JPH02276949A - 化学発光測定方法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は化学発光測定方法およびその装置、特にセル構
造の改良に関する。

［従来の技術］ 近年、所定の化学反応に伴う化学発光強度を測定するこ
とにより所望の物質の分析を行なう化学発光測定方法が
汎用されてきている。

ここで、化学発光とは、化学反応の結果中じたエネルギ
ー状態の高い（励起状態）分子が、より低いエネルギー
状態（基底状態）に移る時に光を放射する現象を言い、
蛍光測定方法に比較し感度が１００倍以上も高く、また
装置の構成が簡単であるため生化学、臨床化学、および
環境化学分析等の他、液体クロマトグラフ等の検出手段
にも利用されてきている。

このような化学発光分析に使用する装置は、所定の発光
反応を行なわせる反応部と、発光強度を測定するための
発光検出部と、を含み、前記発光検出部からの検出信号
を増幅し、反応量として表示するよう構成されている。

また、化学発光測定方法を応用したものとしては、ヒド
ロペルオキシドの検出法が挙げられる。

即ち、チトクロムＣやミクロペルオキシダーゼ、フェリ
シアン化カリウム等の鉄イオンを含む化合物と、ルミノ
ールまたはイソルミノールとを溶解した塩基性緩衝液（
ホウ酸緩衝液等）を反応液とし、この反応液をヒドロペ
ルオキシドを含む試料液に添加することによって発生す
る化学発光強度を検出する。

そして、化学発光強度はヒドロペルオキシドの濃度に比
例するところから、該ヒドロペルオキシドの測定を行な
うものである。

一方、同じく化学発光検出方法を用いる分析法として、
蛍光物質の化学発光を利用した検出法が挙げられる。

即ち、過酸化水素とＴ　ＣＰ　Ｏ（ｂｉｓ（２，４，６
−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｏｘａｌａｔｅ）
あるいはＴ　Ｄ　Ｐ　Ｏ（ｂｉｓ［４−ｎｉｔｒｏ−２
−（３、６、９−ｔｒｉｏｘａｄｅｃｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ　）ｐｈｅｎｙ　１］ｏｘａｌａｔｅ）等のシ
ュウ酸ジエステル化合物とを溶解したアセトニトリル溶
液またはアセトニトリル／酢酸エチル混合溶液を反応液
とし、この反応液を蛍光物質を含む試料液に加えること
によって生成する化学発光量を検出するものである。

ここで、化学発光は、過酸化水素と上記シュウ酸ジエス
テルが反応して活性中間体を生成し、この活性中間体に
よって蛍光物質が励起され基底状態に戻る時に発生する
。

このように、従来においても化学発光測定方法ないし測
定装置は、各種の物質の微量分析に応用されている。

［発明が解決しようとする課題］ ところが、従来の化学発光測定方法にあっては、発光試
薬が極めて高価であったり、発光試薬自体の寿命が短く
、測定が煩雑になるという課題があった。

即ち、前述したヒドロペルオキシドの検出では、チトク
ロムＣ，ミクロペルオキシダーゼ、等の鉄イオンを含む
化合物は極めて高価であり、特に多くのサンプルについ
て分析を行なう場合には多くの費用がかかってしまうと
いう課題があった。

一方、蛍光物質の化学発光による分析を行なう際には、
過酸化水素を加えた発光試薬を用いる必要があるが、過
酸化水素とシュウ酸ジエステルが反応して生成される活
性中間体の寿命は極めて短く、この結果反応液の寿命は
数時間から半日程度であった。従って、測定の度毎に反
応液を調製しなければならず、測定が煩雑であった。　
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり
、その目的は高価な試薬を使わず、しかも煩雑な反応液
調製を必要としない化学発光測定方法およびその装置を
提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 前記目的を達成するために、本出願の請求項１記載の化
学発光測定方法は、ルミノールおよび／またはイソルミ
ノールを含む塩基性緩衝液よりなる反応液と、ヒドロペ
ルオキシドを含む試料液とを、電極を内在したセル中に
導入し、前記電極に電圧を印加することを特徴とする。

また、請求項２記載の化学発光測定方法は、シュウ酸ジ
エステル化合物を含む反応液と、蛍光物質を含む試料液
とを、電極を内在したセル中に導入し、前記電極に電圧
を印加することを特徴とする 請求項３記載の化学発光測定装置は、反応液および試料
液が導入されるセルと、前記セルに対向配置された発光
検出部と、を含む。

そして、前記セル内に電極が配置されることを特徴とす
る 請求項４記載の化学発光測定装置は、セルが螺旋状に巻
回されたフローセルよりなり、電極は前記螺旋状フロー
セルに挿入された白金線よりなることを特徴とする。

［作用コ 本発明にかかる化学発光測定方法および装置によれば、
反応液および試料液が電圧印加状態で反応するので、電
解状態下で反応が行なわれ、電極近傍には反応液ないし
試料液の活性中間体が生成される。

即ち、請求項１記載の化学発光測定方法では、電極にヒ
ドロペルオキシドが達すると、ヒドロペルオキシドが変
化して活性酸素を生成し、この活性酸素がルミノールお
よび／またはイソルミノールを酸化する。

そして、酸化されたルミノールおよび／またはイソルミ
ノールは化学発光を生じ、この化学発光強度を測定する
ことによってヒドロペルオキシドを定量的に分析するこ
とができる。

一方、請求項２記載の化学発光測定方法では、電極近傍
で緩衝液から活性酸素が生成され、この活性酸素とシュ
ウ酸ジエステル化合物とが反応して活性中間体が形成さ
れる。そして、この活性中間体によって蛍光物質が励起
され、基底状態に戻る時に化学発光が生じる。

従って、化学発光強度を測定することにより、蛍光物質
の定量的分析が可能となる。

以上のように、ヒドロペルオキシドの測定に当っては、
チトクロムＣ，ミクロペルオキシダーゼ、等の鉄を含む
化合物が不用となり、安価に且つ正確なペルオキシド分
析を行なうことが可能となる。

また、請求項２記載の測定方法では、反応液に過酸化水
素を入れる必要がないので、反応液の寿命を数か月程度
に延長することが可能となる。

尚、セルを螺旋状に形成することにより、フロー法によ
る連続分析が可能となり、また電極として白金線を用い
れば耐腐食性が極めて良好となる。

［実施例］ 以下、図面に基づいて本発明の好適な実施例を説明する
。

第１図には本発明の一実施例にかかる化学発光測定装置
に用いられるセルが示されており、また第２図には化学
発光測定装置の概略が示されている。

第２図において、化学発光測定装置１０は、フローセル
１２と、発光検出器１４と、を含む。

そして、フローセル１２へは、移動相タンク１６からポ
ンプ１８およびインジェクタ２０を介して移動相が供給
されると共に、反応液タンク２２からはポンプ２４を介
して反応液が供給される。

そして、インジェクタ２０から試料液が一定量注入され
ると該試料液は移動相と共に送られ、反応液と混合され
た後フローセル１２へ供給される。

ここで、フローセル１２は第１図に拡大して示される。

同図に示すフローセル１２は、テフロンチューブを螺旋
状に巻回して構成され、同図表面に対向して発光検出器
１４が配置される。

また、フローセル１２の中心部より該フローセル１２の
流入端１２ａが裏面に突出し、最外縁より流出端１２ｂ
が同じく裏面へ向は突出している。

本発明において特徴的なことは、フローセル１２内に電
極を配したことであり、本実施例においては流入端１２
ａより白金線電極２６が挿入され、螺旋状フローセル１
２の略中央にまで至っている。

尚、前記白金線電極２６は図示を省略した電源の子端子
に接続されている。

一方、フローセル１２の流出端１２ｂには、ステンレス
パイプ２８が接続され、該ステンレスパイプは電源の一
端子に接続されている。

従って、フローセル１２の流入端１２ａより流入された
反応液は、白金電極２６およびステンレスパイプ２８の
間で電解状態に置かれることとなる。

この結果、流入液にヒドロペルオキシドが存在すれば、
白金線電極２６近傍でヒドロペルオキシドが変化して活
性酸素を生成し、この活性酸素が反応液中のルミノール
またはイソルミノールを酸化する。酸化されたルミノー
ルまたはイソルミノールは化学発光を生じ、この化学発
光強度を測定することによって前記ヒドロペルオキシド
を定量的に検出することができる。

また、流入液に蛍光物質を含む場合には、白金線電極に
おいて流入液から活性酸素が生成され、この活性酸素と
ＴＣＰＯあるいはＴＤＰＯ等のシュウ酸ジエステルとが
反応して活性中間体が常時形成されている。

従って、蛍光物質がフローセル中の白金線電極２６に至
ると、前記活性中間体によって励起された蛍光物質から
化学発光か生じる。

以上のようなフローセル１２を用いた化学発光測定装置
の要部が第３図に示されている。

同図において、フローセル１２の前面にその受光面を対
向させた発光検出部としての光電子増倍管１４が配置さ
れている。

一方、フローセル１２の裏面は円盤状の平面鏡３２に接
している。該平面鏡３２の中央にはセル固定棒３４の一
端部が螺着され、該セル固定棒３４の先端の突起３４ａ
が反射ｖ１３２の反射面３２ａより突出している。この
突起３４ａには前記第１図に示すようにフローセル１２
が渦巻き状に巻回されている。

前記フローセル１２の流入端１２ａは、平面鏡３２に設
けられた引出孔を介して電極導入部材３６に接続されて
いる。そして、白金線電極２６は前記電極導入部材３６
を介してフローセル１２内へ挿通される。

また、セル固定棒３４の中間部には中継板４０が固定さ
れ、セル固定棒３４の他端部はネジ４２によりセルパネ
ル４４が固定されている。

前記中継板４０には管継手４６．４８が固定され、また
セルパネル４４には遮光パイプ５０，５２．５３が貫通
固定されている。

そして、前記電極導入部材３６には、配管５４が遮光パ
イプ５０、管継手４６チユーブ５５を介して接続され、
フローセル１２への流入液を供給する。

一方、フローセル１２の流出端１２ｂは、管継手４８に
より配管５６に接続され、該配管５６は遮光パイプ５２
を介して外部へ引出される。

尚、前記配管５６はステンレスパイプよりなり、電源の
一端子に接続されている。

又、白金線電極２６はチューブ５７内に挿通され、遮光
バイブ５３を介して外部に引出され、電源の子端子に接
続されている。

前記電極導入部材３６の詳細な構成が第４図に示されて
いる。

同図より明らかなように、電極導入部材３６は略Ｔ字型
接続バイブよりなり、フローセル１２の流入端１２ａは
チューブ固定部材５８により、また配管５４に接続され
たチューブ５５はチューブ固定部材６２により、白金線
電極２６を挿通したチューブ５７はチューブ固定部材６
６により、それぞれ電極導入部材３６の各導入孔３６ａ
、３６ｂ、３６ｃにバッキングを介して螺合されている
。

そして、チューブ５７を介して引き入れられた白金線電
極２６は、該チューブ５７と対抗したフローセルの流入
端１２ａ内に挿通されている。

一方、チューブ５５よりの流入液は、フローセル流入端
１２ａと白金線電極２６の間隙より、フローセル１２内
へ流入する。

尚、チューブ５７は先端部が白金線電極２６と密着して
おり、チューブ５５より流入する流入液がチューブ５７
を介して外部に漏れないようになっている。

本実施例にかかる化学発光測定装置は以上のように構成
され、次に該装置を用いた実際の分析結果について説明
する。

第５図（Ａ）、（Ｂ）には前記化学発光測定装置１０を
用いたヒドロペルオキシドの分析例が示されている。

ここで、同図（Ａ）はヒドロペルオキシドを添加してい
ないブランクの分析結果を示し、同図（Ｂ）はヒドロペ
ルオキシドとして過酸化水素２０ｎｇ（注入容量＝２μ
λ、試料溶媒：水）を添加したサンプルの分析結果を示
す。

尚、測定条件は以下の通りである。

移動相：水 移動相流量：０．５　ｍｌ／ｍｉｎ 反応液：　２ｘ　１０−’Ｍルミノール１０．ＩＭホウ
酸緩衝液、　　ｐＨ１０，５ 反応液流Ｑ　：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎｌ／ｍ上ル：フ
ッ素樹脂性チューブ。

内径０　、５ｍｍ、外径１　、５ｍｍ、長さ４７０ｍｍ
白金線電極：外径０　、３ｍｍ、長さ２５０ｍｍ印加電
圧＝３Ｖ アッテネーション：１６ ゲイン：×１０ 使用機器：日本分光工業株式会社製　化学発光分析装置
８２５−ＣＬ型のセル部を 改造したもの 第５図（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、反応液に同
等チトクロムＣあるいはミクロペルオキシダーゼ、等の
鉄イオンを含む化合物など高価な試薬を含まないにもか
かわらず、極めて明瞭な分析結果が示されている。

このように、本実施例にかかる装置によれば、比較的安
価な試薬のみを用いてヒドロペルオキシドの正確な定量
測定を行なうことが可能となる。

尚、電極への印加電圧については、ＯＶ〜６Ｖまで１．
５ｖ単位で変化させ最適値を３■と判定した。

即ち、印加電圧を上げていくにつれて、ピークの高さと
ベースラインの位置が両者共高くなり、同時にベースラ
インのノイズも大きくなった。

Ｓ／Ｎ　（シグナル／ノイズ）比が最も良かったのは３
ｖであり、Ｏｖではピークは得られなかった。

第５図（Ｃ）、（Ｄ）には前記同様の化学発光測定装置
を用いて蛍光物質を測定した例が示されている。　即ち
、同図（Ｃ）はブランクとして２μｍのアセトニトリル
を添加した分析結果が示され、同図（Ｄ）は蛍光物質と
してダンジルアスパラギン酸（Ｉ）ｎｓ−Ａｓｐ）を２
００ｎｇ（注入容量：２μｌ、試料溶媒ニアセトニトリ
ル）を注入して分析した結果が示されている。

尚、測定条件は以下の通りである。

移動相：　５０ｍＭ　　イミダゾール緩衝液、　　ｐＨ
６，０／アセトニトリル（７５／２５） 移動相流量：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ 反応液Ｈ０，５ｍＭ　　ＴＣＰＯ／アセトニトリル反応
液流量：　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ ｌ／ｍ上ル：フッ素樹脂性チューブ。

内径０　、５ｍｍ　、外径１．５ｍｍ、長さ４７０ｍｍ
白金線電極：外径０　、３ｍｍ、長さ２５０ｍｍ印加電
圧：６Ｖ アッテネーション：８ ゲイン：Ｘ１００ 使用機器二日本分光工業株式会社製　化学発光分析装置
８２５−ＣＬ型のセル部を 改造したもの 以上の分析結果から明らかなように、発光試薬に同等過
酸化水素を含むことなく極めて良好な蛍光物質の分析を
行なうことが可能となる。

従って、発光試薬の寿命を従来の数時間から数か月程度
に延すことが可能となり、分析操作を容易とすることが
できる。

尚、電極への印加電圧については、Ｏｖ〜６Ｖまで１．
５ｖ単位で変化させ最適値を６Ｖと判定した。

即ち、印加電圧を上げていくにつれて、ピークの高さと
ベースラインの位置が両者共高くなり、同時にベースラ
インのノイズも大きくなった。

Ｓ／Ｎ　（シグナル／ノイズ）比が最も良かったのは６
Ｖであり、ｏＶではピークは得られなかった。

尚、前記各実施例においてはフローセル内に挿入配置す
る電極を白金線電極とした例について説明したが、これ
に限られるものではなく、移動相溶媒や試料に腐食され
ない材料を選択することが可能である。

例えば金、銀、チタンも使用可能であり、また銅や鉄の
基材に白金あるいは金をメツキしたものでもよい。

［発明の効果コ 以上説明したように、本発明にかかる化学発光測定方法
および測定装置によれば、以下のような効果を得ること
ができる。

請求項１記載の化学発光測定方法によれば、高価な鉄イ
オンを含む化合物等を用いることなくヒドロペルオキシ
ドの検出が可能となったので、分析に要する費用を大幅
に低減することが可能となる。

請求項２記載の化学発光測定方法によれば、過酸化水素
を用いることなく蛍光物質の化学発光測定を行なうこと
が可能となったので、安定性のよい発光試薬を調製する
ことができ、蛍光物質を容易且つ迅速に、しかも安定性
よく検出することができる。

請求項３ないし４記載の化学発光測定装置によればセル
内に電極を配置することとしたので、セル内に電解状態
を形成することが可能となり、化学発光に必要な活性物
質を別途添加する必要がなくなる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかる化学発光測定装置に用いられる
フローセルの説明図、 第２図は本発明にかかる化学発光測定装置の概略構成の
説明図、 第３図は第１図に示したフローセルを用いた化学発光測
定装置の要部説明図、 第４図は第３図に示した化学発光測定装置に用いられる
電極導入部材の説明図、 第５図は本発明にかかる化学発光測定装置を用いた分析
結果の説明図である。 Ｏ・・・化学発光測定装置 ２・・・フローセル ４・・・発光検出器 ６・・・白金線電極 ８・・・ステンレスパイプ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ルミノールおよび／またはイソルミノールを含む
   塩基性緩衝液よりなる反応液と、ヒドロペルオキシドを
   含む試料液とを、電極を内在したセル中に導入し、前記
   電極に電圧を印加することを特徴とする化学発光測定方
   法。
2. （２）シュウ酸ジエステル化合物を含む反応液と、蛍光
   物質を含む試料液とを、電極を内在したセル中に導入し
   、前記電極に電圧を印加することを特徴とする化学発光
   測定方法。
3. （３）反応液および試料液が導入されるセルと、前記セ
   ルに対抗配置された発光検出部と、 を含み、前記セル内に電極が配置されることを特徴とす
   る化学発光測定装置。