JP3074361B2 - 定量分析装置 - Google Patents

定量分析装置

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JP3074361B2 JP04188243A JP18824392A JP3074361B2 JP 3074361 B2 JP3074361 B2 JP 3074361B2 JP 04188243 A JP04188243 A JP 04188243A JP 18824392 A JP18824392 A JP 18824392A JP 3074361 B2 JP3074361 B2 JP 3074361B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、医学、薬学、化学分
析、食品工業分野における酵素反応を利用した定量分析
を行う装置に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、酵素反応により定量分析を行う装
置としては、酵素フローインジェクション分析装置が一
般的である。これは、図5に示されるようにキャリヤー
9の流れをつくるためのポンプ7、キャリヤーの流れの
中に一定量の試料を導入する試料導入器8、酵素を固定
化した充填剤を充填し、試料中に含まれる測定対象物質
と酵素反応を行わせる酵素反応部3、酵素反応生成物の
量もしくは酵素反応に伴うキャリヤー中の物質量の変化
を検出する検出部5から構成される。検出部には、物質
の吸光量により定量を行う吸光度検出器、物質を電極に
より電気化学的に酸化還元してその時流れる酸化還元電
流から定量を行う電気化学検出器などが用いられる。
【0003】また、酵素フローインジェクション分析装
置の検出器として、化学発光反応を利用して定量を行う
ものも考案されており、図6に示されるような構成の化
学発光検出器が市販されている。これは、酵素フローイ
ンジェクション分析装置における酵素反応部3の後に化
学発光試薬2を導入するポンプ7、酵素反応生成物と化
学発光試薬を混合する混合器19、化学発光を検出する
渦巻型フローセル20および化学発光量を電気信号に変
換する光電子増倍管21を設置した構成となっていた。
【0004】これらの酵素フローインジェクション分析
装置で各ユニットはすべて別体の部品であり、使用する
場合はこれらを適当に組み合わせ、配管や配線で接続し
て用いている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の酵素フ
ローインジェクション分析装置では、各ユニットが別体
の部品で配管により接続した構成、特に酵素反応カラム
と検出器が別体の部品であることや、酵素カラムや検出
部が機械加工により作製されており微小化に限界がある
ことなどから、酵素反応カラムで生成した物質が検出部
へ流れていく間に拡散してしまい、微量試料の定量や低
能度領域における測定が困難であった。
【0006】また、検出器が吸光度検出器である場合は
光源が必要で装置の小型化が難しい、電気化学検出器で
は試料中に含まれる電極活性物質により妨害を受けやす
い、などの問題点を有していた。また、装置の全容積が
ある程度大きくなるため、測定時にはキャリヤーの流量
を1ml/min前後としなければならず、連続測定を
行った場合に試薬の消費量が多くなるという問題も有し
ていた。
【0007】また、従来の化学発光検出を利用する方法
も同様に酵素反応カラムで生成した物質が混合器に流れ
ていく間に拡散してしまったり、混合器内で発生した化
学発光が、検出部である渦巻型フローセルへ移動する間
に減衰してしまうために微量試料の定量や低濃度領域に
おける測定が困難であるという問題や、キャリヤーおよ
び化学発光試薬の消費量が多くなるという問題があっ
た。
【0008】また、これに加えて、酵素反応カラム、混
合器および渦巻型フローセルの作製に機械加工を伴うた
め、微小化に限界があったり、精密な加工を要するため
に費用がかかるという問題点があった。そこで、この発
明の目的は、酵素反応部、混合部、および検出部を一枚
の基板上に集積化し、従来のこのような課題を解決した
定量分析装置を得ることである。
【0009】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
にこの発明の定量分析装置は、検出手段として化学発光
反応を利用している。これにより、検出用の光源が不要
になり容易に装置の小型化が行えること、および試料中
の妨害物質の影響を少なくすることが可能となった。
【0010】また、同時に酵素反応部、混合部、および
検出部を同一の基板上に構成し、酵素反応部から検出部
までの距離を最短にして、物質の拡散や発光の減衰を最
小限に抑えている。同時に装置の全容積を小さくしてキ
ャリヤーおよび発光試薬の消費量を少なくしている。さ
らに、これらを作製するために機械加工ではなくシリコ
ン基板の異方性エッチングを用いることにより、多数個
を同時に加工できるため安価に作製が行えるようにし
た。
【0011】
【作用】上記のように構成された定量分析装置において
は、酵素反応部において試料中に含まれる測定対象物質
が基質として酵素反応により消費され、別の物質が生成
する。さらに混合部において、酵素反応生成物が化学発
光試薬と混合され、特定波長の光が発生する。その後、
検出部を流れていく間に、フォトダイオードや光電子増
倍管により、光の強弱が電気信号(電流値、電圧値)の
強弱へ変換される。この電気信号の強弱は、化学発光強
度を反映しており、化学発光強度は酵素反応生成物の量
に依存している。
【0012】また、当然ながら酵素反応生成物量は、も
ともと試料中に含まれていた基質(測定対象物質)量に
依存しているので、結局、測定された電気信号の強弱
は、測定対象物質の濃度を反映していることとなる。ま
た、酵素反応部、混合部、検出部を同一基板上に構成
し、酵素反応部から検出部までの距離を最短にすること
により、物質の拡散や発光の減衰を最小限に抑えること
が可能となった。
【0013】
【実施例】以下に、この発明の実施例を図面に基づいて
説明する。 (実施例1)図1は本発明の定量分析装置の模式図であ
る。
【0014】図1において、試料導入器8により一定量
計量された試料1は、キャリヤー9中に導入され、ポン
プ7により酵素反応部3へと送られる。酵素反応部3で
試料中に含まれるある特定物質が酵素反応により消費さ
れ、別の物質が生成する。この酵素反応生成物は混合部
4へと送られ、ポンプ7により送られてくる化学発光試
薬2と混合し、化学発光反応が起こる。その後混合され
た液体は検出部5へと移動する。検出部5を流れていく
間に、外部に設置したフォトダイオード6により化学発
光量が電気信号へと変換される。この電気信号の強度
は、試料1中に含まれていた測定対象物質の濃度を反映
しているため、定量を行うことが可能である。
【0015】図2は本発明の定量分析装置の具体的な構
造の例を示す図である。本発明の定量分析装置はシリコ
ン基板18とガラス基板17が接合した構造となってい
る。シリコン基板上にはキャリヤー導入口10、化学発
光試薬導入口11、酵素反応部12、混合部13、およ
びフローセル部14が設けられている。酵素反応部12
中には表面に酵素を固定化した酵素固定化充填剤15が
充填されている。また、化学発光を電気信号に変換する
ためのフォトダイオード16がフローセル部の真上に設
置されている。測定時には、キャリヤー導入口から試料
を含むキャリヤーをポンプにより導入する。酵素反応部
で酵素反応により試料中の測定対象物の量に依存した酵
素反応生成物が生成し、混合部において化学発光試薬導
入口より導入された化学発光試薬と混合する。
【0016】そこで生じた化学発光が、フローセル部を
流れていく間に外部に設置したフォトダイオードにより
測定される。ここでは、発光量を測定するためにフォト
ダイオードを用いたが、フォトダイオードのかわりに光
電子増倍管を用いても同様の測定を行うことができる。
【0017】(実施例2)本実施例では、本発明の定量
分析装置を用いて酵素反応部にグルコースオキシダーゼ
を固定化した充填剤を充填し、試料中に含まれるグルコ
ースの定量を行った結果について説明する。
【0018】図1において、表面にグルコースオキシダ
ーゼを3−アミノプロピルトリエトキシシランとグルタ
ルアルデヒドを用いてシッフ結合により固定化した直径
100μmのガラスビーズを酵素反応部3に充填し、キ
ャリヤー9にpH7のリン酸緩衝溶液をポンプ7により
20μl/minで、化学発光試薬2に0.47mmo
l/lのルミノールと6.7mmol/lのフェリシア
ン化カリウムを含む溶液を使用し、ポンプ7により60
μl/minで供給した。試料導入器8では0.2μl
のサンプルを計量し、キャリヤー中に導入した。種々の
グルコース濃度に対する応答値をグラフ化した本発明の
定量分析装置の検量線を図3に示す。10mg/dl〜
300mg/dlの濃度範囲で、グルコース濃度と応答
値の間に直線関係が成り立った。
【0019】さらに、この結果に基づき血清中のグルコ
ースの測定を行ったところ、市販の臨床検査用グルコー
ス測定キットとよい相関をもつ測定値を得ることができ
た。また、1回の測定に要する時間は約1分であり、こ
の時使用するキャリヤーの量は約20μl、化学発光試
薬の量は約60μlであった。
【0020】(実施例3)本実施例では、本発明の定量
分析装置を用いて酵素反応部に乳酸オキシダーゼを固定
化した充填剤を充填し、試料中に含まれる乳酸の定量を
行った結果について説明する。
【0021】図1において、表面に乳酸オキシダーゼを
3−アミノプロピルトリエトキシシランとグルタルアル
デヒドを用いてシッフ結合により固定化した直径100
μmのガラスビーズを酵素反応部3に充填し、キャリヤ
ー9にpH7のリン酸緩衝溶液をポンプ7により20μ
l/minで、化学発光試薬2に0.47mmol/l
のルミノールと6.7mmol/lのフェリシアン化カ
リウムを含む溶液を使用し、ポンプ7により60μl/
minで供給した。試料導入器8では0.2μlのサン
プルを計量し、キャリヤー中に導入した。
【0022】種々の乳酸濃度に対する応答値をグラフ化
した本発明の定量分析装置の検量線を図3に示す。4.
5mg/dl〜45mg/dlの濃度範囲で、乳酸濃度
と応答値の間に直線関係が成り立った。さらに、この結
果に基づき血清中の乳酸の測定を行ったところ、市販の
臨床検査用乳酸測定キットとよい相関をもつ測定値を得
ることができた。また、1回の測定に要する時間は約1
分であり、この時使用するキャリヤーの量は約20μ
l、化学発光試薬の量は約60μlであった。
【0023】
【発明の効果】本発明の定量分析装置では、酵素反応
部、混合部、検出部を一体化してエッチングにより作製
したため、各部を接続するために必要な死体積を従来の
定量分析装置に比較して小さくするすることができたと
同時に、装置の全容積も小さくすることが可能となっ
た。これにより、微量の試料が死体積で拡散することも
なく、試薬消費量も1回の測定で数十μlとすることが
できた。また、吸光度検出器などを利用する場合に比較
して光源が不要なため装置の小型化が可能となり、さら
にエッチングで多数個を一括して作製することにより、
作製コストも低減することができた。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の定量分析装置の模式図である。
【図2】本発明の定量分析装置の構造を具体的に示す図
である。
【図3】本発明の定量分析装置のグルコースに対する検
量線を示す図である。
【図4】本発明の定量分析装置の乳酸に対する検量線を
示す図である。
【図5】酵素フローインジェクション分析装置の模式図
である。
【図6】従来の化学発光検出器の構造を示す模式図であ
る。
【符号の説明】
1 試料 2 化学発光試薬 3 酵素反応部 4 混合部 5 検出部 6 フォトダイオード 7 ポンプ 8 試料導入器 9 キャリヤー 10 キャリヤー導入口 11 化学発光試薬導入口 12 酵素反応部 13 混合部 14 フローセル部 15 酵素固定化充填剤 16 フォトダイード 17 ガラス基板 18 シリコン基板 19 混合器 20 渦巻型フローセル 21 光電子増倍管

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 液体中に含まれる物質を、酵素反応及び
    化学発光反応を利用して、化学発光量により定量を行う
    分析装置において、酵素反応を行う酵素反応部、酵素反
    応生成物と化学発光試薬とを混合して化学発光反応を誘
    発させる混合部、化学発光の検出を行う検出部から構成
    され、前記酵素反応部と前記混合部と前記検出部および
    これらを相互に接続する流路を同一基板上に一対で形成
    し、前記酵素反応部が、前記基板に設けた凹部に酵素を
    固定化した媒体を設置した構造を有し、前記酵素反応部
    を液体が通過することにより液対中に含まれる特定の物
    質から化学発光反応を生じせしめる化学発光原物質を生
    成し、前記化学発光原物質が前記混合部に移送され、前
    記混合部において前記化学発光原物質と化学発光試薬が
    混合され、さらに前記検出部において化学発光量が測定
    される構造を有することを特徴とする定量分析装置。
  2. 【請求項2】 前記基板がシリコン単結晶板とガラス板
    を接着した基板であり、前記酵素反応部、前記混合部、
    前記流路が前記シリコン単結晶板上にエッチングにより
    製作された請求項1記載の定量分析装置。
  3. 【請求項3】 前記検出部が前記シリコン単結晶基板上
    にエッチングにより製作したフローセル、および外部に
    設置したフォトダイオードもしくは光電子増倍管で構成
    される請求項2記載の定量分析装置。
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