JPS63212868A - ３−ヒドロキシ酪酸分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は溶液中たとえば血中の３−ヒドロキシ酪酸の
分析装置に関する。

（ロ）従来技術 ３−ヒドロキシ酪酸は一般にケトン体と総称される化合
物の１つであジ、糖質の供給不足や利用障害等において
脂肪酸酸化が亢進して血中及び尿中のケトン体が増加す
る。それゆえ、このケトン体が糖尿病の病体把握に有用
な指標となることが知られている。特に病的な場合に主
として血中で増加する３−ヒドロキシ酪酸が糖尿病の診
断と治療の有用な指標として注目されている。

従来、血中の３−ヒドロキシ酪酸量は３−ヒトミキシ酪
酸？＝−ｚチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
　）の存在下、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によシア
七ト酢酸と吸光物質（ＮＡＤＨ）に変化させ、このＮＡ
ＤＨの生成量を波長３４０ｍｍ　で紫外吸光測定するこ
とにより求めている。以下にこの反応式を示す。

３−ヒト“ロキシ酪酸＋ＮＡＤ＋ へ二上！！２で１リリ町−町！芝　アセト酢酸子ＮＡＤ
Ｈ＋Ｈ＋（Ｗｉ　　Ｉｌｉａｍｓｏｎ＋　　Ｉ）、Ｈ＊
　　＊　　ｅｔ　　　ａｌ　　ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、
Ｊ、　　。

翌、　９０　（１９６２）） この方法による血中３−ヒドロキシ酪酸の測定のための
試薬キット（「ケトンテストＢＪ−三和化学研究所）が
既に販売されてお９．自動生化学分析装置により測定が
行われている。しかしながら。

一般的に吸光度測定は噴出ｒｅ、度が低く、３−ヒドロ
キシ酪ｕ１ヲ紫外＠収測定に工って検出する従来の方法
で高感度測定のためＫは必然的に検査に必要な血液を多
く採収しなければならなかった。通常、自動生化学分析
装置による測定では２０〜４０μｊの血清を必要として
いる。

また９ｇ＆光度測定の場合には、酵素反応前後における
吸光度差上京めるといり測定操作が必要であり、このた
め自動生化学分析装置では分析チャンネルのほかにプラ
ンクチャンネ１ｖ１ｉ−設け、検体ブランクとして同量
の余分の血清を必要とした。

ン１目　的 この発明は、上記問題点に鑑み、微量の血清でその血中
の３−ヒドロキシ酪ｅｋ高感度に測定できるように工夫
した分析袋Ｎを提供すること全目的とするものである。

に）構　成 この発明の３−ヒドロキシ酪酸分析装置は。

在来の３−ヒドロキン酪酸脱水素反応部にさらに同反応
部からの反応生成物（ＮＡＩ）Ｈ）　　ｋ酸化反応させ
る反応部を付加し、この反応部の下流側に化学発光試薬
上供給する流路機構および発光強度を測定する検出手段
を設けてなる構成である６また好ましくは、３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素反応部とＮＡＤＨ酸化反応部は３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素Ｌ３−ＨＢＤＨ）とＮＡＤＨ酸化
酵素（ＮＡＤＨＸＤ）の両酵素金混合して固定化した単
一の酵素固定化カラムで構成される。この単一の酵素固
定化カラムは１個々の酵素をそれぞれ固定化したガラス
ピーズを混合して単一のカラムに充てんするか、あるい
は酵素固定化の段階で両酵素を混合して固定化シタガラ
スピーズ全単一のカラムに充てんすることにより作られ
る。

この発明の分析装置によれば３−ヒドロキシ酪酸に以下
の反応系により検出される。

３−ヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ” ３−ＨＢ　Ｄ　Ｈア七ト酢酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ−−−（１
３ＮＡＤ）ｉ＋０２十Ｈ” 襲史胚ミＮＡＤ　＋Ｈ２Ｏ２−一・−−”−一”（２）
〃ミノーリレ すなわち、溶液中の３−ヒドロキシ酪酸はＮＡＤ＋の存
在下３−ＨＢＤＨによりアセト酢酸とＮＡＤＨに変換さ
れ〔（１）の反応３１次いで生成したＮＡＤＨにＮＡＤ
ＨＸＤにより酸化され過酸化水素（Ｈ２０ｚ）を生じ（
（２）Ｏ反応）　、　コ（ＤＨ２０２はフェリシアン化
カリの存在下ルミノールと反応し、かかる反応によって
生成した 祖４ 光強度検出器で測定される。

発光強度検出器からの出力口舌は、Ａ／Ｄ変換され。

マイクロコンピュータにて３−とドロキシ酪酸濃度の演
算がおこなわれる。

怜）実施例 この発明の分析装置を図面に示す一実施例によって説明
する。

第１図はこの発明の好適な一５Ｊ！施例の３−ヒドロキ
シ酪酸分析装置の構成説明図である。

移動相１の入った移動相容器２．移動相送液ポンプ３．
試料４の入つた試料容器５と試料導入部６と試料吸引ポ
ンプ７とからなる試料分注器８゜３−　ＨＲＤＩ（とＮ
ＡＤＨＸＤの両酵素を固定化した単一の固定化カラム９
．及、びデータ処理器ｌｏ付きの化学発光強度検出器１
１がこの順に導管で連結され。

検出器１１には廃液路１２が設けられている。

さらにルミノー７に４１３の入った！レミノーμ液容器
１４とルミノール液送液ポンプ１５とを具備するルミノ
ール液流路１６．フェリシアン化カリ溶液１７の入った
フェリシアン化カリ溶液容器１８とフェリシアン化カリ
溶液送液ポンプ１９とを具！ＩＦ−ｊるルミノール流路
２０とが混合コイ／ｌ／２１に連結されてなる化学発光
試薬流路機構２２の出口部２３が、固定化力ツム９と検
出器１１との間の導管に連結されている。

なお図面には記載していないが、試料分注器８および固
定化力ラムヲ３７±０５℃に保持するための自動温度調
節器が設けられている〇 以下、上記突施例の分析装置音用いて血中の３−ヒドロ
キシ酪＃に分析する場合の手順を述べる。

１ず、移動相１．／Ｉ／ミノール溶液１３．フェリシア
ン化カリ溶液１７をそれぞれの送液ポンプ３　、１５゜
１９で送り、かつ試料分注器８および固定化カラム９全
３７±０．５℃に保持し、定常状態にしておき、かかる
状態で試料容器５の血清全吸引ポンプ７で吸引して試料
導入部６より導入する。導入された試料は酵素固定化カ
ラム９を通過し、前述した反応系（１）　（２）によジ
Ｈ２Ｏ２全生じ、しかる後このＨ２Ｏ２は前述した反応
系（３）（４）によりフェリシアン化カリの存在下反応
し、かかる反応によって生成した反応液の発光強度が検
出器１１で検出され、この検出器１１からの検出信号に
よジデータ処理器１０で血清中の３−ヒドロキシ酪酸濃
度が算出される。

分析条件の一例を示せば以下の通りである。

１、試料溶液　　　　血清２μ１ ２、移動相 リン酸塩緩衝液（ｐＨ７〜８）にＮＡＤ＋５ｍｇ／ｄｌ
を加えた溶液 流量　０．５〜１゜Ｑｍｌ／ｍ１ｎ ３、ルミノール溶液 ７Ｘ１０　　Ｍ／１ 流量　０．５〜１．０　ｍｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ４．７エ
リシアン化カリ溶液 ２　Ｘ　１０−２Ｍ／ｌ 流量　０．５〜１．０ｍＪ　／　ｍｉ　ｎ５、混合コイ
ル 内径１履長さ１だのテフロンチューブ ６データ処理器 Ｍ クロマトパック　　（島津製作所製ン なお、酵素固定化カラム９は次の要領で作成したＯ アルコキシドガヲヌをγ−アミノプロピルトリエトキシ
シランによりアミノプロピル化シ、グｐタルアルデヒド
により活性化してこれ９３−ＨＢＤＨ。

ＮＡＤＨＸＤが溶解された０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に加え脱気後、４℃で一夜反応させて両酵素全
混合固定化した担体全作成し、これを単一のカラムに充
てんした。

（へ）効　果 この発明の分析装置によれば、化学発光強度により測定
するものであるから微量の血清でも血中の３−ヒドロキ
シ酪酸を高感度に測定することができ、検体ブランクを
測定する必要もなく、効果的な３−ヒドロキシ酪酸の分
析が達成される。

また、３−ヒドロキシ酪酸脱水素反応部とＮＡＤＨ酸化
反応部を３−ＨＢＤＨとＮＡＤＨＸＤの両酵素全混合し
て固定化した単一の酵素固定化カラムで構成すれば、装
置構造が簡素化され、酵素劣化の場合のカラム交換作業
も容易におこなうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の好適な一実施例の３−ヒドロキシ酪
酸分析装置の構成説明因である。 １・・・移動相　　　　　３・・・移動相ポンプ６・−
試料導入部　　　７・−・試料吸引ポンプ８・・・試料
分注器 ９・・・３−ＨＢＤＨおよびＮＡＤＨＸＤ固定化カラム
１１・・・化学発光強度検出器 １３−・・ルミノール溶液 １７・・−フェリシアン化カリ溶液 ２１・・・混合コイル

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶液中の３−ヒドロキシ酪酸とニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＾＋）を３−ヒドロキシ酪
   酸脱水素酵素により反応させ、かかる反応によって生じ
   た物質（ＮＡＤＨ）を測定することにより３−ヒドロキ
   シ酪酸の分析を行う装置において、前記反応部から流出
   する反応生成物（ＮＡＤＨ）を酸化反応させる反応部を
   備え、この反応部の下流側に化学発光試薬を供給する流
   路機構と発光強度を測定する検出手段を設けたことを特
   徴とする３−ヒドロキシ酪酸分析装置。 ２、前記３−ヒドロキシ酪酸脱水素反応部とＮＡＤＨ酸
   化反応部が、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素とＮＡＤＨ
   酸化酵素を混合して固定化した単一の酵素固定化カラム
   にて構成された特許請求の範囲１項記載の３−ヒドロキ
   シ酪酸分析装置。