JPH09206098A - 硫酸抱合胆汁酸検出方法及び硫酸抱合胆汁酸検出装置 - Google Patents
硫酸抱合胆汁酸検出方法及び硫酸抱合胆汁酸検出装置Info
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- JPH09206098A JPH09206098A JP2121196A JP2121196A JPH09206098A JP H09206098 A JPH09206098 A JP H09206098A JP 2121196 A JP2121196 A JP 2121196A JP 2121196 A JP2121196 A JP 2121196A JP H09206098 A JPH09206098 A JP H09206098A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 日常検査に充分利用可能な硫酸抱合胆汁酸検
出方法及び装置，それに用いる固定化酵素カラム，硫酸
抱合胆汁酸センサの提供。 【解決手段】 第１段階。第１の経路１１を流動するキ
ャリア液に，試料溶液をエジェクター３から注入し，固
定化酵素カラム２０に接触させて，前記試料溶液が硫酸
抱合胆汁酸を含む場合において特定物質を生成する。第
２段階。前記酵素に接触した前記試料溶液を含むキャリ
ア液に前記経路とは，異なる第２の経路１２で流動する
反応液を混合して混合液を得，前記混合液に前記特定物
質が含まれている場合，前記特定物質と前記反応液との
化学反応によって発光させる。第３段階。硫酸抱合胆汁
酸センサ１０の化学発光セル６中の前記混合液の発光量
を光電子増倍管７及びこれに接続されたフォトンカウン
タ８によって，測定し，このカウント値から前記試料溶
液中の硫酸抱合胆汁酸の濃度を測定する。
出方法及び装置，それに用いる固定化酵素カラム，硫酸
抱合胆汁酸センサの提供。 【解決手段】 第１段階。第１の経路１１を流動するキ
ャリア液に，試料溶液をエジェクター３から注入し，固
定化酵素カラム２０に接触させて，前記試料溶液が硫酸
抱合胆汁酸を含む場合において特定物質を生成する。第
２段階。前記酵素に接触した前記試料溶液を含むキャリ
ア液に前記経路とは，異なる第２の経路１２で流動する
反応液を混合して混合液を得，前記混合液に前記特定物
質が含まれている場合，前記特定物質と前記反応液との
化学反応によって発光させる。第３段階。硫酸抱合胆汁
酸センサ１０の化学発光セル６中の前記混合液の発光量
を光電子増倍管７及びこれに接続されたフォトンカウン
タ８によって，測定し，このカウント値から前記試料溶
液中の硫酸抱合胆汁酸の濃度を測定する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，尿中の硫酸抱合胆
汁酸濃度を測定するための硫酸抱合胆汁酸センサ，硫酸
抱合胆汁酸濃度測定方法，及び装置に関する。
汁酸濃度を測定するための硫酸抱合胆汁酸センサ，硫酸
抱合胆汁酸濃度測定方法，及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】胆汁酸は，肝臓内でコレステロールから
合成され，胆汁中に排出される胆汁の主成分である。胆
汁酸は，食事摂取時に胆汁と共に十二指腸に排出され，
脂肪の消化，吸収を促進する働きをしている。排出され
た胆汁酸の大部分は，回腸周辺から吸収され，門脈を通
って肝臓に戻るという腸管循環をしている。胆汁酸の不
足分は，コレステロールから吸収され，胆汁酸量は一定
に保持される。正常時には，血液中に漏出する量は極め
て少量であるが，肝胆道系疾患による肝内或いは肝外で
の胆汁のうっ滞時に胆汁酸は大循環系に入る。また，肝
細胞障害時は生体防御機能として硫酸抱合胆汁酸が多く
作られ，血中へ遊出される。さらに，一部肝細胞障害に
よる取り込み障害もあって，血液中の胆汁酸濃度が一層
高くなることは良く知られている。この様に，胆汁酸の
動態は，肝臓と密接な関係がある生体成分で，血液中の
胆汁酸濃度は肝臓機能を直接反映する重要な指標とな
る。
合成され，胆汁中に排出される胆汁の主成分である。胆
汁酸は，食事摂取時に胆汁と共に十二指腸に排出され，
脂肪の消化，吸収を促進する働きをしている。排出され
た胆汁酸の大部分は，回腸周辺から吸収され，門脈を通
って肝臓に戻るという腸管循環をしている。胆汁酸の不
足分は，コレステロールから吸収され，胆汁酸量は一定
に保持される。正常時には，血液中に漏出する量は極め
て少量であるが，肝胆道系疾患による肝内或いは肝外で
の胆汁のうっ滞時に胆汁酸は大循環系に入る。また，肝
細胞障害時は生体防御機能として硫酸抱合胆汁酸が多く
作られ，血中へ遊出される。さらに，一部肝細胞障害に
よる取り込み障害もあって，血液中の胆汁酸濃度が一層
高くなることは良く知られている。この様に，胆汁酸の
動態は，肝臓と密接な関係がある生体成分で，血液中の
胆汁酸濃度は肝臓機能を直接反映する重要な指標とな
る。
【０００３】現在，肝臓の機能の検査する方法として採
血により，硫酸亜鉛混濁反応（ＺＴＴ），トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ等）を調査する方法がある。
血により，硫酸亜鉛混濁反応（ＺＴＴ），トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ等）を調査する方法がある。
【０００４】しかしながら，これらの方法は採血という
苦痛と手間とを伴うものであるとともに，得られた測定
値が肝臓機能を直接反映するものではなかった。これ
は，肝機能自体が極端に悪くなると，上述した方法で用
いられるＺＴＴ等は，正常値に近くなるためである。
苦痛と手間とを伴うものであるとともに，得られた測定
値が肝臓機能を直接反映するものではなかった。これ
は，肝機能自体が極端に悪くなると，上述した方法で用
いられるＺＴＴ等は，正常値に近くなるためである。
【０００５】他方，肝機能が悪化すると，硫酸抱合型胆
汁酸が生じることが知られている。硫酸抱合型胆汁酸
は，硫酸抱合されると水溶性を著しく増し，肝臓におけ
るクリアランスは数倍から数百倍に上昇し，尿中に大部
分が排出される。これらは，一種の解毒機構と考えられ
る。即ち，肝胆道系疾患の場合，尿中には血清中の胆汁
酸濃度の増加とともに，尿中の硫酸抱合型胆汁酸も増加
することになる。
汁酸が生じることが知られている。硫酸抱合型胆汁酸
は，硫酸抱合されると水溶性を著しく増し，肝臓におけ
るクリアランスは数倍から数百倍に上昇し，尿中に大部
分が排出される。これらは，一種の解毒機構と考えられ
る。即ち，肝胆道系疾患の場合，尿中には血清中の胆汁
酸濃度の増加とともに，尿中の硫酸抱合型胆汁酸も増加
することになる。
【０００６】従って，硫酸抱合型胆汁酸の簡便な測定が
可能になれば，尿によって肝機能検査が可能になると考
えられる。
可能になれば，尿によって肝機能検査が可能になると考
えられる。
【０００７】従来，この硫酸抱合型胆汁酸の濃度を測定
するのに，化学的方法であるソルポルシスにより硫酸エ
ステルを加水分解して，脱硫酸後，ガスクロマトグラフ
ィ（ＧＣ）分析法，あるいは，ＧＣ−ＭＳ（マススペク
トル）分析法で測定する方法が取られてきたが，さらに
これらを簡略化して，高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）法，或いは酵素蛍光法で測定する方法も報告さ
れている。
するのに，化学的方法であるソルポルシスにより硫酸エ
ステルを加水分解して，脱硫酸後，ガスクロマトグラフ
ィ（ＧＣ）分析法，あるいは，ＧＣ−ＭＳ（マススペク
トル）分析法で測定する方法が取られてきたが，さらに
これらを簡略化して，高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）法，或いは酵素蛍光法で測定する方法も報告さ
れている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら，前述し
た分析方法では，ソルポルシス処理前に生体試料から胆
汁酸分画の抽出，硫酸抱合胆汁酸の分画という煩雑な前
処理が必要であり，測定する前に多くの煩雑な処理と，
時間と，更に熟練した技術を要するのが現状である。
た分析方法では，ソルポルシス処理前に生体試料から胆
汁酸分画の抽出，硫酸抱合胆汁酸の分画という煩雑な前
処理が必要であり，測定する前に多くの煩雑な処理と，
時間と，更に熟練した技術を要するのが現状である。
【０００９】したがって，この様な生体試料から抽出に
よる硫酸抱合胆汁酸の測定は，煩雑さ，困難さから現在
十分に臨床方面で応用されるには至っていない。
よる硫酸抱合胆汁酸の測定は，煩雑さ，困難さから現在
十分に臨床方面で応用されるには至っていない。
【００１０】そこで，本発明の技術的課題は，痛みもな
く，簡単に，肝臓機能の症状に対応した肝臓機能を検査
できる硫酸抱合胆汁酸検出方法と，それに用いる硫酸抱
合胆汁酸検出装置と，それに用いる固定化酵素カラムと
硫酸抱合胆汁酸検出センサーとを提供することにある。
く，簡単に，肝臓機能の症状に対応した肝臓機能を検査
できる硫酸抱合胆汁酸検出方法と，それに用いる硫酸抱
合胆汁酸検出装置と，それに用いる固定化酵素カラムと
硫酸抱合胆汁酸検出センサーとを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は，上記課題を
解決するために，硫酸抱合胆汁酸の化学発光法を用い，
前処理を必要とせず，高感度の化学発光法と高選択性の
酵素反応を用いる方法を採用し，また，ＦＩＡ（Flow I
njector Analysys) システムを利用して，迅速，簡便，
高感度，高選択的に尿中の硫酸抱合型胆汁酸を検出する
ことができ，日常の検査に利用可能な方法を見出だし本
発明を為すに至ったものである。
解決するために，硫酸抱合胆汁酸の化学発光法を用い，
前処理を必要とせず，高感度の化学発光法と高選択性の
酵素反応を用いる方法を採用し，また，ＦＩＡ（Flow I
njector Analysys) システムを利用して，迅速，簡便，
高感度，高選択的に尿中の硫酸抱合型胆汁酸を検出する
ことができ，日常の検査に利用可能な方法を見出だし本
発明を為すに至ったものである。
【００１２】本発明によれば，酵素とこれを固定する水
不溶性の高分子とを含む固定化酵素を有し，前記酵素は
胆汁酸硫酸スルファターゼと３β−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼとによって形成され，前記固定化酵
素は容器内に封入されていることを特徴とする固定化酵
素カラムが得られる。
不溶性の高分子とを含む固定化酵素を有し，前記酵素は
胆汁酸硫酸スルファターゼと３β−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼとによって形成され，前記固定化酵
素は容器内に封入されていることを特徴とする固定化酵
素カラムが得られる。
【００１３】また，本発明によれば，キャリア液が流動
する第１の経路に設けられ，試料溶液を前記キャリア液
中に注入する試料注入手段と，前記第１の経路の前記試
料溶液注入手段の下流に設けられ，前記試料溶液中に硫
酸抱合胆汁酸を含む場合に，この硫酸抱合胆汁酸と酵素
反応させて特定物質を生成する酵素反応手段と，前記キ
ャリア液中に含まれた前記特定物質を化学反応によって
発光させるための反応液が流動する第２の経路と，前記
第１の経路と前記第２の経路とが合流した第３の経路に
設けられ，前記酵素反応手段からの流出液と前記反応液
とを混合して収容し，混合液からの発光量を検出する発
光検出手段とを備え，この構成により，前記試料溶液中
に前記硫酸抱合胆汁酸が含まれていることを化学発光法
を用いて検出することを特徴とする硫酸抱合胆汁酸検出
装置が得られる。
する第１の経路に設けられ，試料溶液を前記キャリア液
中に注入する試料注入手段と，前記第１の経路の前記試
料溶液注入手段の下流に設けられ，前記試料溶液中に硫
酸抱合胆汁酸を含む場合に，この硫酸抱合胆汁酸と酵素
反応させて特定物質を生成する酵素反応手段と，前記キ
ャリア液中に含まれた前記特定物質を化学反応によって
発光させるための反応液が流動する第２の経路と，前記
第１の経路と前記第２の経路とが合流した第３の経路に
設けられ，前記酵素反応手段からの流出液と前記反応液
とを混合して収容し，混合液からの発光量を検出する発
光検出手段とを備え，この構成により，前記試料溶液中
に前記硫酸抱合胆汁酸が含まれていることを化学発光法
を用いて検出することを特徴とする硫酸抱合胆汁酸検出
装置が得られる。
【００１４】また，本発明によれば，第１の経路を流動
するキャリア液に，試料溶液を注入し，酵素に接触させ
て，前記試料溶液が硫酸抱合胆汁酸を含む場合において
特定物質を生成する第１の段階と，前記酵素に接触した
前記試料溶液を含むキャリア液に前記第１の経路とは，
異なる第２の経路で流動する反応液を混合して混合液を
得，前記混合液に前記特定物質が含まれている場合，前
記特定物質と前記反応液との化学反応によって発光させ
る第２の段階と，前記混合液の発光量を測定することに
よって前記試料溶液中の硫酸抱合胆汁酸の濃度を測定す
る第３の段階を備えていることを特徴とする硫酸抱合胆
汁酸検出方法が得られる。
するキャリア液に，試料溶液を注入し，酵素に接触させ
て，前記試料溶液が硫酸抱合胆汁酸を含む場合において
特定物質を生成する第１の段階と，前記酵素に接触した
前記試料溶液を含むキャリア液に前記第１の経路とは，
異なる第２の経路で流動する反応液を混合して混合液を
得，前記混合液に前記特定物質が含まれている場合，前
記特定物質と前記反応液との化学反応によって発光させ
る第２の段階と，前記混合液の発光量を測定することに
よって前記試料溶液中の硫酸抱合胆汁酸の濃度を測定す
る第３の段階を備えていることを特徴とする硫酸抱合胆
汁酸検出方法が得られる。
【００１５】さらに，本発明によれば，試料中の硫酸抱
合胆汁酸の含有量に応じて発光するセルと，発光された
光を測定する手段とを備えたことを特徴とする硫酸抱合
胆汁酸センサが得られる。
合胆汁酸の含有量に応じて発光するセルと，発光された
光を測定する手段とを備えたことを特徴とする硫酸抱合
胆汁酸センサが得られる。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下，本発明の実施の形態につい
て説明する。
て説明する。
【００１７】図１（ａ），（ｂ），及び（ｃ）は，本発
明の実施の形態による硫酸抱合胆汁酸の検出原理の説明
に供せられる図である。図１に示される反応は二段階反
応である。図１（ａ）に示すように，第１反応におい
て，硫酸抱合胆汁酸（Lithocholic 3-sulfate)は，胆汁
酸硫酸スルファターゼ（Bile acid sulfatase,以下，Ｂ
ＳＳと呼ぶ）によって，脱硫酸化され，３β−ヒドロキ
システロイド(3β-Hydroxy steroid) を生成する。
明の実施の形態による硫酸抱合胆汁酸の検出原理の説明
に供せられる図である。図１に示される反応は二段階反
応である。図１（ａ）に示すように，第１反応におい
て，硫酸抱合胆汁酸（Lithocholic 3-sulfate)は，胆汁
酸硫酸スルファターゼ（Bile acid sulfatase,以下，Ｂ
ＳＳと呼ぶ）によって，脱硫酸化され，３β−ヒドロキ
システロイド(3β-Hydroxy steroid) を生成する。
【００１８】次に，図１（ｂ）に示すように，第２反応
では，生成した３β−ヒドロキシステロイドが補酵素で
あるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(Nicotinam
ideadenine dinucleotide, 以下，ＮＡＤ+ と呼ぶ）の
存在下，３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（ 3β-Hydroxy-steroid dehydrogenase，以下β−ＨＳ
Ｄと呼ぶ）の作用で，３−ケトヒドロキシステロイド
（3-Keto-Hydroxy-steroid) に変化する。その際，ＮＡ
Ｄ+ は還元形であるニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド還元形(Nicotinamide adenine dinucleotide reduc
ed form, 以下，ＮＡＤＨと呼ぶ）に変化する。
では，生成した３β−ヒドロキシステロイドが補酵素で
あるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(Nicotinam
ideadenine dinucleotide, 以下，ＮＡＤ+ と呼ぶ）の
存在下，３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（ 3β-Hydroxy-steroid dehydrogenase，以下β−ＨＳ
Ｄと呼ぶ）の作用で，３−ケトヒドロキシステロイド
（3-Keto-Hydroxy-steroid) に変化する。その際，ＮＡ
Ｄ+ は還元形であるニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド還元形(Nicotinamide adenine dinucleotide reduc
ed form, 以下，ＮＡＤＨと呼ぶ）に変化する。
【００１９】また，電子伝達体としての１−メトキシＰ
ＭＳ（1-metoxy-5-methylphynazinium methylsulfate）
と溶存酸素の共存下で，過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を生成
する。その過酸化水素が，ペルオキシダーゼ（Peroxida
se, 以下ＰＯＤと呼ぶ）によりルミノール（luminol)と
反応して，発光する。この発光量によって，硫酸抱合胆
汁酸を検出し，定量することができる。
ＭＳ（1-metoxy-5-methylphynazinium methylsulfate）
と溶存酸素の共存下で，過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を生成
する。その過酸化水素が，ペルオキシダーゼ（Peroxida
se, 以下ＰＯＤと呼ぶ）によりルミノール（luminol)と
反応して，発光する。この発光量によって，硫酸抱合胆
汁酸を検出し，定量することができる。
【００２０】図２は本発明の実施の形態による硫酸抱合
胆汁酸検出装置の概略構成を示す図である。図２を参照
して，硫酸抱合胆汁酸検出装置１は，基本的に２つの経
路１１及び１２から構成されている。第１の経路１１
は，酵素反応を行う経路であり，第１の経路１１に沿っ
て，ポンプ２，試料溶液を注入する注入手段をなすイン
ジェクター３，及び酵素反応手段をなす酵素カラム４を
それぞれ備え，発光検出手段をなす硫酸抱合胆汁酸セン
サ（以下，単にセンサと呼ぶ）１０内の経路の合流点５
で収束する。
胆汁酸検出装置の概略構成を示す図である。図２を参照
して，硫酸抱合胆汁酸検出装置１は，基本的に２つの経
路１１及び１２から構成されている。第１の経路１１
は，酵素反応を行う経路であり，第１の経路１１に沿っ
て，ポンプ２，試料溶液を注入する注入手段をなすイン
ジェクター３，及び酵素反応手段をなす酵素カラム４を
それぞれ備え，発光検出手段をなす硫酸抱合胆汁酸セン
サ（以下，単にセンサと呼ぶ）１０内の経路の合流点５
で収束する。
【００２１】一方，第２の経路１２は，発光試薬を導入
する経路であり，前記ポンプ２を第１の経路１１と共用
し，センサ１０内の第１の経路１１との合流点５で収束
する。合流点５は発光反応セル６の直前に設けられ，第
１及び第２の経路１１，１２は，一本の第３の経路５と
なり，発光反応セル６に至る。発光反応セル６におい
て，分析が成された後，センサ１０の外に廃液として排
出される。尚，本発明において，単にセルと呼ぶ場合に
は，容器内に収容された溶液も含むものとする。
する経路であり，前記ポンプ２を第１の経路１１と共用
し，センサ１０内の第１の経路１１との合流点５で収束
する。合流点５は発光反応セル６の直前に設けられ，第
１及び第２の経路１１，１２は，一本の第３の経路５と
なり，発光反応セル６に至る。発光反応セル６におい
て，分析が成された後，センサ１０の外に廃液として排
出される。尚，本発明において，単にセルと呼ぶ場合に
は，容器内に収容された溶液も含むものとする。
【００２２】センサ１０は，発光反応セル６と，この発
光反応セル６を上に載置し，発光反応セル６からの光を
検出する光電子増倍管７が設けられている。光電子増倍
管７は，センサ１０の外部に設けられたフォトカウンタ
８に接続され，フォトンカウンタ８の出力は，レコーダ
９にカウント値として記録される。
光反応セル６を上に載置し，発光反応セル６からの光を
検出する光電子増倍管７が設けられている。光電子増倍
管７は，センサ１０の外部に設けられたフォトカウンタ
８に接続され，フォトンカウンタ８の出力は，レコーダ
９にカウント値として記録される。
【００２３】ここで，ポンプ２として，ＧＩＬＳＯＮ社
製のペリスタルティックポンプ，「ミニパルスＭＰ−３
１２型」を用い，ポンプチューブとしてＧＩＬＳＯＮ社
製の内径１．０ｍｍのポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）チュー
ブ，フローチューブとして内径０．５ｍｍのテフロン
（ポリテトラフルオロエチレン樹脂製）チューブ，イン
ジェクタ−３としてＲＨＥＤＹＮＥ社製の７７２５型サ
ンプルインジェクタ，サンプルループとして２０μＬ用
を用いた。
製のペリスタルティックポンプ，「ミニパルスＭＰ−３
１２型」を用い，ポンプチューブとしてＧＩＬＳＯＮ社
製の内径１．０ｍｍのポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）チュー
ブ，フローチューブとして内径０．５ｍｍのテフロン
（ポリテトラフルオロエチレン樹脂製）チューブ，イン
ジェクタ−３としてＲＨＥＤＹＮＥ社製の７７２５型サ
ンプルインジェクタ，サンプルループとして２０μＬ用
を用いた。
【００２４】センサ１０の部分には，浜松ホトニクス株
式会社のＣ−１２３０型フォトンカウンターと光電子増
倍管を用いた。また，センサ１０の発光反応セル６の部
分は，内径１．０ｍｍのタイゴンチューブで渦巻き状に
巻いて作成した。発光反応セル６の直径は，４．０ｃｍ
で，光電子増倍管の上に乗せた。
式会社のＣ−１２３０型フォトンカウンターと光電子増
倍管を用いた。また，センサ１０の発光反応セル６の部
分は，内径１．０ｍｍのタイゴンチューブで渦巻き状に
巻いて作成した。発光反応セル６の直径は，４．０ｃｍ
で，光電子増倍管の上に乗せた。
【００２５】また，試薬として下記のものを用いた。
【００２６】Ｌ−アスコルビン酸，ルミノールと１−メ
トキシＰＭＳは和光純薬株式会社から購入した。アスコ
ルビン酸オキシターゼ（ＥＣ．１．１０．３．３），Ｎ
ＡＤ+ とＮＡＤＨはオリエンタル酵母株式会社から購入
した。また，ペルオキシターゼは２５０ＩＵ／ｍｇ，Ｒ
Ｚ＞２．５，ナカライテスク株式会社から購入した。リ
アクティゲル（６×）はフナコシ株式会社から購入した
粒径４５〜１６５μｍのものを用いた。標準胆汁酸試料
はシグマ薬品株式会社から購入した。胆汁酸硫酸スルフ
ァターゼと３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼは，マルキン醤油株式会社から提供された。
トキシＰＭＳは和光純薬株式会社から購入した。アスコ
ルビン酸オキシターゼ（ＥＣ．１．１０．３．３），Ｎ
ＡＤ+ とＮＡＤＨはオリエンタル酵母株式会社から購入
した。また，ペルオキシターゼは２５０ＩＵ／ｍｇ，Ｒ
Ｚ＞２．５，ナカライテスク株式会社から購入した。リ
アクティゲル（６×）はフナコシ株式会社から購入した
粒径４５〜１６５μｍのものを用いた。標準胆汁酸試料
はシグマ薬品株式会社から購入した。胆汁酸硫酸スルフ
ァターゼと３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼは，マルキン醤油株式会社から提供された。
【００２７】次に，図２の硫酸抱合胆汁酸検出装置１の
動作について説明する。
動作について説明する。
【００２８】第１の経路１１において，１−メトキシＰ
ＭＳとＮＡＤ+ をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し
て，キャリア液として用いる。キャリア液を第１の経路
１１に流している時，測定対象である硫酸抱合胆汁酸を
インジェクター３から注入して酵素カラム４に導入する
と，酵素反応が起こり，硫酸抱合胆汁酸を含むキャリア
液から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は，
第２の経路１２によって導入されたルミノールと発光反
応セル６に入る直前の合流点５で混合され，セル６内に
入り，ペルオキシダーゼの作用で発光する。この発光量
は，光電子増倍管７で増幅され，フォトカウンター８で
測定される。測定された発光強度によって，後に詳しく
説明するように，硫酸抱合胆汁酸を定量することができ
る。
ＭＳとＮＡＤ+ をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し
て，キャリア液として用いる。キャリア液を第１の経路
１１に流している時，測定対象である硫酸抱合胆汁酸を
インジェクター３から注入して酵素カラム４に導入する
と，酵素反応が起こり，硫酸抱合胆汁酸を含むキャリア
液から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は，
第２の経路１２によって導入されたルミノールと発光反
応セル６に入る直前の合流点５で混合され，セル６内に
入り，ペルオキシダーゼの作用で発光する。この発光量
は，光電子増倍管７で増幅され，フォトカウンター８で
測定される。測定された発光強度によって，後に詳しく
説明するように，硫酸抱合胆汁酸を定量することができ
る。
【００２９】図３は図２の硫酸抱合胆汁酸検出装置１の
固定化酵素カラム２０を示す正面図である。図３に示す
ように，固定化酵素カラム２０は，内側空間の長さが５
ｃｍとなるように内径２ｍｍのテフロンチューブ２４の
両端から，内径１ｍｍの鉄チューブ２３を挿入した内径
０．５ｍｍのシリコーンチューブ２５を装着し，また，
内側空間の両端にシリコーンチューブ２５に接してナイ
ロンネット２２が設けられている。そして，内側空間内
に固定化酵素２１を充填している。
固定化酵素カラム２０を示す正面図である。図３に示す
ように，固定化酵素カラム２０は，内側空間の長さが５
ｃｍとなるように内径２ｍｍのテフロンチューブ２４の
両端から，内径１ｍｍの鉄チューブ２３を挿入した内径
０．５ｍｍのシリコーンチューブ２５を装着し，また，
内側空間の両端にシリコーンチューブ２５に接してナイ
ロンネット２２が設けられている。そして，内側空間内
に固定化酵素２１を充填している。
【００３０】ここで，酵素の固定化について，簡単に説
明すると，酵素は一般的に水溶性である。酵素を水溶性
の高分子単体上に結合させて，不要化し，繰り返して使
用することができる。図３の装置に用いた固定化酵素２
１は，共有結合法を利用して，ＢＳＳとβ−ＨＳＤとを
酵素担体であるリアクティゲル（６ｘ）に固定化し，酵
素カラムに充填されている。
明すると，酵素は一般的に水溶性である。酵素を水溶性
の高分子単体上に結合させて，不要化し，繰り返して使
用することができる。図３の装置に用いた固定化酵素２
１は，共有結合法を利用して，ＢＳＳとβ−ＨＳＤとを
酵素担体であるリアクティゲル（６ｘ）に固定化し，酵
素カラムに充填されている。
【００３１】図４は図３の固定化酵素カラム２０に充填
される固定化酵素に用いたリアクティゲル（６ｘ）の説
明に供せられる図である。図４を参照して，リアクティ
ゲル（６ｘ）は架橋されたアガロースを骨格とするビー
ズである。１，１´−カルボニル ジイミダゾール（Ca
rbonyl diimidazole）を官能基として持つ静電気的に中
性な酵素固定担体である。
される固定化酵素に用いたリアクティゲル（６ｘ）の説
明に供せられる図である。図４を参照して，リアクティ
ゲル（６ｘ）は架橋されたアガロースを骨格とするビー
ズである。１，１´−カルボニル ジイミダゾール（Ca
rbonyl diimidazole）を官能基として持つ静電気的に中
性な酵素固定担体である。
【００３２】この酵素固定担体による酵素の固定方法を
具体的に述べる。
具体的に述べる。
【００３３】まず，リアクティゲル保存液のアセトンを
除去する。次に氷冷水で充分に洗浄する。リアクティゲ
ルを０．２ｇ秤量する。胆汁酸硫酸スルファターゼ（Ｂ
ＳＳ）と３β−ヒドロキシステロイドゲナーゼ（β−Ｈ
ＳＤ）を１０ＩＵずつとり，１．５ｍＬ．ｐＨ９．０，
０．２Ｍ硼酸緩衝液に溶解して，ビーズと混合し，４℃
で約４２時間震盪する。次に，０．２Ｍ硼酸緩衝液で洗
浄する。続いて，３．５ｍＬ．ｐＨ８．０，０．２Ｍト
リス緩衝液を加え，室温で３０分震盪する。氷冷水で充
分に洗浄し，３．２Ｍの硫安（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液中
に４℃で保存する。
除去する。次に氷冷水で充分に洗浄する。リアクティゲ
ルを０．２ｇ秤量する。胆汁酸硫酸スルファターゼ（Ｂ
ＳＳ）と３β−ヒドロキシステロイドゲナーゼ（β−Ｈ
ＳＤ）を１０ＩＵずつとり，１．５ｍＬ．ｐＨ９．０，
０．２Ｍ硼酸緩衝液に溶解して，ビーズと混合し，４℃
で約４２時間震盪する。次に，０．２Ｍ硼酸緩衝液で洗
浄する。続いて，３．５ｍＬ．ｐＨ８．０，０．２Ｍト
リス緩衝液を加え，室温で３０分震盪する。氷冷水で充
分に洗浄し，３．２Ｍの硫安（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液中
に４℃で保存する。
【００３４】
【実施例】以下，本発明の実施例について図面を参照し
て説明する。
て説明する。
【００３５】図２の硫酸抱合胆汁酸検出装置１を用いて
測定した具体例を以下に示す。
測定した具体例を以下に示す。
【００３６】酵素反応試薬として５μＭ１−メトキシＰ
ＭＳと５０μＭＮＡＤ+ とを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した溶液を用意した。一方，発光反応
試薬として４０μＭルミノールと１０ｐｐｍＰＯＤを
０．８炭酸緩衝液（ｐＨ１０．１）に溶解した溶液を用
意した。次に，硫酸抱合胆汁酸を０．１μＭから２５μ
Ｍ迄変化させて２０μＬ注入した。固定化酵素カラム２
０を経て，酵素反応を行わせた。固定化酵素カラム２０
からの溶液と，発光試薬と混合して発光反応セル６に導
入し，発光させた。固定化酵素カラムのサイズは，長さ
５．０ｃｍ，内径０．２ｃｍであった。固定化酵素量
は，１０ＩＵ ＢＳＳと５ＩＵ ＨＳＤで，０．２ｇリ
アクティゲルに固定化したものを用いた。発光反応セル
６は，４０ｃｍタインチューブで製作し，内径１．０ｍ
ｍ，容積は，約７００μＬである。光はＣ１２３０型フ
ォトンカウンターと光電子増倍管によって電気信号に変
換され，硫酸抱合胆汁酸を定量した。印加電圧−１３９
２Ｖで，結果として，ｎ＝１４，ＲＳＤ＝２．２％，３
０回／時間，検出下限度は０．１μＭで２μＭから２０
μＭまで良好なる直線性が得られた。
ＭＳと５０μＭＮＡＤ+ とを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した溶液を用意した。一方，発光反応
試薬として４０μＭルミノールと１０ｐｐｍＰＯＤを
０．８炭酸緩衝液（ｐＨ１０．１）に溶解した溶液を用
意した。次に，硫酸抱合胆汁酸を０．１μＭから２５μ
Ｍ迄変化させて２０μＬ注入した。固定化酵素カラム２
０を経て，酵素反応を行わせた。固定化酵素カラム２０
からの溶液と，発光試薬と混合して発光反応セル６に導
入し，発光させた。固定化酵素カラムのサイズは，長さ
５．０ｃｍ，内径０．２ｃｍであった。固定化酵素量
は，１０ＩＵ ＢＳＳと５ＩＵ ＨＳＤで，０．２ｇリ
アクティゲルに固定化したものを用いた。発光反応セル
６は，４０ｃｍタインチューブで製作し，内径１．０ｍ
ｍ，容積は，約７００μＬである。光はＣ１２３０型フ
ォトンカウンターと光電子増倍管によって電気信号に変
換され，硫酸抱合胆汁酸を定量した。印加電圧−１３９
２Ｖで，結果として，ｎ＝１４，ＲＳＤ＝２．２％，３
０回／時間，検出下限度は０．１μＭで２μＭから２０
μＭまで良好なる直線性が得られた。
【００３７】（実施例１）実施例１では，固定化酵素反
応の安定性について述べる。
応の安定性について述べる。
【００３８】ＢＳＳとＨＳＤを１０ ＩＵずつ０．２ｇ
のリアクティゲル担体上に混ぜて固定化して，５．０ｃ
ｍ×０．２ｃｍカラムに充填して固定化酵素の安定性を
調べた。標準試料は，１０μＭ硫酸抱合胆汁酸を用い，
酵素反応試薬として，７μＭの１−ＭＰＭＳ７，２００
μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液），化学発光試薬として，４０μＭルミノール，０．
２ＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．１Ｍ炭酸緩衝溶液）を用
いた。その結果を図５に示す。
のリアクティゲル担体上に混ぜて固定化して，５．０ｃ
ｍ×０．２ｃｍカラムに充填して固定化酵素の安定性を
調べた。標準試料は，１０μＭ硫酸抱合胆汁酸を用い，
酵素反応試薬として，７μＭの１−ＭＰＭＳ７，２００
μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液），化学発光試薬として，４０μＭルミノール，０．
２ＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．１Ｍ炭酸緩衝溶液）を用
いた。その結果を図５に示す。
【００３９】図５を参照して，酵素反応活性は３日目に
３２％に減少し，それ以降，２０日目まで酵素活性は約
６０％であった。
３２％に減少し，それ以降，２０日目まで酵素活性は約
６０％であった。
【００４０】また，再現性については，毎日８回測定
し，変動係数は１．１％から３．７％までであった。固
定化酵素は，３週間安定であることが確認された。
し，変動係数は１．１％から３．７％までであった。固
定化酵素は，３週間安定であることが確認された。
【００４１】（実施例２）実施例２では，酵素の固定化
法について次のように検討した。
法について次のように検討した。
【００４２】２種類の酵素ＢＳＳとＨＳＤの固定化につ
いて，２つの方法を検討した。
いて，２つの方法を検討した。
【００４３】第１の方法は，２つの酵素を１０ＩＵずつ
混ぜて０．４ｇの担体上に固定化する方法であり，第２
の方法は，２つの酵素１０ＩＵずつを別々に０．２ｇの
担体上に固定化する方法である。
混ぜて０．４ｇの担体上に固定化する方法であり，第２
の方法は，２つの酵素１０ＩＵずつを別々に０．２ｇの
担体上に固定化する方法である。
【００４４】実験条件は，流速０．６ｍｌ／分で行い，
酵素反応試薬として７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２０
０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として，４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を図６に示す。
酵素反応試薬として７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２０
０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として，４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を図６に示す。
【００４５】図６を参照すると，２つの酵素をまぜ，担
体上に固定化した場合の応答の方が，別々に担体上に固
定した場合よりも大きいことが判明した。
体上に固定化した場合の応答の方が，別々に担体上に固
定した場合よりも大きいことが判明した。
【００４６】（実施例３）実施例３では，ＨＳＤの固定
化量の最適化について以下のように検討した。
化量の最適化について以下のように検討した。
【００４７】まず，ＢＳＳの固定化量を一定（１０Ｉ
Ｕ）にして，ＨＳＤを０．５ＩＵから２０ＩＵまで変化
させて，それぞれ０．２ｇのリアクティゲル担体上に固
定した。５μＭ，１０μＭ，２０μＭの胆汁酸を標準物
質として最適なＨＳＤ固定化量を調べた。胆汁酸の標準
試料５μＭ，１０μＭ，２０μＭを夫々Ａ，Ｂ，Ｃと
し，流速０．６ｍｌ／分，酵素反応試薬として，７μＭ
の１−メトキシＰＭＳ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ
７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試
薬として４０μＭのルミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ
（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を
図７に示す。図７を参照すると，５ＩＵのＨＳＤを０．
２ｇのリアクティゲル担体上に固定化した場合，最大の
応答が得られた。
Ｕ）にして，ＨＳＤを０．５ＩＵから２０ＩＵまで変化
させて，それぞれ０．２ｇのリアクティゲル担体上に固
定した。５μＭ，１０μＭ，２０μＭの胆汁酸を標準物
質として最適なＨＳＤ固定化量を調べた。胆汁酸の標準
試料５μＭ，１０μＭ，２０μＭを夫々Ａ，Ｂ，Ｃと
し，流速０．６ｍｌ／分，酵素反応試薬として，７μＭ
の１−メトキシＰＭＳ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ
７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試
薬として４０μＭのルミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ
（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を
図７に示す。図７を参照すると，５ＩＵのＨＳＤを０．
２ｇのリアクティゲル担体上に固定化した場合，最大の
応答が得られた。
【００４８】（実施例４）実施例４では，ＢＳＳの固定
化量の最適化について検討した。
化量の最適化について検討した。
【００４９】実験方法として，ＨＳＤの固定化量を一定
（５ＩＵ）として，ＢＳＳを０．０１ＩＵ〜１５ＩＵま
で変化させて，それぞれ０．２ｇのリアクティゲル担体
上に固定した。５μＭ，１０μＭ，２０μＭの胆汁酸を
標準物質として最適なＢＳＳ固定化量を調べた。胆汁酸
の標準試料５μＭ，１０μＭ，２０μＭを夫々Ａ，Ｂ，
Ｃとし，実験条件として流速０．６ｍｌ／分で行った。
酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２
００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝
溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．１Ｍ炭
酸緩衝溶液）を用いた。その結果を図８に示す。
（５ＩＵ）として，ＢＳＳを０．０１ＩＵ〜１５ＩＵま
で変化させて，それぞれ０．２ｇのリアクティゲル担体
上に固定した。５μＭ，１０μＭ，２０μＭの胆汁酸を
標準物質として最適なＢＳＳ固定化量を調べた。胆汁酸
の標準試料５μＭ，１０μＭ，２０μＭを夫々Ａ，Ｂ，
Ｃとし，実験条件として流速０．６ｍｌ／分で行った。
酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２
００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝
溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．１Ｍ炭
酸緩衝溶液）を用いた。その結果を図８に示す。
【００５０】図８を参照すると，１ＩＵのＨＳＤを０．
２ｇのリアクティゲル上に固定化した場合，最大の応答
が得られた。
２ｇのリアクティゲル上に固定化した場合，最大の応答
が得られた。
【００５１】（実施例５）実施例５では，アスコルビン
酸の発光妨害について検討した。このアスコルビン酸
は，還元性物質としてルミノール化学発光反応を妨害す
ることが良く知られている。健常成人の尿中に含まれる
アスコルビン酸は１５〜５０ｍｇ／２４時間である。
酸の発光妨害について検討した。このアスコルビン酸
は，還元性物質としてルミノール化学発光反応を妨害す
ることが良く知られている。健常成人の尿中に含まれる
アスコルビン酸は１５〜５０ｍｇ／２４時間である。
【００５２】実験方法として，５０μＭの胆汁酸を標準
物質としてアスコルビン酸の濃度を１００μＭから５０
０μＭまで変化させ，化学発光反応に対する影響を調べ
た。標準試料として，５０μＭの硫酸抱合胆汁酸を用
い，実験条件として，１０ＩＵのＢＳＳ，５ＩＵのＨＳ
Ｄ，用いたリアクターは寸法５ｃｍ×０．２ｃｍであ
る。酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭ
Ｓ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのル
ミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．
１Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を図９に示
す。
物質としてアスコルビン酸の濃度を１００μＭから５０
０μＭまで変化させ，化学発光反応に対する影響を調べ
た。標準試料として，５０μＭの硫酸抱合胆汁酸を用
い，実験条件として，１０ＩＵのＢＳＳ，５ＩＵのＨＳ
Ｄ，用いたリアクターは寸法５ｃｍ×０．２ｃｍであ
る。酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭ
Ｓ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのル
ミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．
１Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を図９に示
す。
【００５３】図９を参照して，５０ｍＭの胆汁酸溶液中
に１００μＭ〜５００μＭまでのアスコルビン酸を添加
した場合，発光強度が６０％から８９％まで増加した。
アスコルビン酸はルミノール発光を妨害するはずである
が，本実験では逆に促進した。したがって，アスコルビ
ン酸がセンサーの化学発光反応に強い影響を与えること
が認められた。
に１００μＭ〜５００μＭまでのアスコルビン酸を添加
した場合，発光強度が６０％から８９％まで増加した。
アスコルビン酸はルミノール発光を妨害するはずである
が，本実験では逆に促進した。したがって，アスコルビ
ン酸がセンサーの化学発光反応に強い影響を与えること
が認められた。
【００５４】（実施例６）実施例６では，アスコルビン
酸の妨害を除く確認実験を以下の通り行った。
酸の妨害を除く確認実験を以下の通り行った。
【００５５】実験方法は，まず，５０μＭの硫酸抱合胆
汁酸を標準試料として１００μＭから５００μＭまでの
濃度のアスコルビン酸を添加し，その後アスコルビン酸
オキシターゼ（ＡＳＣＯＤ）カラムを流路に組み込ん
で，アスコルビン酸の妨害を除く実験を行った。２００
ＩＵのアスコルビン酸オキシターゼを０．２ｇのリアク
ティゲルに固定化した。
汁酸を標準試料として１００μＭから５００μＭまでの
濃度のアスコルビン酸を添加し，その後アスコルビン酸
オキシターゼ（ＡＳＣＯＤ）カラムを流路に組み込ん
で，アスコルビン酸の妨害を除く実験を行った。２００
ＩＵのアスコルビン酸オキシターゼを０．２ｇのリアク
ティゲルに固定化した。
【００５６】実験条件として，流速０．６ｍｌ／分，酵
素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２０
０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を表１に示す。
素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭＳ，２０
０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのルミノー
ル，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】 上記表１から明らかなように，１００μＭから５００μ
Ｍまでのアスコルビン酸を添加した場合，発光量は＋６
０％から＋８９％まで増加した。ＡＳＣＯＤカラムを流
路に組み込んだ場合，胆汁酸だけの発光量に対して，９
６％〜１０６％の発光量が見られた。したがって，アス
コルビン酸が発光反応に及ぼす影響がＡＳＣＯＤにより
除去できた。
Ｍまでのアスコルビン酸を添加した場合，発光量は＋６
０％から＋８９％まで増加した。ＡＳＣＯＤカラムを流
路に組み込んだ場合，胆汁酸だけの発光量に対して，９
６％〜１０６％の発光量が見られた。したがって，アス
コルビン酸が発光反応に及ぼす影響がＡＳＣＯＤにより
除去できた。
【００５８】（実施例７）実施例７では，測定する際の
溶液の流速について以下のように検討した。
溶液の流速について以下のように検討した。
【００５９】実験方法は，１０μＭの胆汁酸を標準試料
として，インジェクターから注入することによって，酵
素リアクターを経て生成した過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）が
ＰＯＤの作用でルミノールと反応して発光する。ペリス
タポンプ２を利用し流速を０．０５から１．１ｍｌ／分
まで変えて発光量を測定し，最適流速を調べた。ここ
で，酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭ
Ｓ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのル
ミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．
１Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。また，酵素リアクター
として固定化酵素カラム５．０ｃｍ×０．２ｃｍ，固定
化酵素として，ＢＳＳ１０ＩＵとＨＳＤ５ＩＵとを用い
た。また，ポンプチューブは内径１．０ｍｍの物を用い
た。その結果を図１０に示す。図１０を参照して，流速
が０．６ｍｌ／Ｍの場合，最大発光量が得られた。
として，インジェクターから注入することによって，酵
素リアクターを経て生成した過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）が
ＰＯＤの作用でルミノールと反応して発光する。ペリス
タポンプ２を利用し流速を０．０５から１．１ｍｌ／分
まで変えて発光量を測定し，最適流速を調べた。ここ
で，酵素反応試薬として，７μＭの１−メトキシＰＭ
Ｓ，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μＭのル
ミノール，０．２ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．５４の０．
１Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。また，酵素リアクター
として固定化酵素カラム５．０ｃｍ×０．２ｃｍ，固定
化酵素として，ＢＳＳ１０ＩＵとＨＳＤ５ＩＵとを用い
た。また，ポンプチューブは内径１．０ｍｍの物を用い
た。その結果を図１０に示す。図１０を参照して，流速
が０．６ｍｌ／Ｍの場合，最大発光量が得られた。
【００６０】（実施例８）実施例８では，１−メトキシ
ＰＭＳの濃度の最適な条件を以下のようにして求めた。
実験方法は，１−メトキシＰＭＳの濃度を０〜４０μＭ
まで変化させて最適の濃度を調べた。標準試料として，
１μＭ，５μＭ，１０μＭの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，
Ｂ，Ｃとした。実験条件流速度０．６ｍｌ／分で行い，
酵素反応試料として，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬と
して４０μＭのルミノール，２５ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ
１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結
果を図１１に示す。
ＰＭＳの濃度の最適な条件を以下のようにして求めた。
実験方法は，１−メトキシＰＭＳの濃度を０〜４０μＭ
まで変化させて最適の濃度を調べた。標準試料として，
１μＭ，５μＭ，１０μＭの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，
Ｂ，Ｃとした。実験条件流速度０．６ｍｌ／分で行い，
酵素反応試料として，２００μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬と
して４０μＭのルミノール，２５ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ
１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結
果を図１１に示す。
【００６１】図１１を参照すると，１−メトキシＰＭＳ
の濃度は，５μＭの時に，一番高い応答が得られること
が判明した。
の濃度は，５μＭの時に，一番高い応答が得られること
が判明した。
【００６２】（実施例９）実施例９では，ＮＡＤ+ 濃度
の最適な条件について以下の通り求めた。
の最適な条件について以下の通り求めた。
【００６３】実験方法は，ＮＡＤ+ の濃度を０から６０
μＭまで変化させて，発光量へのＮＡＤ+ の濃度依存性
を調べた。
μＭまで変化させて，発光量へのＮＡＤ+ の濃度依存性
を調べた。
【００６４】標準試料として，１μＭ，５μＭ，１０μ
Ｍの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，Ｂ，Ｃとして用意した。
実験条件は流速０．６ｍｌ／分で行った。酵素反応試薬
として，５μＭの１−メトキシＰＭＳ（ｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として
４０μＭのルミノール，２５ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．
５４の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を
図１２に示す。図１２を参照すると，ＮＡＤ+ の濃度が
５０μＭの時に，一番高い応答が得られることが分か
る。
Ｍの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，Ｂ，Ｃとして用意した。
実験条件は流速０．６ｍｌ／分で行った。酵素反応試薬
として，５μＭの１−メトキシＰＭＳ（ｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として
４０μＭのルミノール，２５ｐｐｍのＰＯＤ（ｐＨ９．
５４の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用いた。その結果を
図１２に示す。図１２を参照すると，ＮＡＤ+ の濃度が
５０μＭの時に，一番高い応答が得られることが分か
る。
【００６５】（実施例１０）実施例１０では，ＰＯＤ濃
度の最適化について以下の通り検討した。
度の最適化について以下の通り検討した。
【００６６】実験方法として，ＰＯＤの濃度を０から４
０ｐｐｍまで変化させて，ＰＯＤ濃度を調べた。ＰＯＤ
はSrthroy ramosu由来で，比活性は，２５０ＩＵ／ｍｇ
proteinsであった。標準試料として，１μＭ，５μＭ，
１０μＭの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，Ｂ，Ｃを用意し
た。実験条件は流速０．６ｍｌ／分で行った。酵素反応
試薬として，５０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１
Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μ
Ｍのルミノール（ｐＨ９．５４の０．８Ｍの炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を図１３に示す。図１３を参照
して，ＰＯＤの濃度が１０ｐｐｍ時に一番高い応答が得
られた。
０ｐｐｍまで変化させて，ＰＯＤ濃度を調べた。ＰＯＤ
はSrthroy ramosu由来で，比活性は，２５０ＩＵ／ｍｇ
proteinsであった。標準試料として，１μＭ，５μＭ，
１０μＭの硫酸抱合胆汁酸を夫々Ａ，Ｂ，Ｃを用意し
た。実験条件は流速０．６ｍｌ／分で行った。酵素反応
試薬として，５０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１
Ｍリン酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として４０μ
Ｍのルミノール（ｐＨ９．５４の０．８Ｍの炭酸緩衝溶
液）を用いた。その結果を図１３に示す。図１３を参照
して，ＰＯＤの濃度が１０ｐｐｍ時に一番高い応答が得
られた。
【００６７】（実施例１１）実施例１１では，ルミノー
ルの濃度の最適化について検討した。
ルの濃度の最適化について検討した。
【００６８】ルミノール濃度を０から８０μＭまで変化
させて最適な濃度を調べた。
させて最適な濃度を調べた。
【００６９】標準物質として，５ｍＭの硫酸抱合胆汁酸
を用い，酵素反応試薬として，５μＭの１−メトキシＰ
ＭＳ，５０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として１０ｐｐｍの
ルミノール（ｐＨ１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）
を用いた。その結果を図１４に示す。
を用い，酵素反応試薬として，５μＭの１−メトキシＰ
ＭＳ，５０μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン
酸緩衝溶液）を用い，化学発光試薬として１０ｐｐｍの
ルミノール（ｐＨ１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）
を用いた。その結果を図１４に示す。
【００７０】図１４を参照して，ルミノールの濃度が４
０μＭ時に一番高い応答が得られた。
０μＭ時に一番高い応答が得られた。
【００７１】（実施例１２）実施例１２では，硫酸抱合
胆汁酸濃度の検量線を以下のように求めた。
胆汁酸濃度の検量線を以下のように求めた。
【００７２】実験条件として，流速０．６ｍｌ／分，酵
素反応試薬として，５μＭの１−メトキシＰＭＳ，５０
μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として１０ｐｐｍのルミノー
ル（ｐＨ１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用い
た。その結果を図１５に示す。
素反応試薬として，５μＭの１−メトキシＰＭＳ，５０
μＭのＮＡＤ+ （ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝溶
液）を用い，化学発光試薬として１０ｐｐｍのルミノー
ル（ｐＨ１０．１の０．８Ｍの炭酸緩衝溶液）を用い
た。その結果を図１５に示す。
【００７３】図１５を参照して，直線範囲は，２μＭ〜
２０μＭであった。また，検出の限界は，０．１μＭで
あった。
２０μＭであった。また，検出の限界は，０．１μＭで
あった。
【００７４】
【発明の効果】以上のように，本発明において，充分な
感度を持ち，更に，分析速度が速く，高い選択性を持
ち，操作が簡便であるという利点をもっており，さらに
尿検査だけですむので，採血のように苦痛や手間を伴わ
ないので，日常の検査に充分利用可能である硫酸抱合胆
汁酸検出方法と，そのための装置と，それに用いる固定
化酵素カラムと，硫酸抱合胆汁酸センサとを提供するこ
とができる。
感度を持ち，更に，分析速度が速く，高い選択性を持
ち，操作が簡便であるという利点をもっており，さらに
尿検査だけですむので，採血のように苦痛や手間を伴わ
ないので，日常の検査に充分利用可能である硫酸抱合胆
汁酸検出方法と，そのための装置と，それに用いる固定
化酵素カラムと，硫酸抱合胆汁酸センサとを提供するこ
とができる。
【図１】（ａ），（ｂ），及び（ｃ）は本発明の実施の
一形態による硫酸抱合胆汁酸検出方法の原理を示す図で
ある。
一形態による硫酸抱合胆汁酸検出方法の原理を示す図で
ある。
【図２】本発明の実施の一形態による硫酸抱合胆汁酸検
出装置の構成を概略的に示す図である。
出装置の構成を概略的に示す図である。
【図３】図２の固定化酵素カラムを示す正面図である。
【図４】図３の固定化酵素カラムに用いるリアクティゲ
ルの構造を示す図である。
ルの構造を示す図である。
【図５】本発明の実施例１による固定化酵素反応の安定
性を示す図である。
性を示す図である。
【図６】本発明の実施例２による酵素の２つの固定化方
法についての比較検討図である。
法についての比較検討図である。
【図７】本発明の実施例３によるβ−ＨＳＤの固定化量
についての検討図である。
についての検討図である。
【図８】本発明の実施例４によるＢＳＳの固定化量につ
いての検討図である。
いての検討図である。
【図９】本発明の実施例５によるアスコルビン酸の発光
反応に対する影響を示す図である。
反応に対する影響を示す図である。
【図１０】本発明の実施例７による酵素反応と化学発光
反応試薬の最適化条件を示す図である。
反応試薬の最適化条件を示す図である。
【図１１】本発明の実施例８による酵素反応と化学発光
反応試薬の最適化条件を示す図である。
反応試薬の最適化条件を示す図である。
【図１２】本発明の実施例９による酵素反応と化学発光
反応試薬の最適化条件を示す図である。
反応試薬の最適化条件を示す図である。
【図１３】本発明の実施例１０による酵素反応と化学発
光反応試薬の最適化条件を示す図である。
光反応試薬の最適化条件を示す図である。
【図１４】本発明の実施例１１による酵素反応と化学発
光反応試薬の最適化条件を示す図である。
光反応試薬の最適化条件を示す図である。
【図１５】本発明の実施例１２による硫酸抱合胆汁酸の
検量線を示す図である。
検量線を示す図である。
１ 硫酸抱合胆汁酸検出装置 ２ ポンプ ３ インジェクター ５ 合流点 ６ 発光反応セル ７ 光電子増倍管 ８ フォトンカウンタ ９ レコーダ １０ 硫酸抱合胆汁酸センサ １１ 第１の経路 １２ 第２の経路 ２０ 固定化酵素カラム
Claims (18)
- 【請求項１】 酵素とこれを固定する水不溶性の高分子
とを含む固定化酵素を有し，前記酵素は胆汁酸硫酸スル
ファターゼと３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼとによって形成され，前記固定化酵素は容器内に封
入されていることを特徴とする固定化酵素カラム。 - 【請求項２】 請求項１記載の固定化酵素カラムにおい
て，前記胆汁酸硫酸スルファターゼと前記３β−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼとは，前記水不溶性の
高分子に混合して固定されていることを特徴とする固定
化酵素カラム。 - 【請求項３】 請求項１記載の固定化酵素カラムにおい
て，前記胆汁酸硫酸スルファターゼと前記３β−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼとは，前記水不溶性の
高分子に別々に固定されていることを特徴とする固定化
酵素カラム。 - 【請求項４】 請求項１乃至３の内のいずれかに記載の
固定化酵素カラムにおいて，前記水不溶性の高分子はリ
アクティゲル（６ｘ）からなることを特徴とする固定化
酵素カラム。 - 【請求項５】 請求項１乃至４の内のいずれかに記載の
固定化酵素カラムにおいて，前記不溶性の高分子には，
更に，アスコルビン酸オキシターゼが固定されているこ
とを特徴とする固定化酵素カラム。 - 【請求項６】 キャリア液が流動する第１の経路に設け
られ，試料溶液を前記キャリア液中に注入する試料注入
手段と，前記第１の経路の前記試料溶液注入手段の下流
に設けられ，前記試料溶液中に硫酸抱合胆汁酸を含む場
合に，この硫酸抱合胆汁酸と酵素反応させて特定物質を
生成する酵素反応手段と，前記キャリア液中に含まれた
前記特定物質を化学反応によって発光させるための反応
液が流動する第２の経路と，前記第１の経路と前記第２
の経路とが合流した第３の経路に設けられ，前記酵素反
応手段からの流出液と前記反応液とを混合して収容し，
混合液からの発光量を検出する発光検出手段とを備え，
この構成により，前記試料溶液中に前記硫酸抱合胆汁酸
が含まれていることを化学発光法を用いて検出すること
を特徴とする硫酸抱合胆汁酸検出装置。 - 【請求項７】 請求項６記載の硫酸抱合胆汁酸検出装置
において，前記特定物質は，過酸化水素であり，前記反
応液はルミノール溶液であることを特徴とする硫酸抱合
胆汁酸検出装置。 - 【請求項８】 請求項６又は７記載の硫酸抱合胆汁酸検
出装置において，前記酵素反応手段は，リアクティブゲ
ル（６ｘ）に，胆汁酸硫酸スルファクターゼと３β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを固定化した固定
化酵素カラムからなることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸
検出装置。 - 【請求項９】 請求項８記載の硫酸抱合胆汁酸検出装置
において，前記固定化酵素カラムは，更に，アスコルビ
ン酸オキシターゼが固定化されていることを特徴とする
硫酸抱合胆汁酸検出装置。 - 【請求項１０】 第１の経路を流動するキャリア液に，
試料溶液を注入し，酵素に接触させて，前記試料溶液が
硫酸抱合胆汁酸を含む場合において特定物質を生成する
第１の段階と，前記酵素に接触した前記試料溶液を含む
キャリア液に前記第１の経路とは，異なる第２の経路で
流動する反応液を混合して混合液を得，前記混合液に前
記特定物質が含まれている場合，前記特定物質と前記反
応液との化学反応によって発光させる第２の段階と，前
記混合液の発光量を測定することによって前記試料溶液
中の硫酸抱合胆汁酸の濃度を測定する第３の段階を備え
ていることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸検出方法。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の硫酸抱合胆汁酸検出
方法において，前記酵素は，固定化された胆汁酸硫酸ス
ルファクターゼと３β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼとからなることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸検
出方法。 - 【請求項１２】 請求項１０又は１１記載の硫酸抱合胆
汁酸濃度測定方法において，前記反応液はルミノール溶
液であり，前記特定物質は過酸化水素であることを特徴
とする硫酸抱合胆汁酸検出方法。 - 【請求項１３】 請求項１０乃至１２の内のいずれかに
記載の硫酸抱合胆汁酸検出方法において，前記キャリア
液は，１−メトキシ−５メチルフィナジニウムメチルサ
ルフェート溶液であることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸
検出方法。 - 【請求項１４】 請求項１０乃至１２の内のいずれかに
記載の硫酸抱合胆汁酸検出方法において，前記酵素は固
定化されたアスコルビン酸オキシターゼを含み，前記ア
スコルビン酸オキシターゼは，試料溶液中に含まれるア
スコルビン酸による発光反応に及ぼす影響を除去するこ
とを特徴とする硫酸抱合胆汁酸検出方法。 - 【請求項１５】 試料中の硫酸抱合胆汁酸の含有量に応
じて発光するセルと，発光された光を測定する手段とを
備えたことを特徴とする硫酸抱合胆汁酸センサ。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の硫酸抱合胆汁酸セン
サにおいて，前記セルの発光は，前記硫酸抱合胆汁酸か
ら酵素反応によって生成した過酸化水素とルミノールと
の反応によって生じることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸
センサ。 - 【請求項１７】 請求項１６記載の硫酸抱合胆汁酸セン
サにおいて，前記酵素反応における酵素は，胆汁酸硫酸
スルファターゼと３β−ヒドロキシステロイドとからな
ることを特徴とする硫酸抱合胆汁酸センサ。 - 【請求項１８】 請求項１７記載の硫酸抱合胆汁酸セン
サにおいて，前記酵素は固定化されたアスコルビン酸オ
キシターゼを含むことを特徴とする硫酸抱合胆汁酸セン
サ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2121196A JPH09206098A (ja) | 1996-02-07 | 1996-02-07 | 硫酸抱合胆汁酸検出方法及び硫酸抱合胆汁酸検出装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2121196A JPH09206098A (ja) | 1996-02-07 | 1996-02-07 | 硫酸抱合胆汁酸検出方法及び硫酸抱合胆汁酸検出装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09206098A true JPH09206098A (ja) | 1997-08-12 |
Family
ID=12048670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2121196A Pending JPH09206098A (ja) | 1996-02-07 | 1996-02-07 | 硫酸抱合胆汁酸検出方法及び硫酸抱合胆汁酸検出装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09206098A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056824A1 (ja) * | 2003-12-08 | 2005-06-23 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 硫酸抱合型胆汁酸の検出方法、それに用いられる試験紙およびバイオセンサ |
| CN111443080A (zh) * | 2019-01-17 | 2020-07-24 | 大韩民国(国立水产科学院) | 用于水产养殖的智能水质测定系统 |
| CN111443081A (zh) * | 2019-01-17 | 2020-07-24 | 大韩民国(国立水产科学院) | 环境压力诱发物质测定装置 |
-
1996
- 1996-02-07 JP JP2121196A patent/JPH09206098A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056824A1 (ja) * | 2003-12-08 | 2005-06-23 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 硫酸抱合型胆汁酸の検出方法、それに用いられる試験紙およびバイオセンサ |
| CN111443080A (zh) * | 2019-01-17 | 2020-07-24 | 大韩民国(国立水产科学院) | 用于水产养殖的智能水质测定系统 |
| CN111443081A (zh) * | 2019-01-17 | 2020-07-24 | 大韩民国(国立水产科学院) | 环境压力诱发物质测定装置 |
| JP2020115120A (ja) * | 2019-01-17 | 2020-07-30 | 大韓民国（国立水産科学院）ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ） | スマート水質測定システム |
| JP2020115119A (ja) * | 2019-01-17 | 2020-07-30 | 大韓民国（国立水産科学院）ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ） | 環境ストレス誘発物質測定装置 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070502 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20070905 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |