JPH0243476B2 - - Google Patents
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- JPH0243476B2 JPH0243476B2 JP12734182A JP12734182A JPH0243476B2 JP H0243476 B2 JPH0243476 B2 JP H0243476B2 JP 12734182 A JP12734182 A JP 12734182A JP 12734182 A JP12734182 A JP 12734182A JP H0243476 B2 JPH0243476 B2 JP H0243476B2
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素を用いた生体成分の定量法
に関する。
に関する。
従来、生体成分、例えば血清中に微量に存在す
る胆汁酸等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成
分を例えば蛍光光度計等の検出器によつて直接検
出することが困難な場合には、酵素の触媒作用を
利用して、被測定成分と酵素の存在下に反応する
反応物を予め加えておいた試料液を固定化酵素が
充填されたカラムに導き、そこで被測定成分と反
応物を反応させて還元型補酵素を生成させ、この
反応生成物を蛍光検出器により検出し、試料液中
に含まれる被測定成分の量を算出することが行わ
れている。
る胆汁酸等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成
分を例えば蛍光光度計等の検出器によつて直接検
出することが困難な場合には、酵素の触媒作用を
利用して、被測定成分と酵素の存在下に反応する
反応物を予め加えておいた試料液を固定化酵素が
充填されたカラムに導き、そこで被測定成分と反
応物を反応させて還元型補酵素を生成させ、この
反応生成物を蛍光検出器により検出し、試料液中
に含まれる被測定成分の量を算出することが行わ
れている。
例えば総胆汁酸の定量においては、予めニコチ
ン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+
と略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ（以下3α−HSD
と略す）が固定化された担体が充填された固定化
酵素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD+とを反
応させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物質
NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で検
出するか、又は、上記で発生させたNADHをレ
サズリンの共存下で酸素ジアホラーゼの作用によ
つてNADに酸化させると同時にレサズリンを還
元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れている。
ン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+
と略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ（以下3α−HSD
と略す）が固定化された担体が充填された固定化
酵素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD+とを反
応させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物質
NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で検
出するか、又は、上記で発生させたNADHをレ
サズリンの共存下で酸素ジアホラーゼの作用によ
つてNADに酸化させると同時にレサズリンを還
元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れている。
ところで総胆汁酸は一次胆汁酸と二次胆汁酸か
らなるが、これらの分画は臨床検査上の意義を有
するものであるので、更に一次胆汁酸を定量し、
総胆汁酸量との一次胆汁酸夫々の量から二次胆汁
酸量を定量することができる。そして一次胆汁酸
の定量のためには、酵素7α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（以下7α−HSDと略す）
が固定化された担体が充填された固定化酵素カラ
ムに通して一次胆汁酸との反応を生じさせ一次胆
汁酸との反応生成物を検出器により検出すること
ができる。
らなるが、これらの分画は臨床検査上の意義を有
するものであるので、更に一次胆汁酸を定量し、
総胆汁酸量との一次胆汁酸夫々の量から二次胆汁
酸量を定量することができる。そして一次胆汁酸
の定量のためには、酵素7α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（以下7α−HSDと略す）
が固定化された担体が充填された固定化酵素カラ
ムに通して一次胆汁酸との反応を生じさせ一次胆
汁酸との反応生成物を検出器により検出すること
ができる。
しかしながらこのようにして一次胆汁酸と二次
胆汁酸を定量する場合は、生体試料液を注入して
ブランク値を検出するための検出器と、3α−
HSDを固定した担体を充填した固定化酵素カラ
ムを通した後の生体試料液中の総胆汁酸の定量の
ための検出器と、7α−HSDを固定した担体を充
填した固定化酵素カラムを通した後の生体試料液
中の一次胆汁酸の定量のための検出器の３台の検
出器が必要になり、生体試料を３つに分ける必要
がありこれに伴ない検出に手間が掛り、しかも検
出器を３台揃えることから検出装置が複雑化し、
コストが高くつく欠点があつた。
胆汁酸を定量する場合は、生体試料液を注入して
ブランク値を検出するための検出器と、3α−
HSDを固定した担体を充填した固定化酵素カラ
ムを通した後の生体試料液中の総胆汁酸の定量の
ための検出器と、7α−HSDを固定した担体を充
填した固定化酵素カラムを通した後の生体試料液
中の一次胆汁酸の定量のための検出器の３台の検
出器が必要になり、生体試料を３つに分ける必要
がありこれに伴ない検出に手間が掛り、しかも検
出器を３台揃えることから検出装置が複雑化し、
コストが高くつく欠点があつた。
本発明はこのような欠点を解消することを目的
とするものであり、同一の生体試料から複数の被
測定成分を定量するに当り、一台の検出器での定
量を可能となした、固定化酵素を用いた生体成分
の定量法を提供するものである。
とするものであり、同一の生体試料から複数の被
測定成分を定量するに当り、一台の検出器での定
量を可能となした、固定化酵素を用いた生体成分
の定量法を提供するものである。
本発明の要旨は、生体試料液を固定化酵素カラ
ムに導入する前に検出器に導きブランク値(A)を検
出し、検出後の前記生体試料液を第１の固定化酵
素カラムに導入して固定化酵素と接触させて第１
の被測定成分の反応を生じさせ、第１の被測定成
分の反応生成物を含む生体試料液を前記と同一の
検出器に導き、該反応生成物を含む生体試料液の
検出値(B)を求め、次いで検出後の前記生体試料液
を第２の固定化酵素カラムに導入して固定化酵素
と接触させて第２の被測定成分の反応を生じさ
せ、かくして得られた第２の被測定成分の反応生
成物を含む生体試料液を前記と同一の検出器に導
き、これらの反応生成物を含む生体試料液の検出
値(C)を求め、これらの夫々の値から生体試料中に
含まれる複数の被測定成分の量を定めることを特
徴とする、固定化酵素を用いた生体成分の定量法
に存する。
ムに導入する前に検出器に導きブランク値(A)を検
出し、検出後の前記生体試料液を第１の固定化酵
素カラムに導入して固定化酵素と接触させて第１
の被測定成分の反応を生じさせ、第１の被測定成
分の反応生成物を含む生体試料液を前記と同一の
検出器に導き、該反応生成物を含む生体試料液の
検出値(B)を求め、次いで検出後の前記生体試料液
を第２の固定化酵素カラムに導入して固定化酵素
と接触させて第２の被測定成分の反応を生じさ
せ、かくして得られた第２の被測定成分の反応生
成物を含む生体試料液を前記と同一の検出器に導
き、これらの反応生成物を含む生体試料液の検出
値(C)を求め、これらの夫々の値から生体試料中に
含まれる複数の被測定成分の量を定めることを特
徴とする、固定化酵素を用いた生体成分の定量法
に存する。
次に本発明固定化酵素を用いた生体成分の定量
性について第１図を参照しながら更に詳細に説明
する。
性について第１図を参照しながら更に詳細に説明
する。
第１図において１は緩衝液槽であり、槽内の緩
衝液には酵素の作用により被測定成分と反応しう
る成分、例えば胆汁酸分析の場合はNAD+等が加
えられている。２は定流量ポンプであり、緩衝液
を定流量で送液するために設けられる。３は複数
の被測定成分を含む生体試料の注入器であり、注
入器３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
衝液には酵素の作用により被測定成分と反応しう
る成分、例えば胆汁酸分析の場合はNAD+等が加
えられている。２は定流量ポンプであり、緩衝液
を定流量で送液するために設けられる。３は複数
の被測定成分を含む生体試料の注入器であり、注
入器３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
４は第１の固定化酵素カラムであり、例えば胆
汁酸分析の場合には3α−HSDが固定化された胆
体が充填されている。５は第２の固定化酵素カラ
ムであり、例えば胆汁酸分析の場合には7α−
HSDが固定された担体が充填されている。６は
検出器である。７，８，９，１０は三方切換バル
ブ、１１は四方切換バルブである。この場合にお
いてはバルブ７，８，９，１０，１１の流通路は
次の三通りの組合せて設定される。
汁酸分析の場合には3α−HSDが固定化された胆
体が充填されている。５は第２の固定化酵素カラ
ムであり、例えば胆汁酸分析の場合には7α−
HSDが固定された担体が充填されている。６は
検出器である。７，８，９，１０は三方切換バル
ブ、１１は四方切換バルブである。この場合にお
いてはバルブ７，８，９，１０，１１の流通路は
次の三通りの組合せて設定される。
(1) バルブ７：ａ−ｂ、８：ｄ−ｅ、１０：ｊ−
ｋ、１１：ｎ−ｏ (2) バルブ７：ａ−ｃ、８：ｅ−ｆ、９：ｇ−
ｉ、１０：ｋ−ｊ、１１：ｐ−ｎ (3) バルブ７：ａ−ｃ、８：ｆ−ｅ、９：ｈ−
ｇ、１０：ｊ−ｌ、１１：ｐ−ｍ まずバルブ流路の組合せを(1)に設定する。この
状態において、緩衝液槽１内の緩衝液を定流量ポ
ンプで送液し、注入器３から複数の被測定成分を
含む生体試料を注入し、緩衝液と合流させる。こ
の生体試料液は検出器６に導かれ、ブランク値(A)
が検出される。検出器６を出た生体試料液を第１
の固定化酵素カラム４に導入して固定化酵素と接
触させて第１の被測定成分の反応を生じさせる。
生体試料液がバルブ１１に達する迄にバルブ流路
の組合せを(2)に設定する。生体試料液の流れの方
向が変更され、第１の固定化酵素カラムを４を通
過し第１の被測定成分との反応を生じた生体試料
液が前記検出器６に導かれるので、検出器６によ
り反応生成物を含む生体試料液の検出値(B)が求め
られる。検出器６を出た生体試料液を第２の固定
化酵素カラム５に導入して固定化酵素との接触に
より第２の被測定成分を生じさせる。生体試料液
がバルブ９に達する迄にバルブ流路の組合せを(3)
に設定する。生体試料液の流れの方向は変更さ
れ、第２の固定化酵素カラム５を通過し、第２の
被測定成分との反応を生じた生体試料液が前記検
出器６に導かれるので、検出器６により第２の被
測定成分との反応を生じた生体試料液の検出値(C)
が求められる。
ｋ、１１：ｎ−ｏ (2) バルブ７：ａ−ｃ、８：ｅ−ｆ、９：ｇ−
ｉ、１０：ｋ−ｊ、１１：ｐ−ｎ (3) バルブ７：ａ−ｃ、８：ｆ−ｅ、９：ｈ−
ｇ、１０：ｊ−ｌ、１１：ｐ−ｍ まずバルブ流路の組合せを(1)に設定する。この
状態において、緩衝液槽１内の緩衝液を定流量ポ
ンプで送液し、注入器３から複数の被測定成分を
含む生体試料を注入し、緩衝液と合流させる。こ
の生体試料液は検出器６に導かれ、ブランク値(A)
が検出される。検出器６を出た生体試料液を第１
の固定化酵素カラム４に導入して固定化酵素と接
触させて第１の被測定成分の反応を生じさせる。
生体試料液がバルブ１１に達する迄にバルブ流路
の組合せを(2)に設定する。生体試料液の流れの方
向が変更され、第１の固定化酵素カラムを４を通
過し第１の被測定成分との反応を生じた生体試料
液が前記検出器６に導かれるので、検出器６によ
り反応生成物を含む生体試料液の検出値(B)が求め
られる。検出器６を出た生体試料液を第２の固定
化酵素カラム５に導入して固定化酵素との接触に
より第２の被測定成分を生じさせる。生体試料液
がバルブ９に達する迄にバルブ流路の組合せを(3)
に設定する。生体試料液の流れの方向は変更さ
れ、第２の固定化酵素カラム５を通過し、第２の
被測定成分との反応を生じた生体試料液が前記検
出器６に導かれるので、検出器６により第２の被
測定成分との反応を生じた生体試料液の検出値(C)
が求められる。
検出器６によりブランク値(A)、検出値(B)、検出
値(C)が求められた生体試料液は系外に排出され
る。
値(C)が求められた生体試料液は系外に排出され
る。
検出値(B)とブランク値(A)との差に基づいて第１
の被測定成分の量が定められ、又、検出値(C)と検
出値(B)との差により第２の被測定成分の反応生成
物の値が求められる。そしてこれらの被測定成分
の反応生成物の量に基づいて生体試料中に含まれ
る複数の被測定成分の量を夫々定めることができ
る。
の被測定成分の量が定められ、又、検出値(C)と検
出値(B)との差により第２の被測定成分の反応生成
物の値が求められる。そしてこれらの被測定成分
の反応生成物の量に基づいて生体試料中に含まれ
る複数の被測定成分の量を夫々定めることができ
る。
本発明によれば同一の生体試料から複数の被測
定成分を定量するに当り、一台の検出器での定量
を可能となすことができ、検出に際し生体試料を
分割する必要がなく、検出の手間を省くことがで
き、検出装置を簡素化し、検出コストを低下させ
る等の利点が存する。
定成分を定量するに当り、一台の検出器での定量
を可能となすことができ、検出に際し生体試料を
分割する必要がなく、検出の手間を省くことがで
き、検出装置を簡素化し、検出コストを低下させ
る等の利点が存する。
実施例
粒径約80ミクロンのセルロース微粒子を担体と
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加え撹拌したの
ち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解し
たアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつつ
90秒間反応させた。こうして活性化させたセルロ
ース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したのち、3α−
HSD44mgを溶解させた0.5Mの塩化ナトリウムを
含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加え、室温
で２時間撹拌して反応させた。
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加え撹拌したの
ち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解し
たアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつつ
90秒間反応させた。こうして活性化させたセルロ
ース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したのち、3α−
HSD44mgを溶解させた0.5Mの塩化ナトリウムを
含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加え、室温
で２時間撹拌して反応させた。
次に上記の処理により3α−HSDを固定化した
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の２−メルカプトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の２−メルカプトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
かくして得られた酵素固定化微粒子を0.5Mの
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、第
１の固定化酵素カラム４を用意した。
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、第
１の固定化酵素カラム４を用意した。
同様にして7α−HSDが固定された第２の固定
化酵素カラム５を用意した。
化酵素カラム５を用意した。
第１図に示すような装置において、１中に
NAD+199mgを含む0.1Mピロリン酸緩衝液を緩衝
液槽１に入れ、次いで定流量ポンプ２で0.5ml／
分の流量で送液し、送液が安定した時点で健康人
の血清0.01mlを注入器３から注入した。バルブ流
路の組合せを(1)に設定し、検出器６によりブラン
ク値(A)を記録した。
NAD+199mgを含む0.1Mピロリン酸緩衝液を緩衝
液槽１に入れ、次いで定流量ポンプ２で0.5ml／
分の流量で送液し、送液が安定した時点で健康人
の血清0.01mlを注入器３から注入した。バルブ流
路の組合せを(1)に設定し、検出器６によりブラン
ク値(A)を記録した。
次に、ブランク値を検出後の試料液を第１の固
定化酵素カラム４に導入して3α−HSDとの反応
を生じさせた。試料液がバルブ１１に達する迄に
バルブ流路の組合せを(2)に設定し、検出器６を再
び通過させて総胆汁酸による検出値(B)を記録し
た。
定化酵素カラム４に導入して3α−HSDとの反応
を生じさせた。試料液がバルブ１１に達する迄に
バルブ流路の組合せを(2)に設定し、検出器６を再
び通過させて総胆汁酸による検出値(B)を記録し
た。
更に検出器６を出た試料液を第２の固定化酵素
カラム５に導入して7α−HSDとの反応を生じさ
せ、試料液がバルブ９に達する迄にバルブ流路の
組合せを(3)に設定した。
カラム５に導入して7α−HSDとの反応を生じさ
せ、試料液がバルブ９に達する迄にバルブ流路の
組合せを(3)に設定した。
生体試料液は再々度前記検出器６に導かれ、第
一次胆汁による検出値(C)を記録した。
一次胆汁による検出値(C)を記録した。
このようにして得られた検出値(B)とブランク値
(A)との差に基づき総胆汁酸の量を求めることがで
き、又、検出値(C)と検出値(B)の差に基づいて一次
胆汁酸の量を求めることができた。なお、求めら
れた総胆汁酸量と一次胆汁酸量の差に基づき、二
次胆汁酸の量を求めた。
(A)との差に基づき総胆汁酸の量を求めることがで
き、又、検出値(C)と検出値(B)の差に基づいて一次
胆汁酸の量を求めることができた。なお、求めら
れた総胆汁酸量と一次胆汁酸量の差に基づき、二
次胆汁酸の量を求めた。
コール酸とデオキシコール酸を標準試料として
検量線を作製し、正常人の血清中胆汁酸量を測定
すると一次胆汁酸が1.7μ・モル／、二次胆汁酸
が1.2μモル／であつた。
検量線を作製し、正常人の血清中胆汁酸量を測定
すると一次胆汁酸が1.7μ・モル／、二次胆汁酸
が1.2μモル／であつた。
第１図は本発明方法において使用される定量装
置の一例を示す概要図である。 １…緩衝液槽、２…定流量ポンプ、３…注入
器、４…第１の固定化酵素カラム、５…第２の固
定化酵素カラム、６…検出器、７，８，９…三方
切換バルブ、１０…四方切換バルブ。
置の一例を示す概要図である。 １…緩衝液槽、２…定流量ポンプ、３…注入
器、４…第１の固定化酵素カラム、５…第２の固
定化酵素カラム、６…検出器、７，８，９…三方
切換バルブ、１０…四方切換バルブ。
Claims (1)
- １ 生体試料液を固定化酵素カラムに導入する前
に検出器に導きブランク値(A)を検出し、検出後の
前記生体試料液を第１の固定化酵素カラムに導入
して固定化酵素と接触させて第１の被測定成分の
反応を生じさせ、第１の被測定成分の反応生成物
を含む生体試料液を前記と同一の検出器に導き、
該反応生成物を含む生体試料液の検出値(B)を求
め、次いで検出後の前記生体試料液を第２の固定
化酵素カラムに導入して固定化酵素と接触させて
第２の被測定成分の反応を生じさせ、かくして得
られた第２の被測定成分の反応生成物を含む生体
試料液を前記と同一の検出器に導き、これらの反
応生成物を含む生体試料液の検出値(C)を求め、こ
れらの夫々の値から生体試料中に含まれる複数の
被測定成分の量を定めることを特徴とする、固定
化酵素を用いた生体成分の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12734182A JPS5917998A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12734182A JPS5917998A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917998A JPS5917998A (ja) | 1984-01-30 |
| JPH0243476B2 true JPH0243476B2 (ja) | 1990-09-28 |
Family
ID=14957520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12734182A Granted JPS5917998A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917998A (ja) |
-
1982
- 1982-07-20 JP JP12734182A patent/JPS5917998A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5917998A (ja) | 1984-01-30 |
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