KR0166866B1 - 광섬유 바이오센서 및 그 측정장치 - Google Patents

광섬유 바이오센서 및 그 측정장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광섬유 바이오센서에 관한 것으로, 신체 기능이상시 혈액중으로 과량유출되는 효소인 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와, 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈의 활성을 정확히 측정하는데 적당한 광섬유 바이오센서 및 그 측정장치에 관한 것이다.
이를 위한 본 발명의 광섬유 바이오센서 및 그 측정장치는 전체 시스템을 제어하고 하기의 광섬유 바이오센서 신호처리부에 의한 분석신호를 각각의 GPT, GOT 효소활성 값으로 표시하는 마이크로 프로세서 조절부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 GPT, GOT 각각의 제1 효소반응에 의한 공통반응 산물을 생성하는 FIA부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 상기 FIA부에 의한 공통반응 산물을 제2 효소반응을 이용해 각각의 GPT, GOT 농도에 비례하는 분석신호를 산출하는 광섬유 바이오센서 신호처리부를 포함하여 구성됨을 특징으로 한다.

Description

광섬유 바이오센서 및 그 측정장치
제1도는 본 발명에 적용된 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트 탈수소효소에 의한 효소반응을 나타낸 도면.
제2도는 본 발명에 적용된 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트 탈수효소에 의한 효소반응을 나타낸 도면.
제3도는 본 발명의 광섬유 바이오센서를 나타낸 도면.
제4도는 본 발명의 광섬유 바이오센서 측정장치를 나타낸 구성도.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1 : 감지부 2 : 유리판
3 : 효소고정층 4 : 광섬유
10 : FIA부 11 : 마이크로 펌프
12 : 완충용액 13 : 암모늄 아세트 용액
14 : GPT 효소반응용 파이루베이트 용액
15 : GOT 효소반응용 옥살로아세테이트 용액
16 : 3방변 밸브 17 : 시료투입구
19 : 시료혼합부 20 : 광섬유 바이오센서 신호처리부
21 : 측정 셀 22 : 광원
23 : 광측정기 30 : 마이크로 프로세서 조절부
본 발명은 광섬유 바이오센서(Fiber-optic Biosensoe)에 관한 것으로 특히, 신체 간기능 이상시 혈액증으로 과량 유출되는 효소인 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈(Glutamate-Pyruvate Transaminase, GPT)와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈(Glutamate-Oxaloacetate Transaminae, GOT)의 활성을 정확히 측정하는데 적당하도록 한 광섬유 바이오센서 및 그 측정장치에 관한 것이다.
일반적으로 임상에서 측정되는 검사항목중 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈는 간염진단뿐 아니라 간의 손상 또는 간기능 저하의 지표가 되는 중요한 효소이다.
또한, GPT와 GOT 이 두가지 트랜스아미네이즈(transaminase)는 간뿐만 아니라 심장 기능의 이상유무를 판단할 경우에도 그 측정이 중요한 효소로 알려져 있다.
이러한 GPT와 GOT는 간이 손상을 입거나 비정상적인 상태일 경우에 혈액중으로 유출되기 때문에 혈중 이들 효소의 양을 정량함으로써 임상학적 진단정볼르 얻을 수 있다.
GPT는 생체내에서 아미노산의 일종인 알라닌(L-alanine)의 아미노기를 α-케토글루타레이트(α-Ketoglutarate)에 전이하여 글루타메이트(L­glutamate)와 파이루베이트(pyruvate)를 생성하는 반응에 관여한다.
한편, 역반응이 일어나는 경우는 알라닌이 생성된다.
반면, GOT의 경우는 아스파테이트(L­aspartate)의 아미노기를 α-케토글루타레이트(α-Ketoglutarate)에 전이하여 글루타메이트(L­glutamate)와 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환시킨다.
이 두가지 효소반응의 특징은 평형반응이라는 점이며, 이들 효소반응을 요약하면 다음과 같다.
따라서 GPT는 알라닌 트랜스아미네이즈(alanine transaminase, ALT)라고 불리우기도 하며, GOT는 아스팔테이트 트랜스아미네이즈(aspartate transaminase, AST)라고 불리운다.
GPT와 GOT를 분석하는 기존의 측정방법은 세계특허 WO 91/13169 등에서 기술된 바와 같이 위의 반응 (1)과 (2)에서 각각 생성된 파이루베이트(pyruvate)와 옥살로아세테이트(oxaloacetae)를 기질로 하는 효소반응을 이용하여 개발되었다.
이와 같은 방법은 이미 진단킷트 형태로 상용화 되어 있다.
즉, GPT 측정의 경우 (1)의 반응에서 생성된 파이루베이트가 락테이트 탈수소효소(lactatedehydrogenase, LDH)의 반응으로 락테이트(lactate)로 전환되는데 이때 조효소인 NADH(1, 4­dihydronicotinamide adenine dinucleotide)가 NAD+(β-nicotinamide­adenine dinucleotide)로 전환된다(반응식(3)).
따라서 GPT 효소활성은 1분당 생성되는 파이루베이트의 양에 비례하므로 LDH의 반응에 의해 소모되는 NADH의 양을 측정함으로써 GPT의 양을 알 수 있게 된다.
보통 이것은 기존의 분광학적 방법을 사용하여 365nm의 파장하에서 1분당 NADH의 흡광도 감소변화를 측정한다(J. Lab. Clin. Med., 46:785­789, 1995).
한편, GOT의 측정은 (2)의 반응에서 생성된 옥살로아세테이트가 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH)의 반응으로 말레이트(malate)로 전환되는 것을 이용한다(반응식 (4)).
이 반응에서도 역시 조효소인 NADH가 NAD+로 전환되기 때문에 NADH의 흡광도 변화를 측정하는 같은 원리를 이용하고 있다.
위와 같은 반응기작을 이용하여 GPT와 GOT를 측정하기 위한 바이오센서가 몇가지 보고된바 있다.
한가지 방법은 파이루베이트 산화효소(pyruvate oxidase)라는 효소의 반응을 이용한 예이다.
GPT를 측정할 때는 반응 (1에서 생성된 파이루베이트를 파이루베이트 산화효소 반응시 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 또는 소모되는 용존산소의 양을 전기화학적으로 측정하는 방법(Anal. Chim.AScta., 159:81­86, 1984)과, GOT 반응 (2)에서 생성된 옥살로아세테이트를 옥살아세테이트 탈탄산효소(oxalacetate decarboxylase) 반응 및 파이루베이트 산화효소를 연속적으로 이용한 분석시스템이 보고된 바 있다(Anal. Chem., 56:1876­1880, 1984).
다른 한 예는 글루타메이트 산화효소(Glutamate oxidase) 또는 글루타메이트 탈수소효소(Glutamate Dehydrogenae) 반응을 이용하여 GPT나 GOT의 효소반응(1)과 (2)에서 공통으로 생성되는 글루타메이트를 측정하는 경우이다.
글루타메이트 산화효소를 이용하는 경우는 아래의 식(5)과 같이 생성되는 과산화수소의 전극산화 반응을 전기화학적으로 측정함으로써 GPT나 GOT를 정량할 수 있다(Anal. Chim. Acta, 24:557­62, 1991.)
반면, 글루타메이트 탈수소효소 반응을 이용하는 경우는 아래의 식(6)과 같이 생성되는 조효소인 NAD(P)H의 전극산화 반응으로부터 GPT나 GOT를 정량할 수 있다.
이미 기술한 바와 같이 기존의 상용화된 진단킷트의 경우 대부분 락테이트 탈수소효소와 말레이트 탈수소효소의 반응결과 소모되는 NADH의 흡광도 변화를 측정하는 시스템이다.
따라서 이들 방법은 GPT 및 GOT 측정시 두가지 효소반응 시스템을 각각 적용해야 하며 동시측정은 불가능하다.
또한 센서형태로 소형화 하기가 어려운 문제점이 있었다.
이미 보고된 바와 같은 GPT 또는 GOT 활성측정을 바이오센서 시스템 중에서 파이루베이트 산화효소 또는 글루타메이트 산화효소의 반응을 이용하는 경우에는 식 (5)와 같이 반응산물인 과산화수소(H2O2)의 양을 측정하기 위해 프라티늄(platinum)전극을 트랜스듀서로 활용하여 개발되었다.
이 경우 센서의 소형화 및 대량생산에 어려움이 있고, 고정화된 효소의 활성 뿐만아니라, 시료인 혈액중에 존재하는 다른 전극활성물질에 의한 간섭물질(interferences)에 의한 영향도 크기 때문에 정확한 정량이 어려웠다.
또한, 글루타메이트 산화효소의 경우는 정제된 효소의 가격이 매우 비싸고, 효소의 특이활성이 낮아 감도 및 정확성에 있어서 한계에 있어 실용화하기 어려운 단점이 있었다.
반면, 글루타메이트 탈수소효소 반응을 이용하는 경우, 식(6)의 반응에서 NAD(P)H가 생성되는 쪽으로는 효소반응이 열역학적으로 일어나기 어렵기 때문에 전극상에는 NAD(P)H의 산화로 인해 NAD(P)H가 소모된다 해도 그 반응은 효소의 활성을 충분히 이용하기 어려운 단점이 있다.
따라서, 본 발명에서는 두가지 이상의 효소반응 시스템이 필요하며 소형화하기 불리한 기존의 상용화된 GPT 및 GOT의 측정방법을 개선하과 동시에 광섬유와 글루타메이트 탈수소효소 한가지만을 사용하여 간기능의 정상유무 판단 및 초기간염의 정확한 진단을 하는데 그 지표가 될 수 있는 GPT 및 GOT 활성을 정확하게 측정하기 위한 광바이오센서 제조기술 및 분석수단을 제공하는데 그 목적이 있다.
즉, 본 발명의 핵심은 반응식 (1)과 (2)에서의 반응이 평형 반응이라는 점에 착안, 기존에 보고된 GPT와 GOT 측정용 바이오센서의 측정방법과는 달리, 평형반응에 참여하는 알파케토글루타레이트를 글루타메이트 탈수소효소의 기질로 이용함으로써 글루타메이트 탈수소효소의 활성을 최대한 이용했다는 점이라 할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 광섬유를 트랜스듀서로 사용함으로써 전기장이나 자기장에 대한 간섭을 최소한으로 줄일수 있고, 극히 미세한 양을 손쉽게 측정할 수 있을 뿐만 아니라 소형화 및 대량생산이 유리한 장점을 기대할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 광 바이오센서 및 그 측정장치는 전체 시스템을 제어하고 하기의 광섬유 바이오센서 신호처리부에 의한 분석신호를 각각의 GPT, GOT 효소활성값으로 표시하는 마이크로 프로세서 조절부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 GPT, GOT 각각의 제1 효소반응에 의한 공통반응 산물을 생성하는 FIA부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 상기 FIA부에 의한 공통반응 산물을 제2 효소반응을 이용해 각각의 GPT, GOT 농도에 비례하는 분석신호를 산출하는 광섬유 바이오센서 신호처리부를 포함하여 구성됨을 특징으로 한다.
이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 광 바이오센서 및 그 측정장치를 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 GPT, GOT 효소반응(1) 및 (2)가 평형반응이라는 점에 착안하여 GPT나 GOT를 측정하는 일반적인 방법, 즉 글루타메이트나 파이루베이트, 또는 글루타메이트나 옥살로아세테이트를 측정했던 것과는 반대로 두 평형반응에 공히 관계하는 α-케토글루타레이트의 양을 측정하므로서 GPT와 GOT를 측정할 수 있는 방법을 고안하였다.
즉, GPT와 GOT 두 효소반응이 공통 산물인 α-케토글루타레이트를 기질로 하는 글루타메이트 탈수소효소(Glutamate dehydrogenase) 반응을 이용하였다.
제1, 2도와 같이 시료중에 함유된 GPT와 GOT의 반응결과 생성된 알파케토글루타레이트는 글루타메이트 탈수소효소 반응에 의해 글루타메이트를 생성시키과 동시에 조효소인 NAD(P)H가 NAD(P)+로 산화된다.
조효소인 NAD(P)H는 형광물질로서 360nm의 빛을 줄 경우 450nm에서 형광을 발하게 된다.
따라서, 광섬유를 이용하여 NAD(P)H로 인한 형광도(Fluorescence Intensity)의 감소 정도를 측정할 수 있는데 이는 시료용액내 존재하는 GPT 및 GOT의 양에 비례하게 된다.
제3도는 본 발명의 광 바이오센서를 나타낸 도면이다.
즉, 제3도에서와 같이, 파이펫팁(Pipet Tip)을 직경이 6mm가 되도록 자른 후, 한쪽면에 에폭시 수지를 사용하여 유리판(2)을 붙인다.
이러한 유리면(2)의 한쪽은 효소고정화층(3)을 만드는 지지대로 이용한다.
즉, 효소 고정화층(3)은 다음과 같은 고정화방법을 사용하여 제조할 수 있다.
글루타메이트 탈수소효소(Glutamate Dehydrogenase, EC 1, 4, 1, 3.) 10mg(약 200U)과 ADP(Adenosine Diphosphate) 100mg을 Tris-HCl 완충용액(ph8) 20μL 및 BSA(Bovine Serum lbumin) 10%용액 20μL과 섞어준 후, 여기에 PUV(Poly Vinyl Alcohol) 3% 용액 10μL를 섞는다.
이러한 용액을 앞서 언급한 Pipet Tip의 안쪽 유리면에 잘펴주고 1% 글루타알데히드(Glutaraldehyde) 용액 1μL을 사용하여 냉장고에서 1시간 동안 가교화(crosslinking) 시킴으로써 효소의 고정화층(3)을 완성한다.
그다음, 효소고정화층이 형성된 유리면(2) 반대쪽면에 광섬유(4)를 장착시키면 광섬유 바이오센서가 완성된다.
한편, 효소가 고정화된 감지부(1)는 필요시 새것으로 교체할 수 있게 된다.
한편, 제4도는 본 발명에 따른 광 바이오센서 측정자치를 나타낸 구성블럭도이다.
본 발명에 따른 광 바이오센서 측정장치는 제4도에서와 같이, FIA(Flow Injection Analysis)부(10), 광섬유 바이오센서 신호처리부(20) 그리고 마이크로 프로세서 조절부(20)로 구성된다.
상기와 같이 구성된 본 발명에 따른 광 바이오센서 측정장치의 동작설명은 다음과 같다.
먼저, GPT 활성측정시에는 FIA부(10)내 장착되어 있는 마이크로펌프(11)의 동작에 의해 GPT 및 GOT 효소반응시 공통으로 작용하는 기질인 글루타메이트 및 조효소 NAD(P)H가 들어 있는 완충용액(12)이 시료투입부(17)를 통과하여 일정 온도가 유지되는 시료혼합부(19)로 흘러들어가게 된다.
단, GPT와 GOT에 공통으로 반응하는 기질(substrate)인 글루타메이트의 경우 제1, 2도에서와 같이 글루타메이트의 양은 과량으로 하여 GPT 및 GOT 효소반응이 기질된 글루타메이트의 양에의해서 영향을 받지 않도록 하였다.
본 발명에서는 500mM 글루타메이트 용액을 사용하였다.
이와 동시에 암모늄아세테이트 용액(13)도 시료혼합부(19)내로 흘러들어가게 된다.
한편, GPT 효소반응을 위한 또다른 기질인 10mM 파이루베이트 용액(14)은 펌프(11) 및 3-방변 밸브(16)를 통해 시료혼합부(19)로 흘러들어가게 되면서 시료혼합부(19) 내에서는 투입된 시료(18)와 함께 시료중에 함유되어 있는 GPT에 의한 효소반응이 일어나게 된다.
따라서 제1도에서와 같이, 시료혼합부에서 생성된 α-케토글루타레이트는 일정온도로 조절되는 광섬유푸로브가 장착된 측정셀(measurement cell)(21)로 흘러들어가게 되고, 광섬유프로브상에 고정화 되어 있는 글루타메이트 탈수소효소 반응이 일어나게 된다.
이때 광섬유와 연결된 360nm의 파장으로 조절된 광원(22)과 450nm의 형광도를 측정할 수 있는 광측정기(23)에 의해 결국 GPT 농도에 비례하는 분석신호를 얻을 수 있다.
측정셀(21)을 통과한 반응산물은 빈용기로 버려지게 된다(24).
다음, GOT 활성측정시에는 파이루베이트 용액(14) 대신 GOT 효소반응용 옥살로아세테이트 용액(15)이 펌프(11) 및 3-방변 밸브(16)을 통해 시료혼합부(19)로 흘러들어가게 되는 것을 제외하고는 GPT 측정의 경우와 같다.
즉, FIA부(10)내 장착되어 있는 마이크로 펌프(11)의 동작에 의해 GPT 및 GOT 효소 반응시 공통으로 작용하는 기질인 글루타메이트 및 조효소 NAD(P)H가 들어 있는 완충용액(12)이 시료투입부(17)를 통과하여 일정온도가 유지되는 시료혼합부(19)로 흘러들어가게 된다.
이와 동시에 암모늄 아세테이트 용액(13)도 시료혼합부(19)내로 흘러들어가게 된다.
한편, GOT 효소반응을 위한 또다른 기질인 10mM 옥살로아세테이트 용액(15)은 펌프(11) 및 3-방변 밸브(16)를 통해 역시 시료혼합부(19)로 흘러들어가게 되면서 시료 혼합부(19) 내에서는 투입된 시료(18)와 함께 시료중에 함유되어 있는 GOT에 의한 효소반응이 일어나게 된다.
따라서 제2도에서와 같이 시료혼합부에서 생성된 α-케토글루타레이트는 일정온도로 조절되는 광섬유푸로브가 장착된 측정셀(Measurement cell)(21)로 흘러들어가게 되고, 광섬유프로브상에 고정화 되어 있는 글루타메이트 탈수소효소 반응이 일어나게 된다.
이때 광섬유와 연결된 360nm의 파장으로 조절된 광원(22)과 450nm의 형광도를 측정할 수 있는 광측정기(23)에 의해 결국 GOT 농도에 비례하는 분석신호를 얻을 수 있다.
이와 같이 검출된 GPT, GOT 활성에 비례하는 분석신호는 마이크로프로세서 조절부(30)에 각각의 효소활성값으로 표시된다.
시료투입을 포함한 모든 FIA 기능동작은 역시 내장된 마이크로프로세서(30)의 의해 조절될 수 있다.
이상 상술한 바와 같이 본 발명의 광 바이오센서 및 그 측정장치는 흐름계 분석법(FIA)에 의해 단위시간당 분석가능한 시료의 수를 월등히 증가시킬 수 있으며, GPT, GOT의 두 효소반응시 공통으로 생성되는 α-케토글루타레이트(α-Ketoglutrate)를 기질로 하는 글루타메이트 탈수소효소 반응을 이용하여 GPT, GOT 활성을 정확히 측정할 수 있다.
이와 같은 본 발명에 의한 분석기술은 향후, 마이크로머시닝 기술과 미세가공 기술을 접목시킴으로써 광섬유 바이오센서 및 FIA 시스템의 소형화 및 양산화에 기여할 수 있다.

Claims (5)

  1. 전체 시스템을 제어하고 하기의 광섬유 바이오센서 신호처리부에 의한 분석신호를 각각의 GPT, GOT 효소활성값으로 표시하는 마이크로 프로세서 조절부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 GPT, GOT 각각의 제1 효소반응에 의한 공통반응 산물(Product)을 생성하는 FIA부와, 상기 마이크로 프로세서 조절부의 제어신호에 따라 상기 FIA부에 의한 공통반응 산물을 제2 효소반응을 이용해 각각의 GPT, GOT 농도에 비례하는 분석신호를 산출하는 광섬유 바이오센서 신호처리부를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 광섬유 바이오센서 측정장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 공통반응 산물은 α-케토글루타레이트임을 특징으로 하는광섬유 바이오센서 측정장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 효소반응은 글루타메이트 탈수소효소 반응임을 특징으로 하는 광섬유 바이오센서 측정장치.
  4. 광신호의 전송수단인 광섬유와, GPT, GOT 각각의 제1 효소반응에 따른 공통반응 산물을 제2 효소반응을 이용해 글루타메이트를 생성하는 효소고정화층과, 상기 효소고정화층의 α-케토글루타레이트에 비례하는 광신호를 반사시키는 유리판을 상기 광섬유와 효소고정화층 사이에 형성함을 특징으로 하는 광섬유 바이오 센서.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효소고정화층은 글루타메이트 탈수소효소 반응을 이용함을 특징으로 하는 광섬유 바이오센서.
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