１０−９Ｍ　マでのパーオキサイドが検出される。Ｗｉｌ ｌｉａｍｓ　等（１９７（Ｓ）は、Ｋｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｐｅｒｏｘｙ ｏｘａｌａｔｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉ ｎａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ＥｎｚｙｍｅＧｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　、 　Ａｎａｌ、　Ｃｉｈｅｍ、　、４８．７１００３−１００６に記載の類似の反 応で、パーオキシオキスレ。−トシステムの感度の限界は、ルミノールシステム より１けた劣ることを示している。

それで、現在まで、しゆう酸エステル系（オギヂレート／ステム）は、一般的に 、過酸化水素の変換効率が劣るので、分析の目的には役に立たぬと一般的に考え られた。

ひとつの具体例として、本発明では、オイヂレートシステムの化学における大き な化学ルミネセンス保存エネルギーを用いて、Ｈ２Ｏ２依存性の欠点を克服しよ うとする。適当量の過酸化水素およびオキずレートを用いて、フルオレサ−（ｆ ｌｕｏｒｅＥＩＣｅｒ　）　導入に際して化学ルミネセンスとして放出される形 の大量のエネルギーが生成されうる。

それで、充電した化学バッテリーに類似のものとみなしうる様式で働らくオイデ レートは、回路中の電気スイッチでバッテリのエネルギーが放出されランプが点 燈するように、貯蔵エネルギーをフルオレサー複合物に放出する。この゛°スイ ッチ”作用が化学ルミネセンスをひきおこし、そして、対象とする分析物の検出 器にフルオレサーを加えることにより、測定しようとする分析物に定性および定 量的に関連する検出システムを働らかせる反応を用いることができる。

それで、対象とする生物的分析物（ａｎａｌｙｔｅ　）に特異的な免疫種に複合 させたカプセル封入フルオレサー材料と、フルオレサーを含有するカプセルを破 る手段と、フルオレサーを活性化することのできる電磁放射以外エネルギ〜う原 を包含する。対象とする生物的分析物の検出のためのシステムを提供するのが本 発明の目的である。

本発明のさらに別の目的は、対象とする生物的分析物検出のための定性的方法を 提供することで、つぎの段階を包含する。

（ａｌ　対象とする分析物に特異的な免疫学的な種を、そのような種と生物的に 相客れる、カッセルに封入されたフルオレサーでラベルする： （ｂｌ　カッセルに封入されたフルオレサーラベルされた種と対象とする生物材 料とを接触させて、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物とする ：（ｃｌ　フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分ける；（ｄｌ　フルオレ サーラベル含有カッセルを破壊して、ラベルを溶液中に放出させる： （θ）　放出させたフルオレサーとフルオレサーラヘルを活性化しうる電磁放射 以外のエネルギー“原とを接触させる：そして （ｆｌ　活性化されたフルオレサーより放出された化学ルミネセンス光の存在す るかしないかを測定する。

本発明は、また、対象とする生物的分析物の量を測定するための定量的方法を提 供する。つまり、（ａｌ　対象とする分析物に特異的な免疫種を、そのような種 に生物的に相客れるカプセル封入フルオレサー材料でラベルする：。

（ｂｌ　カプセル封入フルオレサーラベル種と対象とする生物的材料とを接触さ せ、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物的材料複合物とし： （ｃｌ　フルオレサーラヘル含有カプセルを破壊して、溶液中にあけ； （ｄｌ　あけたフルオレサーと、フルオレサーラベルを活性化しうる、電磁放射 以外の工不ルギーン原と接触させ： （ｅ）　そして、活性化フルオレサーより放出される化学ルミネセンス光の存在 または非存在をみる。

本発明のさらに別の目的は、対象とする生物的分析物に特異的な免疫的種に結合 させ得、そのような生物的材料の検出のための手段を提供するために、新しい１ 群のミクロカプセル封入フルオレサー材料を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、対象とする種々の生物的分析の検出に有用な、新し い１群の、複合ミクロカプセル封入フルオレサー／生物材料組成物を提供するこ とである。

本発明のさらに別の目的は、本明細書中に記載のミクロカプセル封入フルオレサ ー材料を用いる、対象とする生物的分析物検出のための試験キットを提供する本 発明によると、対象とする生物的分析物に特異的な免疫的種に複合させた、カプ セル封入フルオレサー材料と、該フルオレサーを含有するカプセルを破壊する手 段と、フルオレサーを活性化しうる電磁放射以外のエネルギー５原とを含有する 、対象とする生物的分析物を検出するためのシステムを提供する。

本発明は、対象とする生物的材料を定性的および（または）定量的に検出するた めの方法を提供する。

これは、つぎの段階を包含する。

（ａｌ　対象とする分析物に特異的な免疫種を、その種と生物的に許容されうる カブセル封入フルオレサーでラベルし： （ｂｌ　カプセル封入フルオレサーラベル種と対象とする生物材料とを接触させ て、カプセル封入フルオレサーラベル糧／生物材料複合物とじ； （ｃｌ　カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分け： （ａｔ　フルオレサーラベル含有カプセルを破壊して、それを溶液にあげ； ＋ｅ）　あけたフルオレサーと、フルオレサーラベルを活性化しうる電磁放射以 外のエネルギー５原とを接触させ：そして、 （ｆｌ　放出される化学ルミネセンス光量子の存在を検出しそして（または）測 定する。

さらに、本発明は、対象とする種々の生物的分析物の検出に有用な、新しいミク ロカプセル封入フルオレサーおよび複合ミクロカプセル封入フルオレサー／免疫 種組成物を提供する。

本発明は、さらに、上記のミクロカプセル封入フルオレサー相料を用いる、対象 とする生物的分析物検出のための、新規試験キットを提供する。

チャート■、■および■は、Ｆｔａｕｈｕｔ等（１９６９）、協奏過酸化物分解 反応よりの化学ルミネセンス（ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃθｎｃθＦｒｏｍ　 Ｃｏｎｃθｒｔｅｄ　ＰｅｒｏｘｉｄｅＩ）ｅｃｏｍｐｏθ１ｔｉｏｎ　Ｒｅａ ｃｔｉｏｎｓ　）　−ＡｃｃＯｕｎｔｅ　ｃｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ８ｅａｒ ｃｈ　、　２巻、８０−８７、から引用したもので、１モルのルミノールを１モ ルのエネルギー添加または励起分子とするのに、１モルのＨ２Ｏ２が必要なこと が分る。この励起された分子は、基底状態に戻り、光を放出する。興味あること として、チャートＩ中の化学ルミネセンス化合物、ルミノールまたはその誘導体 は、また、系の化学エネルギーを光に変えることもできる。それで、ルミノール は化学ルミネセンスエネルギー原として作用し、゛そして、エネルギーを吸収し 可視光を発生するためのフルオレサーとしても作用する。それで、フルオレサー 添加で放出される光と、ルミノール自体により生成する光とのあいだの区別がつ かないので、ルミノール系は、本発明の構成において特に有用でない。

チャート■およびチャート■は、オギずレートシステムでは、光を発生する励起 状態を与えろ糧を、過酸化水素が必ずしも生成しないことを説明する。いくらか の過酸化物は、°゛暗″゛である副反応で失なわれうる。

Ｈ２Ｏ２の消費と放出される光の量子とのあいだに化学量論的関係はない。

チャート■ 過硫酸カリウムおよび過酸化水素との 反応における３−アミノファイハリド ラジド化学ルミネセンス（ルミノール）符表昭５８−５０００８４（７） チャート■ オギずリルクロライド化学ル ミネセンスの仮定された機構 ２１（Ｃｌ　＋　Ｃｏ　−１−ｃｏ３ ｆｌｒ’−〉光＋ｆｉｒ ２ シュウ酸エステル化学ルミ ネセンスの仮定された機構 ５ （１ｒ’　ｆ　Ｌ　ｒ　＋４　ＹＪ Ｈ２０２の存在または量を検出するのに用いられたル２ノールシステムとオヤず レートシステムとのあいだの主要な差は、オギデレートが、反応中に生成した化 学エネルギーを受け取りそのエネルギーを可視光に変えるために追加のフルオレ サーを有する必要のなることである。規定されたフルオレサーが存在しないと反 ３で生じたエネルギーが散逸し、有用な信号を放出しよい。オギずレートシステ ムは一般的に有機溶媒中で用いられ、この条件から、水性媒体中に可溶である他 の化学ルミネセンス材料に比して化学分析に用いることを不利にしている。つま り生物学的なアンチ−分析物はそのような有機物に不溶なのである。

本発明は、発生化学ルミネセンスエネルギーを用いも方法において分析の目的に 化学ルミネセンスを用いろ従来法よりも劇的に異なっている。本発明は、別のヒ 合物つまりフルオレサーを添加した時に光を放出する。基質つまり化学エネルギ ーの保存物として化学ルミネセンスシステムを用いる。我々は、このフルオレす 一化合物を対象とするアンチ分析物に複合°さすこと二より、放出される光の量 として分析物の濃度を定量ヒしうろことを見出だした。このように用いた化学ル ミネセンスは、ラジオイムノアッセイ法（Ｒ工Ａ　）に対−１高い感度の代用物 となる。

表Ｉの比較は、化学ルミネセンスを用いる種々の分析システムを示し１種々の反 応の成分を検出に用いうる様式を示している。分析物に対するディテクターを、 つぎのいずれかに組合わすことによる化学ルミネセンスを用いて分析物を測定し うる。

■　グルコースオキシダーゼのようなＨ２Ｏ２化学ルミネセンス反応生成のため の触媒、または■　ルミノールのような、化学ルミネセンスエネルギーを生成し そしてそれ自身光を放出する化学ルミネセンス化合物。または、 ■　ペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ　）　誘導体のような、化学エネルギーを受け 取りそして光を放出するフルオレサそれぞれの場合、比較を簡単にするのに、分 析物は一ヒト血清中にある、）（ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂに対する表層抗原（ＨＢ ｓＡｇ）であるとし、異質性”サンドウィッチ法で測定する。このシステムは、 放射性アイソトープエ１２５をラベルまたはインディケータ−として広く用いら れている。

６ 槻 べ 表■の脚注 １　化学ルミネセンス、酵素増巾および免疫化学を分けることの利点を含んだ固 相システムは、本明細書に記載の文献にはまったく現われていない。

２Ｗｉｌｌｉａｍｅ　等（１９７６）酵素発生過酸化物測定のためのパーオキシ オイずレート、化学ルミネセンスの評価（Ｂｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｑｆｐｅｒｏ ｘｙｏｘａｌａｔｅ　。

Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　 Ｏｆ　ＥｎｚｙｍｅＧｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　）　、　Ａｎａｌ 、　Ｃｈｅｍ、、　４８゜１００３−１００６゜ ３　Ｐｕｇｅｔ等（１９７７）パーオキシダーゼのフエムトダラムレベルの微量 測定のための光放出技術（Ｌｉｇｈｔ　ｇｍｉｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ　Ｆｏｒ　ＴｈｅＭｉｃｒｏｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｆｅｍｔｏｇｒａ ｍ　Ｌｄｖｅｌｓ　Ｏｆツセイ抗原測定のための新方法（Ｃｈθｍｉ　１ｕｍｉ ｎθｓｃｅｎＱｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｆｏｒ 　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ５　ＭｃＣ！ａｐｒａ等（１９７７）化学ルミネ センスを用いる分析方法（Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＵｔｉｌｉｚｉｎｇｃＭ ｍｉｌｕｍｉｎｅ８ｃｅｎｃｅ　）　、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　ＰａｔｅｎｔＡ６１ ，４６１，８７７゜ ６Ｈθｒｓｈ等（１９７９）ヒト免疫グロブリンＧのルミノールを補助とする、 競合結合イムノアッセイ（Ｌｕｍ１ｎｏｌ　−Ａｓ５ｉｓｔｅｄ　、　Ｃｏｍｐ ｅｔｉｔｉｖｅ　−ＢｉｎｄｉｎｇＩｍｍｕｎｏａｅｓａｙ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ 　Ｉｍｍｕｎｏ　−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　）　。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、９３　、２６７−２７１゜７　Ｐｒａｔｔ等 （１９７８）化学ルミネセンスと組合わせたイムノアッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍ ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　−Ｌｉｎｋθｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）　、　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　工ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ１Ｍｅｔｈｏｄｓ　２１　、１７ ９−１８４゜３　Ｓｉｍｐｓｏｎ等（１９７９）免疫分析のための安定な化学ル ミノニルラベル抗体（Ａ　ＳｔａｂｌｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅ８ｃｅｎｔ　Ｌ ａｂｅユａｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＦｏｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ ａｙｓ　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　、　２７９　。

９　５ｃｈｒｏｅａｅｒ等（１９７９）化学ルミネセンスによりモニターした血 清トロキシンのイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａｓｅａｙ　Ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ 　Ｔｈｒｏｘｉｎｅ　Ｍｏｎ１ｔｏｒｅｄ　ＢｙＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ ｎｃｅ　）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ工ｍｍｕｎｏ１０ｇｉｅａＩＭｅｔｈｏａｓ 　、　２５　、２７５−２８２゜１Ｑ　Ｃ＋１ｅＳｏｎ　等（１９７９）ルミネ センスイムノアッセイ（ＬＩＡ）化学ルミネセンスでモニターする固体相イミノ アッセイ（Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＩＡ　）　 Ａ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｏｎ１ｔｏｒｅｄＢ ｙ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　）　、　ｆｆｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩ ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｏｔｈｏａ８．２５　、１２７−１３５゜抗原− 抗体反応検出のために、表■の比較において説明されているすべての場合におけ るインディケータ−は、化学ルミネセンスよりの光の放出と考える。

１サンドイツチパ技術において、つぎの段階をとる。

つまり、抗−ＨＢｓ　（羊）を、錠剤形（固体相）の孔の一定のガラス（ｃｐｏ 　）粒子に被覆する。ＣＰＧ錠剤を含有するチューブに患者の血清を加える。イ ンキュベーション中に錠剤は崩壊する。被検血清中に肝炎８表層抗原が存在すれ ば、それはガラス表面上の抗体と結合する。インキュベーションのあと血清を除 き、ガラス球を洗う。下記に論議するようなラベルをＨＢｓＡｇに特異的な抗体 に結合させたものを、ついで添加する。ラベルされた抗体はガラス粒子上の抗体 に結合した抗原と合体し、サンドインチを形成する。ついでラベルされた抗体は 化学ルミネセンスシステム中で特異的な方式で反応し、抗原の存在を示す光を放 出する。この化学ルミネセンス分析は、血清中の肝炎８表層抗原の存在を示す定 性試験である。しかし、一般的に、試料中のＨＢｅＡｇＯ量が大であればそれだ け、放出される光の強度も犬となる。

表Ｉに説明した方法を実施する反応順序および操作はつぎのようである。

方法１−酵素化学ルミネセンスイムノアッセイラベル：グルコース−オキシダー ゼ（ＧＬＯ）と複合させた。

肝炎８表層抗原に対する抗体 反応　（１）ガラスａｂ、　ａｇ、　＋　ａｂ、　ＧＬＯ＋グ／Ｌ７　コ−ス− ＋２０２ （２）ルミノー／ｌ／　＋　ＮａＯＨ＋Ｈ２Ｏ２（反応１より）→光 一ションして１サンドイツチ”を形成させたあと、複合物を洗い過剰のラベルを 除く。洗った複合物は、標準グルコース溶液と１定時間インキュベートし、グル コース基質にＨ２Ｏ２を形成させる。この量は、サンドインチ中に最初に存在す るＧＬＯに比例する。乞の溶液の１部を標準触媒添加アルカリルミノール溶液に 加える。放出される光は、最初の試料中のＨＢｓＡｇに比例する。

光 操作二上記のように、ルミノニルラベルをインキュベーションしたあと、”サン ドイッチ″を形成させる。

複合物は洗い、過剰のラベルを除く。洗った複合物に、標準過酸化水素アルカリ ヘミン試剤を加える。光の放出は、最初の試料中に存在するＨＢｓＡｇに比例す る。留意すべきこととして、Ｈｅｒｓｈ等（１９７９）ルミノール補助、拮抗結 合イムノアッセイによるヒト免疫グロ１ プリンＧの分析（Ｌｕｍ１ｎｏｌ　−Ａｓ５ｉｓｔｅｄ　、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉ ｕｓ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏ　−Ａｓ５ａｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍ ｍｕｎｏ　−Ｇｌｇｂｕｌｉｎ、　Ｇ、）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９ ろ、２６７−２７１、の終りにつぎのような、ルミノールの似たような使用を記 載する要旨が記載されている。

″１０−９モル／リットルより大きい濃度の血清成分のイムノアッセイにおいて 、放射ラベルに代えて、ルミノール−ベース化学ルミネセンスラベルを用いうる 。

この方法の感度を限定する主要な要因は、ルミノール標識の比較的に低い全体と しての化学ルミネセンス効率（ＣＥ）である。誘導体としてないルミノールのＣ Ｅは１．５憾であると報告されている（５）。我々のルミノール−ＩｇＧラベル は、約０．６係の最終効率を有する。

ルミノールをカップルさせるより効率的手段が見出だされれば、感度は最大６０ ０係まで上昇しよ°う。これまでに報告されたもつとも効率のよい化学ルミネセ ンスシステムは、酵素を含まぬもので、過酸化水素−しゅう酸エステル反応であ る（６）。この反応の全体としての化学ルミネセンス効率は２３壬である。化学 ルミネセンスラベルとしてのしゆう酸エステルの使用は、ルミノールシステムに 比して１５００％の実質的上昇となる。″ つまり、以前の研究者は、化学ルミネセンスに対するしゆう酸システムの量子効 率を認めたけれども、彼等も、他の研究者と同様に、このしゆう酸エステルを。

エネルギー原として用いるもつとも効率的方法が、６スイツチ”を調節すること によってであって、′エネルギー源″として応用するのでないことに気付かなか った。方法６−化学ルミネセンスでラベルされた光増巾系（本発明方法−゛クラ シック″）ラベル、ペリレン誘導体フルオレサーに結合させた。

肝炎３表層抗原に対する抗体。

に０サンＰインチ”としてから、複合物を洗い過剰のラベルを除く。”サンドイ ッチ″はついで６級ブタノールで洗い、過剰の緩衝剤塩を除く。ついで過剰のビ ストリクロルフェニルオギデレートおよび過酸化水素をジメチルフタレートに含 有する混合物を加えてフルオレサー複合物に光を放出させる。光の放出は、もと の試料中のＨＢｓＡｇに比例する。光の強度は、肉眼で定性的にか、フォトダイ オードを用いて定量的に測定しうる。後者の場合、ヨー化ナトリウム結晶の近く にあるフォト増巾器が１１２５　ラベルよりのガンマ−線により放出される光子 に反応するのと同様である。

方法Ｉ、■および■に関する論議 抗体に結合させた酸化剤の使用（方法■）は、実際には、５７ｕａ　社（Ｕ、Ｓ 、特許Ａ３．８１７．８３７　）およびＯｒｇａｎｏｎ社（Ｕ、Ｓ、特許／１６ ３，６５４，０９０　）のよく知られている酵素イムノアッセイの応用である。

しがし、これらの方法では、化学ルミネセンスを、染料の色の変化に代わる光イ ンディケータ−として用いている。我々の知る限りでは、本明細書中に示唆され ている。全固体相の配列を用いた、似たようなシステムを知らない。しかし、こ の方法の感度は、オキシダーゼ酵素複合物が、上記の酵素イムノアッセイにおけ るように、十分のＨ２Ｏ２を遊離する能力により支配される。

検出ラベルのある程度の上昇は、化学ルミネセンスヲ用いることで達成される。

それは、染料の色の変化に対して化学ルミネセンスの感度のよいことによるが、 この感度も、方法■のフルオレサー複合物の検出レベルには及ばない。

方法Ｈにおいて、数人の分析者は１、分析物のディテクターを化学ルミネセンス 化合物または誘導体でラベルすることを示唆した。この方法は、放出される光の 量が、複合された化学ルミネセンス化合物っま・リルミノールまたはオギずレー トの量に含まれる全エネルギー含量より決して多くはなり得ぬ点で方法■または ■に劣っている。化学ルミネセンス化合物を、たとへば抗体にじかにカップリン グさせることのさらに別の欠点は、複合物の化学ルミネセンス能の損失および化 合物が反応で消耗される時の、光の連続する損失である。

最後に、試験の完了前に、消費された化学ルミネセンス化合物全体が損失するの で、分析者は、試料の化学ルミネセンスを反復したり、再チェックしたりできな い。

方法■は、別様には、本発明の”クラシック法と称するが、方法ＩおよびＨに固 有の欠点を克服する。

”クラシック法では、ラベルされるべき生物材料上の有利な付着サイトを注意し て選択できるので、分析物のディテクターの活性および特異性に最高位のレベル を達成させうる。さらに、この付着サイトにおいて、生物材料を損傷しないで、 生物材料への、効果的に効率のよいそして耐久性のあるフルオレサーの連結をデ ずインしうる。工１２５　ラベルに由来する生物材料の特異性および活性の損傷 および複合化による酵素への損傷は、免疫診断試剤の調製においては、よく知ら れそして受け入れられている事実である。構造そのものにより化学ルミネセンス に有利な螢光ラベルはオイずレート反応の酸化的条件に対して安定であらねばな らない。この不活性さは、フルオレッサーを、免疫化学的分析のための特に効率 のよい形のラベルにする際に、目立ってくる。

種々の型の増巾における、感度および変動の様々のラベルは、ａ　Ｗｉｓｄｏｍ の０１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、、　２２　、１２３４−１２５５のＥｎｚｙｍｅｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｋ総説さレテイル。

これらのシステムは酵素ラベルを増巾する。つまり、酵素の触媒としての性質か ら、それらの系は増巾器として作用し、多くの酵素分子は、毎分１０５　個を超 える生成物の形成を触媒しうる。

ラベルとして適当であるためには、酵素は、Ｗｌｇｄｏｍ（１９７６）（上記引 用文献）が提出したつぎの条件を満足させねばならぬ。

（１）高純度で安価に入手しうろこと。

（２）高い特異活性を有すること。

（３）分析および貯蔵条件で安定なこと。

（４）　可溶性であること。

（５）分析法が簡単で、感度良く、迅速で、安価なこと０ （６）生物液体中に存在しないこと。

（７）生物液体中に、基質、阻害物質、および妨害物質が存在しないこと。

（８）適当な連結反応を受けるあいだ活性を保持すること。

（９）抗体が酵素−ハブテン複合体に結合する時に阻害または活性化しうろこと 。

ａＯ）　ハプテン−抗体の結合と相客れる分析条件であること、である。

これらの規定は、オギデレート基質より化学エネルギーを受け入れうる、ラベル として容易に添加しうるフルオレサーにより容易に満足されうる。さらに。

Ｒａｕｈｕｔ　が示したように、ある種の選択したフルオレサー構造は、パーオ キシオギヂレート反応生成物を触媒でき、それで酵素を用いて可能な型の増巾を 提供する。コノ触媒の意味については、５ｃｈｕｓｔｅｒ（１９７９）がＡｃｃ ｔｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、、１２　＋６６６に提出している。

本発明の化学ルミネセンスシステム”クラシック″は、また、低波長の放射エネ ルギーで励起された時に特定の波長の光を放出するという螢光標識の能力を利用 する螢光抗体技術よりすぐれたいくらかの利点を有する。５ｏｉｎｉにより、Ｃ １１ｎ　、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ７　、　２５　＋３５３−３６１に、フルオルイ ムノアッセイ：現状と問題点（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｅｓａｙ　：　Ｐｒ ｅｓｅｎｔ　５ｔａｔｕｅ　ａｎｄＫｅｙ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　）として、螢光 １ゾローブ″または標識を用いる。いくつかの臨床分析が記載されている。

一般的に、フルオルイムノアッセイの検出レベルまたは感度は、酵素イムノアッ セイ技術より大でラジオイムノアッセイシステムの能力に近づく。

放射性アイソトープに代えて螢光プローブを用いることは、螢光を用いて得られ る感度が減少することから妨げられている。これは、試料または血清の自体の螢 光によるところが犬である。このバックグラウンドの強さは、多くの螢光性物質 、たとえば、試料中に存在することがあり、そしてまた、試料によりおこる散乱 を増加さすような蛋白質で影響される。

螢光法は免疫学分野において、種々の型の組織、細胞、細菌、ウィルスその他の 研究に、螢光顕微鏡において用いられている。多くの螢光性物質そしてそれらを 上記の生物材料および７１ゾテンに連結さす操作カー大いに発展している。

本発明の全範囲の利点を生かそうとするなら、特殊の高強度螢光分子が必要であ る。これらは、蛋白質、多糖類およびハシテン物質、特にイムノグロブリンつま りＩｇＧ−そして抗原と生物的にカップリングでき、しかも、これらの生物材料 の特異性または活性を損じてはならない。

フルオレサーは、蛋白質と結合したり複合したりすると、遊離溶液の場合より、 フルオレサーの光放出の効率が低下することが、つぎの文献のそれぞれにより示 されている。Ｂｅ１１１ｎ　（１９６Ｂ　）染料結合の光物理的および光化学的 効果（Ｐｈｏｔｏ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅ ｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｙｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　）、よびｐｏｒｒｏ等（１９６ ろおよび１９６５）生物・染色の螢光および吸収スペクトル（Ｆ’１ｕｏｒｅｅ ｃｅｎｃｅ　ａｎｄび吸収スペクトル（Ｆ’１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　 Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｙｅｓ　 ）　（ＩＩ）。ＳｔａｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、４０　、Ａｉ３．１ ７３−１７５゜我我の研究もまた同様な放出における損失を示した。しかし、オ キカレートシステムのエネルギー効率は、この損失を補なっている。光放出にお けるこの損失は。

複合フルオレサーのすべての他の既知の応用に影響するが、本発明の分析方法は 、分析の、生物的抗体／抗原形成段階においてのみ複合物を必要とする。複合物 溶液の…または他のパラメーターを任意に変えることにより複合物を引きつづい て分離することを可能とする様式でフルオレツサーを製造するための操作がよく 知られている。対照とする分析物の検出にもつとも良い条件で、クラシック方法 ■の免疫化学反応を実施しうろこと虻も留意されたい。分析物をラベルであるフ ルオレッサーが同定されたあとは、ラベルを複合物より分ける。そうすると、フ ルオレツサーは化学ルミネセンスシステムの溶媒中に入り、最高の光効率を与え る。

一般的に、高い量子効率の、螢光を発する芳香族および置換炭化水素、ヘテロ珊 状化合物、染料、および金属キレートの顕微鏡試剤として入手しうる生物材料へ の複合を容易にすること・が望ましい。我々は、上記５ｏｉｎｉ　（１９７９） の文献にあるような螢光複合物に使用することの現在許容されている既知の操作 を用いてフルオレツサーをカップルさすことの出来ることを発見した。

次表２および乙に上記の５ｏｉｎｉ　（１９７９）の文献から引用の種々の螢光 物質を示す。これらのあるものはラベルとして用いて有利である。

個Ｗ 表１および２の略称のりスト：　ＡＮＳ　、　１−アニリノ−８−ナフタレンス ルホン酸；　ＡＮＳＣ、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホニルクロライド； 　ＢＩＰＭ　、Ｎ　−（ｐ二２“へ／スイミダゾリル−フエニル）−マレイミｒ ；ＤＡＣＭ、Ｎ−（７−シメチルアミノー４−メチル−２−オキシ−ろ−クリオ フエル）−マレルジム；　ＤＮＳ−Ｃ１、ダノシルクロライド、ジメチルアミノ ナフタレ／−５−スルホニルクロライド；　ＦＡＭ　、フルオルアンチルマレイ ミドＦＩＴＣ、フルオルセ七ンイソチオシアｔ　−ト；　Ｆｌｕｏｒａｍ　、フ ルオレスアミン、４−フェニルスピロ−（フラン−２（３Ｈ）−１−フタラン） −６゜６−ジオン；ＭＤＰＦ、２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３（２Ｈ） −フラノン；　ＮＢＤ　−Ｃ１、７−クロル−４−二トロベンゾ−２−オキサ− １，６−ジアゾール；　ＮＰＭ　、　Ｎ　−（３−ピレノ）−マレイミド；ＰＢ Ａ。

ぎレンラク酸；　ＲＢＩＴＣ、ログミノ−Ｂ２００−インチオシアナート＋ＲＢ 　２００　ｓＣ，リサミ／−ロダミノ、Ｂ−２００−スルホニルクロライド；Ｔ ＮＳ、トルイジノナフタレンスルホン酸；　ＴＲＩＴＣ、テトラメチルロダミン インチオシアナート。

Ｑ、＝　遊離フルオルクロームの量子収率Ｑｂ＝　蛋白質結合フルオルクローム の量子収率衣６に対する脚註 ａ　牛血清アルブミン、ＩｇＧ、チロキシ／およびジゴキシンの複合物のような いくつかのふつうに用いられるプローブを用いて得られた測定結果。複合物は文 献（４７，３７，４６，４４）に記載のふつうに用いられる製造。測定をもつと もよくしたわけでない。

それには、１０ｎｍ　のバンド巾での放出極大で直接に測定。カット−オフフィ ルターは使用しない。恐らく、スリット値を変え、測定波長を調整し、適当なカ ット−オフフィルターを用いることで、プローブのいくらかは検出限界を著しく 減少させえたであろう。（たとえばフルオルセインの放出はふつうは５４０　ｎ ｍ　で測定する。しかし放出極大は５１５ｎｍである）。種々のプローブ複合物 の螢光および検出眼界は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　分光光度計、Ｍｏｄｅｌ 　ＭＰＦ　−２人で測定した。検…限界は、励起および放出極大の領域において 測定した。値は、同じ波長で、同じ装置感度で、希釈血清のバックグラウンドの 螢光値と比較した。

ｂＩｇＧ、ＳＨ−基に反応はない。

Ｃ血清バックグラウンドは別の蛋白質に結合するのであろう。

ｄ　蛋白質螢光による干渉 ｅ　血清螢光による干渉、それ自身の螢光は弱い。

ＢＳＡ、牛血清アルブミン；　ｈｌｇＧ、ヒト免疫グロブリンＯ 生物材料をカップルさせうる誘導体を提供するフルオレツサーの代表的なものは 、Ｎｅｖｔ　Ｙｏｒｋ　ＮＹ　＋Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ刊、液体および固体のルミネセンスおよびそれの応用（Ｌｕｍｘｎｅｓｃｅ ｎｃｅ　ｏｆＬｉｑｕｉｄｓ　ａｎｄ　５ｏｌｉｄｓ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｐｒａ ｃｔｌｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に、Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ　（１９４ ６’）によシ記載されてりる。

Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ　が記載の有機フルオレツサーに加えて、レーず一螢光分 析システムに、いくつかの有機金属材料が示唆されている。Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ ｏｇｒａｐｈｙ、　１３４　。

ろ４ろ−６５０にＣｕｒｔｘｓ　等（１９７７’）により、化学ルミネセンス； 薄層クロマトグラフィーで分離した螢光化合物検出のための新しい方法（Ｃｈｅ ｍｌｌｕｍｉｒ、（・・Ｃｅｒ、’：：ｅ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ ｒ　Ｄｅｔｅｃｔｘｎｇ　ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｏｍｐｏｕｎｄｓ　５ｅｐ ａｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｔｈ１ｎ　Ｌａｙｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ） に記載されているルテニウム（Ｉ［−）す（ビピリジル）２１−２７のｓｈｅｒ ｍａｎ　（１９７８）、パーオキシオギずレート化学ルミネセンスの分析への応 用（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｒｏｘｙｏｘ ａｌａｔｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　）　、上記の５ｏｉｎｉ　（ １９７９）の文献による金属コンプレックスがあり、それらの免疫螢光への応用 を、Ｗｅｉｄｅｒ　は、Ｕ、Ｓ、特許−４，０５８，７３２に記載している。さ らに、Ｖａｎ１０７．８０３に記載の希土類のルミネセンス放出に影響する因子 （Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ＴｈｅＬｕｍｌｎｅｓｃｅｎｔ　 Ｅｍｌｓｓｉｏｎ　Ｓ＋ｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｒａｒｅ　Ｅａｒｔｈｓ） の文献には、プロモーター、アクチベーターまたはコアクチベーターとして希土 類および（または）遷移金属の少量を無機および有機リンに添加することが記載 されている。それで、痕跡不純物が、他の有機および金属−有機システムにおい て同様に行動しそしてフルオレノサーの量子効率に著しい効果を及ぼすことの予 期されぬわけでない。

バーオキシオギずレート化学ルミネセ／スンステムよりの化学エネルギーにより 活性化されるフルオレサーー生物材料複合物の新規の分析的な使用に、これまで の議論は集中している。有利なパーオキサイドずレルオレサー複合物のない時に バックグラウンドが最小であるというゆえに、化学ルミネセンスに有利である。

このシステムは、Ｂｏｌｌｙｋｙ　（１９７２）が化学ルミネセント添加物（Ｃ ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ａｄｄｌｔｉｖｅｓ　）、Ｕ、Ｓ、特許ｉ３ ，７０４．２３１に記載している０分析目的のためシステムは、高い強度の光を 、短時間、たとへば約３０分以下だけ提供するだけでよい。

”ノイズ不含パまたは非螢光性のパーオキジオギザレートが有利であるが、他の 、適当な波長を有する、自己螢光性オギザレートエステルまたは化学ルミネセン ス化合物も有用である。このようなエステルには、２−ナフトール−３，６，８ １リスルホ／酸、２−カルボキンフェニル、２−カルボキシ−６−ヒドロキシフ ェノール、１．４−ジヒドロキ７−９．１０−ジフェニルアンスラセン、２−ナ フトール＆ラヒニ水性化学ルミネセンス物質たとえば、ルミノール、ロフィン、 ピロガロール、ルシフェリンおよび類似の化合物がある。

これら物質以外の他のシステムが化学ルミネセ／スフルオレサー複合物を活性化 しうる。

それらには、（１）Ｎａｔｕｒｅ、　２１３　、５３　、ロケット飛行のための オゾゾ／デ（○ｚｏｎｅｓｏｎｄｅ　ｆｏｒ　ＰＯｃｋｅｔＦｌｌｇｈｔ　）（ ｃ　Ｒａｎｄｈａｗａ　（１９６７）が記載したような）（ｈｏｄａｍｘｎｅ− Ｂを活性化するオゾシｏ　（２１Ｋｅｓｔｚｔｈｅｌｙｉ２５６、電気的発生化 学ルミネセ／ス：絶対ルミネセンス効率の測定（Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔ ｅｄ　Ｃｈｅａｌｌｕｍｌｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　ＬｕｍｘｎｅｓｃｅｎｃｅＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　）等 に記載の、あるシステムを用いる、９．１０−ジフェニルアンスラセノ、チア／ スレンおよびルブレ／がある。つまりフルオレサー複合物の存在におけるオゾン またけ電気的に生成する化学ルミネセンスハ、本発明の化学ルミネセ／スフルオ レサーシステムのだめの、他の有用なエネルギー；原を提供する。

さらに、遊離基を提供する機械的エネルギーおよび他の類似の７ステムによる、 種々の重合体のひずみも遊離基を生じ本発明の応用に有用である。他の既知のエ ネルギー原も、本発明で有用である。

多くの分析システムの変動も可能であるが、すべてにおいて、分析物に特異的な 、ラベルされた免疫的種を用いることが共通していることを理解すべきである。

できるたけ少量の試料で検出し、そして、できるだけで安価でもつとも信頼でき る操作を選択するのは、分析者の選ぶところである。検出レベルは、分析物中の 抗原、抗体の機能または・・ゾテ／濃度および分析物の臨床的意味で決まって来 る。

たとえばＤｘｇｏｘｘｎの臨床的に意味のある投与量試験のためには、未知試料 とあわせて既知試料を高度にキャリプレートした装置で、注意深く調整して２度 分析して、標準曲線を作製する。免疫グロブリンの予備的試験では、複雑さはず っと少ないが、この分析スペクトルをカバーしうるような、１回だけの分析シス テムが高度に有利である。

複雑な分析上の必要条件は、Ｂｕｒｔｉｓ　等（１９７５）に記載の、遠心高速 分析器を用いる多目的光学システムの開発を用いて満足しうる。このような複雑 化に対する能力または必要性を欠如する第Ｎ次の国かまたは医者のオフィスまた は病院での予備的試験では、装置は不要である。本発明の０クラシツク“システ ムは、臨床家が肉眼により簡単な定性的の測定するだけの十分の強度をラベルさ れた生物材料に付与する。

臨床家はまた、分析を実行する際に用いるラベル種の役割を改変しうる。本発明 の詳細な説明するのに、例として、固体相技術を用いたけれども、均質性または 異質性のアッセイにも”クラシックパシステムを用いて有利である。試験操作に 許容される別様の変法をつぎに示す。

（１）　ラベルされた抗原の競合的結合。

（２）　ラベルされた抗体の競合的結合。

（３）クエ／チ／グ分析。

（４）免疫沈降反応。

（５）　イオン交換法。

（６）　イオノ排斥法。

本発明の有利な、”ライトスイッチパまたは”ライトインディケータ−゛のため 主要な成分は、Ｕ、Ｓ、特許Ｎろ、５９７，３６２に記載と類似である。それら はしユウ酸エステル、ハイドロパーオキサイド、フルオレサー（または螢光性化 合物）および希釈剤を包含する。

さらに、最大強さの光を発生さすために、追加の触媒的促進剤を用いるのが場合 により必要である。適当な触媒的促進剤の選択および濃度は、また、Ｕ、Ｓ、特 許−ろ、７０４，２３１に記載されている。

本発明がＵ、Ｓ、特許Ｍろ、５９７，３６２の記載と異なる点として、本発明で 用いる螢光化合物（またはフルオレサー）は、免疫グロブリン、酵素、蛋白質、 細菌等の生物材料、ハシテンまたは重合体のような有機材料、またはガラス、シ リカ、セラミックまたは類似の無機材料に共有結合させる。適当なフルオレサー を添加しうる有機および無機材料は、粒子、結晶、チューブ、ロッｒ１プレート 、ブロック、および類似の形状であシうるし、または溶液中に存在しうる。上記 の物質に添加しうる螢光化合物またはンルオレサーはまた、反応性材料に代わる ラベルまたは染料の代ゎシのイ／ディケータ−として、種々のよく知られる分析 に用いうる。

本発明に用いる特に適当な螢光化合物またはフルオレサーは、６５０ミリミクロ ンからｉ、　ｏ　ｏ　ｏミリミクロ７までのスペ久トル放出を有するものである 。本発明で使用しうる螢光化合物またはフルオレサーの構造は、それにカップル さすべき材料と反応しうる官能基の１個または１個よシ多くを有すべきである。

有利な官能基の例として、アルキルアミン基、アリールアミノ基、イソシアノ基 、シアノ基、インチオシアノ基、チオンアノ基、カルボキシ基、チオニルハライ ド基、スルホニルハライド基、ニトロベンゾイルハライド基、カルボニルハライ ド基、トリアゾ基、スクシンイミド基、アノハイドライド基、ハロアセテート基 、ヒドラジノ基、ジハロトリジニル基がある。適当なフルオレサー誘導体の代表 的例は、３，４，９．１０ペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ　）　テトラカルボ／酸 ジ無水物、アミノクリセン（ｃｈｒｙｓｅｎｅ　）　、フルオルセインイソチオ シアネート、テトラメチルロダミンインチオシアネート、アミノーパイレン（ｐ ｙｒｅｎｅ　）　、アミノアンスラセンおよび専門家のよく知っておられる類似 の化合物がある。

螢光化合物またはフルオレサーを固体材料に結合すると、結合させたフルオレサ ーの放出波長は、用いるフルオレサーの微環境に応じて、長波長または短波長に 移動する。

我々はまた、フルオレサーとそれに結合させる材料とのあいだの６スペースアー ム”リガンドが結合させ免疫的または酵素的に活性のある、螢光を添加したりか なしで可視的であり、バックグラウンドよシ識別しうる限シ、添力目するフルオ レサー誘導体の正確な濃度は不可欠の条件とならない。

カップルさせたフルオレサーによシ生成する光の強度はフルオレサーの構造、フ ルオレサーと結合材料とのあいだの連結の型式、結合させる物質の利用しうる官 能基で変わる。一般的に、フルオレサーで生ずる光の強度は、カップルさせたあ とでは、浴液中におけるほど大でない。′また、化学ルミネセ／ス反応の存在で 、フルオレサー複合物が安定なことも重要である０１９８０年１２月９日公告の Ｕ、Ｓ、特許＆４，２３８，１９５は、フルオレサーをラベルとして用いる分析 法を記載し、該ラベルを化学的に励起させて光を放出させついで放出される光を 測定することを包含する改良法を特許請求している。この参照文献は、本発明で 用いうるいくつかの分析方法を述べている。

それで、Ｕ、Ｓ、特許１４４，２３８，１９５の内容を本出願の参照文献として 引用する。

本発明は、カプセルに入れた、フルオレサーまたはクエンチャ−（ｑｕｅｎｃｈ ｅｒ　）／ポイズン（ｐＯｌＳＯｎ）ラベルを用いるアッセイを実施するための 改良方法を提供する。ここでカプセルに入れたフルオレサルラベルは、化学的に かまたは他の非放射性のエネルギ一手段を用いて励起せねばならぬ。より高いフ ルオレサーの量子効率および光放出は、フルオレサーをカプセルに入れることで 得られることが分った。このミクロカプセルは、ついでラベルとして生物材料に 複合させる。

フルオレサルラベルを含有するミクロカプセルを水相全通して運搬する生物的分 析の完了後、ミクロカプセルを破壊して、非結合状態のフルオレサーを放出させ る。この改良は、従来法に対してつぎの利点を有する。

（１）複合物の生物活性に影響しないでより多くのフルオレサルラベルを利用し うる。

（２）溶液中のフルオレサーは、結合フルオレサーよシより効率が良い。

（３）　フルオレサー上になんらの反応性基も必要としない。

（４）過剰のフルオレサーは、添カロ後、生物材料よシよシ容易に分けられる。

（５）　親水性または疎水性のフルオレサーを選択しうる。

（６）高エネルギー中間体のための、もつとも効率の良いフルオレサー触媒また はポイズンを選択しうる。

（７）分析の全体としての感度を上昇さすために、他の蛋白質へのフルオレサー ブローブの非選択的吸収を最小におさえうる°。

フルオレサルラベルの使用はすでに記載されており、免疫的分析のプローブとし て用いるために生物的材料に複合させた時に、これらのフルオレサーよりの螢光 シグナルを強めるために励起されたエネルギーまたは非放射エネルギーを用いる ことの利点は認められていたけれども、化学ルミネセノス分析の感度の利点は、 しばしば、非特異的結合反応、および計画した特異的分析に対してもつとも有利 なフルオレサー分子の量を選ぶ際に選択が本来的に限定されるので制限を受けて 来た。

我々は最近開発されたカプセル封入技術を用いて、生物材料にフルオレサルラベ ルをしかＶＣ？Ｊｔ合さすことによる限定を除外しうることを発見した。

カプセル封入とは、フルオレサーまたはクエンチャ−／ホイズンに対する、リボ ゾームまたは重合体のような担体が、対象とする分析物に特異的な生物的種にフ ルオレサーまたはクエンチャ−／ポイズンが付着しそしてのちに溶液中にそれを 放出するように、フルオレサーまたはクエンチャ−／ポイズンを含有することを 意味する。

多くのカプセル封入方法が知られており、それらにより、現在理解されているメ カニズムとして、適当にカプセルに封入されたフルオレサーを調製することがで きる。

効率の良いイムノアッセイに用いるには、カシセル封入システムは、つぎの性質 を有すべきである。

（１１ラベルされた種が自由に懸濁し、それの運動および免疫的結合を阻害しな いのに十分に小型のコロイドサイズとして、均一な大きさは不可欠である。

（２）ミクロカプセルの内部容置はできるだけ大とすべきである。つまシ、ミク ロカプセルは、容器として許されるできるだけ薄い壁とすべきである。別様には フルオレサーをうめこむ時には、できるだけ厚い壁とすべきである。

（３）ミクロカシセルは、それが生物材料と結合することを可能とする、１個ま たは１個よシ多くの反応性基を有すべきである。

（５）ミクロカプセルの膜は、フルオレサーが容易に溶液中に出るが、フルオレ サーにより生成するべき化学ルミネセ／トシグナルを妨害せぬような、容易に破 れる状態とすべきである。

（６）封入されたフルオレサーは、液体または固体として含有され、ミクロカプ セルよりの漏出は、最小におさえるべきである。

（カ　ミクロカプセルは、貯蔵および環境上の要求される条件は最小におさえて 、安定でそして長いシェルフライフを有すべきである。

（８）　ミクロカプセルは、その表面に、陽性、陰性または中性の荷電を有しう る。

（９）ミクロカプセルは、容易にそして経済的に生産さるべきである。

フルオレサー材料を含有するミクロカプセルまたはサックを形成するに用いられ るカプセル封入技術が高濃度のフルオレサーを封入することを可能とし、対象と する分析物に特異的な免疫種への結合を可能とする適当な結合サイトをミクロカ プセルまたはサックの表面に有し、カプセルに用いる材料は容易にこわれて、含 有されるフルオレサーを放出し、ついで励起されて光を放出しうる限シ、本発明 の改良方法は、前記したようなまたは、Ｕ、Ｓ、特許猶４，２３８，１９５に記 載のような方法で、カプセル封入フルオレサーをラベルとして用いることを可能 とする。

２５０Ｘはどに小型のりボゾームは、 ＰａｐａｍａｄＪｏｐｏｕｌｏｓ　（１９７８）＋　Ｋｏｒｎ　（１９７ろ）。

Ｈｕａｎｇ　（１９６９’）およびＢａｎｇｈａｍ　（１９７６）記載の技術で 製造しうる。

紫外線で励起した時の細胞表面の研究のマーカーとしてのフルオレサーの封入は 、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　（１９７７）により示されている。

Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ　（１９７９）およびＨｅａｔｈ　（１９８０）は、リポゾ ーム２重層に、複合しうる結合部位を導入することに成功した。

この仕事によシ、ミクロカプセルまたはサック中に、結合および非結合フルオレ サーブロープをおくことができるようになった。このサックによシ、アッセイゾ ロープに用いるべき生物材料にじかに効果的に複合さ本発明のミクロカプセルま たはサックに添加すべきフルオレサーは、高エネルギー中間体の触媒を最高とし そしてゾローブよシの放出スペクトルを最高にするように選択しうる。その結果 、シグナル／ノイズの比率を少なくとも２５倍に改良でき、そして、フルオレブ ー２ベル分析の実施に用いうる実際上のフルオレサーのカテゴリーを拡大しうる 。

本発明のミクロカプセルに封入すべき有利なフルオレサーには、５．１２−ジヒ ドロキツキず口（２，３゜６）フェナジンマグネシウムおよび亜鉛金属ポリフィ リン、ニュートラルレッド、マグダラレッド、アクリジンレッド、アクリジンオ レンジ、シアニアシルエチニルテトラセンフェナジン、ローダミン、３，４．９ ゜１０ペリレンテト２カルボン酸ジ無水物、および、上記条件をみたすそれらの 誘導体および類似の材料がある。

つぎに、便宜上無機担体を用い、共有結合によりフル穿しサーを他の結合部分に 付着させる種々の方法を示す。これらは、本発明を限定しない。

例１−５ 例１から５のそれぞれにおいて、調整された孔を有するガラス表面に付着さす連 結は、代表的な蛋白質または生物的複合物上の代表的化学的活性サイトに類似す るように合成した。たとえば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基または ヒｒロキシル基は、付着サイトの代表的なものである。

官能基の活性および特異性を容易に調節しうるように、ガラス担体を用いる。そ しｔ１螢光スペクトルを、オヤずレート化学ルミネセ／ス剤よシ別のものとして 容易に認識しうるよう、フルオレサーを遊離または非結合螢光化合物よシ容易に 分けうるように、フルオレサーを固定化した。

螢光ガラスの色および多孔ガラス（５００Ｘ孔の大きさ）に共有結合させた１− アミノパイレ／の色および放射光の強度についての結果は表４に示しである。

それぞれのフルオレチー／ガラス試料製造方法はつぎのようである。

例　１ ５００（ム）（孔の大きさオンゲスローム）の多孔性のガラス１０グラムを、ト ルエフ９ラ５少なくとも１６時間還流させ液を除いた。未結合シランはメタノー ルで十分に洗い、濾過し、風乾した。約２５ミリグラムの１−アミツバイレンを ジオキサン（２０ミリリツトル）に溶解した。この溶液に約１５６ミリグラムの コハク酸無水物を添加した。２時間後、５ｍｍｏｌｅのＮ，Ｎ−ジシクロへキシ ル−カルボジイミドジオキサン溶液の１０ｍ１を添加した。このジオキサン溶液 に、上記に製造したガンマー−アミノポリトリメトキシシラン処理ガラス（以降 アミノゾロピルガラスと称する）を添加した。スラリーはついで１時間かくはん し、室温に１夜放置した。連続かくはんが有利である。過剰のパイレンジオキサ ン溶液なけいしやし、ガラスは、ジオキサン、メタノールおよびアセトン（各１ ５１１／で６回づつ）で十分に洗った。湿ったパイレンのカップルしたガラスを 濾過し放置風乾した。

例　２ 例１のように製造のアミノゾロぎルーガラスの５００〜をクロロホルム中１０チ チオホスデンの２５ｍ１に添加した。このスラリーは４時間還流させた。クロロ ホルムをけいしやし、クロロホルム、メタノールおよびアセトンで洗った（各洗 浄に、２５ゴ宛６回）。スラリーは濾過し、風乾した。３０ミリグラムの１−７ ミノパイレンを１５１１１！のジオキサンに溶解した。この溶液に乾燥イソシア ナートガラスを添加し、１時間かくはんしそして室温に１夜放置した。反応が完 了してから、アミパイレンジオキサン溶液をけいしやし、パイレンのカップリン グしたガラスを例１のように洗った。

例　６ 例１のように製造のアミノプロピル−ガラスの５００■を，５０ＷＩｇのコハク 酸無水物溶解１０ｍのジオキサンに加えた。スラリーは室温でなるべくはかくは んし１夜放置し、反応完了後、カルボキシガラスに変わったアミノゾロピルガラ スは、例１と同様に洗ったら約２５■の１−アミツバイレンを１ゴのジオキサン に溶解した。この溶液に５８■のＮ−アセチルホモシスティンを溶解した。この 溶液は室温に４時間保った。

５０１Ａ９のＮ，Ｎ−ジシクロへキシル−カルボジイミドを加えた。同時に、上 記に製造しそして乾燥したカルボキシ−ガラスを添加しカップリングさせた。反 応のため室温に２４時間放置した。パイレンのカップルしたガラスは、前記のよ うに洗い乾燥した。

例　４ 例１のように製造のアミノゾロビルガラスの４グラムを、１ゴのトリエチルアミ ンを加えた、１　０％ｐ−ニトロベンゾイルクロライド含有５０ゴクロロホルム 溶液に加えた。スラリーは少なくとも８時間かくはん還流させた。生成アシル化 ガラスはクロロホルムで十分に洗い、風乾し声。０．１Ｍナトリウムジチオナイ ト（３０１１りを調製し、アシル化ガラスを加えた。ついで温度は４０°Ｃとし た。反応は１時間で完了した。ガラスは温水で十分に洗った。得られるアリルア ミノ−ガラスは、ジアゾ化に用いうる。６５０ダの亜硝酸および０，’１ｍｌの １Ｎ塩酸を含む２０１１１Ｊの水溶液に１　９−のアリールアミノガラスを加え た。温度は水浴で４℃とした。１時間反応させた。酸性溶液を叶いしゃし、ガラ スを十分に洗い、−を８．０以上にした。ｐ遇したガラスは、２０■のアミノピ レン含有溶液１Ｑｍｌに添加した。゛反応は室温８時間で完了する。パイレンの カップルしたガラスは、例１と同様に洗った。

例　５ ５　０　０　（Ａ）孔の大きさのガラス１グラムをトルエン中１５％ガンマーー グリシドキシゾロぎルトリメトキシシラン１５ゴで処理し、少なくとも１６時間 還流させた。ついでガラスはアセトンで十分に洗い、風乾した。１．５＃／Ｌ／ のｍ−ナトリウムパーヨーデートを含有する５０ｍ１の水溶液に、シラン処理ガ ラス（エポキシガラス）を添加した。２時間反応させた。ガラスは水で十分に洗 った。２５ダの１−アミツバイレンを５Ｑｍｌのジオキサンに溶解した。この溶 液に、Ｆ取した湿ケーキガラスを加えた。スラリーは１時間かきまぜ、室温に１ 夜放置した。ついで例１のように、パイレンをカップルさせたガラスは洗った。

５０ 例　６ フルオレサー結合のための“スペースアーム１を種種の長さにして、生ずる結合 フルオレサーの化学ルミネセンスに対する影響を研究した。

さの１スペースアーム１をつぎのように調製した。例６のように製造したカルざ キシ−ガラスの５００１Ｒｇを、２００ＦＲ９のＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカル ボジイミドを含有する２０ｍ１のジオキサン溶液を加えて活性化した。ガラスは ２４時間かきまぜ、ジオキサンおよびメタノールで洗った。２００■のへキサメ チレンジアミンを含有する溶液２０ｍ１を調製し、冷、却しておいた。

この冷却溶液に活性化カルボキシ−ガラスを加えた。

５時間かきまぜた。４℃に２４時間放置した。ガラスは、水、メタノールそして ジオキサンで十分に洗った。

５０ｒｎ９のコハク酸無水物を含有する２０ｍ１のジオキサンをガラスに加えた 。反応は２４時間で終った。ついでガラスはメタノールで十分に洗った゛。２５ 即の１−７ミノパイレンを３Ｑ＋ｎｌのジオキサンに溶解した。この溶液に５ｍ ｍｏｌｅのＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミドを加えた。そして溶解した 上記のガラスを加えた。スラリーは１時間かきまぜ、室温に１夜放置した。２４ 時間反応させてから、パイレン被覆ガラスは例１と同様に洗った。

イレン被覆ガラスを、例１のように製造しコントロールとした。これら２種のガ ラスを表５に示す。

表５−例６ ガラス表面とフルオレサーとのあいだの１スペースアーム°の長さの化学ルミネ センスの特性に及ぼす効果 （例１）対照１０　（Ａ）　帯青緑色　中程度例６　２０（Ａ）　緑　色　弱− 中程度例７−９ 化学ルミネセンスに対する孔の大きさの効果を示すために異な、る孔の大きさの 多孔性ガラスを１−アミツバイレンで被覆した。１７０（Ａ）（オングストロー ム）５００　ＣＸ）および５０００　（Ａ）の孔の大きさのそれぞれの多孔性の ガラスを例１と同様に被覆した。化学ルミネセンスに及ぼす効果を表６に示す。

例１０−１５ 構造の色放出に及ぼす効果を研究するために、いくつかの異なるフルオレサーを 多孔性ガラスに被覆した。

例１記載のよう圧して、多孔性のガラス（５００Ｘ）Ｋ１−アミツバイレンおよ び２−アミノ−アンスラセンを被覆した。

２０１Ｒｇの３．４，９．１０−ペリレンテトラカルボン酸ジ無水物を２５ｍ１ のジオキサンに添加し、この溶液に２５■のアミノゾロビル−ガラスを加え１時 間かきまぜてから、室温にさらに６時間放置した。ついでガラスはメタノールま たはアセトンで十分に洗った。

ついで濾過し風乾した。

５０ダのコハク酸無水物を含有する６０ｄのジオキサン［５００りのアミノゾロ ビルガラスを添加した。

１時間かくはんしてから室温に１夜放置した。ついでガラスはアセトンで十分に 洗い、濾過し、風乾した。

Ｃｔｆ＞　！　５スの１部２５０■（カルボキシ−ガラス）を２５ゴの、Ｐ）］ ７．６の、２０〜のインチオシアネートフルオルセインを含有する０、０１Ｍリ ン酸カリウムｌこ添加した。別に、２５０〜のカルボキシル−ガラスを、２０Ｉ Ｊｇの６−アミノ−フタルヒドラジドを含有する溶液（アセトン／ジオキサン５ ０１５０容量比）に添加した。２つのガラススラリーは１時間かくはんし室温に １夜放置した。反応を完結したあと、ガラスは脱イオン水およびアセトンでそれ ぞれ洗った。最後にアセトンで洗い、濾過し、風乾した。

２５１ｖの０−フタールジ力ルポキサルデヒドを含有する５Ｑｍｌの０．０１Ｍ リン酸カリウム（ｐ）（＝７．６）に、例１に記載のように製造したアミノプロ ピル−ガラスの６００〜を添加した。ガラススラリーを１時間かくはんし、２４ 時間室温に放置した。ついでガラスは脱イオン水、アセトンで十分に洗い、濾過 し風乾した。

表７に、オギデレートエステル／パーオキサイドシステム中で多孔性ガラスに結 合させた種々のフルオレサーの化学ルミネセンス特性の観察結果を示す。

６ 例１６ 多孔性ガラス上に被覆した肝炎ウィル７９表層抗原に対する抗体と、アミツバイ レンとの複合物ガラス上に被覆した、肝炎ウィルスＢ抗原に対する抗体（市販品 ）の６０■を、ｐＨ＝７．６の０．０１　Ｍリン酸カリウムの５ｍｌ！に添加し た。２４〜の１−アミツバイレンを２ｍｌのジオキサン溶解した。この溶液に４ ５９のコハク酸無水物を添加し、２時間混合した。約９５■のＮ、Ｎ−ジシクロ へキシル−カルボジイミドを１１１Ｌｌのジオキサンに溶解した。後２者の溶液 を相互に混ぜろ０分かきまぜた。パイレン溶液の２５０ラムダをガラススラリー 溶液に移し、た。スラリーは室温で２時間かくはんし、４°Ｃに１夜放置した。

ガラ＼は、ｐｉ（７，６のリン酸緩衝液の１Ｑｍｌ宛４度洗った。試験前に、つ いで、ｔ−ブタノールでさらに２度洗い、ついで１Ｑｍｌのリン酸緩衝液で洗っ た。必要ならば、スラリーの上清より光が検出されなくなるまでスラリーを洗っ た。ついで多孔性ガラス上に被覆した１−アミツバイレン−抗体複合物は、オギ デレートおよびパーオキサイドと反応させて試験した。ガラス粒子のみが淡青色 に光るのが分った。

例１７ フルオルセインインチオシアネート抗−ヒトガンマー−グロブリン複合物をつぎ のように製造した。４　ｍｇのフルオルセインイソチオシアネートを、ｐＨ９， ０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１Ｑｍｌ中で混合した。このフルオルセイン リン酸塩溶液に４　ｍｌの抗−ヒトガンマー−グロブリン（蛋白質濃度２０　ｍ ９／ｍｌ　）を加えた。

混合物は４°Ｃで１時間連続的にかくはんし、同じ温度に２４時間放置した。ｐ Ｈ７，２の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に対し十分に透析して、過剰のフルオ ルセインを除いた。透析に際して、１００ｍ１のリン酸緩衝液をそのたびに用い た。２時間毎に５回交換した。

ガンマー−グロブリン被覆多孔性ガラスをつぎのように調製した。例４記載のよ うに５０ｍ９のエポキシ−〜のｍ−ナトリウムパーヨーデートを５　ｍｌの脱イ オン水に溶解した。ついで、この溶液にガラスを添加し、室温で２時間かくはん した。ガラスは脱イオン水で十分に洗い、ついで１０ｍ１の０．１ＭｐＨ＝９． ０リン酸カリウム緩衝液に１時間放置した。ついでガラスを戸数した。これはカ ップリングに用いうる。５　ｍｌのヒトガンマー−グロブリン（３０■／　ｍｌ 蛋白質濃度）を、０．１Ｍ、　ＰＨ＝９．０　！ｊン酸塩緩衝液の５ｍｌで希釈 した。活性化ガラスをこの溶液に添加し、４℃で２時間かき才ぜ、ついで、この 温度に１夜放置した。反応を完結したら、ｐＨ７，２の０．１Ｍ！ｊン酸塩緩衝 液で十分に洗い、濾過した。これはすぐに使用しうる。

ヒトガンマー−グロブリン被覆ガラスの３０■をフルオルセイシー抗ヒトガンマ ーーグロブリン複合物のＱ、５ｍｌに添加した。スラリーは、かくはん／放置（ ６０／９０秒比）の２４サイクルでインキュベートした。過剰の抗体溶液をけい しやし、ガラスは、ＰＨ７，２の０．０１Ｍリン酸カリウム溶液で洗い、けいし やした緩衝液をオヤデレート／パーオキザイドシステム中で試験して光が検出さ れなくなるまでに至らせた。

ガラスはついで５　ｍｌのｔ−ブタノールで洗い、過剰のブタノールを除いた。

オギずレー　トおよび過酸化物を添加すると、ガラス粒子上に緑色の光を観察し た。

例１８−１９ 化学ルミネセンスイムノアッセイにおけるラベルとしてのカプセル封入フルオレ サーの使用 つぎの実施例は、カプセル封入フルオレサーの製造およびラベルとしての使用を 説明する。これらが、本発明を限定するわけではない。

例１８ 化学ルミネセンスおよび親水性フルオレサー（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ　）のり ポゾーム中への封入ホスファチジルコリン（卵）、コレステロールおよびホスフ ァチジルエタノールアミンのモル比６：２：２（全濃度約２６ｍ９）のクロロホ ルム溶液を５０ｒＩＬｌの丸底フラスコに入れ室温でロータリーエバポレーター 上で溶媒を蒸発させた。リピリドフィルムにＮ２を吹きつけ、Ｒｈｏｄｏｍｉｎ ｅ　Ｂを含有するｐＨ８，５の０．０１　Ｍホウ酸塩緩衝液の２．Ｑｍｌを加え た。激しく振とうしてフラスコ壁よりフィルムをはがした。生ずるエマルション 状のりポゾーム懸濁液を取り出し、超音波発生器を用い水浴中で５分間超音波処 理した。

リボゾーム溶液はセファロース　６Ｂカラムに通し、均一な単一コンパートメン トリボデームをマルテイラメラーのりボゾームより分けた。均一な単一コンパー トメントリボデーム分画はふたたびＧ−７５セフアデツクスに通して、遊離ロー ダミンＢを除いた。

Ｇｌｙｍｅ中０．０１４４　ＭのＴｃｐｏ　（２、４、５−トリクロルフェニル オギヂレート）の２５μｔおよび１．２３ＭのＨ２Ｏ２の２５μｔを６　Ｘ　５ ０　ｒｎｍの試験管にピペットで加えた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ溶液含有リポ ゾームはまずＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１ＱＱで処理しく　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ を遊離さすため）、ついでこの溶液の５０ｍをＨ２Ｏ２／オギずレート混合物に 注入した。赤色フィルタを用いたＰｉｃｏ−Ｌｉｔｅルミノメータ−で光が検出 された。

例１９ 化学ルミネセンスおよび疎水性フルオレサーＤＡＩｉＦ（ジアニシルエチニルテ トラセン）のりボゾーム中への封入／埋め込み ギャングリオシド、ホスファチジルコリン、コレステロール（１０：４５：４５ モル比）を含有するクロロホルム溶液および２００ｍＭのＤＡ　ＥＴを室温でロ ータリーエバポレータ中で蒸発させた。脂質フィルムにはＮ２を吹きつけ２．Ｏ ｍｌのｐＨ８，５の０．０１０Ｍホウ酸塩緩衝液を加えた。脂質エマルション溶 液は、水溶中で５分間超音波処理した。

リボゾーム溶液はまずセファロース　６Ｂカラムを通し、ふたたびＧ−７５セフ アデツクスカラムを通し、未分散脂質、マルテイラメラーリボゾームおよび遊離 フルオレサーを除いた。

脂質膜の破裂を確かにするのに、リボゾーム溶液をＴｒｉｔＯｎ　ｘ−１００で 処理した。０．０１４４Ｍの’ｒｃｐｏの２５μｔおよび１．２３ＭのＨ２Ｏ２ の２５μｔを６×５０朋の試験管にピペットで加え、試験管はＰｉｃｏ−Ｌｉｔ ｅルミネーターの分析器中においた。Ｔｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００処理リボゾーム 溶液の５０μｔを試、験管に注入し、・光の放出を、赤色フィルターのＰｉｃｏ −Ｌｉｔｅルミノメータ−で化学ルミネセンスおよび結合フルオレサー（親水性 または疎水性）のシリカゾル中への封入 ５ｎｍの大きさのシリカゾルのＱ、５ｍｌをｐＨ１２，５の０．０１　Ｍホウ酸 塩緩衝液０．５１Ｌｌで希釈した。ゾル溶液に２５μのＴ−アミノプロピリルト リエトキシシランを添加した。混合物は激しく振ってゾル粒子を分散させた。つ いでゾル溶液はＰＨ−９，０の脱イオン水に対し十分に透析した。ＬＲ８Ｏ（ｌ ｉｅｅａｍｉｎｅ　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　 ）の５ｍ９を１．Ｏｍｌの０．０１Ｍホウ酸塩ｐＨ−’１２．５に含むものをゾ ル溶液に加え１夜インキュベートした。透析またはデル濾過で、遊離フルオレサ ーよりＲｈ−Ｂ／メチル分けた。螢光ゾルをホウ酸塩緩衝液に分散さ、せ、例１ ９に示すようにリポゾーム中に封入した。

捕捉されたＲｈ−Ｂ　メチルはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ＱＱで処理し、溶液をＴＣ ＰＯ／Ｈ２Ｏ２の混合物に注入した。赤色フィルター付Ｐｉｃｏ−Ｌｉｔｅルミ ノメータ−より光を検出した。

例２１ リポゾーム封入フルオレサーをラベルに用いる化学ルミネセントイムノアツセイ 例１８のように製造したＲｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ含有リボゾーム２１に２５％グ ルタルアルデヒドの２０μｔを加え、２０℃で１０分間インキュベートした。過 剰のグルタルアルデヒドは、０．１４５　Ｍ　ＮａＣ！１１リツトルに対し１時 間そして１リツトルのホウ酸塩緩衝液の１リツトルに対し、室温において透析し た。活性化したりボゾームはついで、４℃で１夜Ａｎｔｉ−ＨｂｓＡｇ溶液とイ ンキュベートした。

インキュベーションしたあと、抗体と複合させたりボゾームはセファロース４Ｂ カラムを通して精製した。

工１２５ラベル抗体に代えてリポゾーム複合抗体を用い、ＲＩＡＵＳＵＲＫキッ トの試剤を用いてイムノアッセイ法を実施した。生物分析のあと、ＴＣＰＯ／Ｈ ２０□溶液を加えるより前に、試験管にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ＱＯ溶液を添加し た。

陽性試料で光が発生し、レッドフィルターを用いるｐｉｃｏ−Ｌｉｔｅルミネー ターで検出した。

本発明の方法を実施するための有利なエネルギー原は、パーオキサイドと、つぎ の群より選択したオギデレート／オキシミドとの反応で生成するものである。

ビス（２，４，６−ドリクロルフエニル→オイデレート ビス（６−ドリフルオルメチルー４−ニトロフェニルチオギザレート ビス（２−ホルミル−４−ニトロフェニル±オギデレート ビス（２、６−）クロル−４−′−トロフェニル÷オギデレート Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４，５−１リクロルフエニル十Ｎ　、　Ｎ’−ビス（ トリフルオルメチルスルホニルチオキシミド Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４−ジクロルフェニル＋Ｎ　、　Ｎ’−ぎス（トリフ ルオルメチルスルホニルチオキシミドＮ　、　Ｎ’−ビス（２−メトキシフェニ ル＋Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスルホニルナオキシミぜおよびＮ 、Ｎ’−ビス（２−ニトロエチルナＮ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルス ルホニルチオキシミｙ上記に本発明の種々の変型を説明する例を示したが、専門 家には他の変法も明らかであろう。それで、請求の範囲に記載の範囲内で、上記 の具体例に変化を施しうろことはもちろんである。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和５７年１０月８日 特許庁長官　殿 １、特許出願の表示　ＰＯＴ／ＵＳ８１１０１２８６３、特許出願人 ４、代理人 居　所　〒１００東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビルヂング３３ １ ５、補市書の提出年月日　昭和５７年４月９　日請求の範囲 １、　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入フル オレサー材料と、フルオレサー乞含有するカプセルを破壊する手段と、フルオレ サーを活性化しうる電磁放射以外のエネルギーｊ原とを含有する、対象とする生 物的分析物乞検出するだめのシステム。

２、　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入フル オレサー材料と、フルオレサー含有するカプセルを破壊する゛手段と、フルオレ サーを活性化しうる電磁放射以外のエネルギー５原の過剰量とを含有する、対象 とする生物的分析物を検出（るためのシステム。

３、　（ａ）　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種を、そのような糧に生 物的に相客れるカプセル封入フルオレサー材料でラベルし； （ｂ）　カプセル封入フルオレサーラベル種と対象とする生物材料とを接触させ て、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物とし； （Ｃ）　カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分離し； （ｄ）　フルオレサーラベル含有カプセルを破壊してフルオレサーを溶液中に遊 離させ： （８）　遊離したフルオレサーと、フルオレサーラベルを活性化しりる、電磁放 射以外のエネルギー？原とを接触させ； （ｆ）　放出される化学ルミネセンス光の存在馨測定することを包含する、対象 とする生物分析物の定性的検出のための方法。

４、　（ａ）　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種を、そのような種に生 物的に相接れるカプセル封入フルオレサー材料でラベルし； （ｂ）　カプセル封入フルオレサーラベル種と、対象トする生物材料とを接触さ せて、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物とし： （Ｃ５カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分離し： （ｄ）　フルオレサーラベル含有カプセルＹ破壊Ｌ−’Ｃフルオレサーを溶液中 に遊離させ； （ｅ）　遊１１１１ｍしたフルオレサーと、フルオレサーラベルを活性化しうる 、電磁放射以外のエネルギー５原とを接触させ； （ｆ）　放出される化学ルミネセンス光の量子乞測定することを包含する、対象 とする生物的分析物の量を測定するだめの定食的方法。

５、（ａ）のカプセル封入フルオレサー材料を、対象とする生物材料に特異的な 免疫種に化学的に複合濱せろ、上記６項記載の方法。

６、カプセル封入フルオレサー材料と対象とする生物材料に特異的な免疫種との 化学的複合を、付着させた種への実質的な生物的損傷乞与えないような既知の技 術で実施する上記５項記載の方法。

Ｚ　用いろカプセル封入フルオレサー材料が約６５０ミリミクロンから約１００ ０ミリミクロンまでの放出スペクトルを有する、上記６項記載の方法。

８、　用いるカプセル封入フルオレサー材料が、対象とする生物材料に特異的の 免疫種、エネルギー源、または用いた場合の溶媒システムの放出波長？超える放 出スペクトルヲ有する、上記６項記載の方法。

９　用いるカプセル封入フルオレ・サー材料が、高濃度のフルオレサー材料ヲ肩 するミクロカプセルを生産するだめの既知のカプセル封入技術により生成される 、上記６項記載の方法。

１０、用いるカプセル封入フルオレサー材料が、対象とする分析物に特異的な免 疫種にミクロカプセルを複合させることを可能とするような反応性基の１個また は１個よ’）多くｙａ″肩するミクロカプセル構造を有する、上記６項記載の方 法。

１１、用いるカプセル封入フルオレサー材料が、容易ニ破壊されてフルオレサー 材料暑遊離さすような膜の構造である、均一なコロイドの大きさのミクロカプセ ル’Ｙ！している、上記６項記載の方法。

１２、カプセルに封入するフルオレサー材料を５，１２−ジヒドロキシキザロ（ ２、３、６）フェナジン、マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィリン、ニュー トラルレッド、マグダラレッド、アクリジンレッド、アクリジンオレンジ、シア ニアシルエチニルテトラセン、フエニシン、ローダミン、３，４，９．１０ペリ レンテトラカルボン酸ジ無水物およびそれらの誘導体より成立つ群より選択する 、上記６項記載の方法。

１３、遊離されるフルオレサー材料と接触させる（ｅ）のエネルギーシ原が、遊 離されるフルオレサー材料の丁べてｔ活性化するに必要な量よりも過剰に存在す る、上記６項記載の方法。

１４、　（ｅ）のエネルギー原が、選択した’％定のフルオレサーを活性化しう る、電磁放射以外のエネルギー５原である、上記６項記載の方法。

１５、　（ｅ）のエネルギー５原が、パーオキサイドと、ビス（２，４，６−） ’Ｊクロルフェニル÷オｑｒレ−）ビス（６−ドリフルオルメチルー４−二トロ フェニルナオキスレートビス（２−ホルミル−４−ニトロフェニルｙ−’ｅ”ｒ レートビス（２，６−シクロルー４−二トロフェニル士オｆプレートＮ　、　Ｎ ’−ビス（２，４，５−）リクロルフェニルナＮ、Ｎ’−ビス（トリフルオルメ チルスルホニルチオキシミドＮ　、　Ｎ’−ビス（２，４−ジクロルフェニル＋ Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスルホニルナオキシミドＮ　、　Ｎ’ −ビス（２−メトキシフェニル＋Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスル ホニルナオキシミドおよびＮ　、　Ｎ’−ビス（２−ニトロエチレル＋Ｎ、Ｎ” ビス（トリフルオルメチルスルホニルナオキシミドを包含する群より選択された オギずレート／オキシミドとの反応生成物である、上記６項記載の方法。

１６、エネルギーシ原が、２−ナフトール−３，６，８−トリスルホン醗、２− カルボキシフェニル、２−カルボキシ−６−ヒドロキシフェノール、１．４−ジ ヒドロキシ−９，１０−ゾフエニルアンスラセン、２−ナフトール、ルミノール 、ロフィン、ヒロガロール、ルシフェリン、ジオキセタン、ジオキセタンオン、 および他のパーオキサイドの反応より成立つ群より選択した化学反応である、上 記１４項記載の方法。

１Ｚ　エネルギー源が化学反応、オゾン、電流、電気化学的反応または機械的に 発生させたもの、に由来する、上記１４項記載の方法。

１８、既知の分析技術を用いて実施する、上記６項記載の方法。

１９、異質性サンドインチ技術を用い（実施する、上記３項記載の方法。

２０、異質性競合アッセイ技術を角いて実施する、上記５項記載の方法。

２１、対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入クエ ンチング／ポイズニング物質と、エネルギー信号を発生する化学ルミネセンス反 応と、クエンチャ−／ポイズンを含有するカプセルを破壊して、クエンチャ−／ ポイズンを自由な溶液に遊離させ、化学ルミネセンス反応で生じたエネルギー信 号を低下させる手段馨包含する、対象とする生物的分析物の検出のためのシステ ム。

２２、　（ａ）のカプセル封入フルオレサー材料？、対象とする生物材料に特異 的な免疫種に化学的に複合させる、上記４項記載の方法。

２３、対象とする生物材料に特異的な免疫種へのカプセル封入フルオレサー材料 の複合を、付着される種の実質的な生物的損傷を避けるような既知の方法を用い て実施する、上記２２項記載の方法。

２４、用いる封入される材料が約３５０ミリミクロンから約１０００ミリミクロ ンまでのスペクトル放出を肩する、上記４項記載の方法。

２５、用いる封入される材料が、対象とする生物材料に特異的な免疫種、エネル ギーシ原または用いる溶媒システムの放出波長を超える波長ヲ有する、上記４項 記載の方法。

２６、用いるカプセル封入フルオレサー材料ｔ、高濃度のフルオレサー材料’に ！するミクロカプセル構造するだめの既知の方法により生成させる、上記４項記 載の方法。

２Ｚ　用いるガプセル封入フルオレサー材料が、対象とする分析物に特異的な免 疫種へのミクロカプセルの複合を可能とするような、１個または１個より多くの 反応性基を有するミクロカプセル構造を有する、上記４項記載の方法。

２ａ用いるカプセル封入フルオレサー材料が、容易に破壊されてフルオレサー材 料馨放出するような膜を有する構造の、均一なコロイド状の大きさのミクロカプ セルを肩する、１記４項記載の方法。

２９　用いるカプセル封入フルオレサー材料ｖ、５゜１２−ジヒドロキシキゾロ （２，３，６）フェナジン、マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィリン、ニュ ートラルレッド、マグダラレッド、アクリジンレッド・、アクリジンオレンジ、 ジアニシルエチニルテトラセン、フエニシン、ローダミン、３，４．９．１０− ペリレンテトラカルボン酸ジ無水物すよびそれらの誘導体より成立つ群より選択 子ゐ、上記４項記・載の方法。

３０、遊離されたフルオレサー材料と接触させるエネルギー原（８）が、遊離さ れたフルオレサー材料の丁べてを活性化するよりも過剰に存在する、上記４項記 載の方法。

３１、　（ｅ）のエネルギー５原が、選択した特定のフルオレサ−を活性化しう る、電磁照射以外のものである、上記４項記載の方法。

５２、　（ｅ）のエネルギー源が、パーオキサイドと、ビス（２，４，６−）リ クロルフェニルナオギデレート、ビス（６−ドリフルオルメチルー４−二トロフ ェニルナオギデレート、ビス（２−ホルミル−４−二トロフェニルナオギデレー ト、ビス（２，６−ゾクロルー４−二トロフェニル＋オギデレート、Ｎ　、　Ｎ ’−ビス（２，４，５−１リクロルフェニル＋Ｎ、Ｎ’−ビス（トリフルオルメ チルスルホニルナオキシミドＮ　、　Ｎ’−ビス（２，４−ジクロルフェニル＋ Ｎ、Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスルホニルナオキシイミドＮ　、　Ｎ’− ビス（２−メトキシフェニル＋Ｎ、Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスルホニル ナオキシミドおよびＮ　、　Ｎ’−ビス（２−二トロエチル＋Ｎ　、　Ｎ’ビス （トリフルオルメチルスルホニルナオキシミドより成立つ群より選択したオギデ レート／オキシイミドとの反応生成物である、上記４項記載の方法。

３６、エネルギー〉原が、２−ナフトール−３，６，８ルボキシ−６−ヒドロキ シフェノール、１．４−ジヒドロキシ−９，１０−ジフェニルアンスラセン、２ −ナフトール、ルミノール、ロフィン、ヒロガロール、ルシフェリン、ジオキセ タン、ジオキセタンオンおよび他のパーオキサイド反応より成立つ群より選択し た化学反応である、上記６１項記載の方法。

６４、エネルギーシ原が、化学反応、オゾン、電流、電気化学的反応、または機 械的に発生されたものに由来する、上記３１項記載の方法。

６５、既知のアッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。

６６、異質サンドイッチアッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。

６Ｚ　異質の競合的アッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。

３ａ　対象とする分析物に特異的な免疫種へのミクロる、ミクロカプセル封入フ ルオレサー組成物。

３９．５．１２−ジヒドロキシキゾロ（２，ｉ６）フェナジン、マグネシウムお よび亜鉛メタロボルフイリ／、ニュートラルレッド、マグダラレノド、アクリジ ンレッド、アクリジンオレンジ、シアニアシルエチニルテトラセン、フエニシン 、ローダミン、３，４゜９．１０−ペリレンテトラカルボン酸ジ無水物およびそ れらの誘導体より成立つ、群よりフルオレ、サー馨選択する、対象とする生物的 材料に特異的でそしてそれの検出のための免疫種のラベルに有用な、ミクロカプ セル封入フルオレサー組成物。

４０、対象とする分析物に特異的な免疫的種と、対象とする分析物に特異的な免 疫的種へのミクロカプセルの複合を可能とする反応性基の１個または１個より多 くを有するミクロカプセル構造を有する封入物とを反応させて生成した、対象と する生物材料の検出に有用な、複合ミクロカプセル封入フルオレサー／免疫的種 の組成物。

４１、免疫的種と、容易に破壊されてフルオレサー材料を放出するような膜構造 を有する均一なコロイドの大きさのミクロカプセル構造するカプセル封入フルオ レサーとの反応で生成した、対象とする生物材料の検出に有用な、複合した、ミ クロカプセル封入フルオレサー／免疫種組成物。

４２、免疫的種と、５，１２−ゾヒドロキシキデロ（２，３，６）フェナジン、 マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィリン、ニュートラルレッド、アクリジン レッド、アクサジ／オレンジ、ジアニシルエチニルテトラセン、フエニシン、ロ ーダミン、３，４，９゜１０ペリレンテトラカルボン酸シアンハイドライドおよ びそれらの誘導体より成立つ群より選択したカプセル封入フルオレサーとの反応 で生成した、対象とする生物種の検出に有用な、複合された、ミクロカプセル封 入フルオレサー／免疫種組成物。

４３、＋１）　対象とする生物材料に特異的な免疫的種に複合させたミクロカプ セル封入フルオレサー材料と、（２）ミクロカプセル封入フルオレサーの膜構造 ヲ破壊するための手段と、そし℃ （３）　遊離されたフルオレサー材料？励起して光を放出させるような高エネル ギー中間体乞生成さ丁ように反応しうる化学剤とを含有する、１個または１個よ り多くの容器乞、包装された組合わせとして含有する、従来法のアッセイ技術を 用いて対象とする生物材料を検出するために用いる試験用キット。

４４、化学試剤が（１）過酸化水素筐たは過酸化水素を発生するための化学シス テムおよび（ト）オキサミド化合物またはビスーオギデレートエステル化合物を 含有する上記４５項記載のキット。

４５、ｔｌｌ　対象とする生物材料喀特異的な免疫的種に複合させた、ミクロ封 入されたクエンチング／ボイズニング材料と、 （２）　反応して、エネルギーシグナルを発生する化学ルミネセンスを生成しう る化学反応剤と、そして（３）　クエンチャ−／ポイズンを自由溶液に遊離さす だめの、ミクロカプセル封入クエンチング／ボイズニング材料の膜構造を破壊す るだめの手段を含有する、１個または１個より多くの容器馨、包装され゛た組合 わせとして含有する、従来法によるアッセイ技術を用ｔ）る、対象とする生物材 料の検出のために用いる試験用キット。

４６、フルオレサーラベルを含Ｖ′″ｆるカプセル馨破壊しラベルを溶液中に遊 離さすより前に、ミクロカプセル封入フルオレサー／生物材料の複合物によりラ ベルされた種を分けることをしない、対象とする生物的分析物の定性的検出のた めの上記６項記載の方法。

４ス　フルオレサーラベルを含有するカプセル馨破壊しラベルを溶液中に遊離さ すより前に、ミクロカプセル封入フルオレサー／生物材料の複合物によりラベル された種を分けることをしない、対象とする生物的分析物の窒素的測定のための 上記４項記載の方法。

４８、フルオレサーー触媒を活性化しうる、電磁放射以外のエネルギー；原の存 在において、対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたフルオレサ ル触媒を含有する、対象とする生物的分析物の検出のためのシステム。

４２　フルオレサー触媒乞活性化しうる、電磁放射以外のエネルギー原の過剰量 の存在において、対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたフルオ レサル触媒を含有する、対象とする生物的分析物の検出のためのシステム。

５０、（ａ）対象とする分析物に特異的な免疫的種をその種と生物的に相客れる フルオレサル触媒材料でラベルし； （ｂ）　フルオレサル触媒でラベルされた種と対象とする生物材料とを接触させ て、フルオレサー触媒／生物材料複合物でラベルされた種とし。

（Ｃ）　フルオレサー触媒／生物的材料複合物でラベル　゛された種を分け； （ｄ）（ｃ）による、分けられた、フルオレサー触媒／生物的材料複合物でラベ ルされた種と、フルオレサーー触媒ラベルを活性化しうる、電磁放射以外のエネ ルギー５原と馨接触させ：そして、 （θ）　活性化されたフルオレサル触媒より放出される光の存在または非存在を 測定することを包含する、対象とする生物的分析物の定性的検出方法。

５１、フルオレサー触媒／生物材料複合物を、フルオレサル触媒ラベルの活性化 の前に分けることをしない、上記５０項記載の、対象とする生物的分析物の定性 的検出のための方法ν ５２、（ａ）対象とする分析物に特異的の免疫種を、その種と生物的に相容れる フルオレサル触媒材料でラベルし； （ｂ）　フルオレサーー触媒でラベルされた種と対象とする生物材料とを接触さ せて、フルオレサーー触媒／。

生物材料複合物でラベルされた種とし：（Ｃ）　フルオレサーー触媒／生物材料 複合物でラベルされた種を分け； （ｄ）　（ｃ）による、分けら、れた、フルオにサー触媒／生物材料複合物でラ ベルされた種と、フルオレサル触媒ラベルを活性化しうる、電磁放射以外のエネ ルギー５原とを接触させ；そして （ｅ）活性化されたフルオレサル触媒より放出される光の量を測定することを包 含する、対象とする生物的分析物の量χ測定するための定電的方法。

５３、フルオレサル触媒ラベルを活性化するより前に、フルオレサー触媒／生物 材料複合物でラベルされた種乞分離することをしない、上記５２項に準する対象 とする生物的分析物の量を定食的に測定するだめの方法。

５４、　（ａ）のフルオレサル触媒を、対象とする生物材料に特異的な免疫種に 化学的に複合させる、上記５０項記載の方法。

５５、対象とする生物材料に特異的な免疫種へのフルオレサー触媒の化学的複合 を、付着させる種への実質的な生物的損傷を与えぬような方法で実施する、上記 ５４項記載の方法。

５６、用いるフルオレサー触媒材料が約２６０ミリミクロンから約１０００ミリ ミクロンまでのスペクトル放出を有する、上記５０項記載の方法。

５Ｚ　用いるフルオレサー触媒材料が、対象とする生物材料に特異的な免疫種か または対象とする生物材料の光吸収波長より大で、溶媒系乞用いれば、その溶媒 系の光吸収波長より小であるスペクトル放出を有する、上記５０項記載の方法。

５ａ用いるフルオレサー触媒が、対象とする生物材料に特異的な免疫種に悪影響 せずにその免疫種と反応しうる１′ｍまたは１種より多くの官能基’Ｙ！する構 造を有する、上記５０項記載の方法。

５９　用いるフルオレサー触媒材料が、アルキルアミ７基、アリールアミノ基、 イソシアノ基、シアン基、イソチオシアノ基、チオシアノ基、カルボキシ基、ヒ ドロキシ基、メルカプト基、フェノール基、イミダゾール基、アルデヒド基、エ ポキシ基、チオニルノ・ライド基、スルホニル７％ライド基、ニトロベンゾイル ノ１ライド基、カルボキシ基・ライド基、トリアゾ基、スクシンイミド基、アン ノ・イドライド基、ノｈロアセテート基１、ヒドラジノ基、およびジノ・ロトリ アジニル基より成立つ群より選択した１個または１個より多くの官能基を６０、 　３　、４　、９　、１０ベニレンチトラカルボン酸ゾ無水物、アミノクリセン 、フルオル上４フト、アミノーパイレンおよびアミノ−アンスラセンを包含する 群よりフルオレサー触媒材料を選択する上記５０項記載の方法。

６１、フルオレサー触媒／生物材料複合物によりラベルされた、分けられた種と 接触させる（ｄ）のエネルギー原が、フルオレサー触媒のすべでを活性化するに 必要な量より過剰に存在する上記５０項記載の方法。

６２、フルオレサー触媒／生物材料複合物によりラベルされた、分けられた種と 接触させる（ｄ）のエネルギー原が、ラベルされた種と相客れるように選択され た、特定のフルオレサー触媒を活性化しうる、電磁放射以外のエネルギー源であ る、上記５０項記載の方法。

６６、フルオレサー触媒／生物材料複合物によりラベルされた、分けられた種と 接触させる（ｄ）のエネルギー原が、パーオキシオヤデレート反応である、上記 ５０項記載の方法。

６４、エネルギー〉原が、２−ナフトール−３．６．８−トリスルホン酸、２− カルボキシフェニル、２−カルボキシ−６＝ヒドロキシフエノール、１．４−ジ ヒドロキシ−９．１０−ジフェニルアンスラセン、２−ナフトール、ルミノール 、ロフィン、ヒロガロールおよびルシフェリン反応より成立つ群より選択した化 学反応である、上記６２項記載の反応。

６５、エネルギー源が、化学反応、オゾン、電流、電気化学反応または機械的に 発生させたものに由来する、上記６２項記載の方法。

６６、固体相分析技術を用いる、上記５０項記載の方法。

６Ｚ　サンドインチ技術馨用いる、上記５０項記載の方法。

６８、異質性分析技術を用いる、上記５０項記載の方法。

６９　異質性競合結合技術馨用いる、上記５０項記載の方法。

７０、フルオレサー触媒／生物材料複合物でラベルされた種Ｚ分けることなく、 クエンチング分析技術を用いて実施する、上記５０項記載の方法。

７１、免降−沈降反応技術を用いて実施する、上記５０項記載の方法。

７２、イオン交換技術を用いて実施する、上記５０項記載の方法。

７６、イオン排斥技術を用いて実施する、上記５０項記載の方法。

７４、マスキング技術馨用いて実施する上記５０項記載の方法。

７５、　（ａ）のフルオレサー触媒を対象とする生物材料に特異的な免疫種に化 学的に複合させる、上記５２項記載の方法。

７６、対象とする生物材料に特異的な免疫種へのフルオレサー触媒材料の化学的 複合を、付着させる種への実質的な生物的損傷を与えぬように実施する、上記５ ２項記載の方法。

７Ｚ　用いるフルオレサー触媒材料が約２６０ミリミクロンから約１０００ミリ ミクロンまでのスペクトル放出を肩する、上記５２項記載の方法。

７８、用いるフルオレサー触媒材料゛が、対象とする生物材料に特異的な免疫種 か箇たは対象とｇ′る生物材料の光吸収波長より大で、溶媒系？用いればその溶 媒系の光吸収より小のスペクトル放出’ＹＮする、上記５２項記載の方法。

７９　用いるフルオレサー触媒材料が、対象とする生物材料に特異的な免疫種に 悪影響しないでそのような免疫種と反応しうる、官能基のひとつまたはひとつよ り多くｔ有する構造を肩する、上記５２項記載の方丸８０、用いるフルオレサー 触媒材料が、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、イソシアノ基、シアノ基、 インチオシアノ基、チオシアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メルカプト基 、フェノール基，イミダゾール基、アルデヒド基、エポキシ基、チオニルハライ ド基、スルホニルハライド基、ニトロペンゾイルノ１うイド基、カルボニルハラ イド基、トリアゾ基、スクシンイミド基、アンハイドライド基、ハロアセテート 基、ヒドラジノ基、およびジハロトリアジニル基より成立つ群より選択した官能 基のひとつまたはひとつより多くを有する、上記５２項記載の方法。

８１、用いるフルオレサー触媒材料を、３，４，９゜１０ペリレンテトラカルボ ン酸ジ無水物、アミノ−クリセン、フルオルセインインチオシアネート、テトラ メチルローダミンイソチオンアネート、アミツバイレン、およびアミノアンスラ センより成立つ群より選択する、上記５２項記載の方法。

８２、フルオレサー触媒／生物材料複合物でラベルされた、分けられた種と接触 させる（、ｉ）のエネルギー源が、フルオレサー触媒のすべてを活性化するに必 要な量より過剰に存在する、上記５２項記載の方法。

８６、フルオレサー触媒／生物材料複合物でラベルされた、分けられた塊と接触 させる（ｄ）のエネルギー源が、ラベルされた塊と相客れるように選択された、 特定のフルオレサー触媒を活性化しうる、電磁放射以外のエネルギー源である、 上記５２項記載の方法。

８４、フルオレサー触媒／生物材料複合物でラベルされた、分けられた種と接触 させる、（ｄ）のエネルギー源原が、パーオキ／オギサレート反応である、上記 ５２項記載の方法。

８５、エネルギー源が、２−ナフトール−３，６，８−トリスルホン酸、２−カ ルボキシフェニル、２−カルボキシ−６−ヒドロキシフェノール、１．４−ジヒ ドロキシ−９，１０−ジフェニルアンスラセン、２−ナフトール、ルミノール、 ロフィン、ヒロガロール、ルシフェリン反応より成立つ群より選択した化学反応 である、上記８６項記載の方法。

８６、エネルギー源原が、化学反応、オゾン、電流、電気機械的反応または機械 的に発生するものに由来する、上記８６項記載の方法。

８Ｚ　固体相分析技術を用いて実施する、上記５２項記載の方法。

８８、異質性の分析的アッセイ技術を、用いて実施する上記５２項記載の方法。

８９　異質性の競合的結合技術を用いて実施する上記５２項記載の方法。

９０、　クエｙ　チア　り分析技術’ｒ：用い、フルオレサー触媒／生物材料複 合物を分けないで実施する、上記５２項記載の方法。

、２１．免疫沈降反応技術を用いて実施する、上記５２項記載の方法。

９２、イオン交換技術音用いて実施する、上記５２項記載の方法。

９３、イオン排斥技術を用いて実施する、上記５２項記載の方法。

９４、マスキング技術を用いて実施する上記５２項記載の方法。

９５、対象とする生物材料に特異的な免疫種の特異性に悪影響しないで免疫種と 化学的に反応しうる官能基のひとつまたはひとつより多くを有する化学構造を有 するフルオレサー触媒のような、対象とする生物材料に特異的な免疫種ヒラベル しそして対象とする生物材料を検出するに有用なフルオレサー触媒組成物。

９６、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、イソシアノ基、シアン基、インチ オシアノ基、チオシアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、フェ ノール基、イミダゾール基、アルデヒド基、エポキシ基、チオニルハライド基、 スルホニルハライド基、ニトロベンゾイルハライド基、カルボニルハライド基、 トリアゾ基、スクシンイミド基、アンハイドライド基、ハロアセテート基、とド ラジノ基、およびジハロトリアゾニル基より成立つ群より選択した官能基のひと っまたはひとつより多くヲ有する化学構造を有するフルオレサーを用いた、対象 とする生物材料に特異的な免疫種のラベルおよび生物材料の検出に有用な、フル オレサー触媒組成物。

９７．３，４，９．１０ペリレンテトラカルボン酸ジ無水物、アミノクリセン、 フルオルセインインチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネー ト、アミツバイレンおよびアミノアンスラセンよす成立つ群より選択したフルオ レサー触媒を用いる、対象とする生物材部に特異的な免疫種のラベルおよび該生 物材料の検出に有用なフルオレサー触媒組成物。

９８、対象とする生物材料に対する免疫種の特異性に悪影響することなしに、免 疫種と化学反応しうるひとつまたはひとつより多くの官能基２有する化学構造を Ｍするフルオレサー触媒との反応を経由して形成された、対象とする生物材料の 検出に有用な、複合した、フルオレブー触媒／免疫種組成物。

９９　アルキルアミノ基、アリールアミノ基、イソシアノ基、シアン基、イソチ オシアノ基、チオシアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メ・ルカプト基、フ ェノール基、イミダゾール基１、アルデヒド基１．エポキシ基、チオニルハライ ド基、スルホニルハライド基、ニトロベンゾイルハライド基、カルボニルハライ ド基、トリアゾ基、スクシンイミド基、無水物基、ハロアセテート基、ヒドラジ ノ基およびジハロトリアゾニル基を包含する群より選択した官能基のひとつまた はひとつより多くを育する化学構造を有する゛フルオレサー触媒と、免疫種とを 反応させて生成した、対象とする生物材料の検出に有用な、複合された、フルオ レブー触媒／免疫種組成物。

１００、３　、４　、９　、１０ペリレンテト力ラルポン酸ジ無水物、アミノク リセン シアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、アミツバイレンおよ びアミノ−アンスラセンより成立つ群より選択したフルオレサー触媒と、免疫種 とを反応させて生成した、対象とする生物材料の検出に有用な、複合された、フ ルオレブー触媒／免疫種組成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入フルオ レサー材料と、フルオレサーを含有するカプセルを破壊する手段と、フルオレサ −を活性化しうろ電磁放射以外のエネルギー５原とを含有する、対象とする生物 的分析物を検出するためのシステム。 ２、対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入フルオ レサー材料と、フルオレサー含有するカプセルを破壊する手段と、フルオレサー を活性化しつる電磁放射以外のエネルギー！原の過剰量とを含有する、対象とす る生物的分析物を検出するだめのシステム。 ろ（ａ）　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種を、そのような種に生物的 に相客れるカプセル封入フルオレサー材料でラベルし： （ｂ）　カプセル封入フルオレサーラベル種と対象とする生物材料とを接触させ て、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物とし；（ｃ）　カプセ ル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分離し： （ｄ）　フルオレサーラベル含有カプセルを破壊してフルオレサーを溶液中に遊 離させ； （ｅ）遊離したフルオレサーと、フルオレサーラベ５ ルを活性化しうる、電磁放射以外のエネルギ七源とを接触させ； （ｆ）　放出される化学ルミネセンス光の存在を測定することを包含する、対象 とする生物分析物の定性的検出のだめの方法。 ４、　（ａ）　対象とする生物的分析物に特異的々免疫種を、そのような種に生 物的に相客れるカプセル封入フルオレサー材料でラベルし； （ｂ）　カプセル封入フルオレサーラベル種と、対象とする生物材料とを接触さ せて、カプセル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物とし；（Ｃ）　カプ セル封入フルオレサーラベル種／生物材料複合物を分離し； （ｄ）　フルオレサーラベル含有カプセルを破壊してフルオレサ−を溶液中に遊 離させ； （ｅ）遊離したフルオレサーと、フルオレサーラベルを活性化しうる、電磁放射 以外のエネルギー！原とを接触させ； （ｆ）　放出される化学ルミネセンス光の量子を測定することを包含する、対象 とする生物的分析物の量を測定するための定量的方法。 ５、（ａ）のカプセル封入フルオレサー材料を、対象とする生物材料に特異的な 免疫種に化学的に複合させる、上記３項記載の方法。 ６、　カプセル封入フルオレサー材料と対象とする生物材料に特異的な免疫種と の化学的複合を、付着させた種への実質的な生物的損傷を与えないような既知の 技術で実施する上記５項記載の方法。 ７、　用いるカプセル封入フルオレサル材料が約３５０ミリミクロンから約１０ ００ミリミクロンまでの放出スペクトルを有する、上記３項記載の方法。 ８、用いるカプセル封入フルオレサル材料が対象とする生物材料に特異的の免疫 種、エネルギー源、または用いた場合の溶媒システムの放出波長を超える放出ス ペクトルを有する、上記６項記載の方法。 ９　用いるカプセル封入フルオレサル材料が、高濃度のフルオレサー材料を有す るミクロカプセルを生産するための既知のカプセル封入技術により生成される、 上記６項記載の方法。 １０、用いるカプセル封入フルオレサル材料が、対象とする分析物に特異的々免 疫種にミクロカプセルを複合させることを可能とするような反応性基の１個また は１個より多くを有するミクロカプセル構造を有する、上記３項記載の方法。 １１、用いるカプセル封入フルオレサル材料が、容易に破壊されてフルオレサー 材料を遊離さすような膜の構造である、均一なコロイドの大きさのミクロカプセ ルを有している１、上記３項記載の方法。 １２　カプセルに封入するフルオレサー材料を５，１２−ジヒドロキツキず口（ ２，３，＜Ｓ）フェナジン、マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィ１ノン、ニ ュートラルレッド、マグダラレッド、アクリシンレノｒ、アクリジンオレンジ、 ジアニアンルエチニルテトラセン、フエニゾン、ローダミン、ろ、４，９．１０ ぺ１）レンチトラカルボン酸ジ無水物およびそれらの誘導体より成立つ群より選 択する、上記３項記載の方法。 １ろ　遊離されるフルオレサー材料と接触させる（ｅ）のエネルギー源が、遊離 されるフルオレサー材料のすべてを活性化するに必要な量よりも過剰に存在する 、上記３項記載の方法。 １４、　（ｅ）のエネルギー７原が、選択した特定のフルオレサ−を活性化しう る、電磁放射以外のエネルギ−３原である、上記６項記載の方法。 １５、　（ｅ）のエネルギー、源が、パーオキサイドと、ビス（２、４、６−） 　ＩＪクロルフェニル→オキテレート ビス（３−ト！Ｊフルオルメオルー４−二トロフェニル分オギデレート ビス（２−ホルミル−４−ニトロフェニル→オキスレート ビスＣ２，６−ジクロル−４−ニトロフェニル→オギずレート Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４，５−）リクロルフェニル→Ｎ、Ｎ′−ヒス（）　 ＩＪフルオルメチルスルホニル→オキシミド Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４−ジクロルフェニル→Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフ ルオルメチルスルホニル分オキシミド Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２−メトキシフェニル＋Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオ ルメチルスルホニル分オキシミＶおよび　Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２−ニトロエテ ル＋Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオルメチルスルホニル今オキシミド を包含する群より選択されたオギヂレート／オキシミドとの反応生成物である、 上記６項記載の方法。 １６、エネルギー！原が、２−ナフトール−ろ、６，８−　）　ＩＪスルホンＩ ！＋２−カルボキシフェニル、２−カルボキシ−６−ヒドロギシフエノール、１ ．４−ジヒルノフエリン、ジオキセタン、ジオキセタンオン、および他のパーオ キサイドの反応より成立つ群より選択した化学反応である、上記１４項記載の方 法。 １Ｚ　エネルギー３原が化学反応、オゾン、電流、電気化学的反応まだは機械的 に発生させたものに由来する。 上記１４項記載の方法。 １８、既知の分析技術を用いて実施する、上記６項記載の方法。 １９、異質性サンドイッチ技術を用いて実施する、上記３項記載の方法。 ２０、異質性競合アッセイ技術を用いて実施する、上記６項記載の方法。 ２１　対象とする生物的分析物に特異的な免疫種に複合させたカプセル封入クエ ンチング／ボイズニンゲ物質と、エネルギー信号を発生する化学ルミネセンス反 応と、クエンチャ−／ポイズンを含有するカプセルを破壊して、クエンチャ−／ ポイズンを自由な溶′ｏ、に遊離させ、化学ルミネセンス反応で生じたエネルギ ー信号を低下させる手段を包含する、対象とする生物的分析物の検出のだめのシ ステム。 ２２、　（ａ）のカプセル封入フルオレサル材料を、対象とする生物材料に特異 的な免疫種に化学的に複合させる、上記４項記載の方法。 ２６６対象とする生物材料に特異的な免疫種へのカプセル封入フルオレサル材料 の複合を、付着される種の実質的な生物的損傷を避けるような既知の方法を用い て実施する、上記２２項記載の方法。 ２４、用いる封入される材料が約３５０ミリミクロンから約１０００ミリミクロ ンまでのスペクトル放出を有する、上記４項記載の方法。 ２５、用いる封入される材料が、対象とする生物材料に特異的な免疫種、エネル ギー；原または用いる溶媒システムの放出波長を超える波長を有する、上記４項 記載の方法。 ２６、用いるカプセル封入フルオレサル材料を、高濃度のフルオレサー材料を有 するミクロカプセルを製造するための既知の方法により生成させる、上記４項記 載の方法。 ２７　用バるカプセル封入フルオレサー材料が、対象とする分析物に特異的な免 疫種へのミクロカプセルの複合を可能とするような、１個または１個より多くの 反応性基を有するミクロカプセル構造を有する、上記４項記載の方法。 ２８、用いるカプセル封入フルオレサー材料が、容易に破壊されてフルオレサー 材料を放出するような膜を有する構造の、均一なコロイド状の大きさのミクロカ プセルを有する、上記４項記載の方法。 ２９　用いるカプセル封入フルオレサー材料ヲ５．１２−ジヒドロキシキゾロ（ ２，３，６）フェナジン、マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィリン、ニュー トラルレッド、マグダラレッド、アクリジンレッド、アクリジンオレンジ、ジア ニシルエチニルテトラセン、フエニジン、ローダミン、ろ、４．９．１０−ペリ レンテトラカルボン酸ゾ無水物およびそれらの誘導体より成立つ群より選択する 、上記４項記載の方法。 ６０、遊離されたフルオレサー材料と接触させるエネルギー：原（ｅ）が、遊離 されたフルオレサー材料のすべてを活性化するよりも過剰に存在する、上記４項 記載の方法。 ３１、　（ｅ）　（７）エネルギー源原が、選択した特定のフルオレサーを活性 化しうる、電磁照射以外のものである、上記４項記載の方法。 ３２、　（ｅ）のエネルギー源が、パーオキサイーと、ビス（２，４，６−１リ クロルフエニル→オギヂレート、 ビス（３−トリフルオルメチル−４−ニトロフェニル÷オギザレート、 ビス（２−ホルミル−４−ニトロフェニル分オキテレート、 ビスＣ２，６−ジクロル−４−二トロフェニル÷オギデレート、 Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４，５−）ジクロルフェニル→Ｎ　、　Ｎ／−ヒス（ トリフルオルメチルスルホニル→オキシミド Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２，４−ジクロルフェニル→Ｎ　、　Ｎ’−ヒス（）　Ｉ Ｊフルオルメチルスルホニル÷オキシイミド Ｎ　、　Ｎ’−ビス（２−メトキシフェニル＋Ｎ　、　Ｎ’−ビス（トリフルオ ルメチルスルホニル今オキシミーおよびＮ　、　Ｎ’−ビス（２−ニトロエチル ＋Ｎ、Ｎ’−ビス（）　ＩＪフルオルメチルスルボニル→オキシミド より成立つ群より選択したオギデレート／オキシイ・ミドとの反応生成物である 、上記４項記載の方法。 ３６、エネルギー源が、２−ナフトール−３，６，８−トリスルホン酸、２−カ ルボキシフェニル、２−カルボキシ−６−ヒドロギシフエノール、１．４−ジヒ ドロキシ−９，１０−ジフエニルア／スラセン、２−ナフト−ル、ルミノール、 ロフィン、ヒロガロール、ルシフェリン、ジオキセタン、ジオキセタンオンおよ び他のパーオキサイド反応より成立つ群より選択した化学反応である、上記３１ 項記載の方法。 ３４、エネルギー源が、化学反応、オゾン、電流、電気化学的反応、または機械 的に発生されたものに由来する、上記６１項記載の方法。 ３５、既知のアッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。 ろ６．異質サンＰイツチアッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。 ３７　異質の競合的アッセイ技術を用いて実施する、上記４項記載の方法。 ろ８．高濃度のフルオレサー材料を有するミクロカプセルを生成さすだめの既知 のカプセル封入技術ヲ用いて生成された、カプセル封入フルオレサー組成物。 ３９、対象とする分析物に特異的な免疫種へのミクロカシセルの複合を可能とす るような、１個または１個より多い反応性基を有するミクロカプセル構造を有す る、カプセル封入フルオレサー組成吻。 ４０、容易に破壊されてフルオレサー材料を放出するような膜の構造を有してｂ る、均一なコロイド状の大きさのミクロカプセルを有する、カプセル封入フルオ レサー組成物。 ４１．５．１２−ジヒドロキシキゾロ（２，３，６）フェナジン、マグネシウム および亜鉛メタロポルフィリン、ニュートラルレッド、マグダラレッＰ、アクリ ジンレッド、アクリジンオレンジ、シアニアシルエチニルテトラセン、フエニシ ン、ローダミン、３，４゜９．１０−ペリレンテトラカルボン酸ゾ無水物および それらの誘導体より成立つ群よりフルオレサーを選択する、対象とする生物的材 料に特異的でそしてそれの検出のための免疫種のラベルに有用な、カプセル封入 フルオレサー組成物。 ４２、対象とする分析物に特異的な免疫的種と、対象とする分析物に特異的な免 疫的種へのミクロカプセルの複合を可能とする反応性基の１個または１個より多 くを有するミクロカシセル構造を有する封入物とを反応させて生成した、対象と する生物材料の検出に有用な、複合カプセル封入フルオレサー／免疫的種の組成 物。 ４６、免疫的種と、容易に破壊されてフルオレサー材料を放出するような膜構造 を有する均−彦コロイーの大きさのミクロカプセルを有するカプセル封入フルオ レサーとの反応で生成した、対象とする生物材料の検出に有用な、複合した、カ プセル封入フルオレサー／免疫種組成物。 ４４゜免疫的様と、５．１２−ジヒドロキシキゾロ（２，３，６）ツェナクン、 マグネシウムおよび亜鉛メタロポルフィリン、ニュートラルレッド、アクリジン レッド、アクリジンオレンジ、ジアニンルエチニルテトラセン、フエニジン、ロ ーダミン、３，４，９゜１０ペリレンテトラカルボン酸シアンハイトライＰおよ びそれらの誘導体より成立つ群より選択したカプセル封入フルオレサーとの反応 で生成した、対象とする生物種の検出に有用な、複合された、カプセル封入フル オレサー／免俊種組成物。 ４５、　ｆｌ）　対象とする生物材料に特異的な免疫的様に複合させたミクロカ プセル封、入フルオレサー材料ト、（２）　ミクロカプセル封入フルオレサーの 膜構造を破壊するための手段と、そして （３）　遊離されたフルオレサー材料を励起して光を放出させるような高エネル ギー中間体を生成さすように反応しうる化学斉１とを含有する、１個または１個 より多くの容器を、包装された組合わせとして含有する、従来法のアッセイ技術 を用いて対象とする生物材料を検出するために用いる試験用キット。 ４６、化学試剤が　（１）過酸化水素または過酸化水素を発生するだめの６化学 システムおよび（１１）オキサミド化合物マタはビスーオギずレートエステル化 合物を含有する上記４５項記載のキット。 ４７、　＋１）　対象とする生物材料に％異的な免疫的様に複合させたミクロ封 入されたクエンチング／ボイズニング材料と、 （２）反応して、エネルギーシグナルを発生する化学的ルミネセンスを生成しう る化学反応剤と、そして （３）　クエンチャ−／ポイズンを自由溶液に遊離さすための、ミクロカプセル 封入クエンチング／ボイズニング材料の膜構造を破壊するための手段を含有する 、１個または１個より多くの容器を、包装された組合わせとして含有する、従来 法によるアッセイ技術を用いる、対象とする生物材料の検出のために用いる試験 用キット。 １−α