JPS595000B2 - 固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法 - Google Patents
固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法Info
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- JPS595000B2 JPS595000B2 JP7261880A JP7261880A JPS595000B2 JP S595000 B2 JPS595000 B2 JP S595000B2 JP 7261880 A JP7261880 A JP 7261880A JP 7261880 A JP7261880 A JP 7261880A JP S595000 B2 JPS595000 B2 JP S595000B2
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- Japan
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- enzyme
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- biochemical analysis
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Description
【発明の詳細な説明】
５ この発明は固定化酵素カラムを用いた生化学分析方
法に関し、特に胆汁酸・抱合胆汁酸を好適に分析する方
法を提供する。
法に関し、特に胆汁酸・抱合胆汁酸を好適に分析する方
法を提供する。
生体内の化学物質の定量ないし定性が多々行われるよう
になつてきた。
になつてきた。
その代表的な一例として、１０胆汁の機能に関連した疾
病の際に、生体液中の遊離および抱合胆汁酸の定性ない
し定量的変化を測定することの重要性が増している。一
般に、その分析には、ガスクロマトグラフィー、薄層ク
ロマトグラフィーあるいは高速液体クロマトグラフィ１
５−の技法を用いることが知られているが：いずれも感
度、精度、操作性などの点で問題があり、あまり行われ
ていない。一方、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す。）を用いる酵素法
が、感度もよく比較的に操’０ 作が容易なためかなり
使用されてきている。しかしながら、この酵素法では、
酵素を試薬液として使用するので酵素を比較的大量に要
し、また一回の使用で廃棄せざるを得なかつた。すなわ
ち高価な酵素を大量に消費する欠点があつた。！５ こ
の発明は、酵素法の利点を最大限に利用しつつ、上記欠
点を解消した生化学分析方法を与える。つまり、この発
明方法によれば、酵素の使用量が少量でしかも酵素を繰
返し使用できる。かくして、この発明によれば、試料を
高速液体■ｏ クロマトグラフィーに付してその分離カ
ラムを通過させ、次いで分離成分をキャリヤー液と共に
所定酵素を固定化した多孔質ガラスビーズを充填もしく
は保持した固定化酵素カラムに導入し、一方この固定化
酵素カラム中で所定試薬を導入して酵１５素反応を起こ
させ、その酵素反応生成物を定量測定して試料の定量を
する固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法が提供さ
れる。
病の際に、生体液中の遊離および抱合胆汁酸の定性ない
し定量的変化を測定することの重要性が増している。一
般に、その分析には、ガスクロマトグラフィー、薄層ク
ロマトグラフィーあるいは高速液体クロマトグラフィ１
５−の技法を用いることが知られているが：いずれも感
度、精度、操作性などの点で問題があり、あまり行われ
ていない。一方、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す。）を用いる酵素法
が、感度もよく比較的に操’０ 作が容易なためかなり
使用されてきている。しかしながら、この酵素法では、
酵素を試薬液として使用するので酵素を比較的大量に要
し、また一回の使用で廃棄せざるを得なかつた。すなわ
ち高価な酵素を大量に消費する欠点があつた。！５ こ
の発明は、酵素法の利点を最大限に利用しつつ、上記欠
点を解消した生化学分析方法を与える。つまり、この発
明方法によれば、酵素の使用量が少量でしかも酵素を繰
返し使用できる。かくして、この発明によれば、試料を
高速液体■ｏ クロマトグラフィーに付してその分離カ
ラムを通過させ、次いで分離成分をキャリヤー液と共に
所定酵素を固定化した多孔質ガラスビーズを充填もしく
は保持した固定化酵素カラムに導入し、一方この固定化
酵素カラム中で所定試薬を導入して酵１５素反応を起こ
させ、その酵素反応生成物を定量測定して試料の定量を
する固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法が提供さ
れる。
ハーー
この発明による生化学分析方法の特徴のひとつは、高速
液体クロマトグラフイ一を利用し、その分離カラムの後
に固定化酵素カラムを組合わせて酵素反応を起こさせる
新しい技法を用いることである。
液体クロマトグラフイ一を利用し、その分離カラムの後
に固定化酵素カラムを組合わせて酵素反応を起こさせる
新しい技法を用いることである。
更に他の特徴のひとつは酵素が固定化された多孔質ガラ
スビーズを細管カラムに充填もしくは保持したビーズ型
固定化酵素カラムを利用することである。
スビーズを細管カラムに充填もしくは保持したビーズ型
固定化酵素カラムを利用することである。
以下、図に示す装置１によつてこの発明を詳説する。
なお、説明の都合上試料として胆汁酸・抱合胆汁酸含有
試料を用いる場合について述べる。しかし、この発明が
これに限定されるものではない装置１において、キヤリ
ヤ一液２、送液ポンプ３、分離カラム４および試料導入
口５により高速液体クロマトグラフ部Ｌが構成されてお
り、分離カラム４はオーブン６で５５℃に保たれている
。
試料を用いる場合について述べる。しかし、この発明が
これに限定されるものではない装置１において、キヤリ
ヤ一液２、送液ポンプ３、分離カラム４および試料導入
口５により高速液体クロマトグラフ部Ｌが構成されてお
り、分離カラム４はオーブン６で５５℃に保たれている
。
これら各要素の詳細は以下のようである。キヤリヤ一液
２； ０．０２ＭＫＨ２Ｐ０４（ＰＨ２．５），５５／エタノ
ール，４５ 送液ポンプ３： 島津製作所 ＨＰＬＣＬＣ−３Ａ 分離カラム４： ＤｕＰＯｎｔ８．ＺＯｒｂａｘＣ８ ４，６ｍｌｎＩ．Ｄ．×１５０龍 オーブン６； 島津製作所 ＣＴＯ−２Ａカラムオーブン試薬７は送液
ポンプ８を介して前記高速液体クロマトグラフ部Ｌの出
口側に合流されている。
２； ０．０２ＭＫＨ２Ｐ０４（ＰＨ２．５），５５／エタノ
ール，４５ 送液ポンプ３： 島津製作所 ＨＰＬＣＬＣ−３Ａ 分離カラム４： ＤｕＰＯｎｔ８．ＺＯｒｂａｘＣ８ ４，６ｍｌｎＩ．Ｄ．×１５０龍 オーブン６； 島津製作所 ＣＴＯ−２Ａカラムオーブン試薬７は送液
ポンプ８を介して前記高速液体クロマトグラフ部Ｌの出
口側に合流されている。
試薬７および送液ポンプ８の詳細は以下のようである。
試薬７； トリス緩衝液（ＰＨ８．５） ２００ｍｍ０１／ＥＮＡ
ＤｌｍｍＯｌ／ｅジチオトレイトール ６．５
ｍｍ０１／ｅトリトンＸ−１０００．４％送液ポンプ８
； 島津製作所 ＨＰＬＣＬＣ−３Ａ 固定化酵素カラム９は、分離成分およびキヤリヤ一液と
試薬の合流した液が流入するように、前記高速液体クロ
マトグラフ部Ｌの出口側の前記試薬の合流点の後に接続
されており、室温にされている。
試薬７； トリス緩衝液（ＰＨ８．５） ２００ｍｍ０１／ＥＮＡ
ＤｌｍｍＯｌ／ｅジチオトレイトール ６．５
ｍｍ０１／ｅトリトンＸ−１０００．４％送液ポンプ８
； 島津製作所 ＨＰＬＣＬＣ−３Ａ 固定化酵素カラム９は、分離成分およびキヤリヤ一液と
試薬の合流した液が流入するように、前記高速液体クロ
マトグラフ部Ｌの出口側の前記試薬の合流点の後に接続
されており、室温にされている。
固定化酵素カラム９は、粒子サイズ約１００メツシユ、
表面積２００イ／９、細孔サイズ１００λの多孔質カラ
スビーズ１１に、酵素３α−ＨＳＤｌ２を固定化し、こ
れを内径２．１１１，長さ１００１１のステンレス直管
１３に充填したものである。
表面積２００イ／９、細孔サイズ１００λの多孔質カラ
スビーズ１１に、酵素３α−ＨＳＤｌ２を固定化し、こ
れを内径２．１１１，長さ１００１１のステンレス直管
１３に充填したものである。
多孔質ガラスビーズ１１への酵素３α−ＨＳＤｌ２の固
定化は、公知のウイートオル法（Ｗｅｅｔ−Ａｌｌｍｅ
ｔｈＯｄ）による。すなわち、多孔質ガラスとγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランを反応させて多孔質ガラ
スにアミノアルキル基を導入し、これにグルタルアルデ
ヒドを介して酵素を結合させるものである。ステンレス
直管１３への多孔質カラスビーズ１１の充填は、通常の
液体クロマトグラ・フ用の充填カラムの作成と同様に５
ｄ／ＭｉＲ．以上の大流量下でスラリー充填したもので
ある。固定化酵素カラム９の出口側には、けい光光度検
出器１０が接続されている。けい光光度検出器１０の詳
細は以下のようである。けい光光度検出器１０； 島津製作所 ＲＦ−５００ＬＣＡ けい光スペクトロモニタ 励起波長 ３５０ｎｒｎ 放出波長 ４６０ｎｒｒ１ 胆汁酸・抱合胆汁酸試料を試料導入口５より導入すると
、試料は分離カラム４で各成分に分離され、キヤリヤ一
液と共に固定化酵素カラム９に導入される。
定化は、公知のウイートオル法（Ｗｅｅｔ−Ａｌｌｍｅ
ｔｈＯｄ）による。すなわち、多孔質ガラスとγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランを反応させて多孔質ガラ
スにアミノアルキル基を導入し、これにグルタルアルデ
ヒドを介して酵素を結合させるものである。ステンレス
直管１３への多孔質カラスビーズ１１の充填は、通常の
液体クロマトグラ・フ用の充填カラムの作成と同様に５
ｄ／ＭｉＲ．以上の大流量下でスラリー充填したもので
ある。固定化酵素カラム９の出口側には、けい光光度検
出器１０が接続されている。けい光光度検出器１０の詳
細は以下のようである。けい光光度検出器１０； 島津製作所 ＲＦ−５００ＬＣＡ けい光スペクトロモニタ 励起波長 ３５０ｎｒｎ 放出波長 ４６０ｎｒｒ１ 胆汁酸・抱合胆汁酸試料を試料導入口５より導入すると
、試料は分離カラム４で各成分に分離され、キヤリヤ一
液と共に固定化酵素カラム９に導入される。
同時に試薬も導入されるので、固定化酵素カラム９中で
酵素反応を起こす。この酵素反応によつて試薬中のＮＡ
ＤがＮＡＤＨに変わるので、そのけい光光度を定量測定
して試料を定量できる。これは公知のとおりである。キ
ヤリヤ一液流量０．６ｄ／―、試薬流量１．２ｍ１／―
、として標準試料および患者から抽出した胆汁試料を分
析した結果を第２図に示す。
酵素反応を起こす。この酵素反応によつて試薬中のＮＡ
ＤがＮＡＤＨに変わるので、そのけい光光度を定量測定
して試料を定量できる。これは公知のとおりである。キ
ヤリヤ一液流量０．６ｄ／―、試薬流量１．２ｍ１／―
、として標準試料および患者から抽出した胆汁試料を分
析した結果を第２図に示す。
患者から抽出した胆汁試料は、患者から採つた胆汁１０
０μｅをメタノール５ｄと混合し、３０００ｒｐ１で５
分間遠心分離したものの上層液３０μ２を使つた。この
結果、感度、精度とも充分満足できるデータが得られた
。しかも、酵素を繰返し使用できるので、分析のランニ
ングコストが格段に低下した。また、分析操作も従来に
比べて簡便になつた。なお、胆汁酸はキヤリヤ一液中で
ミセルを作りやすく、それが固定化酵素カラム９の多孔
質ガラスビーズ１１の細孔内に入り込んで酵素を覆つて
しまい、酵素反応を阻害することがある。その結果、見
かけ土酵素が失活したかのようになつて分析が不正確に
なる。このような場合には、非イオン性界面活性剤を少
量添加することが極めて有効である。上記装置１では、
試薬７中にトリトンＸ一１００が混入されているので、
分析がミセルによつて妨害されず、正確な分析を行うこ
とができた。
０μｅをメタノール５ｄと混合し、３０００ｒｐ１で５
分間遠心分離したものの上層液３０μ２を使つた。この
結果、感度、精度とも充分満足できるデータが得られた
。しかも、酵素を繰返し使用できるので、分析のランニ
ングコストが格段に低下した。また、分析操作も従来に
比べて簡便になつた。なお、胆汁酸はキヤリヤ一液中で
ミセルを作りやすく、それが固定化酵素カラム９の多孔
質ガラスビーズ１１の細孔内に入り込んで酵素を覆つて
しまい、酵素反応を阻害することがある。その結果、見
かけ土酵素が失活したかのようになつて分析が不正確に
なる。このような場合には、非イオン性界面活性剤を少
量添加することが極めて有効である。上記装置１では、
試薬７中にトリトンＸ一１００が混入されているので、
分析がミセルによつて妨害されず、正確な分析を行うこ
とができた。
第１図はこの発明方法を実施する装置の一例を示す構成
図、第２図は分析結果を示すけい光光度図で、Ａは標準
試料、Ｂは患者から抽出した胆汁試料である。 １・・・・・・分析装置、２・・・・・・キヤリヤ一液
、４・・・・・・分離カラム、５・・・・・・試料導入
口、７・・・・・・試薬、９・・・・・・固定化酵素カ
ラム、１０・・・・・・けい光光度検出器、１・・・・
・・タウロコール酸、２・・・・・・タウロケイデオキ
シコール酸、３・・・・・・タウロデオキシコール酸、
４・・・・・・グリココール酸、５・・・・・・グリコ
ケノデオキシコール酸、６・・・・・・グリコデオキシ
コール酸。
図、第２図は分析結果を示すけい光光度図で、Ａは標準
試料、Ｂは患者から抽出した胆汁試料である。 １・・・・・・分析装置、２・・・・・・キヤリヤ一液
、４・・・・・・分離カラム、５・・・・・・試料導入
口、７・・・・・・試薬、９・・・・・・固定化酵素カ
ラム、１０・・・・・・けい光光度検出器、１・・・・
・・タウロコール酸、２・・・・・・タウロケイデオキ
シコール酸、３・・・・・・タウロデオキシコール酸、
４・・・・・・グリココール酸、５・・・・・・グリコ
ケノデオキシコール酸、６・・・・・・グリコデオキシ
コール酸。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 試料を高速液体クロマトグラフィーに付してその分
離カラムを通過させ、次いで分離成分をキャリヤー液と
共に所定酵素を固定化した多孔質ガラスビーズを充填も
しくは保持した固定化酵素カラムに導入し、一方この固
定化酵素カラム中に、少量の非イオン性界面活性剤と所
定試薬を導入して酵素反応を起こさせ、その酵素反応生
成物を定量測定して試料の定量をすることを特徴とする
固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法。 ２ 試料が胆汁酸・抱合胆汁酸含有試料であり、キャリ
ヤー液が緩衝液／アルコールまたは緩衝液／アセトニト
リルであり、非イオン性界面活性剤がトリトンＸ−１０
０である特許請求の範囲第１項記載の生化学分析方法。 ３ 試料が胆汁酸・抱合胆汁酸含有試料であり、酵素が
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−
ＨＳＤ）であり、試薬がニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）含有試薬であり、酵素反応生成物の
定量測定がＮＡＤＨのけい光光度測定である特許請求の
範囲第１項ないし第２項のいずれかに記載の生化学分析
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7261880A JPS595000B2 (ja) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | 固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7261880A JPS595000B2 (ja) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | 固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56169596A JPS56169596A (en) | 1981-12-26 |
| JPS595000B2 true JPS595000B2 (ja) | 1984-02-02 |
Family
ID=13494545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7261880A Expired JPS595000B2 (ja) | 1980-05-29 | 1980-05-29 | 固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS595000B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62238993A (ja) * | 1986-04-11 | 1987-10-19 | 住友金属工業株式会社 | 炉体管理方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58146299A (ja) * | 1982-02-23 | 1983-08-31 | Japan Spectroscopic Co | ステロイドホルモン代謝産物の選択的高感度検出法 |
| JPS58170500A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-07 | Japan Spectroscopic Co | ３βの水酸基を有する胆汁酸の分析方法 |
| JPS596897A (ja) * | 1982-07-06 | 1984-01-13 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
| JPS5961772A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-09 | ザ・イエロ−・スプリングス・インストルメント・カンパニ−・インコ−ポレ−テツド | 液体クロマトグラフ酵素電極検出器 |
| CN105588936A (zh) * | 2015-12-14 | 2016-05-18 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法 |
| CN106226512B (zh) * | 2016-07-29 | 2018-10-16 | 胡清 | 一种试剂盒、试剂盒的制备方法及利用该试剂盒实现的外周血甘氨胆酸的检测方法 |
-
1980
- 1980-05-29 JP JP7261880A patent/JPS595000B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62238993A (ja) * | 1986-04-11 | 1987-10-19 | 住友金属工業株式会社 | 炉体管理方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56169596A (en) | 1981-12-26 |
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