JPS5961772A - 液体クロマトグラフ酵素電極検出器 - Google Patents
液体クロマトグラフ酵素電極検出器Info
- Publication number
- JPS5961772A JPS5961772A JP15010483A JP15010483A JPS5961772A JP S5961772 A JPS5961772 A JP S5961772A JP 15010483 A JP15010483 A JP 15010483A JP 15010483 A JP15010483 A JP 15010483A JP S5961772 A JPS5961772 A JP S5961772A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- effluent
- electrode
- cell
- column
- Prior art date
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- Pending
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
- A61B5/1486—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using enzyme electrodes, e.g. with immobilised oxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/64—Electrical detectors
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体中の溶質の検出に関するものであり、更に
詳細には流体クロマトグラフカラム流出物中の諸成分を
検出するための装置及び方法に関する。
詳細には流体クロマトグラフカラム流出物中の諸成分を
検出するための装置及び方法に関する。
本明細書にて使用される「液体クロマトグラフィー」な
る用語は、薄層クロマトグラフィー、壁に定常相が付着
した管状ンリンダーを用いて行なわれる分離及び類似方
法を含む液体試料の成分分離を達成する全ての手段を包
含するものど解さるべきものである。
る用語は、薄層クロマトグラフィー、壁に定常相が付着
した管状ンリンダーを用いて行なわれる分離及び類似方
法を含む液体試料の成分分離を達成する全ての手段を包
含するものど解さるべきものである。
液体クロマトグラフカラム用検出器として良好なるため
には、高感度、小容積、広範囲の応答及び直線範囲が犬
でなければならぬことは周知である。更に検出器は、実
験パラメーターすなわち流速及び温度等の量にほとんど
影響を受けぬものでなければならない。更に検出器は、
長期にわたる安定性と信頼性を有するものでなければな
らない。
には、高感度、小容積、広範囲の応答及び直線範囲が犬
でなければならぬことは周知である。更に検出器は、実
験パラメーターすなわち流速及び温度等の量にほとんど
影響を受けぬものでなければならない。更に検出器は、
長期にわたる安定性と信頼性を有するものでなければな
らない。
斯かる検出器は、現在商業的に多数入手可能であり、文
献にも記載されている。これらの検出器は、例えば屈折
率等カラム流出物の内部性質に応答するものであるが、
或いは分析対象物内の特定の性質、例えば螢光又は電気
化学的性質に応答する選択的検出器である。例えば、ジ
ェー、ジェー、カークランド（Ｊ、 Ｊ、 Ｋｉｒｋｌ
ａｎｄ）編のＭｏｄ、ｅｒｎ Ｐｒａ−ｃ ｔｉ ｃｅ
ｓ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ、ｒｏｍｎｔｏｇｒａｐ
ｈ、ｙ （１９７１）第９５−１２２頁を参照されたい
。
献にも記載されている。これらの検出器は、例えば屈折
率等カラム流出物の内部性質に応答するものであるが、
或いは分析対象物内の特定の性質、例えば螢光又は電気
化学的性質に応答する選択的検出器である。例えば、ジ
ェー、ジェー、カークランド（Ｊ、 Ｊ、 Ｋｉｒｋｌ
ａｎｄ）編のＭｏｄ、ｅｒｎ Ｐｒａ−ｃ ｔｉ ｃｅ
ｓ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ、ｒｏｍｎｔｏｇｒａｐ
ｈ、ｙ （１９７１）第９５−１２２頁を参照されたい
。
検出システムの構成要素として固定化酵素を使用するこ
とも、文献に記載されるところである。
とも、文献に記載されるところである。
例えば、ジェー、スチュヮート（Ｊ、Ｓｔｅｗａｒｔ）
の「高性能液体クロマトグラフィー（ＩｉＰＬＣ＞に於
けるカラム後誘導（Ｄｅｒｉｖａｔ １ｚａｔ １ｏｎ
）の方法論」、１’ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ、
ｃｈｅｍ、 １７０ 、 １７１（１９８２）を参照さ
れたい。代表的方法では、酵素をカラスビーズ床反応器
又は管状反応器に固定化し、それにクロマトグラフカラ
ム流出物をポンプで通過させる。反応器を通過後、酵素
反応生成物は前記のような検出器で検出される。多くの
場合、この方、去は、従来の非特異性検出器に比較して
、感度及び／又は選択性を高めることができる。
の「高性能液体クロマトグラフィー（ＩｉＰＬＣ＞に於
けるカラム後誘導（Ｄｅｒｉｖａｔ １ｚａｔ １ｏｎ
）の方法論」、１’ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ、
ｃｈｅｍ、 １７０ 、 １７１（１９８２）を参照さ
れたい。代表的方法では、酵素をカラスビーズ床反応器
又は管状反応器に固定化し、それにクロマトグラフカラ
ム流出物をポンプで通過させる。反応器を通過後、酵素
反応生成物は前記のような検出器で検出される。多くの
場合、この方、去は、従来の非特異性検出器に比較して
、感度及び／又は選択性を高めることができる。
最高感度を得るためには、浴出基質が酵素反応により生
成物に完全転化する必要がある。更には、酵素反応に再
現性があるならば、検出器の信頼性に関しては完全転化
の必要はないが、検出器システムの応答特性が酵素反応
の動力学に影響されぬためには、完全転化が必要である
。従って、不完全転化であると、直線応答範囲並びに流
速及び温度からの応答特性の独立性を双方とも損なうお
それがある。従って、基質が生成物に完全に転化するよ
うに酵素反応器内の滞留時間は十分にとられる。
成物に完全転化する必要がある。更には、酵素反応に再
現性があるならば、検出器の信頼性に関しては完全転化
の必要はないが、検出器システムの応答特性が酵素反応
の動力学に影響されぬためには、完全転化が必要である
。従って、不完全転化であると、直線応答範囲並びに流
速及び温度からの応答特性の独立性を双方とも損なうお
それがある。従って、基質が生成物に完全に転化するよ
うに酵素反応器内の滞留時間は十分にとられる。
完全転化及びそれに伴な５ａ留時間の増大は、空隙容積
が大きいためのバンドの広幅化並びに分析時間の延長を
含むその他の不利点を招くことがしばしばある。その上
、分離された試木Ｆ成分を更に分析するための回収が不
可能となる。検出せんとして、酵素反応生成物に転化し
たからである。
が大きいためのバンドの広幅化並びに分析時間の延長を
含むその他の不利点を招くことがしばしばある。その上
、分離された試木Ｆ成分を更に分析するための回収が不
可能となる。検出せんとして、酵素反応生成物に転化し
たからである。
酵素反応生成物は、酵素反応の禁止剤であってもいけな
い。更には、酵素反応の進行に移動相の溶解成分が必要
な場合には（Ｑ２共同因子又は緩衝能）完全転化させん
とすると基質が高濃度だとこれらの成分を消耗し、従っ
て直線応答範囲な制限することになろう。また、滞留時
間が比較的長いため、酵素反応生成物が検出を許容する
程度に寸分安定で変化しないことが重要である。
い。更には、酵素反応の進行に移動相の溶解成分が必要
な場合には（Ｑ２共同因子又は緩衝能）完全転化させん
とすると基質が高濃度だとこれらの成分を消耗し、従っ
て直線応答範囲な制限することになろう。また、滞留時
間が比較的長いため、酵素反応生成物が検出を許容する
程度に寸分安定で変化しないことが重要である。
結局、固定化酵素反応器は、酵素を高装荷ぜねばならぬ
ため、一般に高値用となる。斯かる反応器では、酵素が
反応器から洗い出されたり、反応器が閉塞されたりする
ので、長期の安定性を欠く欠点がある。前者の場合、反
応器の使用時間の長期化につれて、完全転化のための滞
留時間をだんだん長くする必要があろう。
ため、一般に高値用となる。斯かる反応器では、酵素が
反応器から洗い出されたり、反応器が閉塞されたりする
ので、長期の安定性を欠く欠点がある。前者の場合、反
応器の使用時間の長期化につれて、完全転化のための滞
留時間をだんだん長くする必要があろう。
従って、効率的検出にＭ要な性質を犠牲にせず、感度及
び選択性の増大の利益を実現可能とするように、固定化
酵素技術をクロマトグラフの検出に糾込むだめの更に適
切な手段が必要である。
び選択性の増大の利益を実現可能とするように、固定化
酵素技術をクロマトグラフの検出に糾込むだめの更に適
切な手段が必要である。
本発明は、クロマトグラフカラムを通過する液体中の溶
質を検出する方法を提供するものである。
質を検出する方法を提供するものである。
続いてカラム流出物を酵素電極に露出する。電極の出力
は、適当な記録及び／又は表示手段に供給される。
は、適当な記録及び／又は表示手段に供給される。
固定化酵素電極は周知であるが、これがクロマトグラフ
の検出に使用可能だとは今日まで認識されていなかった
。大部分の酵素電極は、基質が酵素に接近するのを制限
するようにつくられている。
の検出に使用可能だとは今日まで認識されていなかった
。大部分の酵素電極は、基質が酵素に接近するのを制限
するようにつくられている。
従って通常分析では一般に約１−程度の少量の基質しか
生成物に転化しない。従って、代表的、クロマトグラフ
条件下で、これらの電極を検出器として用いた際に期待
される感度は、基質を完全に生成物に転化する固定化反
応器システム又はその他の検出方法のいずれと比較して
も低い値となるであろう。予期に反し実際は、多数の場
合に於て、酵素電極検出は従来の検出方法よりもはるか
に高感度なのである。
生成物に転化しない。従って、代表的、クロマトグラフ
条件下で、これらの電極を検出器として用いた際に期待
される感度は、基質を完全に生成物に転化する固定化反
応器システム又はその他の検出方法のいずれと比較して
も低い値となるであろう。予期に反し実際は、多数の場
合に於て、酵素電極検出は従来の検出方法よりもはるか
に高感度なのである。
更には、酵素電極の開発並ひに使用に際し、一般に複雑
な試料の特異分析を可ｌ止とするような選択性が強調さ
れてきたことに注目すべきである。
な試料の特異分析を可ｌ止とするような選択性が強調さ
れてきたことに注目すべきである。
他力、クロマトグラフ検出器の発展について、多数の溶
質化合物の検出を特徴とする特異性が強調されるように
なった。クロマトグラフィーで試料成分が完全に分離さ
れ得るならば、非特異性検出器は常に好適であろう。こ
れは理想であって現実的ではない。特に現実の試料を考
慮すると、試料成分の共溶用が頻繁だからである。従っ
て、酵素電極検出の特異性は、場合によっては共溶用成
分の識別を可能とする。更に基線の安定性は、酵素電極
の場合は選択性が強いために一般により大となる。
質化合物の検出を特徴とする特異性が強調されるように
なった。クロマトグラフィーで試料成分が完全に分離さ
れ得るならば、非特異性検出器は常に好適であろう。こ
れは理想であって現実的ではない。特に現実の試料を考
慮すると、試料成分の共溶用が頻繁だからである。従っ
て、酵素電極検出の特異性は、場合によっては共溶用成
分の識別を可能とする。更に基線の安定性は、酵素電極
の場合は選択性が強いために一般により大となる。
従って、本発明の目的は、液体クロマトグラフカラムを
酵素電極と組合せて使用する液体中の溶質を検出するだ
めの方法及び装置を提供すること；既知の方法及び装置
よりも高感度となるような方法及び装置を提供すること
；既知の方法及び装置よりも酵素反応動力学からの独立
性が大であって、一層直線性に富み且つ温度並びに流速
等の実験パラメーターに対する感度が低い装置及び方法
を提供すること、移動相中の酵素その他可溶成分の消耗
に制限されない方法及び装置を提供すること；及び酵素
の量が比較的少量且つ酵素が洗去され難く、そのため既
知の方法及び装置よりも試験当りの費用がはるかに小と
なるような方法及び装置を提供することである。
酵素電極と組合せて使用する液体中の溶質を検出するだ
めの方法及び装置を提供すること；既知の方法及び装置
よりも高感度となるような方法及び装置を提供すること
；既知の方法及び装置よりも酵素反応動力学からの独立
性が大であって、一層直線性に富み且つ温度並びに流速
等の実験パラメーターに対する感度が低い装置及び方法
を提供すること、移動相中の酵素その他可溶成分の消耗
に制限されない方法及び装置を提供すること；及び酵素
の量が比較的少量且つ酵素が洗去され難く、そのため既
知の方法及び装置よりも試験当りの費用がはるかに小と
なるような方法及び装置を提供することである。
本発明のその他の目的及び利点は、以下の説明、付属図
面及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
面及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
第１図は、液体中の溶質を検出するための本発明装置を
示す概要図である。
示す概要図である。
第２図は、酵素電極セルの断面図である。
第３図は、第２図の線３−３に沿った断面図である。
第４図は、第８図の線４−４に沿った断面図である。
第５ａ図は、酵素電極セルを用いて得られたクロマトグ
ラムである。
ラムである。
第５ｂ図は、ＬＤＣ屈折計を用いて得られたクロマトグ
ラムである。
ラムである。
第６ａ及び６ｂ図は、夫々第５ ａ、及び５ｂ図と同一
であって、ただ記録手段の感度を１０倍に高めたもので
ある。
であって、ただ記録手段の感度を１０倍に高めたもので
ある。
第１図を参照すると、液体中の溶質を検出するための装
置１０は、液体クロマトグラフカラム１２を含む。カラ
ムは、適当な市販のクロマトグラフカラムのいずれでも
よく、例えばＩｉ Ｉ） Ｘ −８７Ｃバイオ−ラドＣ
ＢＩＯ−ＲＡＤ）カラムである。
置１０は、液体クロマトグラフカラム１２を含む。カラ
ムは、適当な市販のクロマトグラフカラムのいずれでも
よく、例えばＩｉ Ｉ） Ｘ −８７Ｃバイオ−ラドＣ
ＢＩＯ−ＲＡＤ）カラムである。
移動相は、ポンプ１４にて、注入弁１６を介して供給さ
れる。分析対象試料は、注入弁１６によりカラム１２に
入るように移動相中に導入される。
れる。分析対象試料は、注入弁１６によりカラム１２に
入るように移動相中に導入される。
カラム流出物がカラム１２を出る際、ポンプ１８その他
の適当な手段にて供給される緩衝剤を添加する。次に流
出物を酵素電極セル２ｏに通し、そこから装置１０の外
へ導く。酵素電極セル２゜からの出力信号は、適当な信
号調節器２１を介してグラフ記録計２２又はその他のデ
ータ表示装置に提供される。
の適当な手段にて供給される緩衝剤を添加する。次に流
出物を酵素電極セル２ｏに通し、そこから装置１０の外
へ導く。酵素電極セル２゜からの出力信号は、適当な信
号調節器２１を介してグラフ記録計２２又はその他のデ
ータ表示装置に提供される。
本明細書で用いる「酵素電極」なる用語は、該電極に何
等かの方法で緊密に連結されている固定化酵素を備え、
カラム流出物と接触するように配置された少くとも２本
の個々の電極を包含する。
等かの方法で緊密に連結されている固定化酵素を備え、
カラム流出物と接触するように配置された少くとも２本
の個々の電極を包含する。
酵素電極セル２０は、本質的にはポーラログラフセルで
あり、その好適例を第２図に詳細に示すが、該セルはセ
ル収納板２４と挿入可能な円筒状プローブ（７ｙｒｏｂ
ｅ）を有する。収納板２４は透明ルサイト（Ｌｕｃｉｔ
ｅ）製が好ましく、底部２９を持った内部空洞部２８を
有する。読破２４ば、更に入口３０と出口３２を備えて
おり、これらは底部２９を経由して空洞部２８に通じて
いる。口３０及び３２は、セル２０を第１図に示した流
体供給ラインと連結するため、３（−２８取付具に合う
ようになされている。
あり、その好適例を第２図に詳細に示すが、該セルはセ
ル収納板２４と挿入可能な円筒状プローブ（７ｙｒｏｂ
ｅ）を有する。収納板２４は透明ルサイト（Ｌｕｃｉｔ
ｅ）製が好ましく、底部２９を持った内部空洞部２８を
有する。読破２４ば、更に入口３０と出口３２を備えて
おり、これらは底部２９を経由して空洞部２８に通じて
いる。口３０及び３２は、セル２０を第１図に示した流
体供給ラインと連結するため、３（−２８取付具に合う
ようになされている。
プローブ２６は、セル収納板の空洞部２８内に挿入可能
であり、好ましくはエポキシ製の内実な本体３４を有し
、電気ケーブル８６がそれに接続している。ケーブル３
６はキャップ３７を通る。
であり、好ましくはエポキシ製の内実な本体３４を有し
、電気ケーブル８６がそれに接続している。ケーブル３
６はキャップ３７を通る。
キャップ３７は、セル収納板２４の空洞部２８内に配置
されたインサート３９とかみ合う一対のアーム３８を備
えている。インサート３９は一対のタブ４０を有し、タ
ブ４０はキャップ上のアーム３８と共に、プローブ２６
を収納板２４内部の場所に固定するための差込取付具を
形成する。スプリリング４１は、ケーブル８６の周囲に
配置され、一端は）−ロープ本体に隣接し、他端はキャ
ップ３７に隣接し、セル収納被２４内に固定された際に
プローブ本体を空洞部２８の底部２９に押し付ける。
されたインサート３９とかみ合う一対のアーム３８を備
えている。インサート３９は一対のタブ４０を有し、タ
ブ４０はキャップ上のアーム３８と共に、プローブ２６
を収納板２４内部の場所に固定するための差込取付具を
形成する。スプリリング４１は、ケーブル８６の周囲に
配置され、一端は）−ロープ本体に隣接し、他端はキャ
ップ３７に隣接し、セル収納被２４内に固定された際に
プローブ本体を空洞部２８の底部２９に押し付ける。
さて次に第３図を参照すると、プローブ本体３４の隣接
す゛る面及び域は複数の電極を有し、電極は位置ぎめさ
れたあとその周囲に本体３４を注型することにより、そ
の位置に保持される。電極は本体表面を少なくとも少し
は越えるまで本体３４内を伸長し、中心軸に白金電極を
含有する。
す゛る面及び域は複数の電極を有し、電極は位置ぎめさ
れたあとその周囲に本体３４を注型することにより、そ
の位置に保持される。電極は本体表面を少なくとも少し
は越えるまで本体３４内を伸長し、中心軸に白金電極を
含有する。
一対の半円形のＡ ｇ ／ Ａｙ ＣＩＪ電極４４及び
４６は電極４２の周りに配置され、電極間の空間はエポ
キン材料で満たされている。各電極には適当なリード線
（図示していない）が付属しており、プローブ本体３４
を経てケーブル３６に向って伸びている。白金電極４２
は、Ａｙ／ＡｇＣ１！電極４４又は４６の一方に対して
＋０．７ボルトに分極されており、第２ ノＡｙ／Ａｆ
ｅ 電極４４ 又ハ４６ ハ補助！極として使用される
。
４６は電極４２の周りに配置され、電極間の空間はエポ
キン材料で満たされている。各電極には適当なリード線
（図示していない）が付属しており、プローブ本体３４
を経てケーブル３６に向って伸びている。白金電極４２
は、Ａｙ／ＡｇＣ１！電極４４又は４６の一方に対して
＋０．７ボルトに分極されており、第２ ノＡｙ／Ａｆ
ｅ 電極４４ 又ハ４６ ハ補助！極として使用される
。
第４図に示されるように、プローブ本体３４の先端には
環状フランジ５０がある。Ｏ−リングを載せた酵素膜５
２は、膜５２が電極４２．４４及び４６の露出表面を被
うように、７ランジ５０の形成する開口部に挿入可能で
ある。ゴムのＯ−Ｉ）ング５４は膜５２上にあってそれ
を支えているが、その断面直径は、プローブ本体３４上
に配置される際にＯ−リング５４がフラン７５ｏの端部
を僅かに越えて伸びるように選択される。従って、０−
リング５４をセル収納板の空洞部２８に挿入すると、Ｑ
−ＩＪング５４は空洞部底部に僅かに圧縮され、それに
より口８０及び３２に通ずる開口部の周囲を密封する。
環状フランジ５０がある。Ｏ−リングを載せた酵素膜５
２は、膜５２が電極４２．４４及び４６の露出表面を被
うように、７ランジ５０の形成する開口部に挿入可能で
ある。ゴムのＯ−Ｉ）ング５４は膜５２上にあってそれ
を支えているが、その断面直径は、プローブ本体３４上
に配置される際にＯ−リング５４がフラン７５ｏの端部
を僅かに越えて伸びるように選択される。従って、０−
リング５４をセル収納板の空洞部２８に挿入すると、Ｑ
−ＩＪング５４は空洞部底部に僅かに圧縮され、それに
より口８０及び３２に通ずる開口部の周囲を密封する。
従って、ｏ−リング５４の内径及び厚みは、酵素電極セ
ル２ｏの試験容積を決定する。該試験容積は、５−５０
マイクロリットル程度が好ましい。
ル２ｏの試験容積を決定する。該試験容積は、５−５０
マイクロリットル程度が好ましい。
酵素電極セル２０の操作時に、移動相反び溶解された基
質は口３０を経てセル２ｏに入り、口３０から出る。移
動相及び溶解された基質は、セル２０の内部で酵素膜５
２に接触する。酵素膜５２は、少くとも固定化オキノダ
ーゼ酵素を含有する多層の半透膜であり、これに関して
は米国・特許第８，９７９，２７４号（二：Ｌ −−７
７（＃ｅｕｙｍａ ｎ ）、１９７６年９月７日発行）
に詳細に記載されており、これを参考文献として引用す
る。
質は口３０を経てセル２ｏに入り、口３０から出る。移
動相及び溶解された基質は、セル２０の内部で酵素膜５
２に接触する。酵素膜５２は、少くとも固定化オキノダ
ーゼ酵素を含有する多層の半透膜であり、これに関して
は米国・特許第８，９７９，２７４号（二：Ｌ −−７
７（＃ｅｕｙｍａ ｎ ）、１９７６年９月７日発行）
に詳細に記載されており、これを参考文献として引用す
る。
第４図を参照すると、膜５２の層５６は電（愼４２．４
４及び４６の活性相に隣接しており、ｌＩ２０２ 等の
小分子のみを透過する実質的に均質な７リコーン、メチ
ルメタクリレート又は酢酸セルロース材料製の膜である
。層５８は分析試料と接触する外層である。好適実施態
様での層５８は厚さ５ミク０７．０．７ ／ｃ９／ ｔ
ｙｎ２（１０ｐｓｉ ）での窒素流速２５ｍ１１分／ｃ
ｙｎ ２．６Ｘ１０８孔／ｃｍ２（１’）０．０３ミク
ロン径を孔を有するポリカーボネートフィルムである。
４及び４６の活性相に隣接しており、ｌＩ２０２ 等の
小分子のみを透過する実質的に均質な７リコーン、メチ
ルメタクリレート又は酢酸セルロース材料製の膜である
。層５８は分析試料と接触する外層である。好適実施態
様での層５８は厚さ５ミク０７．０．７ ／ｃ９／ ｔ
ｙｎ２（１０ｐｓｉ ）での窒素流速２５ｍ１１分／ｃ
ｙｎ ２．６Ｘ１０８孔／ｃｍ２（１’）０．０３ミク
ロン径を孔を有するポリカーボネートフィルムである。
代表的な厚みは、層５８が５ミクロン、層５６が１ミク
ロン、層６０が１ミクロンで、全体として７ミクロンで
ある。層６０は、層５６と５８を結合する接着剤−酵素
材料である。
ロン、層６０が１ミクロンで、全体として７ミクロンで
ある。層６０は、層５６と５８を結合する接着剤−酵素
材料である。
分離された基質は、セル２０を通過する際、酵素膜５２
０層５８を通して拡散し、酵素層６０に入って、そこで
１以上の酵素の存在下に０２と反応してＨ２Ｏ２を生成
し、それが白金電極４２に向って拡散してそこでＨ２Ｏ
２が０２とＨ２Ｏになる酸化が起る。酵素電極にＨ２Ｏ
２検出を使用することは周知である。例えば米国特許第
８，５８９，４５５号（クラーク（Ｃ１ａｒｋ）、１９
７０年１１月１０日発行）を参照されたい。電極４２と
４４又は４６の間で得られるビーク又は積分電流は、基
質濃度に比例する。次に電流に比例する電圧を記録計２
２に供給する。
０層５８を通して拡散し、酵素層６０に入って、そこで
１以上の酵素の存在下に０２と反応してＨ２Ｏ２を生成
し、それが白金電極４２に向って拡散してそこでＨ２Ｏ
２が０２とＨ２Ｏになる酸化が起る。酵素電極にＨ２Ｏ
２検出を使用することは周知である。例えば米国特許第
８，５８９，４５５号（クラーク（Ｃ１ａｒｋ）、１９
７０年１１月１０日発行）を参照されたい。電極４２と
４４又は４６の間で得られるビーク又は積分電流は、基
質濃度に比例する。次に電流に比例する電圧を記録計２
２に供給する。
別法として、酵素反応に基ずく溶解酸素の消耗を、基質
を定量するための適当な電極を使用することにより測定
することができる。例えば米国特許第８，５４２，６６
２号（ヒックス（Ｉｉｉｃｋｓ）他、１９７０年１１月
２４日発行）を参照されたい。
を定量するための適当な電極を使用することにより測定
することができる。例えば米国特許第８，５４２，６６
２号（ヒックス（Ｉｉｉｃｋｓ）他、１９７０年１１月
２４日発行）を参照されたい。
クロマトグラフカラム基質の酵素電極検出が好適な用途
は多数種存在する。例えば、前記の装置は食品細目、ワ
イン、ビール、その他砂糖、アルコールを含む有機物質
及び類似物等の各種試料を分析するために使用される。
は多数種存在する。例えば、前記の装置は食品細目、ワ
イン、ビール、その他砂糖、アルコールを含む有機物質
及び類似物等の各種試料を分析するために使用される。
検出可能な代表的基質には、グルコース及びグルコース
重合物、ガラクトース及びガラクトース重合物、活性化
アルコール、及びメタノール、エタノール、ｎ−プロパ
ツール及びｎ−ブタノール等の１級アルコールが包含さ
れる。勿論、検出可能な特定の基質（単数又は複数）は
、電極セル２０の酵素膜５２中に含まれる特定の酵素（
単数又は複数）Ｋ依存する。
重合物、ガラクトース及びガラクトース重合物、活性化
アルコール、及びメタノール、エタノール、ｎ−プロパ
ツール及びｎ−ブタノール等の１級アルコールが包含さ
れる。勿論、検出可能な特定の基質（単数又は複数）は
、電極セル２０の酵素膜５２中に含まれる特定の酵素（
単数又は複数）Ｋ依存する。
第１表は、諸測定を行なうために酵素膜５２に使用され
る各種の好適酵素を、要求される分離を行なうた。゛）
に必要な特定の対応カラムと共に示す。
る各種の好適酵素を、要求される分離を行なうた。゛）
に必要な特定の対応カラムと共に示す。
酵素。の相対的非特異性は、酵素、電極検出器に使用の
際、検出器の有用性を増大させるので、重要な利点であ
ることが認められよう、他方、酵素電極の既知の特異性
とクロマトグラフ保持時間を組み合せると、全面的に非
特異性の検出にて得られるものよりも更に情報量の多い
２次元分析が可能となる。
際、検出器の有用性を増大させるので、重要な利点であ
ることが認められよう、他方、酵素電極の既知の特異性
とクロマトグラフ保持時間を組み合せると、全面的に非
特異性の検出にて得られるものよりも更に情報量の多い
２次元分析が可能となる。
装置１０で得られる結果を示すためには、特異分析が考
慮されるであろう。２０マイクロリツトルのシャンパン
を弁１６によりカラム１２に注入した。この場合のカラ
ムは８５℃に温度調節した８ ０ ｃｗｒｏ）ＩＩ Ｐ
Ｘ−８７Ｃパイオーラドカラムであった。移動相とし
て脱気Ｈ２０を、ポンプ１４（この場合、ミルトンロイ
ミニポンプ（Ｍｉｌｔｏｎ ＲｏｙＭｉｎｉｐｕｍｐ）
）にて２４ｍ１／時の流速で供給した。
慮されるであろう。２０マイクロリツトルのシャンパン
を弁１６によりカラム１２に注入した。この場合のカラ
ムは８５℃に温度調節した８ ０ ｃｗｒｏ）ＩＩ Ｐ
Ｘ−８７Ｃパイオーラドカラムであった。移動相とし
て脱気Ｈ２０を、ポンプ１４（この場合、ミルトンロイ
ミニポンプ（Ｍｉｌｔｏｎ ＲｏｙＭｉｎｉｐｕｍｐ）
）にて２４ｍ１／時の流速で供給した。
比較結果を与えるため、カラム１２からの流出物を最初
はＬＤＣ屈折率検出器（第１図には示していない）Ｋ通
した。ポンプ１８により導入される緩衝剤は、フェリシ
アン酸塩を含むｐＨ７，８のリン酸塩緩衝剤であった。
はＬＤＣ屈折率検出器（第１図には示していない）Ｋ通
した。ポンプ１８により導入される緩衝剤は、フェリシ
アン酸塩を含むｐＨ７，８のリン酸塩緩衝剤であった。
緩衝化のあと、酵素膜５２が酵素ガラクト−スオキ／ダ
ーゼを含有する酵素電極セル２０に、カラム流出物を通
した。
ーゼを含有する酵素電極セル２０に、カラム流出物を通
した。
酵素電極セルを用いて得られたクロマトダラムを第５ａ
図及び第６α図に、ＬＤＣ屈折計を用いて得られたクロ
マトダラムを第５ｂ図及び第６ｂ図に夫々示す。クロマ
トグラムの水平軸は時間を表わし、曲線の秤々のピーク
は検出器に有感な基質の検出器通過に対応する。各曲線
の対応ピークを対応する文字Ａ及びＢで同定する。第５
ａ図は酵素電極セルによる結果を示すものであり、第５
ｂ図は屈折計による結果を示すもので、共にフルスケー
ル１ボルトの記録計で記録されたものであるが、この両
結果の比較は、酵素電極がクロマトグラムを如何に単純
化し且つ屈折率クロマトグラムでは明らかに認められる
基線の上昇と変動を如何に軽減し得るかを示している。
図及び第６α図に、ＬＤＣ屈折計を用いて得られたクロ
マトダラムを第５ｂ図及び第６ｂ図に夫々示す。クロマ
トグラムの水平軸は時間を表わし、曲線の秤々のピーク
は検出器に有感な基質の検出器通過に対応する。各曲線
の対応ピークを対応する文字Ａ及びＢで同定する。第５
ａ図は酵素電極セルによる結果を示すものであり、第５
ｂ図は屈折計による結果を示すもので、共にフルスケー
ル１ボルトの記録計で記録されたものであるが、この両
結果の比較は、酵素電極がクロマトグラムを如何に単純
化し且つ屈折率クロマトグラムでは明らかに認められる
基線の上昇と変動を如何に軽減し得るかを示している。
クロマトグラムの単純化は、酵素電極の特異性に基ずく
ものである。このことは場合によっては有利となり得る
。
ものである。このことは場合によっては有利となり得る
。
酵素電極が検出可能な成分だけに関心がある場合、屈折
率検出の場合よりも試叫の注入を一層凄近して行なうこ
とができ、従って試料処理量を増加させることができる
。屈折率クロマトグラムに於ける基線の変動はピークの
定量に誤差を与えるが、酵素電極クロマトグラムではこ
の変動が著るしく減少している。
率検出の場合よりも試叫の注入を一層凄近して行なうこ
とができ、従って試料処理量を増加させることができる
。屈折率クロマトグラムに於ける基線の変動はピークの
定量に誤差を与えるが、酵素電極クロマトグラムではこ
の変動が著るしく減少している。
第６α図及び第６ｂ図シま第５α図及び第５ｂ図と同じ
もので、ただ記録手段の感度を第６α図及び第６ｂ図で
は第５α図及び第５ｂ図の１０倍（０，１ボルトフルス
ケール）にしただけである。
もので、ただ記録手段の感度を第６α図及び第６ｂ図で
は第５α図及び第５ｂ図の１０倍（０，１ボルトフルス
ケール）にしただけである。
第６ｂ図の屈折率クロマトグラムでは、基線の上昇は更
にはっきりとしており、屈折率クロマトグラムのノイズ
の大きさの程度が第６ａ図の酵素電極クロマトグラムの
ノイズよりも２乃至３桁犬なることは明白である。これ
は、屈折率測定が、酵素電極の場合と異なり、移動相つ
供給のために使用されるポンプの流体力学的パルスに非
常に感度が高いことに直接基ずくものである。従って、
高感度で屈折率を使用する際には、パルスが発生しない
ような非常に高価なポンプを使用するか、ノ々ルスを補
＜１ スるエレクトロニック手段又はパルス鈍化システ
ムを使用する必要がある。酵素電極の場合はそうでなく
、従ってパルス発生系で酵素電極を用いた際の信号／ノ
イズ比は、屈折率分析の場合の２００及至１０００倍の
オーダーとなる。
にはっきりとしており、屈折率クロマトグラムのノイズ
の大きさの程度が第６ａ図の酵素電極クロマトグラムの
ノイズよりも２乃至３桁犬なることは明白である。これ
は、屈折率測定が、酵素電極の場合と異なり、移動相つ
供給のために使用されるポンプの流体力学的パルスに非
常に感度が高いことに直接基ずくものである。従って、
高感度で屈折率を使用する際には、パルスが発生しない
ような非常に高価なポンプを使用するか、ノ々ルスを補
＜１ スるエレクトロニック手段又はパルス鈍化システ
ムを使用する必要がある。酵素電極の場合はそうでなく
、従ってパルス発生系で酵素電極を用いた際の信号／ノ
イズ比は、屈折率分析の場合の２００及至１０００倍の
オーダーとなる。
これまで説明した装置及び方法は、本発明の好適実施態
様であるが、本発明はこの装置及び方法に厳密に制限さ
れるものではなく、特許請求の範囲に定められた本発明
の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
様であるが、本発明はこの装置及び方法に厳密に制限さ
れるものではなく、特許請求の範囲に定められた本発明
の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
第１図は、液体中の溶質を検出するだめの本発明装置を
示す概要図である。 第２図は、酵素電極セルの断面図である。 第３図は、第２図の線８−３に沿った断面図である。 第４図は、第８図のｍ４−４に沿った断面図である。 第５ａ図は、酵素電極セルを用いて得られたクロマトグ
ラムである。 第５ｂ図は、ＬＤＣ屈析計を用いて得られたクロマトグ
ラムである。 第６ａ及び６ｂ図は、夫々第５α及び５ｂ図と同一であ
って、ただ記録手段の感度を１０倍に高めたものである
。 特許出願人 ザ・イエロー・スプリングス・インスト
ルメント・カンノへ°ニー・ インコーホレーテッド （外４名）
示す概要図である。 第２図は、酵素電極セルの断面図である。 第３図は、第２図の線８−３に沿った断面図である。 第４図は、第８図のｍ４−４に沿った断面図である。 第５ａ図は、酵素電極セルを用いて得られたクロマトグ
ラムである。 第５ｂ図は、ＬＤＣ屈析計を用いて得られたクロマトグ
ラムである。 第６ａ及び６ｂ図は、夫々第５α及び５ｂ図と同一であ
って、ただ記録手段の感度を１０倍に高めたものである
。 特許出願人 ザ・イエロー・スプリングス・インスト
ルメント・カンノへ°ニー・ インコーホレーテッド （外４名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）クロマトグラフカラム； 液体を前記カラムに導入するための手段；酵素電極；及
び 前記カラムからの流出物を捕集し且ろ前記流出物を前記
酵素電極に導き該電極に露出させるだめの手段 からなる、液体中の溶質を検出するだめの装置。 ２）前記の酵素電極は入口及び出口を有するポーラログ
ラフセルを含み、前記流出物は前記入口にて前記セルに
供給され且つ前記出口から前記セルを出てゆき、前記セ
ルの内部に少くとも１対の電極が露出され、且つ、多層
半透膜は少くとも１酵素を含む１層を有し、前記の膜は
前記の口と前記電極を隔てるように前記セル内部に配置
されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
装置。 ３）前記の酵素が少くとも１秤のオキ／ダーゼを包含す
る特許請求の範囲第２項に記載の装置。 ４）前記の酵素がガラクトースオキ／ダーセである特許
請求の範囲第２項に記載の装置。 ５）前記流出物を前記酵素′電極に露出する前（で、該
流出物中に緩衝剤を導入するだめの手段を更に含むこと
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の装置。 ６）前記流出物が前記酵素に露出されて製造されるＨ２
Ｏ、、の量を測定するようＫ、前記の対をなす電極を適
合させることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載
の装置。 ７）前記流出物の前記酵素への露出時に、溶解酸素の前
記流出物からの消耗を測定するように、前記電極を適合
させることを特徴とする特許請求の範囲第３虫に記載の
装置。 ８）前記の液体をクロマトグラフカラムに通ずこと；及
び前記カラムの流出物を酵素電極に露出することの工程
からなる、液体中の溶質を検出するだめの方法。 ９）前記流出物を前記酵素電極に露出する前に、緩衝溶
液を該流出物に混合する工程を特徴とする特許請求の範
囲第８項に記載の方法。 １０）前記の酵素電極がオキシダーゼ酵素を含有する特
許請求の範１１１１第８項に記載の方法。 １１）前記の液体をクロマトグラフカラムに通すこと； 緩衝溶液を前記カラムの流出物と混合すること；及び 流出物と緩衝溶液の混合物を、ガラクトースオキシダー
ゼ酵素電極に車高することの工程からなる、液体中の溶
解砂糖及びアルコールを検出するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42515582A | 1982-09-28 | 1982-09-28 | |
| US425155 | 1982-09-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5961772A true JPS5961772A (ja) | 1984-04-09 |
Family
ID=23685402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15010483A Pending JPS5961772A (ja) | 1982-09-28 | 1983-08-17 | 液体クロマトグラフ酵素電極検出器 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0104935A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5961772A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4778680B2 (ja) * | 2001-12-18 | 2011-09-21 | ダイオネックス コーポレイション | 電気化学セル用使い捨て作用電極 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8702370A (nl) * | 1987-10-05 | 1989-05-01 | Groningen Science Park | Werkwijze en stelsel voor glucosebepaling en daarvoor bruikbaar meetcelsamenstel. |
| SE8803054L (sv) * | 1988-09-01 | 1990-03-02 | Beta Sensor Ab | Anordning foer maetning av parametrar i ett stroemmande fluidum |
| EP0360276A3 (en) * | 1988-09-22 | 1991-12-11 | Kao Corporation | Microbial adsorbent and microbial sensor using the same |
| DE4130742A1 (de) * | 1991-09-16 | 1993-03-18 | Inst Diabetestechnologie Gemei | Verfahren und anordnung zur bestimmung der konzentration von inhaltsstoffen in koerperfluessigkeiten |
| KR100241928B1 (ko) * | 1997-03-31 | 2000-03-02 | 박종근 | 다공성 박막 위에 전극이 일체로 형성된 정량장치 및 이를 이용한 정량방법 |
| CN104007219B (zh) * | 2014-06-05 | 2016-03-30 | 浙江省中医药研究院 | 一种液相色谱-酶电极联用装置及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3542662A (en) * | 1967-04-18 | 1970-11-24 | Du Pont | Enzyme electrode |
| DE2551004A1 (de) * | 1975-11-13 | 1977-05-26 | Owens Illinois Inc | Glukoseanalyse |
| CA1077566A (en) * | 1975-12-18 | 1980-05-13 | Peter H. Chang | Polarographic membrane apparatus |
| JPS595000B2 (ja) * | 1980-05-29 | 1984-02-02 | 株式会社島津製作所 | 固定化酵素カラムを用いた生化学分析方法 |
| US4356074A (en) * | 1980-08-25 | 1982-10-26 | The Yellow Springs Instrument Company, Inc. | Substrate specific galactose oxidase enzyme electrodes |
-
1983
- 1983-08-17 JP JP15010483A patent/JPS5961772A/ja active Pending
- 1983-09-27 EP EP83305760A patent/EP0104935A3/en not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4778680B2 (ja) * | 2001-12-18 | 2011-09-21 | ダイオネックス コーポレイション | 電気化学セル用使い捨て作用電極 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0104935A3 (en) | 1984-08-22 |
| EP0104935A2 (en) | 1984-04-04 |
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