JPS5921396A - 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 - Google Patents
固定化酵素を用いた生体成分の定量法Info
- Publication number
- JPS5921396A JPS5921396A JP13063582A JP13063582A JPS5921396A JP S5921396 A JPS5921396 A JP S5921396A JP 13063582 A JP13063582 A JP 13063582A JP 13063582 A JP13063582 A JP 13063582A JP S5921396 A JPS5921396 A JP S5921396A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biological sample
- immobilized enzyme
- column
- measured
- branch channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素を用いた生体成分の定量法に関する
。
。
従来、生体成分、例えば血清中に微量に存在する胆汁酸
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば螢光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する反応物を予め加えておいた試料液を
担体に固定化された酵素が充填されたカラム（これを固
定化酵素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と
反応物を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを螢光
検出器により検出し、試料液中に含まれる被測定成分の
量を算出することが行われている。
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば螢光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する反応物を予め加えておいた試料液を
担体に固定化された酵素が充填されたカラム（これを固
定化酵素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と
反応物を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを螢光
検出器により検出し、試料液中に含まれる被測定成分の
量を算出することが行われている。
例えば胆汁酸の定量においては、予めニコチン酸アミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋と略す）を加え
た試料液を、酵素３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
グナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す）が固定化された担
体が充填された固定化酵素カラムに通してそこで胆汁酸
とＮＡＤ＋とを反応させ、その結果、胆汁酸と等モル量
の螢光物質ＮＡＤＨを生成させて該ＮＡＤＨを螢光光度
計で検出するか、又は、上記で発生させたＮＡＤＨをレ
サズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によってＮ
ＡＤに酸化させると同時にレサズリンを還元させて螢光
物質であるレゾルフインを生成させ、該レゾルフインの
螢光を測定することが行われている。
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋と略す）を加え
た試料液を、酵素３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
グナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す）が固定化された担
体が充填された固定化酵素カラムに通してそこで胆汁酸
とＮＡＤ＋とを反応させ、その結果、胆汁酸と等モル量
の螢光物質ＮＡＤＨを生成させて該ＮＡＤＨを螢光光度
計で検出するか、又は、上記で発生させたＮＡＤＨをレ
サズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によってＮ
ＡＤに酸化させると同時にレサズリンを還元させて螢光
物質であるレゾルフインを生成させ、該レゾルフインの
螢光を測定することが行われている。
しかしながら生体試料液が固定化酵素カラムを通過しな
い場合に示す測定値であるブランク値を測定しなければ
正確な被測定成分量の定量が出来ないものとなるので、
従来はブランク値の測定の為に固定化酵素カラムを設け
ない測定装置を別途用意していた。しかしこの場合はブ
ランク値の測定及び固定化酵素カラムを通過した生体試
料液の検出値を求めるために、生体試料を２度に分けて
採取する必要があり、又検出器を別々にしているため秤
量誤差を生じやすく、しかも測定時間が長くなる欠点が
あった。
い場合に示す測定値であるブランク値を測定しなければ
正確な被測定成分量の定量が出来ないものとなるので、
従来はブランク値の測定の為に固定化酵素カラムを設け
ない測定装置を別途用意していた。しかしこの場合はブ
ランク値の測定及び固定化酵素カラムを通過した生体試
料液の検出値を求めるために、生体試料を２度に分けて
採取する必要があり、又検出器を別々にしているため秤
量誤差を生じやすく、しかも測定時間が長くなる欠点が
あった。
本発明はかゝる欠点を解消することを目的とするもので
あり、その要旨とするところは、被測定成分を含む生体
試料液を固定化酵素カラムが接続されている分岐流路と
固定化酵素カラムが接続されない分岐流路に分流させ、
固定化酵素カラムが接続されている分岐流路を流れる生
体試料液をカラム内で固定化酵素と接触させて被測定成
分との反応を生じさせ、前記の各分岐流路を流通した生
体試料液を合流させ、前記の各分岐流路を流通した生体
試料液を時間差をおいて同じ検出器に到達させることに
より生体試料液のブランク値及び反応生成物を含有する
生体試料液の検出値を順次検出し、これらの検出値に基
づいて被測定成分量を定量することを特徴とする、固定
化酵素を用いた生体成分の定量法に存する。
あり、その要旨とするところは、被測定成分を含む生体
試料液を固定化酵素カラムが接続されている分岐流路と
固定化酵素カラムが接続されない分岐流路に分流させ、
固定化酵素カラムが接続されている分岐流路を流れる生
体試料液をカラム内で固定化酵素と接触させて被測定成
分との反応を生じさせ、前記の各分岐流路を流通した生
体試料液を合流させ、前記の各分岐流路を流通した生体
試料液を時間差をおいて同じ検出器に到達させることに
より生体試料液のブランク値及び反応生成物を含有する
生体試料液の検出値を順次検出し、これらの検出値に基
づいて被測定成分量を定量することを特徴とする、固定
化酵素を用いた生体成分の定量法に存する。
次に本発明固体化酵素を用いた生体成分の定量法につい
て図面を参照しながら更に詳細に説明する。
て図面を参照しながら更に詳細に説明する。
１は緩衝液槽であり、槽内の緩衝液には酵素の作用によ
り被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の場
合はＮＡＤ＋等が加えられている。２は定流量ポンプで
あり、緩衝液を定流量で送液するために設けられる。
り被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の場
合はＮＡＤ＋等が加えられている。２は定流量ポンプで
あり、緩衝液を定流量で送液するために設けられる。
３は被測定成分を含む生体試料の注入器であり、注入器
３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
生体試料と緩衝液は両者が均一に混合されて生体試料液
となる。生体試料液は注入器３を出た後、分岐流路４、
５に分流される。分岐流路４にはコイル状の流通管路６
を経を固定化酵素カラム７が接続されており、又分岐流
路５には前記流通管路６と同径のコイル状の流通管路８
が形成されている。分岐流路４、５は両者が並列に設け
られ、ほゞ同程度の長さの流通路とされている。
となる。生体試料液は注入器３を出た後、分岐流路４、
５に分流される。分岐流路４にはコイル状の流通管路６
を経を固定化酵素カラム７が接続されており、又分岐流
路５には前記流通管路６と同径のコイル状の流通管路８
が形成されている。分岐流路４、５は両者が並列に設け
られ、ほゞ同程度の長さの流通路とされている。
分岐流路４に分流される生体試料液はコイル状の流通管
路６を経て固定化酵素カラム７に導入され、カラム７内
で固定化酵素と接触することによりその触媒作用を受け
、被測定成分が液中の反応成分と反応して反応生成物を
生成する。
路６を経て固定化酵素カラム７に導入され、カラム７内
で固定化酵素と接触することによりその触媒作用を受け
、被測定成分が液中の反応成分と反応して反応生成物を
生成する。
分岐流路５に分流される生体試料液はコイル状の流通管
路８を経て流通する。コイル状の流通管路６、８は例え
ば内径が０．２ｍｍ、長さが１０ｍのステンレスチュー
ブを巻回したものでこれによる圧力損失は固定化酵素カ
ラム７と検出器９によるよりも著しく大きくなるので、
分岐流路４、５の流量の比はほゞ１：１になる。
路８を経て流通する。コイル状の流通管路６、８は例え
ば内径が０．２ｍｍ、長さが１０ｍのステンレスチュー
ブを巻回したものでこれによる圧力損失は固定化酵素カ
ラム７と検出器９によるよりも著しく大きくなるので、
分岐流路４、５の流量の比はほゞ１：１になる。
前記の各分岐流路４、５を流通した生体試料液は合成さ
れる。合流路１０には検出器９が設けられており、前記
の分岐流路５を流通した生体試料液がまず検出器９に到
達し、次いで若干の時間差をおいて分岐流路４を流通し
た生体試料液が検出器９に到達する。
れる。合流路１０には検出器９が設けられており、前記
の分岐流路５を流通した生体試料液がまず検出器９に到
達し、次いで若干の時間差をおいて分岐流路４を流通し
た生体試料液が検出器９に到達する。
そして分岐流路５を流通した生体試料液がまず検出器９
に到達することにより生体試料液のブランク値が測定さ
れ、次いで若干の時間差をおいて分岐流路４を流通した
生体試料液が検出器９に到達することにより反応生成物
を含有する生体試料液の検出値が順次得られる。
に到達することにより生体試料液のブランク値が測定さ
れ、次いで若干の時間差をおいて分岐流路４を流通した
生体試料液が検出器９に到達することにより反応生成物
を含有する生体試料液の検出値が順次得られる。
検出器９による検出結果は記録計１１に記録される。
このようにして反応生成物を含有する生体試料液の検出
値及びブランク値を螢光強度−時間曲線として求め、そ
の面積の差を計算すると共に、別に測定した検量線から
被測定成分の量を定量することができる。検出器９を出
た生体試料液は系外に排出される。
値及びブランク値を螢光強度−時間曲線として求め、そ
の面積の差を計算すると共に、別に測定した検量線から
被測定成分の量を定量することができる。検出器９を出
た生体試料液は系外に排出される。
本発明方法によれば、固定化酵素カラムを通過した生体
試料液の検出値、及び、ブランク値はいずれも同じ装置
における同じ検出器により測定することができるので、
生体試料の採取は一回で済み、又秤量誤差も生じ難いも
のとなり、更に測定時間を短縮することが可能となる。
試料液の検出値、及び、ブランク値はいずれも同じ装置
における同じ検出器により測定することができるので、
生体試料の採取は一回で済み、又秤量誤差も生じ難いも
のとなり、更に測定時間を短縮することが可能となる。
実施例
粒径約８０ミクロンのセルロース微粒子を担体として用
い、該微粒子５ｍｌにイオン交換水５ｍｌ、２Ｍ炭酸ナ
トリウム水溶液１０ｍｌを加えて撹拌したのち、これに
予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解したアセトニトリル
１ｍｌを加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。
い、該微粒子５ｍｌにイオン交換水５ｍｌ、２Ｍ炭酸ナ
トリウム水溶液１０ｍｌを加えて撹拌したのち、これに
予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解したアセトニトリル
１ｍｌを加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。
こうして活性化させたセルロース微粒子をすばやく０．
１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９．５）、イオン交換水及び０．
５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ
９．５）で洗浄したのち、３α−ＨＳＤ４４ｍｇを溶解
させた０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ＰＨ９．５）５ｍｌを加え、室温で２時間撹拌し
て反応させた。
１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９．５）、イオン交換水及び０．
５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ
９．５）で洗浄したのち、３α−ＨＳＤ４４ｍｇを溶解
させた０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ＰＨ９．５）５ｍｌを加え、室温で２時間撹拌し
て反応させた。
次に上記の処理により３α−ＨＳＤを固定化した微粒子
表面上なお存在する活性点をブロックするため、０．０
５％の２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）中で４℃で２時間反応させ
た。
表面上なお存在する活性点をブロックするため、０．０
５％の２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）中で４℃で２時間反応させ
た。
かくして得られた酸素固定化粒子を０．５Ｍの塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．０）、イオ
ン交換水及び０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ
炭酸緩衝液（ＰＨ９．５）で繰り返し洗浄したのち、長
さ１００ｍｍ、内径４ｍｍのカラムに充填し、固定化酵
素充填カラムを用意した。
リウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．０）、イオ
ン交換水及び０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ
炭酸緩衝液（ＰＨ９．５）で繰り返し洗浄したのち、長
さ１００ｍｍ、内径４ｍｍのカラムに充填し、固定化酵
素充填カラムを用意した。
上記のようにして得たカラムを第１図のカラム７として
用い、１ｌ中にＮＡＤ＋１９９ｍｇを含む０．１Ｍピロ
リン酸緩衝液（ＰＨ９．５）を緩衝液槽１に入れ、次い
で定流量ポンプ２で１．２ｍｌ／分の流量で送液し、送
液が安定した時点で健康人の血清０．０１ｍｌを注入器
３から注入し、緩衝液と混合させた。かくして得られた
試料液は２分されて分岐流路４、５に夫々流通し、分岐
流路５に分流した試料液は内径２ｍｍ、長さ１０ｍのコ
イル状の流通管路８を経て流通し、又分岐流路４に分流
した試料液は内径２ｍｍ、長さ１０ｍのコイル状の流通
管路６から固定化酵素カラム７を経て流通し、合流路１
０に達した。次いで検出器９に到達したが、この際分岐
流路５を流通した試料液は注入器３への注入後２０秒で
検出器９に到達し、又分岐流路４を流通した試料液は１
、２分後に検出器９に到達した。検出器９による検出は
励起波長３６０ｎｍ、螢光波長４６０ｎｍにより行ない
、第２図に示す螢光強度−時間曲線を得た。この曲線か
らピーク（ａ）の面積−ピーク（ｂ）の面積の値を求め
、これとは別に測定した検量線から血中胆汁酸値８μモ
ル／ｌの値を得た。
用い、１ｌ中にＮＡＤ＋１９９ｍｇを含む０．１Ｍピロ
リン酸緩衝液（ＰＨ９．５）を緩衝液槽１に入れ、次い
で定流量ポンプ２で１．２ｍｌ／分の流量で送液し、送
液が安定した時点で健康人の血清０．０１ｍｌを注入器
３から注入し、緩衝液と混合させた。かくして得られた
試料液は２分されて分岐流路４、５に夫々流通し、分岐
流路５に分流した試料液は内径２ｍｍ、長さ１０ｍのコ
イル状の流通管路８を経て流通し、又分岐流路４に分流
した試料液は内径２ｍｍ、長さ１０ｍのコイル状の流通
管路６から固定化酵素カラム７を経て流通し、合流路１
０に達した。次いで検出器９に到達したが、この際分岐
流路５を流通した試料液は注入器３への注入後２０秒で
検出器９に到達し、又分岐流路４を流通した試料液は１
、２分後に検出器９に到達した。検出器９による検出は
励起波長３６０ｎｍ、螢光波長４６０ｎｍにより行ない
、第２図に示す螢光強度−時間曲線を得た。この曲線か
らピーク（ａ）の面積−ピーク（ｂ）の面積の値を求め
、これとは別に測定した検量線から血中胆汁酸値８μモ
ル／ｌの値を得た。
第１図は本発明方法の実施態様を示す説明図、第２図は
実施例において得られた螢光強度−時間曲線を示す。 符号の説明 １・・・・・・緩衝液槽、２・・・・・・定流量ポンプ
、３・・・・・・注入器、４、５・・・・・・分岐流路
、６、８コイル状流通管路、７・・・・・・固定化酵素
カラム、９・・・・・・検出器、１０・・・・・・合流
路。 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 藤 沼 基 利
実施例において得られた螢光強度−時間曲線を示す。 符号の説明 １・・・・・・緩衝液槽、２・・・・・・定流量ポンプ
、３・・・・・・注入器、４、５・・・・・・分岐流路
、６、８コイル状流通管路、７・・・・・・固定化酵素
カラム、９・・・・・・検出器、１０・・・・・・合流
路。 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 藤 沼 基 利
Claims (1)
- １、被測定成分を含む生体試料液を固定化酵素カラムが
接続されている分岐流路と固定化酵素カラムが接続され
ない分岐流路に分流させ、固定化酵素カラムが接続され
ている分岐流路を流れる生体試料液をカラム内で固定化
酵素と接触させて被測定成分との反応を生じさせ、前記
の各分岐流路を流通した生体試料液を合流させ、前記の
各分岐流路を流通した生体試料液を時間差をおいて同じ
検出器に到達させることにより生体試料液のブランク値
及び反応生成物を含有する生体試料液の検出値を順次検
出し、これらの検出値に基づいて被測定成分量を定量す
ることを特徴とする、固定化酵素を用いた生体成分の定
量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063582A JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063582A JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921396A true JPS5921396A (ja) | 1984-02-03 |
| JPH0243477B2 JPH0243477B2 (ja) | 1990-09-28 |
Family
ID=15038958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13063582A Granted JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921396A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207597A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-10-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
| JPS60241898A (ja) * | 1984-05-15 | 1985-11-30 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
-
1982
- 1982-07-26 JP JP13063582A patent/JPS5921396A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207597A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-10-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
| JPS60241898A (ja) * | 1984-05-15 | 1985-11-30 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0243477B2 (ja) | 1990-09-28 |
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