JPH0243475B2 - - Google Patents
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- JPH0243475B2 JPH0243475B2 JP9184482A JP9184482A JPH0243475B2 JP H0243475 B2 JPH0243475 B2 JP H0243475B2 JP 9184482 A JP9184482 A JP 9184482A JP 9184482 A JP9184482 A JP 9184482A JP H0243475 B2 JPH0243475 B2 JP H0243475B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の触媒作用を利用するために固定
化酵素が用いられた、血清中の微量成分等を定量
する等生体物質の定量分析の目的に好適に用いら
れる定量法に関するものである。
化酵素が用いられた、血清中の微量成分等を定量
する等生体物質の定量分析の目的に好適に用いら
れる定量法に関するものである。
従来、主として生体物質、例えば胆汁酸等を定
量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によつて直接検出することが困
難な場合には、酵素の触媒作用を利用して、被測
定成分と酵素の存在下に反応する反応物を予め加
えておいた試料液を固定化酵素が充填されたカラ
ムに導き、そこで被測定成分と反応物を反応さ
せ、その結果生ずる検出器にて検出可能な物質例
えば蛍光性物質を測定し、その測定結果にもとづ
いて、試料液中に含まれる被測定成分の量を算出
することが行われている。
量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によつて直接検出することが困
難な場合には、酵素の触媒作用を利用して、被測
定成分と酵素の存在下に反応する反応物を予め加
えておいた試料液を固定化酵素が充填されたカラ
ムに導き、そこで被測定成分と反応物を反応さ
せ、その結果生ずる検出器にて検出可能な物質例
えば蛍光性物質を測定し、その測定結果にもとづ
いて、試料液中に含まれる被測定成分の量を算出
することが行われている。
例えば胆汁酸の定量においては、予めニコチン
酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+と
略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーセ（以下3α−HSDと
略す）が固定化された担体が充填された固定化酵
素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD+とを反応
させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物質
NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で検
出するか、又は、上記で発生させたNADHをレ
サズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によ
つてNADに酸化させると同時にレサズリンを還
元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れるのであるが、この様な酵素利用の定量法にお
いては、酵素作用による反応後の１点のみを検出
器によつて測定したのでは、酵素接触前における
測定値すなわちブランク値がゼロとは限らないの
で、定量値が実際の値と異なる恐れがある。
酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+と
略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーセ（以下3α−HSDと
略す）が固定化された担体が充填された固定化酵
素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD+とを反応
させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物質
NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で検
出するか、又は、上記で発生させたNADHをレ
サズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によ
つてNADに酸化させると同時にレサズリンを還
元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れるのであるが、この様な酵素利用の定量法にお
いては、酵素作用による反応後の１点のみを検出
器によつて測定したのでは、酵素接触前における
測定値すなわちブランク値がゼロとは限らないの
で、定量値が実際の値と異なる恐れがある。
この様な場合に一般的に考えつくのは、固定化
酵素に接触する前と接触した後の２点のそれぞれ
において検出器を設けておき、上記接触する前に
測定したブランク値を上記接触した後の測定値か
ら差し引いて、ブランク値の補正を行うことであ
るが、この様な方法では検出器が２台必要となる
ので装置的に複雑化し、又、２台の検出器の感度
を同一に揃えるための調整が必要となる。
酵素に接触する前と接触した後の２点のそれぞれ
において検出器を設けておき、上記接触する前に
測定したブランク値を上記接触した後の測定値か
ら差し引いて、ブランク値の補正を行うことであ
るが、この様な方法では検出器が２台必要となる
ので装置的に複雑化し、又、２台の検出器の感度
を同一に揃えるための調整が必要となる。
本発明はより簡単な装置や操作で測定すること
の出来る固定化酵素を用いた定量法を提供するこ
とを目的としてなされたものであり、その要旨
は、被測定成分を含む試料液を固定化酵素に接触
させて該酵素の作用により被測定成分の反応を生
ぜしめ、該反応にもとづいて生成する反応生成物
を検出器で測定することにより被測定成分の量を
定量する方法において、試料液を固定化酵素に接
触させる前と試料液を固定化酵素に接触させて上
記反応を生ぜしめた後の２点において同一の検出
器を通過せしめて測定を行うことを特徴とする固
定化酵素を用いた定量法に存する。
の出来る固定化酵素を用いた定量法を提供するこ
とを目的としてなされたものであり、その要旨
は、被測定成分を含む試料液を固定化酵素に接触
させて該酵素の作用により被測定成分の反応を生
ぜしめ、該反応にもとづいて生成する反応生成物
を検出器で測定することにより被測定成分の量を
定量する方法において、試料液を固定化酵素に接
触させる前と試料液を固定化酵素に接触させて上
記反応を生ぜしめた後の２点において同一の検出
器を通過せしめて測定を行うことを特徴とする固
定化酵素を用いた定量法に存する。
以下、図面により本発明定量法を説明する。
第１図は本発明の一実施例を示す系統図であ
る。図中１は緩衝液が入れられた緩衝液槽であ
り、該緩衝液には酵素の作用により被測定成分と
反応する反応物例えば胆汁酸分析の場合はNAD+
等を予め加えておいてよい。そして緩衝液は定量
ポンプ２により、測定の始めの段階では試料注入
器３、切換バルブ４、検出器５、固定化酵素充填
カラム６及び切換バルブ４を通過して系外に排出
される様になされている。
る。図中１は緩衝液が入れられた緩衝液槽であ
り、該緩衝液には酵素の作用により被測定成分と
反応する反応物例えば胆汁酸分析の場合はNAD+
等を予め加えておいてよい。そして緩衝液は定量
ポンプ２により、測定の始めの段階では試料注入
器３、切換バルブ４、検出器５、固定化酵素充填
カラム６及び切換バルブ４を通過して系外に排出
される様になされている。
しかして検出器５としては目的とする被測定成
分が酵素の作用により反応して生成する反応生成
物を検出するに適した検出器が用いられるのであ
り、例えば胆汁酸定量の場合には蛍光光度計等の
蛍光物質を検出するのに適したものが用いられ
る。
分が酵素の作用により反応して生成する反応生成
物を検出するに適した検出器が用いられるのであ
り、例えば胆汁酸定量の場合には蛍光光度計等の
蛍光物質を検出するのに適したものが用いられ
る。
又、固定化酵素充填カラムは被測定成分の測定
目的に適合した反応を起すための酵素が固定化さ
れたセルロース等の有機系微粒子やガラス等の無
機系微粒子等の担体が充填されたものである。
目的に適合した反応を起すための酵素が固定化さ
れたセルロース等の有機系微粒子やガラス等の無
機系微粒子等の担体が充填されたものである。
なお、酵素を担体に固定化するには、例えばシ
アン化ブロマイド等の適当な試薬で化学的に活性
化させた担体表面に該酵素を接触させて化学的に
結合させる等の適宜な方法が採用される。
アン化ブロマイド等の適当な試薬で化学的に活性
化させた担体表面に該酵素を接触させて化学的に
結合させる等の適宜な方法が採用される。
本発明にもとづいて定量を行うには、まず第１
図に示される測定系に同図に示される経路で緩衝
液を定量ポンプ２により流通させるのであり、そ
の際の切換バルブ４は、該バルブ接続端のうちの
ＡとＢ及びＣとＤがそれぞれ連絡する様になされ
ている。途中で試料注入器３により、被測定成分
を含む例えば血清などの試料を注入すると、該試
料を含む試料液は切換バルブ４の接続端Ａ，Ｂを
通つて検出器５に達し、ここで試料液についての
第１回目の測定が行われる。そして検出器５を通
過した試料液は次に固定化酵素充填カラム６に達
し、該カラム６内で酵素と接触することによりそ
の触媒作用を受け、被測定成分が予め緩衝液中に
添加する等によつて試料液中に含まれる前記反応
物と反応し、その結果反応生成物が生成する。次
に本発明においては、上記カラム６を試料液の被
測定成分を含む部分が通過していまだ切換バルブ
４に達していない時点において、該切換バルブ４
を第２図に示される如く、接続端ＡとＣ、ＢとＤ
がそれぞれ連絡するように切換えるのであり、こ
の様に切換えると接続端BC間に形成されている
流路内の試料液は逆流して雨び前記カラム６及び
検出器５を経由して接続端Ｂに達し、そこから接
続端Ｄを通つて系外に排出されるのであるが、上
記検出器５の通過時に第２回目の測定が行なわれ
るのである。
図に示される測定系に同図に示される経路で緩衝
液を定量ポンプ２により流通させるのであり、そ
の際の切換バルブ４は、該バルブ接続端のうちの
ＡとＢ及びＣとＤがそれぞれ連絡する様になされ
ている。途中で試料注入器３により、被測定成分
を含む例えば血清などの試料を注入すると、該試
料を含む試料液は切換バルブ４の接続端Ａ，Ｂを
通つて検出器５に達し、ここで試料液についての
第１回目の測定が行われる。そして検出器５を通
過した試料液は次に固定化酵素充填カラム６に達
し、該カラム６内で酵素と接触することによりそ
の触媒作用を受け、被測定成分が予め緩衝液中に
添加する等によつて試料液中に含まれる前記反応
物と反応し、その結果反応生成物が生成する。次
に本発明においては、上記カラム６を試料液の被
測定成分を含む部分が通過していまだ切換バルブ
４に達していない時点において、該切換バルブ４
を第２図に示される如く、接続端ＡとＣ、ＢとＤ
がそれぞれ連絡するように切換えるのであり、こ
の様に切換えると接続端BC間に形成されている
流路内の試料液は逆流して雨び前記カラム６及び
検出器５を経由して接続端Ｂに達し、そこから接
続端Ｄを通つて系外に排出されるのであるが、上
記検出器５の通過時に第２回目の測定が行なわれ
るのである。
本発明にもとづく被測定成分の定量は、上記第
２回目の測定値からブランク値である第１回目の
測定値を差し引いて補正を行い、これにもとづい
て前記反応生成物の正確な量を知り、同時にその
反応に関与した被測定成分を算出することにより
行われる。
２回目の測定値からブランク値である第１回目の
測定値を差し引いて補正を行い、これにもとづい
て前記反応生成物の正確な量を知り、同時にその
反応に関与した被測定成分を算出することにより
行われる。
本発明の定量法は上述の通りの方法であるの
で、２台の検出器を用いる必要がなく、非常に簡
単な操作で簡便にしかも精度よく被測定成分を定
量することが出来るのである。
で、２台の検出器を用いる必要がなく、非常に簡
単な操作で簡便にしかも精度よく被測定成分を定
量することが出来るのである。
以下本発明につき前記により説明する。
実施例
粒径約80ミクロンのセルロース微粒子を担体と
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加えて撹拌した
のち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解
したアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつ
つ90秒間反応させた。こうして活性化させたセル
ロース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）、イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウム
を含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したの
ち、3α−HSD44mgを溶解させた0.5Mの塩化ナト
リウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加えて撹拌した
のち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解
したアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつ
つ90秒間反応させた。こうして活性化させたセル
ロース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）、イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウム
を含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したの
ち、3α−HSD44mgを溶解させた0.5Mの塩化ナト
リウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
次に上記の処理により3α−HSDを固定化した
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の２−メルカブトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の２−メルカブトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
かくして得られた酵素固定化微粒子を0.5Mの
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（ft5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、固
定化酵素充填カラムを用意した。
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（ft5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、固
定化酵素充填カラムを用意した。
次に、上記で用意したカラムを第１図の充填カ
ラム６として用い、又、１中にNAD+199mgを
含む0.1Mピロリン酸緩衝液（HP9.0）を用意し
て第１図の緩衝液槽１に入れ、検出器５としては
蛍光検出器を用いて、第１図に示される測定系を
準備した。なお、該測定系に於て各機器を結ぶ流
路として内径２mmの軟質塩ビチユーブを用いた。
ラム６として用い、又、１中にNAD+199mgを
含む0.1Mピロリン酸緩衝液（HP9.0）を用意し
て第１図の緩衝液槽１に入れ、検出器５としては
蛍光検出器を用いて、第１図に示される測定系を
準備した。なお、該測定系に於て各機器を結ぶ流
路として内径２mmの軟質塩ビチユーブを用いた。
測定にあたつては、まず第１図に示す切換バル
ブの接続状態で上記緩衝液を定量ポンプ２によつ
て１ml／分の流速で送液し、該送液が安定した時
点で健康人の血清0.1c.c.を試料注入器３から注入
し、検出器５を通過する際の励起波長365nm、蛍
光波長450nmでの蛍光強度（Ｘ）を測定した。上
記注入後７分経過し、注入された試料が完全に充
填カラム６を通過しかつ切換バルブ４の接続端と
にいまだ達しない時点で、切換バルブ４を第２図
の様に切換えて流れを逆転させ、試料液を再び充
填カラム６及び検出器を通過する様になし、検出
器５で上記と同様にして蛍光強度（Ｙ）を測定し
た。
ブの接続状態で上記緩衝液を定量ポンプ２によつ
て１ml／分の流速で送液し、該送液が安定した時
点で健康人の血清0.1c.c.を試料注入器３から注入
し、検出器５を通過する際の励起波長365nm、蛍
光波長450nmでの蛍光強度（Ｘ）を測定した。上
記注入後７分経過し、注入された試料が完全に充
填カラム６を通過しかつ切換バルブ４の接続端と
にいまだ達しない時点で、切換バルブ４を第２図
の様に切換えて流れを逆転させ、試料液を再び充
填カラム６及び検出器を通過する様になし、検出
器５で上記と同様にして蛍光強度（Ｙ）を測定し
た。
上記蛍光強度の測定値Ｙから測定値Ｘを差し引
いた値Ｙ−Ｘから、標準試料（コール酸）により
予め用意した検量線を用いて試料血清の血中総胆
汁酸量を求めると13μM／であつた。なお、上
記測定値Ｙをブランク補正しないで用いて上記検
量線から求めた血中総胆汁酸量は16μM／であ
り、3μM／の誤差が認められた。又、上記測
定に用いた血清の血中総胆汁酸量を、血清胆汁酸
測定試薬ネオステログノスト（第１化学薬品社
製）を用いる測定法により測定した所、
12.5μM／の結果が得られた。
いた値Ｙ−Ｘから、標準試料（コール酸）により
予め用意した検量線を用いて試料血清の血中総胆
汁酸量を求めると13μM／であつた。なお、上
記測定値Ｙをブランク補正しないで用いて上記検
量線から求めた血中総胆汁酸量は16μM／であ
り、3μM／の誤差が認められた。又、上記測
定に用いた血清の血中総胆汁酸量を、血清胆汁酸
測定試薬ネオステログノスト（第１化学薬品社
製）を用いる測定法により測定した所、
12.5μM／の結果が得られた。
第１図は本発明の一実施例を示す系統図、第２
図は第１図の切替バルブ３の切替後の接続状況を
示す平面図である。 １…緩衝液槽、２…定量ポンプ、３…試料注入
器、４…切換バルブ、５…検出器、６…固定化酵
素充填カラム、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ…切換バルブ接続
端。
図は第１図の切替バルブ３の切替後の接続状況を
示す平面図である。 １…緩衝液槽、２…定量ポンプ、３…試料注入
器、４…切換バルブ、５…検出器、６…固定化酵
素充填カラム、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ…切換バルブ接続
端。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被測定成分を含む試料液を固定化酵素に接触
させて該酵素の作用により被測定成分の反応を生
ぜしめ、該反応にもとづいて生成する反応生成物
を検出器で測定することにより被測定成分の量を
定量する方法において、試料液を固定化酵素に接
触させる前と試料液を固定化酵素に接触させて上
記反応を生ぜしめた後の２点において同一の検出
器を通過せしめて測定を行うことを特徴とする固
定化酵素を用いた定量法。 ２ 固定化酵素に接触させて反応させた後の試料
液の流れを逆方向に切換えて、固定化酵素を経由
して再度検出器を通過するように試料液を流す第
１項記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9184482A JPS58209996A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化酵素を用いた定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9184482A JPS58209996A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化酵素を用いた定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58209996A JPS58209996A (ja) | 1983-12-07 |
| JPH0243475B2 true JPH0243475B2 (ja) | 1990-09-28 |
Family
ID=14037885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9184482A Granted JPS58209996A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化酵素を用いた定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58209996A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE455822B (sv) * | 1985-12-03 | 1988-08-08 | Mo Och Domsjoe Ab | Forfarande for att meta kemikaliehalten i blekvetska inom cellulosamassaindustrin samt apparatur for genomforande av forfarandet |
| US5158868A (en) * | 1987-07-17 | 1992-10-27 | Iniziative Marittime 1991, S.R.L. | Method of sample analysis |
| US4997627A (en) * | 1987-07-17 | 1991-03-05 | Fisher Scientific Company | Sample analysis |
| CN101788462B (zh) * | 2010-03-09 | 2012-02-08 | 清华大学 | 一种单通道酶活自动检测装置 |
-
1982
- 1982-05-28 JP JP9184482A patent/JPS58209996A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58209996A (ja) | 1983-12-07 |
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