JPS59130197A - 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 - Google Patents
固定化酵素を用いた生体成分の定量法Info
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- JPS59130197A JPS59130197A JP313883A JP313883A JPS59130197A JP S59130197 A JPS59130197 A JP S59130197A JP 313883 A JP313883 A JP 313883A JP 313883 A JP313883 A JP 313883A JP S59130197 A JPS59130197 A JP S59130197A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
末完ｌＶ１は固定化酵素を用いた生体成分の定量法に関
する。
する。
従来、生体成分、例えば血清中に微量に存在する胆汁酸
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する成分を予め加えておいた試料液を相
体に固定化された酵素が充填されたカラム（これを固定
化酵素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と反
応成分を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを蛍光
検出器により検出し、試料液中て含才れる被測定成分の
量を算出することが行われている。
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する成分を予め加えておいた試料液を相
体に固定化された酵素が充填されたカラム（これを固定
化酵素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と反
応成分を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを蛍光
検出器により検出し、試料液中て含才れる被測定成分の
量を算出することが行われている。
そして例えば米国特許第４，１５３，５１３号明Ｋ１ｊ
書においては、生体試料液である面清を捷ず透析し、透
析後の被測定成分を含む生体試料液を、（イ）検出器の
セルに導入してブランク値を検出した後、固定化酵素カ
ラムを通して廃液溜に捨てること、（ロ）透析後の生体
試料液を固定化酵素カラムに通し固定化酵素を利用して
反応させた後に検出器のセルに導入し、反応生成物を含
有する生体試料液の検出値を検出した後洗液溜に捨てる
こと、の両操作を生体試料液を連続的に流す間に頻繁に
切換えることにより、プランク値々反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を記録計により記録し、これらの
検出結果に基づいて試料液中の被測定成分を定量するこ
とが行なわれている。
書においては、生体試料液である面清を捷ず透析し、透
析後の被測定成分を含む生体試料液を、（イ）検出器の
セルに導入してブランク値を検出した後、固定化酵素カ
ラムを通して廃液溜に捨てること、（ロ）透析後の生体
試料液を固定化酵素カラムに通し固定化酵素を利用して
反応させた後に検出器のセルに導入し、反応生成物を含
有する生体試料液の検出値を検出した後洗液溜に捨てる
こと、の両操作を生体試料液を連続的に流す間に頻繁に
切換えることにより、プランク値々反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を記録計により記録し、これらの
検出結果に基づいて試料液中の被測定成分を定量するこ
とが行なわれている。
しかしながら上記の場合では、被測定成分の測定は透析
器による透析と固定化酵素カラムによる酵素反応が定常
状態に入り検出器による検出結果が安定し々ければ行な
うことができない。
器による透析と固定化酵素カラムによる酵素反応が定常
状態に入り検出器による検出結果が安定し々ければ行な
うことができない。
このだめ生体試料液中の被測定成分の定量に時間が川り
、生体試料液が多情に必要となる。
、生体試料液が多情に必要となる。
又、一般的に固定化酵素は生体試料液中の被ｍ１１定成
分によって徐々に失活してゆくので、固定化酵素を出来
る限り長期間使用するためには生体試料＃量を少くした
方がよい。しかしながら上記の場合には、切換弁をブラ
ンク測定側に切換えた時にも、検出器のセルを通過した
生体試料液は固定化酵素カラムを通過するという無駄が
ある。
分によって徐々に失活してゆくので、固定化酵素を出来
る限り長期間使用するためには生体試料＃量を少くした
方がよい。しかしながら上記の場合には、切換弁をブラ
ンク測定側に切換えた時にも、検出器のセルを通過した
生体試料液は固定化酵素カラムを通過するという無駄が
ある。
換言すれば、固定化酵素カラムを通過する生体試料液の
半量は無駄に流れ、固定化酵素カラムの寿命を縮め、又
固定化酵素カラムを通過することにより分析時間を長く
するものであった。
半量は無駄に流れ、固定化酵素カラムの寿命を縮め、又
固定化酵素カラムを通過することにより分析時間を長く
するものであった。
本発明は上記欠点を解消するものであり、その要旨とす
るところは、生体試料液を固定化酵素カラムを経ずに検
出器に導く流路、及び、生体試料液中の複数個の被測定
成分と同数６−置された固定化酵素カラムを経てＯｆＪ
記検出器に導く夫々の流路に、生体試料液を同量ずつ順
次導入することにより、生体試料液のブランク値及び夫
々の固定化酵素カラムにおける反応生成物を含む生体試
料液の検出値を順次検出し、これらの検出値に基づいて
被測定成分量を定量することを特徴とする、固定化酵素
を用いた生体成分の定量法に存する。
るところは、生体試料液を固定化酵素カラムを経ずに検
出器に導く流路、及び、生体試料液中の複数個の被測定
成分と同数６−置された固定化酵素カラムを経てＯｆＪ
記検出器に導く夫々の流路に、生体試料液を同量ずつ順
次導入することにより、生体試料液のブランク値及び夫
々の固定化酵素カラムにおける反応生成物を含む生体試
料液の検出値を順次検出し、これらの検出値に基づいて
被測定成分量を定量することを特徴とする、固定化酵素
を用いた生体成分の定量法に存する。
次に末完りＪ固定化酵素を用いた生体酸部の定量法につ
いて更に詳細に説明する。
いて更に詳細に説明する。
第１図乃至第３図において、１は緩衝液槽であり、槽内
の緩衝液には酵素の作用により被測定成分き反応しうる
成分、例えば胆汁酸分析の場合はＮＡＤ （−コチン
酸アミドアデニンジヌタレオチド）等が加えられている
。又は定流゛Ｍ水ポンプあり、緩衝液を定流量で送液す
るだめに設けられる。
の緩衝液には酵素の作用により被測定成分き反応しうる
成分、例えば胆汁酸分析の場合はＮＡＤ （−コチン
酸アミドアデニンジヌタレオチド）等が加えられている
。又は定流゛Ｍ水ポンプあり、緩衝液を定流量で送液す
るだめに設けられる。
３は被測定成分を含む生体試料液の注入器であり、試料
注入器３内で生体試料液と緩衝液とが合流する。
注入器３内で生体試料液と緩衝液とが合流する。
４及び５け６方切換弁であり、生体試料液全切換弁４．
５の切換えにより各流路に送給することができる０ ６は酵素３ Ｑ！ −ＨＳ Ｔ’）を固定化したものが
充填されている、固定化酵素カラムであり、７け酵素７
Ｏ−Ｈ５Ｄを固定化したものが充填されている固定化酵
素カラムである。８は検出器、９は記録計、１０は廃液
溜である。
５の切換えにより各流路に送給することができる０ ６は酵素３ Ｑ！ −ＨＳ Ｔ’）を固定化したものが
充填されている、固定化酵素カラムであり、７け酵素７
Ｏ−Ｈ５Ｄを固定化したものが充填されている固定化酵
素カラムである。８は検出器、９は記録計、１０は廃液
溜である。
上記の場合において、定流量ポンプ２により緩衝液Ｗ１
１のＮＡＤ＋を含む緩衝液が試ｔ１注入器３に送給され
、生体試石七混合される。切換弁４゜５がまず第１図の
状態に設定されていると、流路１１，１２．１３によっ
て生体試料液を固定化酵素カラム６．７を経ずに検出器
８に導く流路が形成され、生体試料液は検出器８により
そのブランク値が検出される。流路１４，１５ｔ′ｉ閉
ざされており、生体試料液は流入しない。
１のＮＡＤ＋を含む緩衝液が試ｔ１注入器３に送給され
、生体試石七混合される。切換弁４゜５がまず第１図の
状態に設定されていると、流路１１，１２．１３によっ
て生体試料液を固定化酵素カラム６．７を経ずに検出器
８に導く流路が形成され、生体試料液は検出器８により
そのブランク値が検出される。流路１４，１５ｔ′ｉ閉
ざされており、生体試料液は流入しない。
次に第２図の状態に６方切換弁４．５ｆｒ、切換え、ブ
ランク値を検出した際七同量の生体試料液を導入する。
ランク値を検出した際七同量の生体試料液を導入する。
流路１１，１５によって生体試料液を固定化酵素カラム
７を経て検出器８に導く流路が形成され、流路１２，１
３，１４け閉ざされる。生体試料液は固定化酵素カラム
７に導入され、酵素７α−Ｈ８Ｄの存在下に反応が行な
われ、７０１位に水酸基を持つ胆汁酸の反応生成物が得
られる。この反応生成物を含有する生体試料液は検出器
８に導かれ、検出値は記録計９により記録される。
７を経て検出器８に導く流路が形成され、流路１２，１
３，１４け閉ざされる。生体試料液は固定化酵素カラム
７に導入され、酵素７α−Ｈ８Ｄの存在下に反応が行な
われ、７０１位に水酸基を持つ胆汁酸の反応生成物が得
られる。この反応生成物を含有する生体試料液は検出器
８に導かれ、検出値は記録計９により記録される。
次に第３図の状態に６方切換弁４，５を切換え、ＩＱ記
と同量の生体試料液を導入する。流路１３゜１４によっ
て固定化酵素カラム６を経て検出器８に導く流路が形成
され、流路１１，１２．１５は閉ざされる。生体試料液
は固定化酵素力う八６に導入され、酵素３α−Ｈ８Ｄの
存在下に反応が行なわれ、３０位に水酸基を有する胆汁
酸の反応生成物が得られる。この反応生成物を含有する
生体試料液は検出器８に導かれ、検出値が記録計９によ
り記録される。
と同量の生体試料液を導入する。流路１３゜１４によっ
て固定化酵素カラム６を経て検出器８に導く流路が形成
され、流路１１，１２．１５は閉ざされる。生体試料液
は固定化酵素力う八６に導入され、酵素３α−Ｈ８Ｄの
存在下に反応が行なわれ、３０位に水酸基を有する胆汁
酸の反応生成物が得られる。この反応生成物を含有する
生体試料液は検出器８に導かれ、検出値が記録計９によ
り記録される。
このようにして得られる検出結果は、第４図に示すよう
なものとなる。
なものとなる。
ピーク（ａ）はブランク値を示しており、その面積値Ａ
が求められる。ピーク（ｂ）は固定化酵素カラム７にお
ける反応生成物を含む生体試料液の検出値であり、その
面積値Ｂが求められる。ピーク（ｃ）は固定化酵素カラ
ム６における反応生成物を含む生体試料液の検出値であ
り、その面積値Ｃが求められる。面積値ＣとＡの差Ｅに
より試料中の総胆汁酸量を示す値が得られ、又面積値Ｂ
とＡの差をＥより差引くことにより３α位に水酸基を持
つが７ＩｌｌｌＩ位に水酸基を持たない２次胆汁酸量を
示す面積値Ｆが求められる。又ＢとＦの差より１次胆汁
酸素を示す面積値が求められる。
が求められる。ピーク（ｂ）は固定化酵素カラム７にお
ける反応生成物を含む生体試料液の検出値であり、その
面積値Ｂが求められる。ピーク（ｃ）は固定化酵素カラ
ム６における反応生成物を含む生体試料液の検出値であ
り、その面積値Ｃが求められる。面積値ＣとＡの差Ｅに
より試料中の総胆汁酸量を示す値が得られ、又面積値Ｂ
とＡの差をＥより差引くことにより３α位に水酸基を持
つが７ＩｌｌｌＩ位に水酸基を持たない２次胆汁酸量を
示す面積値Ｆが求められる。又ＢとＦの差より１次胆汁
酸素を示す面積値が求められる。
このようにして得られた値を用い、別に測定した検量線
から被測定成分の量を定量することができる。
から被測定成分の量を定量することができる。
第５図は上記とけ別の態様を示すものであり、ロークリ
方式の６方切換弁２４が使用されており、生体試料液を
固定化酵素カラムを経ずに検出器１８に導く流路２８、
固定化酵素カラム２５゜２６．２７を経て検出器１８に
導く流路２９゜３０．３１が夫々並列的に設けられてい
る。固定化酵素カラム２５には、酵素３α−Ｈ８Ｄを固
定化したもの、固定化酵素カラム２６には酵素７α−Ｈ
５Ｄを固定化したもの、固定化酵素カラム２７には酵素
１２α−Ｈ５Ｄを固定化し、たものが夫々充填されてい
る。
方式の６方切換弁２４が使用されており、生体試料液を
固定化酵素カラムを経ずに検出器１８に導く流路２８、
固定化酵素カラム２５゜２６．２７を経て検出器１８に
導く流路２９゜３０．３１が夫々並列的に設けられてい
る。固定化酵素カラム２５には、酵素３α−Ｈ８Ｄを固
定化したもの、固定化酵素カラム２６には酵素７α−Ｈ
５Ｄを固定化したもの、固定化酵素カラム２７には酵素
１２α−Ｈ５Ｄを固定化し、たものが夫々充填されてい
る。
切換弁２４が捷ず（ト）の位置に設定された状態で、定
流量ポンプ２により緩衝液槽１のＮＡＤ を含む緩衝
液が試料注入器３に送給され、生体試料と混合され、次
いで生体試料液は流路２８を経て検出器１８に導かれ、
そのブランク値が検出される。
流量ポンプ２により緩衝液槽１のＮＡＤ を含む緩衝
液が試料注入器３に送給され、生体試料と混合され、次
いで生体試料液は流路２８を経て検出器１８に導かれ、
そのブランク値が検出される。
次いで切換弁２４が（イ）の位置に切換え、同一量の生
体試料液を流路２９に導入し、固定化酵素カラム２５内
で反応を生じさせ、反応生成物を含有する生体試料液は
検出器１８に導かれ、検出値は記録計１９により記録さ
れる。
体試料液を流路２９に導入し、固定化酵素カラム２５内
で反応を生じさせ、反応生成物を含有する生体試料液は
検出器１８に導かれ、検出値は記録計１９により記録さ
れる。
検出器１８を出た生体試料液Ｉ″ｉ膓液溶液溜に導かれ
る。
る。
次いで同様に切換弁２４が（り）、に）の位置に順次切
換えられ、各同量の生体試料液が流路３０゜３１に導か
れ、固定化酵素カラム２６．２７内で反応が行われ、反
応生成物を含有する生体試料液が順次検出器１８に導か
れ、検出値が記録計１９により記録される。
換えられ、各同量の生体試料液が流路３０゜３１に導か
れ、固定化酵素カラム２６．２７内で反応が行われ、反
応生成物を含有する生体試料液が順次検出器１８に導か
れ、検出値が記録計１９により記録される。
このようにして得られる検出結果は、第６図に示すよう
なものとなる。
なものとなる。
ピーク（ｂ）の面積値Ｂとピーク（ａ）の面積値Ａとの
差より総胆汁酸量を示す面積値Ｅが得られ、ピーク（ｃ
）の面積値Ｃとピーク（ａ）の面積値′Ａとの差より７
Ｑ！胆汁酸量を示す面積値Ｆが得られ、ピーク（ｄ）の
面積値りとピーク（ａ）と面積値Ａとの差より１２ａ！
胆汁酸量を示す面積値Ｇが得られる。
差より総胆汁酸量を示す面積値Ｅが得られ、ピーク（ｃ
）の面積値Ｃとピーク（ａ）の面積値′Ａとの差より７
Ｑ！胆汁酸量を示す面積値Ｆが得られ、ピーク（ｄ）の
面積値りとピーク（ａ）と面積値Ａとの差より１２ａ！
胆汁酸量を示す面積値Ｇが得られる。
このようにして得られた値を用い、別に測定した検量線
から被測定成分の量を定量することができる。
から被測定成分の量を定量することができる。
本発明方法によれば、生体試料液中の被測定成分量を定
量するために、ブランク値を測定する場合に固定化酵素
カラムに生体試料液を無駄に通過させないので固定化酵
素カラムの失活をその分防ぐことができる。又生体試料
中の被測定成分はクロマトグラフィーによって分離する
必要がなく、測定時間が短かくなる。
量するために、ブランク値を測定する場合に固定化酵素
カラムに生体試料液を無駄に通過させないので固定化酵
素カラムの失活をその分防ぐことができる。又生体試料
中の被測定成分はクロマトグラフィーによって分離する
必要がなく、測定時間が短かくなる。
実施例１
粒径約８０ミクロンのセルロース微粒子を担体として用
い、該微粒子５ ｍｅにイオン交換水５ｍ／、２Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液１０ｍｅを加えて撹拌したのち、これ
に予めシアン化ブロマイド２ｙを溶解したアセトニトリ
ルＩＷｄ！を加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させ
た。
い、該微粒子５ ｍｅにイオン交換水５ｍ／、２Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液１０ｍｅを加えて撹拌したのち、これ
に予めシアン化ブロマイド２ｙを溶解したアセトニトリ
ルＩＷｄ！を加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させ
た。
こうして活性化させたセルロース微粒子をすばや＜ ０
． Ｉ Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）、イオン交換水
及びα５Ｍの塩化ナトリウムを含む９１Ｍ炭酸緩衝液（
Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３（１！−Ｈ５Ｄ４４
ｒｎ９を溶解させたα５Ｍの塩化す） ＩＪウムを含む
０．１ Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５） ５ ｍｅを加
え、室温で２時開撹拌して反応させた。
． Ｉ Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）、イオン交換水
及びα５Ｍの塩化ナトリウムを含む９１Ｍ炭酸緩衝液（
Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３（１！−Ｈ５Ｄ４４
ｒｎ９を溶解させたα５Ｍの塩化す） ＩＪウムを含む
０．１ Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５） ５ ｍｅを加
え、室温で２時開撹拌して反応させた。
次に上記の処理により３α−Ｈ８Ｄを固定化した微粒子
表面上なお存在する活性点をブロックするため、Ｏ，Ｑ
−５９６の２−メルカプトエタノールを含む０． Ｉ
Ｍ ｌ−ＩＪスス−酸緩衝液（ＰＨ８，０）中で４℃で
２時間反応させた。
表面上なお存在する活性点をブロックするため、Ｏ，Ｑ
−５９６の２−メルカプトエタノールを含む０． Ｉ
Ｍ ｌ−ＩＪスス−酸緩衝液（ＰＨ８，０）中で４℃で
２時間反応させた。
かくして得られた酵素固定化微粒子を０．５λ（の塩化
ナトリウムを含む０．１ Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ Ｈ５，０
）、イオン交換水及び０．５ Ｍの塩化す） ＩＪウム
を含む９１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）で繰り返し洗浄
したのち、長さ１００ｍｍ、内径４ ｔａｎ ｔ７）
ｈラムに充填し、３α−１１ＳＤの固定化酵素カラムを
用意した。
ナトリウムを含む０．１ Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ Ｈ５，０
）、イオン交換水及び０．５ Ｍの塩化す） ＩＪウム
を含む９１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）で繰り返し洗浄
したのち、長さ１００ｍｍ、内径４ ｔａｎ ｔ７）
ｈラムに充填し、３α−１１ＳＤの固定化酵素カラムを
用意した。
又、上Ｅノ３ （］！−ＨＳ Ｄヲ、７ Ｑ！ −ＨＳ
Ｄ Ｋ置き換えて、同様の操作で、７α〜？（ＳＤの
固定化酵素カラムを用意した。
Ｄ Ｋ置き換えて、同様の操作で、７α〜？（ＳＤの
固定化酵素カラムを用意した。
上記のようにして得た３Ｑ！−Ｈ５Ｄカラム及び７α−
Ｈ５Ｄカラムを、それぞれ第１図乃至第３図のカラム６
及びカラム７として用い、ＩＪ中にＮ Ａ Ｄ ＋１９
９ ｍｇを含む０．１Ｍビロリン酸Ｍ衝液（Ｐ ）１９
．５ ）を緩衝液槽１に入れ、次いで定流量ポンプ２で
、１ ｍｅ ７分の流量で送液し、送液が安定した時点
で、肝内胆汁うつ滞患者の血清０．０１ ｍｅを試料注
入器３により注入し、緩衝液と混合させた。かくしで、
全ての試料が検出１を通過した。ただちに切換弁５金切
り替えることによって、ｗＪ２図の流路とし、同一の血
清０．０１ ｍｅを試料注入器３により注入した。この
試料は、カラム７で酵素反応を行った後、注入後２分で
、全ての試料か検出器８を通過した。ただちに切換弁４
及び５を切り替えることによって第３図の流路とし、同
一の血清Ｄｏ １ｒｎｌを試料注入器３により注入した
ところ、この試ｔ）は、カラム６で酵素反応を行った後
、注入後、２分で、全ての試料が検出器８を通過した。
Ｈ５Ｄカラムを、それぞれ第１図乃至第３図のカラム６
及びカラム７として用い、ＩＪ中にＮ Ａ Ｄ ＋１９
９ ｍｇを含む０．１Ｍビロリン酸Ｍ衝液（Ｐ ）１９
．５ ）を緩衝液槽１に入れ、次いで定流量ポンプ２で
、１ ｍｅ ７分の流量で送液し、送液が安定した時点
で、肝内胆汁うつ滞患者の血清０．０１ ｍｅを試料注
入器３により注入し、緩衝液と混合させた。かくしで、
全ての試料が検出１を通過した。ただちに切換弁５金切
り替えることによって、ｗＪ２図の流路とし、同一の血
清０．０１ ｍｅを試料注入器３により注入した。この
試料は、カラム７で酵素反応を行った後、注入後２分で
、全ての試料か検出器８を通過した。ただちに切換弁４
及び５を切り替えることによって第３図の流路とし、同
一の血清Ｄｏ １ｒｎｌを試料注入器３により注入した
ところ、この試ｔ）は、カラム６で酵素反応を行った後
、注入後、２分で、全ての試料が検出器８を通過した。
検出器８による検出は、励起波長３６０ｎｍ。
蛍光波長４６０ ｎｍ Ｋより行ない、第４図に示す蛍
光強度□時間曲線を得・だ。第４図のピーク（ｂ）の而
ｍＢとピーク（ａ）の面積への差より、総胆汁酸晋に対
応する面積Ｅが、又、ピーク（ｃ）の面積Ｃさピーク（
ａ）の面積Ａの差より、１次胆汁酸（コール酸、ケノデ
オキシコール酸）量に対応する面積Ｆが、又、Ａ、！：
Ｂの差より、２次ｊｌｌｌ−１ｆｆ（クルソデオキシコ
ール酸、デオキシコール酸、リトコール酸）量に対応す
る面積Ｇが求められ、別に求めた検量線より順に、７９
ｐＭ、７２μＭ、７μＭと求められた。
光強度□時間曲線を得・だ。第４図のピーク（ｂ）の而
ｍＢとピーク（ａ）の面積への差より、総胆汁酸晋に対
応する面積Ｅが、又、ピーク（ｃ）の面積Ｃさピーク（
ａ）の面積Ａの差より、１次胆汁酸（コール酸、ケノデ
オキシコール酸）量に対応する面積Ｆが、又、Ａ、！：
Ｂの差より、２次ｊｌｌｌ−１ｆｆ（クルソデオキシコ
ール酸、デオキシコール酸、リトコール酸）量に対応す
る面積Ｇが求められ、別に求めた検量線より順に、７９
ｐＭ、７２μＭ、７μＭと求められた。
実施例２
実施例１と同じ操作で、３ ａｌ −ＨＳ Ｄ及び７α
−ＨＳ ｎの固定化酵素カラムを用意し／こ。
−ＨＳ ｎの固定化酵素カラムを用意し／こ。
ヌ、同様にして１２０−ＨＳ Ｉ）固定化酵素カラムを
用意した。上記のようにして得た、３Ｑ！−Ｈ５Ｄ、
７（１１−Ｈ５Ｔ）、 １ ２ Ｑ！−ＨＳ Ｄの
各固定化酵素カラムを、順に、第５図の固定化酵素カラ
ム２５，２６．２７とシテ用い、実施例１と同じ緩衝液
を、緩衝液１ａ２ｘに入れ、次にａ−タリー切換弁４を
、第５図の（ト）の位置にして、定流量ポンプ２２で１
献／分の流量で送液し、送液が安定した時点で、肝性胆
汁うつ滞患者の血？ｌ１ｒ０．０１ ｍｅを試料注入器
２３に！り注入し、緩衝液と混合させた。
用意した。上記のようにして得た、３Ｑ！−Ｈ５Ｄ、
７（１１−Ｈ５Ｔ）、 １ ２ Ｑ！−ＨＳ Ｄの
各固定化酵素カラムを、順に、第５図の固定化酵素カラ
ム２５，２６．２７とシテ用い、実施例１と同じ緩衝液
を、緩衝液１ａ２ｘに入れ、次にａ−タリー切換弁４を
、第５図の（ト）の位置にして、定流量ポンプ２２で１
献／分の流量で送液し、送液が安定した時点で、肝性胆
汁うつ滞患者の血？ｌ１ｒ０．０１ ｍｅを試料注入器
２３に！り注入し、緩衝液と混合させた。
かくして得られた試料液は、注入後１５秒で検出器に達
し、注入後５５秒で、全ての試料が検出器を通過した。
し、注入後５５秒で、全ての試料が検出器を通過した。
ただちに、切換弁２４金切り替え、て、第５図の（イ）
の流路２９とし、同一の血清０．０１ ｍｅを試料注入
器２３により注入した。この試料は、固定化酵素カラム
２５で酵素反応を行った後、注入後２分で、全ての試料
が検出器１８を通過した。以下同様に切換弁２４を、（
つ）、に）の位置に切換え、そのつど同一血清０．０１
ｍｅを注入し、固定化ｎ素カラム２６．２７で反応を
行わせた後、検出器１８に導いた。検出器１８による検
出は、ポルタンメトリーＶＭＤ−１で行い、第６図に示
す、電流強度□時間曲線を得た。第６図の、ピーク（ｂ
）の面積Ｂとピーク（ａ）の面積への差より総胆汁酸最
に対応する面積Ｅが、ピーク（ｃ）の而８′ｔＣとピー
ク（ａ）の面積Ａの差より７０胆汁Ｍ（コール酸、ケノ
デオキシコール酸）引゛に対応する面積Ｆが、ピーク（
ｄ）の面積りとピーク（ａ）の面積Ａの差より１２α胆
汁酸（コール酸、デオキシコール酸）に対応する而ｇｔ
Ｇが求められ、別に求めた検量線より換算して、（Ｆ十
Ｇ−Ｅ）よりコール酸は、５８μＭ、Ｆの換算濃度から
コール酸濃度をひくことにまりケノデオキシコール酸は
２９μＭ１Ｇの換算濃度からコール酸濃度をひくことに
よりデオキシフール酸は３μＭと求められた。
の流路２９とし、同一の血清０．０１ ｍｅを試料注入
器２３により注入した。この試料は、固定化酵素カラム
２５で酵素反応を行った後、注入後２分で、全ての試料
が検出器１８を通過した。以下同様に切換弁２４を、（
つ）、に）の位置に切換え、そのつど同一血清０．０１
ｍｅを注入し、固定化ｎ素カラム２６．２７で反応を
行わせた後、検出器１８に導いた。検出器１８による検
出は、ポルタンメトリーＶＭＤ−１で行い、第６図に示
す、電流強度□時間曲線を得た。第６図の、ピーク（ｂ
）の面積Ｂとピーク（ａ）の面積への差より総胆汁酸最
に対応する面積Ｅが、ピーク（ｃ）の而８′ｔＣとピー
ク（ａ）の面積Ａの差より７０胆汁Ｍ（コール酸、ケノ
デオキシコール酸）引゛に対応する面積Ｆが、ピーク（
ｄ）の面積りとピーク（ａ）の面積Ａの差より１２α胆
汁酸（コール酸、デオキシコール酸）に対応する而ｇｔ
Ｇが求められ、別に求めた検量線より換算して、（Ｆ十
Ｇ−Ｅ）よりコール酸は、５８μＭ、Ｆの換算濃度から
コール酸濃度をひくことにまりケノデオキシコール酸は
２９μＭ１Ｇの換算濃度からコール酸濃度をひくことに
よりデオキシフール酸は３μＭと求められた。
＠１図乃至第３図は本発明方法の実施態様を示し、第１
図はブランク値を検出する状態の説明図、第２図及び第
３図は反応生成物を含有する生体試料液の検出値を得る
状態の説明図、第４図は実施例１における検出結果の記
録図、第５図は末完’ＪＪ方法の他の実施態様を示す説
明図、第６図は実施例２における検出結果の記録図であ
る。 符号の説明 ｌ緩衝液槽、２定流量ポンプ、３試料注入器、４．５．
６方切換弁、６，７固定化酵素カラム、８検出器、９記
録計、１ｏ廃液溜 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 藤 沼 基 利
図はブランク値を検出する状態の説明図、第２図及び第
３図は反応生成物を含有する生体試料液の検出値を得る
状態の説明図、第４図は実施例１における検出結果の記
録図、第５図は末完’ＪＪ方法の他の実施態様を示す説
明図、第６図は実施例２における検出結果の記録図であ
る。 符号の説明 ｌ緩衝液槽、２定流量ポンプ、３試料注入器、４．５．
６方切換弁、６，７固定化酵素カラム、８検出器、９記
録計、１ｏ廃液溜 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 藤 沼 基 利
Claims (1)
- １ 生体試料液を固定化酵素カラムを経ずに検出器に導
く流路、及び、生体試ネ゛１液中の複数個・の被測定成
分と同数４置された固定化酵素カラムを経て１ｉｆｔ記
検出器に導く夫々の流路に、生体試料液を同量ずつ順次
導入するこＬＫより、生体試ｒｌ液のブランク値及び夫
々の固定化酵素カラムにおける反応生成物を含む生体試
料液の検出値を順次□検出し、これらの検出値に阜づい
て被測定成分惜を定量するこ上音特徴とする、固定化酵
素を用いた生体成分の定量法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP313883A JPS59130197A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP313883A JPS59130197A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130197A true JPS59130197A (ja) | 1984-07-26 |
Family
ID=11548986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP313883A Pending JPS59130197A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59130197A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5847484A (ja) * | 1981-09-12 | 1983-03-19 | Rikagaku Kenkyusho | 生体試料分析装置 |
-
1983
- 1983-01-11 JP JP313883A patent/JPS59130197A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5847484A (ja) * | 1981-09-12 | 1983-03-19 | Rikagaku Kenkyusho | 生体試料分析装置 |
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