JP2595141B2 - リン酸イオン濃度測定装置 - Google Patents

リン酸イオン濃度測定装置

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JP2595141B2
JP2595141B2 JP3111619A JP11161991A JP2595141B2 JP 2595141 B2 JP2595141 B2 JP 2595141B2 JP 3111619 A JP3111619 A JP 3111619A JP 11161991 A JP11161991 A JP 11161991A JP 2595141 B2 JP2595141 B2 JP 2595141B2
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征夫 軽部
いづみ 久保
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、河川や湖沼等の水中
のリン酸イオン濃度を測定する装置に関する。
【0002】
【従来の技術】現在、水質管理上、河川や湖沼等の富栄
養化の一因となりうるリンの水中溶存濃度(すなわち、
リン酸イオン濃度)を測定することは、重要な作業とな
っている。従来のリン酸イオン濃度の測定法としては、
吸光光度法、原子吸光法、重量法、容量法などの方法が
知られている。
【0003】吸光光度法には、モリブドリン酸法、モリ
ブンデンブルー法、バナドモリブドリン酸法などがあ
る。これらの方法は、各試薬をリン酸イオンを含む溶液
と反応させた後、各反応で生じる特異な吸収波長帯を有
する生成物質についてその吸光度をそれぞれの吸収波長
帯にて測り、その結果からリン酸イオンを定量する方法
である。
【0004】原子吸光法では、リンを直接定量すること
が困難であるため、リン酸イオンを含む溶液にモリブデ
ン酸塩試薬を加えてリンモリブデン酸アンモニウムとし
て沈澱させた後に濾過し、得られた沈澱を再び溶解させ
た溶液からモリブデンを原子吸光で定量することによ
り、間接的にリン酸イオン濃度を測定している。
【0005】重量法には、マグネシア混液中でリンとマ
グネシウムとによる沈澱を生じさせたのち、焼成してM
2 2 7 を秤量する方法などがある。また、容量法
としては、中和滴定やキレート滴定などがある。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記各
吸光光度法は、各反応で生じる生成物質の特異な吸収波
長帯に近似した波長の光を他の物質が吸収するため、そ
の影響を受けたり、感度が不十分であったりして、リン
酸イオン濃度の正確な測定値が得られ難いという問題点
を有している。
【0007】一方、原子吸光法、重量法、容量法などは
正確な定量を行えるが、これらの方法は測定用試料作製
や測定操作の煩雑性からリアルタイム測定が難しく、所
定水域の水質を即時に把握し、その結果に応じて迅速な
対応を行う必要のある水質管理作業には適さない。
【0008】本発明の目的は、被検査水中のリン酸イオ
ン濃度を他の物質の影響を受けることなく正確に且つリ
アルタイムに測定できるリン酸イオン濃度測定装置を提
供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明のリン酸イオン濃
度測定装置は、ピルビン酸を含む溶液の入った第一の容
器と、送液ポンプと、試料注入口と、ピルビン酸オキシ
ダーゼ固定化カラムと、をこの順に送液管で接続して第
一流路を構成し、過酸化水素と反応して発光が生じる化
学発光試薬を含む溶液の入った第二の容器と、送液ポン
プと、をこの順に送液管で接続して第二流路を構成する
とともに、前記第一流路を通った液体および前記第二流
路を通った液体が導入されて過酸化水素と化学発光試薬
との発光反応を生じさせる化学発光反応部と、当該化学
発光反応部での発光量を検出する発光検出器とを有する
ことを特徴とする。
【0010】前記化学発光試薬がルミノールであれば好
ましい。ピルビン酸オキシダーゼ( EC1.2.3.3)(PO
P)は、下記(1)式の反応を触媒する酵素であり、ラ
クトバチルス科(Lactobacilluceae)に属する種々の菌
の菌体内に存在している。
【0011】
【化1】
【0012】
【作用】本発明のリン酸イオン濃度測定装置によれば、
両流路の送液ポンプを稼働させて、ピルビン酸を含む溶
液が、第一の容器から試料注入口およびピルビン酸オキ
シダーゼ固定化カラムを通って化学発光反応部に導入さ
れ、第二の容器から前記化学発光試薬を含む溶液が化学
発光反応部に導入されている状態で、前記試料注入口か
ら河川水等の被検査水を注入することにより、第一流路
において、当該被検査水が送液管内のピルビン酸を含
む溶液とともにピルビン酸オキシダーゼ固定化カラム内
に入って当該カラム内を拡散するため、前記被検査水が
リン酸イオンを含んでいれば、上記(1)式のピルビン
酸オキシダーゼを触媒とした反応が起き、過酸化水素
(H2 2 )が生じる。ここで、ピルビン酸オキシダー
ゼ固定化カラム内には、ピルビン酸オキシダーゼが固定
化しされたカラム樹脂が充填されているため、当該カラ
ム内に入った被検査水およびピルビン酸を含む溶液は、
ピルビン酸オキシダーゼと十分に接触しながら拡散す
る。この第一流路で生じた過酸化水素が化学発光反応部
に入ると、当該化学発光反応部内に第二流路を通って導
入されている化学発光試薬と前記過酸化水素とが反応し
て発光が生じる。このとき、過酸化水素の生成量に応じ
た発光量が得られるが、過酸化水素の生成量は被検査水
のリン酸イオン濃度に依存している(リン酸イオン1モ
ルに対して過酸化水素が1モル生成する)ため、この発
光量を発光検出器で検出することにより、前記試料注入
口から注入された被検査水に含まれるリン酸イオンの定
量ができる。
【0013】ルミノールによる化学発光反応は、下記
(2)式に示すように、アルカリ溶液中で過酸化水素な
どの酸化剤によりルミノールが酸化されて励起状態のア
ミノフタル酸となり、これが基底状態に戻るときに光を
発するものである。ルミノール+H 2 2 +O 2 ─→アミノフタル酸+N 2 +H 2 O+Hν ……(2)
【0014】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳述するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
【0015】図1は、本発明のリン酸イオン濃度測定装
置の一実施例を示す。この装置は、2つの流路と、化学
発光反応部1としてのフローセルと、化学発光反応部1
で生じた発光量を検出するための発光検出器2としての
フォトマルチプライヤ(光電子増倍管)とからなる。
【0016】第1流路Aは、容器3、例えばペリスタポ
ンプのような送液ポンプ4、試料注入口5、およびピル
ビン酸オキシダーゼ固定化カラム6を、この順に送液管
で接続して化学発光反応部1に達する。容器3には、ピ
ルビン酸、ピルビン酸オキシダーゼの補酵素、およびピ
ルビン酸オキシダーゼ用の緩衝液が入っている。また、
この例では、ピルビン酸オキシダーゼ固定化カラム6と
して、通常の酵素の固定化に用いられるようなカラム樹
脂にピルビン酸オキシダーゼを固定したものが充填さ
れたカラムを用いている。
【0017】第2流路Bは、化学発光試薬が入った容器
7と送液ポンプ4とを、この順に送液管で接続して化学
発光反応部1に達する。化学発光試薬としては、ルミノ
ールやルミノール誘導体、およびシュウ酸エステル等が
用いられる。ルミノールやルミノール誘導体は、アルカ
リ溶液中で過酸化水素などの酸化剤により酸化されて励
起状態のアミノフタル酸またはその誘導体となり、これ
が基底状態に戻るときに光を発する。この発光反応の触
媒としては、ペルオキシダーゼ(H2 2 +AH2 →2
2 O+Aの反応を触媒する酵素)、ヘミン、Ag2+
Cd2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+などを用いる
ことができる。シュウ酸エステルの場合は、第2の物質
(蛍光物質)が必要であり、シュウ酸エステルが過酸化
水素と反応して活性中間体を生成し、蛍光物質がこの活
性中間体との電荷移動錯体を経て励起され発光する(こ
の発光反応は、『過シュウ酸エステル化学発光反応』と
称されているものである)。したがって、容器7には、
化学発光試薬の他に発光反応に必要な物質が含まれてい
る。また、化学発光反応部1には廃液管8が接続され、
この廃液管8から外部へ廃液を出している。
【0018】発光検出器2には信号増幅器9が接続さ
れ、その先に記録計10が接続されている。これによ
り、化学発光により得られた光の出力が発光検出器2で
電気信号に変換された後増幅され、記録される。
【0019】第1流路Aに容器3内の液体を、第2流路
Bに容器7内の液体をそれぞれ送液ポンプ4により常時
通せば、発光検出器2の出力電圧が定常状態になる。こ
の状態で試料注入口5よりリン酸イオンを含む被検査水
をマイクロシリンジなどで注入すると、この被検査水は
送液管内の液体とともにピルビン酸オキシダーゼ固定
カラム6内に入って拡散し、この内部でピルビン酸とリ
ン酸イオンとが反応して過酸化水素が生じる。したがっ
て、ピルビン酸オキシダーゼ固定化カラム6を出た後の
送液管から化学発光反応部1へ過酸化水素が入り、この
過酸化水素と第2流路Bから化学発光反応部1へ通液さ
れている化学発光試薬とが化学発光反応部1内で反応し
て発光が生じる。この発光を発光検出器2で捕らえて電
気信号に変換し、この信号を信号増幅器9で増幅した
後、記録計10に送る。記録計10には出力電圧が記録
され、出力電圧は、発光開始により定常状態の値から緩
やかに増加してやがて極大値に達し、過酸化水素の全量
が反応すれば徐々に減少して最初のレベルに戻る。この
発光検出器2からの出力電圧の応答値が、化学発光反応
による発光量(すなわち、(1)式の反応による過酸化
水素生成量)に相当し、被検査水中のリン酸イオン濃度
に比例する。
【0020】この装置により、化学発光試薬としてルミ
ノールを用い、濃度が既知のKH2 PO4 試料液のリン
酸イオン濃度を測定する実験を行った。容器3には、2
mM(Mはmol/lを表す)ピルビン酸、10-3Mチ
アミンピロリン酸と10-7Mフラビンアデニンジヌクレ
オチド(ともにピルビン酸オキシダーゼの補酵素)、お
よび0.2MTris−malate緩衝液(pH7.
0)からなる溶液を入れた。容器7には、12.5μM
ルミノール(予めジメチルスルホキシドにより溶解させ
たものを使用)、10μMp−ヨードフェノール(増感
剤)、1.0mg/dlペルオキシダーゼ、および0.
2MTris−HCl緩衝液(pH8.5)からなる溶
液を入れた。
【0021】第1流路Aに容器3内の液体を、第2流路
Bに容器7内の液体を常温でそれぞれ送液ポンプ4によ
り常時通して、発光検出器2の出力電圧を定常状態とし
た後、試料注入口5より各濃度のKH2 PO4 試料液1
00μlをマイクロシリンジで注入した。注入してから
記録計10に記録されるまでの時間は2、3分であっ
た。この実験により得られた検量線を図2に示す。この
グラフからわかるように、リン酸イオン濃度10-5〜1
-3Mの範囲内で、発光検出器2からの出力電圧と実際
のリン酸イオン濃度との間に直線関係が認められた。こ
の検量線により、被検査水をこの装置内に注入して得ら
れる発光検出器2からの出力電圧値で、被検査水中のリ
ン酸イオンが定量できる。
【0022】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のリン酸イ
オン濃度測定装置では、ピルビン酸オキシダーゼ固定
ラム内でピルビン酸とリン酸イオンとを反応させ、生じ
る過酸化水素の全量を発光反応させて得られた発光量を
検出することにより、リン酸イオン濃度を測定してい
る。ピルビン酸オキシダーゼは前記過酸化水素生成反応
を特異的に触媒するため、他の物質の影響を受けること
なく正確にリン酸イオン濃度の測定をすることができ
る。また、この装置は、両流路の送液ポンプを稼働させ
た状態で被検査水を注入口に注入するだけで、ピルビン
酸オキシダーゼ固定化カラム内部での過酸化水素生成反
応と化学発光反応部での発光反応が連続的に生じ、発光
検出器によって被検査水に含まれるリン酸イオンの定量
ができる。すなわち、この装置は、応答時間(被検査水
を注入してから結果が記録されるまでの時間)が短いた
めに、測定作業をリアルタイムで行うことができる。
た、不安定な酵素であるピルビン酸オキシダーゼがカラ
ムに固定化してあるため、膜に固定化した場合と比べて
長期間ピルビン酸オキシダーゼの活性を保持することが
できることから、前記過酸化水素生成反応を長期間確実
に起こさせることができる。したがって、本発明のリン
酸イオン濃度測定装置は、河川や湖沼などの水中のリン
酸イオン濃度を屋外の現場で正確且つ容易に測定するた
めの装置として有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のリン酸イオン濃度測定装置の一実施例
を示す概要図である。
【図2】本発明のリン酸イオン濃度測定装置の一実施例
を使用した実験により得られた検量線を示すグラフであ
る。
【符号の説明】
1 化学発光反応部 2 発光検出器 6 ピルビン酸オキシダーゼ固定化カラム
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−71399(JP,A) 特開 昭60−54699(JP,A) 特開 昭59−216586(JP,A) 特公 昭59−15637(JP,B2)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ピルビン酸を含む溶液の入った第一の容
    器と、送液ポンプと、試料注入口と、ピルビン酸オキシ
    ダーゼ固定化カラムと、をこの順に送液管で接続して第
    一流路を構成し、過酸化水素と反応して発光が生じる化
    学発光試薬を含む溶液の入った第二の容器と、送液ポン
    プと、をこの順に送液管で接続して第二流路を構成する
    とともに、前記第一流路を通った液体および前記第二流
    路を通った液体が導入されて過酸化水素と化学発光試薬
    との発光反応を生じさせる化学発光反応部と、当該化学
    発光反応部での発光量を検出する発光検出器とを有する
    ことを特徴とするリン酸イオン濃度測定装置。
  2. 【請求項2】 前記化学発光試薬がルミノールである請
    求項1記載のリン酸イオン濃度測定装置。
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