JPS61268172A - 濃度勾配測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ この発明は、試料中の特定化学物質あるいは酵素の活性
を測定する装置の技術分野に属する。

［発明の技術的背景とその問題点］ 固定化酵素を利用して試料中の化学物質あるいは酵素活
性を測定する方法として、電極装置を利用し、カラムに
充填した、あるいは電極表面に張りつけた固定化酵素に
より生成し、あるいは消失した物質の量を電気化学的に
検出する電気化学的方法、および酵素反応により生成し
た物質と発光物質のとの反応により生ずる螢光あるいは
化学発光を検出する光学的方法がある。

前記固定化酵素を利用して試料中の化学物質あるいは酵
素活性を測定する方法のうちカラムを使用する方法は、
寿命や安定性等にすぐれているけれど、カラムの出口で
化学物質の増減を検出するので、エンドアッセイしかで
きない。したがってレートアッセイを基本とする酵素活
性の測定に前記カラムを使用する方法は不適当である。

また電極表面に固定化酵素を設けた所謂酵素電極を用い
る電気化学的方法は、酵素電極そのものを試料中に浸漬
するのでレートアッセイに適している。しかしながら物
質の検出に当っては、固定化酵素で増減する物質が固定
化酵素を担持する担持体中を拡散して電極表面に到達し
なければならないので、電極の応答時間が担持体中での
拡散距離に依存することとなり、応答時間を早めるため
に担持体たとえば膜を薄く形成しなければならなかった
。そうすると酵素電極の短命化、不安定化を招くことに
なり、さらに酵素電極自体、感度がそれ程高くはなかっ
た。

光学的方法は電気化学的方法に比べて検出感度が高いけ
れど、一般に酵素反応に好適なｌ）Ｈ［と化学発光反応
に好適なｐＨ域とが相違することがあり、どのような場
合にも適用可能というわけではない等の問題があった。

［発明の目的］ 本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであり、カラ
ムを用いるフロー法の利点を生かしつつ試料中の物質量
、酵素活性を光学的に検出しレートアッセイ及びエンド
アッセイのいづれの分析も可能である濃度勾配測定装置
の提供を目的とする。

［発明の概要］ 前記目的を達成する為の本発明の概要は、流路系内にお
ける酵素反応等の化学反応を流路方向に沿って検出する
事により、流動状態における反応速度の測定を可能とし
たものである。

［発明の実施例］ 本発明の概要について図面を参照しながら説明する。

本発明に使用される濃度勾配測定装置は、固定化酵素を
有し発光物質含有の試料の流動可能な透明細管１と、前
記透明細管１の長手方向の所定範囲にわたって移動可能
な前記透明細管１の中心軸に直交して配置された光検出
部２と、該光検出部２を移動せしめる駆動部３と前記光
検出部２より出力される信号を増幅するアンプ４と、前
記光検出部２の駆動を制御し前記光検出部２からの光検
出信号により濃度勾配を検出し演算処理する制御演算部
５と、該制御演算部５に必要なパラメータを入力する外
部入力部６と制御演算部５で処理された結果を表示する
表示部７とで構成される。

上記構成において、前記透明細管１には固定化酵素を有
し、前記透明ｍ管１に発光物質を含有する試料を流通さ
せることにより試料内の特定化学物質が固定化酵素の助
けにより酵素反応をし、その生成物と発光物質とを反応
させて発光を起す。

一般に酵素反応および発光物質による発光の強度はＩ）
Ｈに依存する。したがって前記透明細管１への酵素の固
定の態様は、酵素反応と発光反応とに応じて適宜に選択
する事ができる。

酵素活性検出の手段として用いる発光物質には化学発光
と生物発光がある。化学発光の場合には例えばルミノー
ルが過酸化水素（Ｈ２０２）と鉄イオンの共存下で反応
する所謂ルミノール反応が有名である。化学発光物質に
はルミノールの他にもルシゲニン、ロフィン、ピロガロ
ール、シロキサン等種々知られている。化学発光を検出
の手段とする場合、使用される酵素はＨ２Ｏ２を生成す
る酸化酵素が用いられる。

酸化酵素としてはグルコースオキシターゼ、コレステロ
ールオキシターゼ等が一般によく知られている。例えば
グルコース定量の場合にはグルコースオキシターゼを用
い、グルコースを酸化してグルコン酸とし、その際生成
するＨ２０２をルミノールと反応させて発光させれば良
い。この様な方法で各種物質及び酵素の定量が可能であ
る。しかしながら化学発光の場合１つの問題がある。そ
れは多くの化学発光はｐＨ１０以上のアルカリ域で行な
われる。−万人部分の酵素は上記条件下では活性が低下
するか又は失活してしまう。従って酵素反応を行なわせ
つつ発光反応を見るためには特殊な工夫が必要となる。

一方、中性域で発光する物質も数は少ないが知られてい
る。例えばビス（２−４−ジニトロフェニル）オキサシ
−１・（ＤＮＰＯ）やビス（２−４−ｉ−リクロロフェ
ニル）オキサレート（ＴＣＰＯ＞等である。ＤＮＰＯや
ＴＣＰＯを用いる場合の発光助材としては、ホルフイリ
ン、フルオロサミン、ダンシル化合物等を用いる事が出
来る。

生物発光の場合、ホタルのルシフェリン・ルシフェラー
ゼ反応が知られており、アデノシン・三リンＦｉ９　（
ＡＴＰ＞の検出方法として既に実用化されている。最近
新しい生物発光系が見い出され、市販されてきている。

それはバクテリアのルシフェラーゼであり下記の様な２
段階の反応により発光する。

ＬＪｅａｎｅ　　Ｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｌｅｎｅ　
　Ｄｅｌｕｃａ　：Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
、　１１０．４３　（’　８３）　＞［１）　　Ｈ２＋
ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ＋ＦＭＮ還元型　　　　酸化型 ニコチンアミド　フラビンモノ アデニンジ　　　ヌクレオチド ヌクレオチド →ＮＡＤ　　（Ｐ）　　　＋ＦＭＮＨ２酸化型　　　　
還元型 ニコチンアミド　フラビンモノ アデニンジ　　　ヌクレオチド ヌクレオチド （２）　　Ｆ　Ｍ　Ｎ　Ｈ２＋デ力ナール＋０２→ＦＭ
Ｎ＋デカノイックアシド＋ｈν光ここで（１）を触媒す
るのはＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドリダクターゼという酵
素であり、（２）の反応は細菌ルシフェラーゼにより進
行する。

第１段反応で使用されるＮＡＤ　（Ｐ）は種々の脱水素
酵素の補酵素として知られている。脱水素酵素は基質か
ら水素を扱きとるが、その際ＮＡＤ（Ｐ）はその水素を
受けとってＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとなる。

従って脱水素酵素を上記生物発光反応と共設させる事に
より、種々の基質及び酵素活性を発光現象として検出す
る事が出来る。生物発光の特徴は中性域で進行する事で
あり、この点からも種々の他の酵素反応と共設させ易い
。

一方脱水素酵素は酸化酵素と並んで各種物質の分析に広
く使用されている。例えばグルコース−６−リン酸テヒ
ドロゲナーゼ、乳酸テヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、リン
ゴ酸テヒドロゲナーゼ（ＭＤＩ４）、グルタミン酸テヒ
ドロゲナーヒ、３αヒトＯキシステロイトチヒドロゲナ
ーゼ等である。

酵素をキャピラリー内に固定化する場合、化学発光の場
合は酸化酵素を固定化すれば良い。生物発光の場合は脱
水素酵素を固定化する事も出来るが、ルシフェラーゼ及
びオキシドリダクターゼのみを固定化した場合には種々
の脱水素酵素反応の共通検出要素として用いる事も出来
る。

キャピラリー内への酵素の固定化にはいくつかの方法が
考えられるが、キャピラリー自体は光を透過するもので
あれば特に材質は問わない。酵素はキャピラリーの内壁
に直接固定する事も可能であるし、さらにたとえばテキ
ストラン等の担体に固定化した後、上記キャピラリー内
に充填しても良い。

この場合の担体は、発光反応及び発光自体を妨害しない
様なものであれば特に材質は問わない。

固定化反応自体は、これまで報告されて来た既知の方法
で行なえば良い。酵素がたとえばグルコースオキシダー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ。

ピルビル酸オキシダーゼ等の酸化酵素（オキシダーゼ）
であるとき、酵素反応はｐＨ４〜８で行なわれ、また試
料中の発光物質がルミノールであるときには発光強度は
ｐＨがアルカリ域で強い。

したがって、内壁にアミン基等の塩基性基を導入した前
記透明細管１に、通常の方法でオキシダーゼを固定した
不溶性の微粒子（不溶性物質）たとえばガラス粒子を充
填するのが良い。このようにすると、内壁に導入した塩
基性基により前記透明細管１の内壁がアルカリ域のｐｔ
−＋にシフトするので、ガラス粒子に固定されたオキシ
ダーゼにより生じたＨ２０２が、アルカリ域の内壁近傍
でルミノールと反応して充分な強度で発光を生じさせる
ことができる。

また、内壁に塩基性基を導入した前記透明細管１のかわ
りに、たとえば内壁にカルボキシル基等の酸性基を導入
した前記透明細管１を用い、その内壁にオキシダーゼを
固定してもよい。このようにすると、１）８９以上の試
料を透明細管１に流通させるとき、内壁に導入した酸性
基により前記透明細管１の内壁近傍が中性域のｐＨにシ
フトするので、内壁近傍でオキシダーゼによる酵素反応
が進行し、生成するＨ２０２とルミノールとが内壁近傍
以外の透明細管１内で反応して発光を生じさせる事がで
きる。

ｐ（（９以上の試料を用いる場合、内壁に酸性基を導入
した前記透明細管１を用いるかわりに、酸性基を内壁に
導入した透明細管１を用い、この透明細管１内に酸性基
を導入すると共にオキシダーゼを固定したガラス粒子を
充填してもよい。

このようにすると、１）Ｈ９以上の試料を透明細管１に
流通させるとき、ガラス粒子の表面近傍は導入して酸性
基で中性域のｐＨにシフトするので、ガラス粒子の表面
近傍でオキシダーゼによる酵素反応が進行し、生成する
１１２ｏ２とルミノールとがガラス粒子の表面近傍以外
の透明細管１内で反応して発光生じさせる事ができる。

化学発光物質がＤＮＰＯやＴＮＰＯの様に中性で発光す
る物質の場合や生物発光の場合には、酵素の固定化に際
し、この様な工夫は不要であり、通常の方法に従って固
定化すれば良い。

竹記光検出部２はたとえばフォトダイオード。

フォトマルチプライヤ−等を使用する事が出来る。

又前記光検出部２は固定状態にし該光検出部２に直結さ
せたライトガイドたとえば光ファイバー８を前記透明細
管１の長手方向に沿って移動させる事も可能である（第
４図参照）。前記光検出部２は、前記透明細管１内での
発光を各位置で検出し発光強度に比例する電気信号を出
力する。

演算部５は、前記光検出部２より出力され、前記透明細
管１の各位置での発光の強度に比例する電気信号をアン
プ４を介して入力し、また外部入力部６により入力した
データたとえば試料の流通速度、試料の種類等から駆動
部３を制御し、試料中の特定物質の濃度勾配、酵素反応
の速度を算出してレートアッセイの結果を算出し、酵素
反応の速度の飽和点を検出してエンドアッセイの結果を
算出し算出結果は表示装置７で表示する。

以上の構成の作用について述べる。

細菌ルシフェラーゼ及びＮＡＤＩ−１−ＦＭＮオキシド
リダクターゼを固定化した透明細管内に発光に必要な物
質ＦＭＮ、デカナール及びＮＡＤ、乳酸ＬＤＨを含む試
料を流過させると、ＬＤＨの作用により下記の反応が進
行しＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ（３）　　乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン
酸＋ＮＡＤＨが生成する。このＮ　Ａ　Ｄ　Ｈは固定化
酵素の触媒により（１）及び（２の反応が進行して発光
が起る。

前記酵素反応及び発光反応は、第２図に示すように前記
透明細管１内の試料の流通と共に進行するので、発光強
度は透明細管１の進行方向の長さにより増加する。透明
細管１内での発光は、該透明粗管１の長手方向に沿って
移動する光検出部２で検知され、発光強度に比例する検
知信号がアンプ４より増幅された後演葬部５に入力する
。該演算部５では、発光強度の増加率を算出することに
より８１度勾配を算出し、又発光強度の増加率Ｏを検知
してエンドアッセイの分析結果を出力し、表示装置７に
それぞれの分析結果を表示する。

次に、本発明に係る装置を用いた具体的な試料の分析例
を示す。

まず本発明の第１実施例として第３図に工程図を示す。

同図において濃度勾配測定ＶＡ＠は、反応及び発光用キ
ャピラリーカラム１とフォトダイオード２を収納した恒
温暗箱９と、基質等溶液１０と送液用ポンプ１１とサン
プル注入用弁１２はキャピラリーカラム１とたとえばフ
ッ素樹脂製チューブで接続され、また前記基質等溶液１
０と送液用ポンプ１１は必要に応じて少なくとも１台は
設置する事ができる。

上記構成において送液用ポンプ１１で送られて来た基質
はサンプル注入用弁１２より注入されたサンプルと前記
フッ素樹脂製チューブ内で混り合う。前記フッ素樹脂内
で混り合った基質とサンプルの混合液が前記発光用キャ
ピラリーカラム１内で反応し発光すると、その光は前記
発光用キャピラリーカラム１の長手方向に沿って移動す
るフォトダイオードアレー２に到達し、該フォトダイオ
ードアレー２の出力信号はアンプ４で増幅されて演算部
５を経て表示部７に表示され、反応終了後反応液はチュ
ーブを通じ廃液１３として廃山される。

次に第２実施例として、発光要素として細菌ルシフェラ
ーゼ及びＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドリダクターゼをジー
ン・フォードらの方法（Ｊ　ｅａｎｅＦｏｒｄ　ａｎｄ
　Ｍａｒｌｅｎｅ　　Ｄｃｌｕｃａ　：　Ａｎａｌ　、
　Ｂ　ｉｏ　−ｃｈｅｍ、、１１０．４３〜４８　（１
９８３））に従って臭化シアン活性化セファロース４Ｂ
に固定化し、前記固定化酵素組成物（以下ゲルと略称す
）を内径１１ｎＩＩｌの石英製キャピラリーカラムに充
填し、前記ゲルの漏出を防止する為に前記石英製キャピ
ラリーカラムの両端にガラスウールを充填して構成した
発光用キャピラリーカラム１を第１図で示した濃度勾配
測定装置に構設した濃度勾配測定装置において、２ｎ＋
　ＭＡＴＰと２ｎ＋　ＭＮＡＤＰと３μＭＦＭＮと５　
ｐｐｍデカナール６００１Ｊ＃！ヘキソキナーゼ及び３
００Ｕ／ｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含有す
る０、１ＭリンＭ緩衝液（ｐＨ７，５）を用いた基質溶
液で、流量は０、１　１１１！／＋＋＋ｉｎで反応槽内
温度を３７℃とした。

またサンプルとしてＯ〜１００ｍａ／ｄ　　のグリコー
ス溶液を用い、その２μ乏を反応系に注入した結果第５
図に示す良効な測定感度を得る事が出来た。

次に第３実施例として、前記実施例１及び実施例２に示
した濃度勾配測定装置を用いて乳酸脱水素酵素（以下Ｌ
　Ｄ　Ｈと略称す）の測定を行ない、２００ｍＭ乳酸リ
チウムと２ｍ　ＭＮＡＤと３μＭＦＭＮと５１）Ｉ）Ｉ
ＩＩテカナールを含くむ０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８
，５）を用い、ＬＨＤは１０〜１００１Ｕ＃！となる様
調整した基質溶液の２μ　を反応等に注入した時のタイ
ムコースを第６図に示す。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明によると、透明細管中を流通
する試料につき、酵素反応の後の発光反応による発光を
透明細管における各位置で検出するので、レートアッセ
イとエンドアッセイとを同時に分析する事が出来、しか
も両分析は光学的に行なうのでその分析結果を早い反応
速度でかつ高い精度で得る事が出来る。また透明細管に
固定する酵素の活性が低下したときには、透明細管を取
り換えるだけで酵素活性を維持する事が出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の概略を示す説明図、第２図は前記概
略説明における透明細管中での発光強度の変化を示す特
性図、第３図は本発明の第１実施例の工程図、第４図は
本発明の第１実施例の変形例の工程図、第５図は第２実
施例の特性図、第６図は、第３実施例の特性図である。 １・・・透明細管、２，３・・・光検出部、４・・・ア
ンプ、５・・・制御演算部、６・・・外部入力部、７・
・・表示部、８・・・ライトガイド、９・・・恒温暗箱
、１１・・・送液用ポンプ、１２・・・サンプル注入用
弁。 代理人　弁理士　則　近　憲　佑（ばか１名）還ｒη麹
Ｕ−

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）流路系内における酵素反応等の化学反応を流路方
   向に沿つて検出する事により、流動状態における反応速
   度の測定を可能とした濃度勾配測定装。
2. （２）前記流路系が光学的に透明なキャピラリーよりな
   る事を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の濃度勾配
   測定装置。
3. （３）前記検出系が透明キャピラリーの長手方向に沿つ
   て移動する受光素子である事を特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の濃度勾配測定装置。
4. （４）前記検出系が受光素子と該受光素子に連結された
   ライトガイドよりなり、このライトガイドが透明キャピ
   ラリーの長手方向に沿つて移動する事を特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。
5. （５）前記流路系内に固定化酵素を含くむ事を特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。
6. （６）前記化学反応が発光反応を含くむ事を特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の濃度勾配測定装置。
7. （７）前記固定化酵素は、前記透明細管の内壁に担持さ
   れる事を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の濃度
   勾配測定装置。
8. （８）前記固定化酵素は、前記透明細管に充填される水
   不溶性物質に担持される事を特徴とする特許請求の範囲
   第５項に記載の濃度勾配測定装置。
9. （９）前記固定化酵素は酸化酵素である事を特徴とする
   特許請求の範囲第５項記載の濃度勾配測定装置。
10. （１０）前記固定化酵素はルシフエラーゼである事を特
    徴とする特許請求の範囲第５項記載の濃度勾配測定装置
    。
11. （１１）前記受光素子が、フォトダイオードである事を
    特徴とする特許請求の範囲第１項、第３項ないし第４項
    のいづれかに記載の濃度勾配測定装置。
12. （１２）前記受光素子がフォトマルチプライヤーである
    事を特徴とする特許請求の範囲第１項、第３項ないし第
    ４項のいづれかに記載の濃度勾配測定装置。