JPS60186761A - 濃度勾配測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 この発明は、試料中の竹足化学物質あるいは酵素の活性
を測定する装置の技術分野に属する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

固定化酵素を利用して試料中の化学物質あるいは酵素活
性全測定する方法として、電極装置を利用し、カラムに
充填した、あるいは電極表面に張りつけた固定化酵素に
よυ生成し、あるいけ消失した物質の量を電気化学的に
検出する電気化学的方法、および、酵素反応によシ生成
した物質と発光物質との反応によシ生ずる螢光あるいは
化学発光を検出する光学的方法がある。

前記電気化学的方法のうちカラムを使用する方法は、寿
命や安定性等にすぐれているけれど、カラムの出口で化
学物質の増減を検出するので、エンドアッセイしかでき
ない。したがって、レートアッセイを基本とする酵素活
性の測定に、前記カラムを使用する方法は不適当である
。

また、電極表面に固定化酵素を設けた、ＰＪｒ請、酵素
電極を用いる電気化学的方法は、酵素電極そのものを試
料中に浸漬するので、レートアッセイに適している。し
かしながら、物質の検出に当っては、固定化酵素で増減
する物質が、固定化酵素を担持する担持体中を拡散し：
て電極光ｍ」に到達しなければならないので、電極の応
答時間が相持体中での拡散距離に依存することとなり、
応答時間を早めるために相持体たとえば膜を薄く形成し
なければならなかった。そうすると、酵素電極の短命化
、不安定化を紹くことに々る。さらに、酵素電極自体、
感度がそれ程高くは々がった。

光学的方法は、電気化学的方法に比べて、検出感度が高
いけれど、一般に、酵素反応に好適なｐＨ域と化学発光
反応に好適ｋｐＨ域とが相違することがち９、どのよう
な場合にも適用可能というわけではない。

〔発明の目的〕

この発明は、前記事情に基づいて々されたものであり、
カラムを用いるフロー法の利点を生かしつつ、試料中の
物質量、酵素活性を光学的に検出シ、レートアッセイお
よびエンドアッセイのいずれの分析も可能である濃度勾
配測定装置を提供することを目的とするものである。

〔発明の概要〕

前記目的を達成するためのこの発明の概要は、流路系内
における酵素反応等の化学反応を流路方向に沿って検出
する事により、流動状態における反応速度の測定を可能
としたものである。

〔発明の実施例〕

この発明の概要について図面を参照しながら説明する。

この発明に使用される濃度勾配測定装置は、固定化酵素
を有し、発光物質含有の試料の流通可能な透明細管１と
、前記透明細管１の長手方向の所足範囲にわたって、前
記透ＢＡａ管ｌの中心軸に直交して配列された複数本の
ライトガイドまたとえばオプティカルファイバと、前記
ライトガイド２を介して前記透明細管ｌの長手方向に沿
って配列された複数の受光素子よυなる光検出部３と、
前記光検出部３よシ出カされる検出信号を増幅するアン
プ４と、前記検出信号により濃度勾配を検出し、レート
アッセイおよびエンドアッセイのための演算処理をする
演算部５と、演算部５で処理した結果を表示する表示部
６と、を倫えて構成される。

この発明においては、前記透明細管ｌには固定化酵素を
有し、前記透明＃Ｉ管ｌに、発光物質を含有する試料を
流通させるととＫよシ、試料内の腸定化学物賀が同定化
酵素の助けにょシ酵素反応をし、その生成物と発光物質
とを反応させて発光を起す。一般に、酵素反応および発
光物質による発光の強度は、ＰＨに依存する。したがっ
て、前記透明細１１への酵素の固定の態様は、酵素反応
と発光反応とに応じて適宜に選択することができる。

酵素活性検出の手段として用いる発光反応には、化学発
光と生物発光がある。化学発光の場合には例えばルミノ
ールが過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と鉄イオンの共存下で反
応する所謂ルミノール反応が有名である。化学発光物質
ＫＩｔ−１ルミノールの他にモルシゲニン、ロフィン、
ピロガロール、シロキサン等極々知らｆｌ、ている。化
学発光を検出の手段とする場合、使用される酵素はＨ２
Ｏ２を生成する酸化酵素が用いられる。

酸化酵素と１〜では、グルコースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等であ
る。例えばグルコース定量の場合には、グルコースオキ
シダーゼを用い、グルコースを酸化して、グ刀・コン酸
とし、子の際生成するＨ２Ｏ２をルミノールと反応、さ
せて発光させればよい。この様な方法で各種物質及び酵
素の定量が可能である。しかしながら化学発光の場合１
つの問題がある。それは多くの化学発光はＰＨ１０以上
のアルカリ域で行なわれる。−力大部分の酵素は上記条
件下では、活性が低下するか又は失活してしまう。従っ
て、酵素反応を行なわせつつ、発光反応を見る為には、
特殊な工夫が必要となる。−力、中性域で発光する物質
も数は少々いが知られている。例ｔ　ハビス（２−４−
ジニトロフェニル）オキサレー）　（ＤＮＰＯ）やビス
（２−４−トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰ
Ｏ）　等である。

ＤＮＰＯやＴＣＰＯを用いる場合の発光助材としては、
ポルフィリン、フルオロサミン、ダンシル化合物等を用
いる事が出来る。

生物発光の場合、ホタルのルシフェソン自ルシフェラー
ゼ反応が知られており、アデノシントリ・リン酸（ＡＴ
Ｐ）の検出力法として既に実用化されている。最近、新
しい生物発光系が見出され、市販されてきている。それ
は、バクテリアのルシフェラーゼであり、下記の様な２
段階の反応釦より発光する。

（Ｊｅａｎｅ　Ｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｌｅｕｅ　Ｄ
ｅｌｕｃａ　ＡｕａｌＢｉｏｃｈｅｍ　１１０，４３（
’８３））（１）　Ｈ２＋ＮＡＩＸＰ）Ｈ＋ＦＭＮ→Ｎ
ＡＩＸＰ）”　十Ｆ胴２光 ここで（１）を触媒するのはＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシド
リダクターゼという酵素であり、　（２）の反応は細菌
ルシフェラーゼにより進ゼする。

第１段反応で使用されるＮ　Ａ、　Ｄ（ト）は種々の脱
水素酵素の補酵素として知られている。脱水素酵素は基
質から水素を抜きとるが、その際ＮＡＤ［Ｆ］はその水
素を受けとってＮＡＤ（ト）Ｈとなる。

従って脱水素酵素を上記生物発光反応と共設させる拳に
より、種々の基質及び酵素活性を発光現象として検出す
る事が出来る。生物発光の判長は中性域で進行する事で
あり、この点からも種々の他の酵素反応と共設させ易い
。

一力脱水素酵素は、酸化酵素と並んで各種物質の分析に
広く使用されている。例えばグルコース−６−リン酸テ
ヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ、３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ等である。

酵素をキャピラリー内に固定化する場合、化学発光の場
合は酸化酵素を固定化すれば良い。一方生物発尤の場合
、にはルシフェラーゼ及びオキシドリダクターゼを固定
化すれば良い。尚この場合脱水素酵素をも同時に固定化
する事も出来るが、ルシフェラーゼ及びオキシドリダク
ターゼのみを固定化した場合には種々の脱水素酵素反応
の共通検出機素として用いる事も出来る。

キャピラリー内への酵素の固定化にはいくつかの方法が
考えられるが、キャピラリー自体は光を透過するもので
あれば判に材質は問わない。酵素はキャピラリーの内壁
に直接固定する事も可能であるし、更には、デキストラ
ン等の担体に固定化した後、上記キャピラリー内に充填
しても良い。

この場合の担体は、発光反応及び発光自体を妨害しない
様なものであれは、腸に材質は問わない。

固定化反応自体は、これまで報告されて来た既知の方法
で行なえば良い。

酵素がたとえばグルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等の酸化酵素
（オキシダーゼ）であるとき、酵素反応はＰＨ４〜８で
行なわれ、また、試料中の発光物質がルミノールである
ときには発光強度はＰＨがアルカリ域で強い。

したがって、内壁にアミノ基等の塩基性基を導入した前
記透明細管１に、通常の方法でオキシダーゼを同定し７
た不溶性の微粒子（不溶性物質）たとえばガラス粒子を
充填するのが良い。このようにすると、Ｐ　Ｈ，７〜８
の試料を透明細管１に流通させると、内壁に導入した塩
基性基にょシ前記透明卸１臂１の内壁がアルカリ域のＰ
Ｈにシフトするので、ガラス粒子に固？されたオキシダ
ーゼにより生じた１］２０２が、アルカリ域の内壁近傍
でルミノールと反応して充公な強度で発光を生じさせる
ことができる。

甘だ、内壁に塩基性基を導入した前記透明細管１のかわ
りに、内壁にカルボキシル基等の酸性基を導入した前記
透明細管１を用い、その内壁にオキシダーゼを固定して
もよい。このようにすると、Ｐ　Ｈ９以上の試料を透明
細管１に流通させるとき、内壁に導入した酸件卑により
前記透明細管１の内壁近傍が中性域のＰＨにシフトする
ので、内壁近傍でオキシダーゼによる酵素反応が進行し
、生成するＩＩ２　（’）２とルミノールとが内壁近傍
以外の透明細管１内で反尾、して発光を生じさせること
ができる。

ＰＨ９以上の試料を用いる場合、内壁に酸性基を導入し
た前記透明細管１を用いるがわりに、酸性基を内壁に導
入した透明油１′１イ１を用い、この透明細管１内に、
戯性違を導入すると共にオキシダーゼを固定したガラス
粒子を充填してもよい。

このようにすると、ＰＨ９以上の試料を透明細管１に流
通させるとき、ガラス粒子の表面近傍は導入した酸性基
で中性域のＰ　Ｈにシフトするので、ガラス粒子の表面
近傍でオキシダーゼによる酵素反応が進行し、生成する
Ｈ２Ｏ２とルミノールとがガラス粒子の表面近傍以外の
透明細管１内で反応して発光を生じさせることができる
。

化学発光物負がＤＮＰ　ＯやＴＮＰ（１の様に中性で発
光する物質の場合や、生物が光の場合には、酵素の固定
化に際し、この様な工夫は不要であり、通常の方法に従
って固定化すれば良い。

前記ライトガイド２は、前記透明細管１内での発光を迷
光を生じることなく光検出部３に導びくために設けられ
る。

前記）“１−検出部３は、女、とえば−次元撮像デバイ
ス、−夕！１に配列した多数の７オトダイオートを使用
することができる。前記光検出部３は、前記透明細管１
内Ｃの発光を各位置で検出し、発光強度（τ汁例−する
７ｈ′気信号を出力する。

演宍部５　［、前記光検出部３より出力されるところの
、前盲シ透明細管１の名位置での発光の強度に比セｌ）
する市、伝信−号を゛アンプ４を介して、人力し、また
、国元Ｌ５なＶ／′ｌ外部入力装置により入力し、たデ
ータだとλ−°試料の流通速度、試料の種類等から試料
中の相定物負の濃度勾配、酵素反応の速度を切出してレ
ートアッセイの結果を算出し、酵素反応の速度の飽和点
を検出してエンドアッセイの粘体を１４出する。算出結
果は表示装置ｔ　６で表示する。

以上構成の作用について述べる。

細菌ルシノェラーゼ及びＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドリタ
クターゼを固定化した透明細管内に発光に心安な物質Ｆ
ＭＮ１デカナール及びＮＡＤ、乳酸ＬＤＨを含む試料を
流過させると、ＬＤＨの作用によシ下記の反応が進行し
ＮＡＤＨ （８）乳酸＋ＮＡＤ−−ンビルビン酸４−ＮＡＤＨが生
成する。このＮ　Ａ　Ｄ　Ｈけ、Ｌ＾１定化醇化酵素媒
により（１）及び（２）の反応が進やｒｌ、て発光がお
こる。

前記酵素反応および発光役Ｙ６は、第２図に示すよう傾
、前記透明細管１内の試料の流通と共に進行するので、
発光強度は、透明油１賀１の進イゴカ向の長さにより増
加する。透明＋１１１官１円での発光は、ライトガイド
２を介して光検出部３Ｔ検知され、発光強度に比例する
検知信号が、アンプ４により増幅さｉ＊後、演ｐ部５に
入力する。演算部５Ｔは、発光強度の増加率を算出する
ことによシ條度勾配をｐ−出しル−トアッセイの分析結
果を出力し、１だ、発光強度の増加率Ｏを検知ｊ、’７
エンドアツセイの分析結果を出力し、表示装置６にそれ
ぞれの分析結果を表示する。

次に、この発、明に係る装置を用いた具体的々試料の分
析例を示す。

例 実施例１ 濃度勾配測定装置の具体的実施例を第３図に示した。こ
こで１′は反応及び発光用キャピラリーカラム、２は光
学ファイバー、３は多チヤンネルフォトダイオードアレ
ーであり、これら一式は７の恒温暗ねに収められている
。１１は、基質等溶液であり、１２は送液用ポンプ、１
３はサンプル注入用弁である。これらは１′のキャピラ
リーとフッ素樹脂製チューブで接続されでいる。１１及
び１２は必要に応じ複数設ける串が出来る。ポンプ１２
で送られて来た基質ば１３の注入弁より注入されたサン
プルとチューブ内で混じり合う。上記混合液が１′のキ
ャピラリー内で反応し、発光すると光は２の光学ファイ
バーを通じフォトダイオードアレー３に到達する。フォ
トダイオードアレー３の出力信号はアンプ４で増巾され
、演算部５を経て表示部６に表示される。反応終了後反
応液はチューブを通じ廃液８として売出される。

実施例２ 発光要素として、細菌ルシフェラーゼ及びＮＡＤＨ−Ｆ
ＭＮオキシドリダクターゼをジーン・フォードらの方法
（Ｊｅａｎ　Ｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｌｅｎｅｌ）ｅ
、ｌ、ｕｃａ：Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１０．４
３−４８（１９８３））に従って臭化シアン活性化セフ
ァロース４　Ｂ　（商品名：ファルコシア製）に固定化
した。次に上記固定化酵素組成物（以下ゲルという）を
内径１膓の石英製キャピラリーカラムに充填した。尚ゲ
ルの漏出を防止する為にキャピラリーの両端にガラスウ
ールを充填した。この様にして作成した発光用キャピラ
リーカラム１′を第１図で示した、濃度勾配測定装置に
装着した。

次に本装置を用いてグルコースの測定を試みた。

基質溶液としては、２　ｍＭＡＴＰ　、　２ｍＭＮＡＤ
Ｐ　、　３／ＪＭＦＭＮ、５ｐｐｍデカナール６００Ｕ
／ｌヘキソキナーゼ、及び３００Ｕ／ｌ！グルコース−
６−リン酸脱水素酵素を含有する０、　Ｉ　Ｍ　＋、１
ン酸緩衝液（ＰＨ７，５）を用いた。流速は０・１　ｍ
／／ｍｉｎで反応槽内温度は３７°Ｃとした。サンプル
としてＯ〜１００ｍｙ／ｄｌのグルコース溶液を用い、
その２μｌを反応系に注入した。その結果第４図に示す
様に良好な測定感度が祷られた。

実施例３ 実１施例１及び実施例２に示した濃度勾配測定装置を用
いて、次に乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨ）の測定を行な
った。基質溶液としては、２００１’）１Ｍ乳酪リチウ
ム、２ｍＭＮＡＤ、３ｕＭＦＭ、Ｎ、５　ｐＰ”デカナ
ールを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ＰＨ８５）を用いた
。ＬＤＨは１０〜１００ＩＵ／／となる様、調製しその
２μｅを反応等に注入した。その時のタイムコースを第
５図に示したが良好に測定感度が得られた。

〔発明の効果〕

以上に詳述したように、この発明によると、透明細管中
を流通する試料につき、酵素反応の後の発光反応により
生ずる発光を、透明細管における各位置で検出するので
、レートアッセイとエンドアッセイとを同時に分析する
ことができる。しかも両分析は、光学的に行なうので、
その分析結果を早い応答速度で、冒い精１ｕで州ること
ができる。

また、透明細管に固定する酵素の活性が低下したときに
は、透明細管を取りかえるだけで、酵素活性を維持する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の概略を示す説明図および第２図は前
記棚略説明における透明細管中での発光強度の変化を示
す特性図、第３図は具体的実施例を示す図、第４図及び
第５図は効果説明のだめの特性図である。 １・・・透明細管、１′・・・キャピラリーカラム、２
・・・ライトガイド（光ファイバー）、３・・・フォト
ダイオードアレー（光検出部）、４・・・アンプ、５・
・演算部、　６・・・表示部。 代理人　弁理士　則　近　憲　佑（ほか１名）第１図 暫 第２図 シーＩ１１麹′ｇ長−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　流路系内における酵素反応等の化学反応を流路
   方向に沿って検出する事により、流動状態における反応
   速度の測定を可能とした濃度勾配測定装置 （２）前記流路系が光学的に透明なキャビラＩＪ−よシ
   なる事を特徴とする特許請求の範囲第１頌に記載の濃度
   勾配測定装置 （８）前記検出系が透明キャピラリーの長手方向に沿っ
   て配例された複数の受光素子である事を特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。 （４）前記流路系内に固定化酵素を含む馨を特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。 （５ン　前記化学反応が発光反応を含む事を特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。 （６）前記固定化酵素は、前記透明細管の内壁に担持さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の濃
   度勾配測定装置。 （γ）前記固定化酵素は、前記透明細管に充填される水
   不溶物質に担持されることを特徴とする特許請求の範囲
   第４項に記載の濃度勾配測定装置。 （８）前記固定化酵素は酸化酵素である事を特徴とする
   特許請求の範囲第４頓記載の濃度勾配測定装置。 （９）前記固定化酵素はルシフェラーゼである事を特徴
   とする特許請求の範囲第４項記載の濃度勾配測定装置。 α０）前記複数の受光素子が、−次元撮像デバイスであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項
   のいずれかに記載の濃度勾配測定装置。 α→　前記複数の受光素子が、フォトダイオードプレイ
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項々いし第
   ３項のいずれかに記載の濃度勾配測定装抛−０