JP2015087293A - グリコアルブミンの測定キットおよび測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アルブミンに対するグリコアルブミン（ＧＡ）の存在比を簡便かつ精度よく測定する。【解決手段】固相１０１に固定された抗アルブミン抗体１０２を用いて捕捉されるアルブミン１０３とＧＡ１０４の総量を規格化し、抗ＧＡ抗体１０５を用いて捕捉されたアルブミン１０３とＧＡ１０４のうちのＧＡ１０４の量を測定する。【選択図】図１

Description

糖尿病はインスリン作用不足により血糖値が高くなる病気であり、脳卒中や心臓病の原因ともなるため早期の診断と治療が必要である。従来は糖尿病の診断には血糖値の測定が用いられてきたものの、血糖値は食事や飲酒により変動するという課題があった。これに対し、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）やグリコアルブミン（ＧＡ）などの糖化タンパク質の量はより長期（数週間〜数ヶ月）の血糖値を反映した安定した指標であるため、糖尿病の診断および治療のために行う血糖コントロールの成否を判定するのに有用である。

糖化タンパク質はヘモグロビンやアルブミンといった特定のタンパク質が血糖値に応じて糖化されたものであるため、特定のタンパク質あたりの糖化タンパク質の存在比は長期の血糖値を反映する。例えば、ＨｂＡ１ｃの場合はヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比（ＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比）が、ＧＡの場合はアルブミンに対するＧＡの存在比（ＧＡ／アルブミン比）が長期の血糖値の指標となる。

糖化タンパク質の存在比が反映する期間は糖化タンパク質の体内での半減期によって決まるため、ＨｂＡ１ｃの場合は過去１〜２ヶ月間、ＧＡの場合は過去２週間の血糖値の推移を反映した値となる。そのため、ＧＡはＨｂＡ１ｃよりも短期間の血糖コントロール状態が分かるマーカーとして注目されている。

ＨｂＡ１ｃは国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）により標準化され、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端のバリン残基の糖化物と定義された。それに対し、ＧＡは日本臨床化学会 糖尿病関連指標専門委員会「グリコアルブミン測定の標準法の確立」プロジェクトにより、グルコースが結合したリジン残基を有するアルブミンであり、ＧＡ値はグルコースが結合したリジン残基とアルブミンのモル比と定義された。すなわち、糖化を判断する部位がＨｂＡ１ｃでは１ヶ所であるのに対し、ＧＡでは少なくとも主な糖化部位として知られている４ヶ所が対象になる。このように、ＨｂＡ１ｃとＧＡは糖化タンパク質ではあっても定義に違いがある。

ＧＡの測定法はまずＨＰＬＣ法（Diabetologia, 31, pp.627-631, 1988）が開発され、その後、酵素法（特開平５−１９２１９３号公報）や免疫法（特開２０１０−２６１９６１号公報）が開発されたことで、それまでのＨＰＬＣ法に比べ反応が容易かつ短時間で測定できるようになった。ただし、これらの方法はアルブミン量とＧＡ量を別々に測定し、ＧＡ／アルブミン比へと換算する必要があることから、測定操作が煩雑になっていた。そこで、一定量のアルブミンを固相へ吸着させたり（特開２００４−２４２５２２号公報）、抗アルブミン抗体を固定化した固相へ結合させたり（特開平５−８７８０９号公報）することで、アルブミンの総量を別途に測定することなく規格化し、ＧＡ／アルブミン比を測定できる方法が開発された。

特開平５−１９２１９３号公報 特開２０１０−２６１９６１号公報 特開２００４−２４２５２２号公報 特開平５−８７８０９号公報

Diabetologia, 31, pp.627-631, 1988

簡便かつ高精度にアルブミンに対するＧＡ／アルブミン比を測定する方法を鋭意検討したところ、特開２００４−２４２５２２号公報のようにアルブミンを固相吸着する方法では吸着量の制御が難しいため、アルブミン総量を再現性よく規格化することが困難であった。また、特開平５−８７８０９号公報のようにフェニルボロン酸誘導体のような糖のみを認識して検出する分子を用いてＧＡを検出する方法では、ＧＡ以外にも反応系に存在する糖すべてに反応してしまうため、検体によってＧＡ測定に誤差が生じる可能性があった。

したがって、本発明の課題は、アルブミンに対するＧＡの存在比を簡便かつ精度よく測定するために、１）アルブミンの総量を別途に測定することなく規格化する、２）アルブミン総量の規格化およびＧＡの検出において測定系の制御を容易にし、測定精度を下げる要因を減らすことにある。

上記の課題を解決するためには、抗アルブミン抗体を用いて捕捉されるアルブミン総量を規格化し、抗ＧＡ抗体を用いて捕捉されたアルブミンのうちのＧＡ量を測定する。固相に固定化した抗アルブミン抗体に検体を反応させることで検体中のアルブミンのみを固相に捕捉する。このとき、検体中のアルブミン量よりも固相に固定化した抗アルブミン抗体の量が少なくなるようにする。捕捉されたアルブミンのうちＧＡのみを抗ＧＡ抗体により検出と定量をする。さらに、固相化したアルブミン抗体とは異なるエピトープを認識する抗アルブミン抗体を用いて捕捉されたアルブミン量を測定する。

他の手段として、検体液中のアルブミンを固相に物理吸着させ、まず抗ＧＡ抗体を用いて捕捉されたアルブミンのうちのＧＡ量を測定し、続いて抗アルブミン抗体を用いて捕捉されたアルブミン量を測定する。

また、簡便に検体の希釈を行うには、流路上に検体導入のためのフィルタを設置し、フィルタ上に検体を滴下して流路中の溶液に拡散した検体を試料として用いる。本発明はアルブミンに対するＧＡの存在比を直接求める方法であるため、測定値が希釈倍率に大きく影響を受けず、このような簡便な希釈方法でも十分な精度で測定が可能である。

本発明のグリコアルブミン測定キットは、固定化抗アルブミン抗体と電極とが設けられた固相と、酵素標識された抗グリコアルブミン抗体とを含むことを特徴とする。電極は電位測定用であることが好ましい。固相は、検体導入口および検体保持部を有することができ、検体保持部はろ紙、不織布、多孔質繊維のいずれかを用いることができる。抗アルブミン抗体と電極は流路中に配置されており、抗アルブミン抗体は少なくとも電極の上流と下流に配置されていることが好ましい。また、固相は流路に接続された検体導入口を有することができる。

本発明のグリコアルブミン測定方法は、抗アルブミン抗体と、酵素標識抗グリコアルブミン抗体とを用いて、電位測定により検体中のアルブミンに対するグリコアルブミンの割合を定量化する。本測定方法において、抗アルブミン抗体が固相に固定化された固定化抗体であり、固相に検体を供給する工程と、固定化抗体に検体中のアルブミンとグリコアルブミンを結合させる工程と、固相に酵素標識抗グリコアルブミン抗体を供給する工程と、酵素標識抗体を固相に結合したグリコアルブミンに結合させて固定化抗アルブミン抗体−グリコアルブミン−酵素標識抗グリコアルブミン抗体の複合体を形成させる工程と、固相に基質を供給する工程と、基質を複合体の酵素と反応させて反応産物を生成させる工程と、反応産物濃度を電位測定により測定する工程と、反応産物の濃度を検体中のグリコアルブミン濃度に換算する工程と、を順に有することができる。ここで検体として、希釈液を用いて希釈した検体を用いることが好ましい。希釈の希釈倍率は１０倍以上１０００倍以下であることが好ましい。さらに、固相は検体保持部を有し、固相に検体を供給する工程の後に、固相に希釈液を供給する工程を有し、検体保持部に保持させた検体と希釈液を接触させることによって検体を希釈することができる。

本発明の方法では、アルブミンを抗アルブミン抗体で捕捉した後に抗ＧＡ抗体を用いて捕捉されたアルブミンのうちのＧＡ量を測定することで、アルブミンの総量を別途に測定することなく、簡便かつ高精度にアルブミンに対するＧＡの存在比を測定することができる。アルブミンの捕捉に抗アルブミン抗体を用いることで、捕捉されるアルブミン量のばらつきを抑えることができる。捕捉されるアルブミン量が予測できるため、抗ＧＡ抗体の使用量を必要最小限にすることができる。検体中のアルブミン量が固相に固定化した抗アルブミン抗体の量よりも多ければよいので、必要な希釈倍率が予測できる。固相化したアルブミン抗体とは異なるエピトープを認識する抗アルブミン抗体を用いて捕捉されたアルブミン量を測定することで、固相化抗体の活性が変動するなどしてもその影響を抑制してより安定に測定することができる。

検体中のアルブミンを固相に物理吸着させる場合は、まず抗ＧＡ抗体を用いて捕捉されたアルブミンのうちのＧＡ量を測定し、続いて抗アルブミン抗体を用いて捕捉されたアルブミン量を測定することで、物理吸着量の変動の影響を抑制して、安定してアルブミンに対するＧＡの存在比を測定することができる。

ＧＡ／アルブミン比の測定の概略を示した図。 ＧＡ／アルブミン比を測定する手順の概略を示した図。 抗ヒトアルブミン抗体固定固相で一定量のヒトアルブミンが捕捉できることを示した図。 総アルブミン濃度への依存を小さく抑えてＧＡ／アルブミン比を検出できることを示した図。 ＧＡ／アルブミン比とＧＡ・抗ＧＡ抗体複合体の濃度の関係を理論的に算出した図。 抗ヒトアルブミン抗体を検出用抗体として用いてヒトアルブミン量を補正する方法を示した図。 ＧＡ／アルブミン比測定用のカートリッジの一例を示す図。 図７のカートリッジで測定を行うための装置の一例を示す図。 グリコアルブミン測定キットの概要を示す図。 図７のカートリッジで測定を行うための装置の外観を示す図。 図７のカートリッジと図８の装置を用いた測定方法の一例を示す図。 カートリッジ流路への検体の導入方法を示す図。 電気化学センサを用いた電位測定方法を示す図。 電位計測用電極と抗体固定部位の位置関係の例を示す図。

図１は、本発明を用いたＧＡ／アルブミン比の測定法の概略を図示したものである。固相１０１に抗ヒトアルブミン抗体１０２が固定化されており、抗ヒトアルブミン抗体１０２には試料液中のヒトアルブミン１０３およびＧＡ１０４が捕捉される。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識された抗ＧＡ抗体（以下、酵素標識抗ＧＡ抗体）１０５は捕捉されたＧＡ１０４の糖化部位（図１では○で模式的に表している）を認識して結合する。基質１０６を添加すると、酵素標識抗ＧＡ抗体１０５の標識酵素（この場合、アルカリホスファターゼ）により産物１０７に変換される。試料溶液中のＧＡ／アルブミン比が高い場合と低い場合をそれぞれ図１Ａ、図１Ｂに表した。ＧＡ／アルブミン比に応じて抗ヒトアルブミン抗体１０２に捕捉されるＧＡ１０４の量が異なり、それに応じて結合する酵素標識抗ＧＡ抗体１０５の量が変わるため、産物１０７量を比較することでＧＡ／アルブミン比を求めることができる。なお、抗ヒトアルブミン抗体１０２を固相に固定化できるものであれば、固相１０１の代わりにビーズなどを用いてもよい。

図２は、ＧＡ／アルブミン比を測定する手順の概略を示したものである。

ステップ１：試料溶液を添加し、固相１０１に固定した抗ヒトアルブミン抗体１０２に試料溶液中のヒトアルブミン１０３とＧＡ１０４を捕捉させる
ステップ２：洗浄により、抗体と結合していない試料溶液中のヒトアルブミン１０３およびＧＡ１０４を除く
ステップ３：酵素標識抗ＧＡ抗体１０５を加え、抗ヒトアルブミン抗体１０２に捕捉されたＧＡ１０４に結合させる
ステップ４：洗浄により、結合していない過剰な酵素標識抗ＧＡ抗体１０５を除く
ステップ５：アルカリホスファターゼ用の基質１０６を加え、産物１０７の量から酵素活性を測定する

このとき、一般的な抗原抗体反応では試料溶液中のヒトアルブミンよりも過剰量の捕捉抗体である抗ヒトアルブミン抗体を用いるが、本発明では試料溶液中のヒトアルブミンよりも少ない抗ヒトアルブミン抗体を固相に固定することを特徴とする。抗ヒトアルブミン抗体の固定化密度が同じである条件下では、試料溶液中のヒトアルブミン濃度が、抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合し得る濃度以上であれば、固相上に捕捉されるヒトアルブミン総量は抗ヒトアルブミン抗体と同等量で一定となり、測定毎に一定量のヒトアルブミンを分取することができる。抗原抗体反応における複合体の濃度は式（１）で表せる。

［式１］

例えば，Ａｂ＝１０^-8（Ｍ），ｋ_on＝１０⁵（Ｍ^-1ｓ^-1），ｋ_off＝１０^-4（ｓ^-1），ｔ_b＝１０（min），ｔ_w＝１（min）とすると，Ａｇ＝１０^-6（Ｍ）の場合はＸ_b＝９．９３×１０^-9（Ｍ），Ａｇ＝１０^-5（Ｍ）の場合はＸ_b＝９．９４×１０^-9（Ｍ）となる。

ここで抗体濃度Ａｂは、抗体の固定密度Ｄ、反応場の容量Ｖ、反応場における抗体固定面積Ｓを用いて式（２）で表せる。

［式２］

Ｄ：抗体固定密度，Ｖ：反応場容量，Ｓ：抗体固定面積

式（２）より、容量が１００μｌ、抗体固定面積が１５４ｍｍ²の反応場において、抗ヒトアルブミン抗体を固定密度６．５×１０^-9ｍｏｌ／ｍ²で固定した条件は抗体濃度１０^−８Ｍに相当する。血中のヒトアルブミン濃度は５．６〜７．４×１０^-4Ｍ（３７〜４９ｍｇ／ｍｌ）であるため、固定密度６．５×１０^-9ｍｏｌ／ｍ²で抗ヒトアルブミン抗体を固定した反応場（反応場の容量１００μｌ、抗体固定面積１５４ｍｍ²）にとって、血清試料は固相上の抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合するのに十分なアルブミン濃度である。

抗ヒトアルブミン抗体の固定密度は１．７×１０^-14〜３．６×１０^-4ｍｏｌ／ｍ²であるとよい。１．７×１０^-14よりも抗ヒトアルブミン抗体の固定密度が低いと、測定値の有効数字３桁が確保できなくなってしまう。逆に、３．６×１０^-4ｍｏｌ／ｍ²よりも高い固定密度で抗ヒトアルブミン抗体を固定した反応場は、抗体の性能にもよるが血清試料に含まれるヒトアルブミンがすべて抗ヒトアルブミン抗体に結合してしまうため、固相上に捕捉されるヒトアルブミンの総量は血清試料中のヒトアルブミン濃度によって変動してしまい、測定毎に一定量のヒトアルブミンを捕捉することはできない。

図３は、抗ヒトアルブミン抗体１０２を固定化した固相１０１を用いることで、試料液中のヒトアルブミン濃度が一定以上であれば一定量のヒトアルブミンを抗体で捕捉できることを示している。詳細な実験手順を以下に示す。

ビオチン化したモノクローナル抗ヒトアルブミン抗体（捕捉抗体）をストレプトアビジンコートされたマイクロプレートに加え、固定した。０．１％Tween20含有Tris Buffered Saline（以下、ＴＢＳＴという）で洗浄後、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳＴを加えてブロッキングした。ＴＢＳＴで洗浄し、抗ヒトアルブミン抗体固定プレートを作製した。

ヒトアルブミン（ＧＡ含有）とＴＢＳＴを混合した希釈系列を用意し、試料溶液とした。抗ヒトアルブミン抗体固定プレートに試料溶液を導入し、試料溶液中のヒトアルブミンおよびＧＡを捕捉抗体と反応させ、ＴＢＳＴで過剰なヒトアルブミンを洗浄した。アルカリホスファターゼ修飾したモノクローナル抗ヒトアルブミン抗体（検出用抗体）をプレートに加え反応させた後、ＴＢＳＴで過剰な抗体を洗浄した。

アルカリホスファターゼの発色性基質であるブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）と発色剤ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＴＢ）を添加し、反応させた後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えて反応を停止させ、５９５ｎｍの吸光度を測定した。試料溶液中のヒトアルブミン濃度と吸光度の関係を図３に示す。ヒトアルブミン濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ以上でほぼ一定の吸光度となっており、捕捉抗体により一定量のヒトアルブミンが捕捉できたことが分かる。

図４は、抗ヒトアルブミン抗体で捕捉されたヒトアルブミンに含まれるＧＡを抗ＧＡ抗体で検出することにより、総ヒトアルブミン濃度への依存性を小さく抑えてＧＡ／アルブミン比を測定できることを示す図である。詳細な実験手順を以下に示す。

図３での測定と同様にして抗ヒトアルブミン抗体固定プレートを作製した。ＧＡ／アルブミン比既知の血清検体とＴＢＳＴを混合して血清検体を１００倍希釈および１０００倍希釈し、試料溶液とした。このとき、試料溶液中のヒトアルブミン濃度は固定した抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合し得る濃度以上であることが望ましい。すなわち、容量が１００μｌ、抗体固定面積が１５４ｍｍ²の反応場に抗ヒトアルブミン抗体を固定密度６．５×１０^-9ｍｏｌ／ｍ²で固定した場合であれば、５０００倍までなら希釈できる。

抗ヒトアルブミン抗体固定プレートに試料溶液を導入し、試料溶液中のヒトアルブミンおよびＧＡを抗ヒトアルブミン抗体と反応させ、ＴＢＳＴで過剰な検体を洗浄した。アルカリホスファターゼ修飾したモノクローナル抗ＧＡ抗体（検出用抗体）を加え、抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されているＧＡに反応させた後、ＴＢＳＴで洗浄した。一般的な抗原抗体反応では検出用抗体の濃度は捕捉抗体の１０分の１程度だが、本発明では捕捉抗体である抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが捕捉されているため、検出用抗体である抗ＧＡ抗体の濃度は抗体の性能にもよるが固定した抗ヒトアルブミン抗体の濃度より高いことが望ましい。例えば、抗ヒトアルブミン抗体の固定密度が２．１×１０^-8ｍｏｌ／ｍ²、反応場の容量が１００μｌ、固定面積が１５４ｍｍ²であれば、抗ＧＡ抗体の濃度は３３ｎＭ以上であるとよい。また、抗ＧＡ抗体は複数種のモノクローナル抗体を混合したものでもよく、ポリクローナル抗体でもよい。ヒトアルブミンの糖化部位は複数個所存在するため、エピトープの異なるモノクローナル抗ＧＡ抗体を複数種混合することで、感度や再現性を向上させられる。

なお、捕捉抗体の密度と検出抗体の濃度の関係は式（１）および式（２）を用いて一般化できる。前述したように試料溶液中のヒトアルブミン濃度が抗ヒトアルブミン抗体のすべてに結合し得る濃度以上であれば、固相上に捕捉されるヒトアルブミン総量は抗ヒトアルブミン抗体の分子数で近似できる。したがって、式（１）において抗体に捕捉されたヒトアルブミン濃度Ａｇに式（２）の抗ヒトアルブミン抗体濃度Ａｂを代入することで、捕捉抗体の密度と検出抗体の濃度の関係を１つの式（３）で表せる。

［式３］

ＢＣＩＰおよびＮＴＢを添加し、反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、５９５ｎｍの吸光度を測定した。試料溶液中のＧＡ／アルブミン比と吸光度の関係をまとめたグラフを図４に示す。何らかのバックグラウンドシグナルが加わっているものの、ＧＡ／アルブミン比に応じた吸光度が得られた。式（３）によると、理論的にはＧＡ／アルブミン比とＧＡ・抗ＧＡ抗体複合体の濃度は図５に示すような線形の関係にある。図４においてもＧＡ／アルブミン比と吸光度の関係は線形で表せており、理論に従ってＧＡ／アルブミン比が測定できた。さらに、１００倍希釈と１０００倍希釈の吸光度で大きな差は見られず、１０倍アルブミン濃度が違うにも関わらず、検量線から求めたＧＡ／アルブミン比は１．１〜１．４倍の変化に抑制できた。固定化した抗ヒトアルブミン抗体を用いてヒトアルブミンを捕捉したため、１０倍のヒトアルブミン濃度の違いにも関わらず、ほぼ一定のヒトアルブミンが捕捉された効果である。したがって、検体を希釈する際に希釈倍率の変動があったとしても、その変動の影響を抑制してＧＡ／アルブミン比を測定できる。

試料を１００倍および１０００倍希釈した例を示したのに対し、無希釈および低希釈倍率でも同様にして試料溶液中のＧＡ／アルブミン比を求めることができる。ただし、無希釈や低希釈倍率の場合、ヒトアルブミンの非特異吸着により測定値が変動しやすいため、ある程度の希釈を行うのが望ましい。

図６に示すように、図６Ａのように抗ＧＡ抗体で検出した後に、捕捉抗体とは異なるエピトープを認識する酵素標識抗ヒトアルブミン抗体１０８を添加して、図６Ｂのように固定化した抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されたヒトアルブミン量を測定することにより、固相化抗体の活性が変動するなどしても抗ＧＡ抗体での測定値を補正して変動をさらに抑制できる。

固相上に結合したヒトアルブミンを抗ＧＡ抗体でＧＡ濃度を測定した後に、抗ヒトアルブミン抗体でヒトアルブミン総量の濃度を求めＧＡ／アルブミン比を補正する方法は、静電相互作用や疎水性相互作用などの物理吸着により固相上にヒトアルブミンを一定量吸着させて規格化する場合にも応用できる。物理吸着によるヒトアルブミン総量の変動を補正するステップがあるため、特開２００４−２４２５２２号公報のような固相への吸着によりヒトアルブミン総量の規格化を行っている従来法よりも精度よく測定できる。

図７は、ＧＡ比測定用のカートリッジの一例を示す図である。図７Aは平面模式図，図７Ｂ〜７Ｄは断面模式図である。カートリッジは、固相７０１、流路部７０２、液体保持部７０３から構成され、固相７０１は、溶液導入検知用電極７１３、７１４、電位測定用電極７１５、抗体固定部位７１６、端子７２４〜７２６を有し、流路部７０２は、検体導入口７１２、試薬供給口７１７、７１８、７２７、７２８、廃液溜め接続口７２０を有し、液体保持部７０３は検体保持部７１１、廃液溜め７１９、空気穴７２１、境界部７２２、７２３を有する。試薬供給口７１７から流路をたどってそれぞれの位置関係を説明すると、溶液導入検知用電極７１３、抗体固定部位７１６、電位測定用電極７１５、抗体固定部位７１６、溶液導入検知用電極７１４の順に流路内側に設けられている。また、抗体固定部位７１６と検体導入検知用電極７１４の間の流路上部には、検体導入口７１２がある。カートリッジの概寸は２０ｍｍ×１０ｍｍで、流路は幅１ｍｍ×長さ１３ｍｍ×高さ０．２５ｍｍとした。

固相７０１には、シリコンなどの半導体基板や、ガラスエポキシなどの回路用基板や、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリイミド（ＰＩ）などのフィルム状基板を用いることができる。流路部７０２には、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリイミド（ＰＩ）などのフィルムを積層したものや、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）などの熱可塑性樹脂や、エポキシ樹脂や、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーン樹脂を用いることができる。液体保持部７０３には、アラミド繊維製、ガラス繊維製、セルロース繊維製、ナイロン繊維製、ビニロン繊維製、ポリエステル繊維製、ポリオレフィン繊維製、レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。検体保持部７１１は図７Ｂに示すように検体導入口７１２の外側にあってもよいし、図７Ｃに示すように検体導入口７１２と流路の間にあってもよく、図７Ｄに示すように流路中にあってもよい。なお、図７Ｂや図７Ｃでは検体保持部７１１が流路と外部を隔てているため、圧力損失が大きく検体導入口７１２を測定時に塞ぐ必要がない。境界部７２２、７２３には、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）樹脂や、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）樹脂や、ポリアミド樹脂やポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂を用いることができる。抗体固定部位７１６には抗ヒトアルブミン抗体などの抗体が固定化されており、固定化方法は物理吸着であっても、化学結合であってもよく、まずアビジンを固定化した後にビオチン化抗体をアビジン−ビオチン結合により固定化してもよく、ビオチン修飾した分子を固定化した後にアビジンを介して抗体を固定化してもよい。

図８は、図７のカートリッジで測定を行うための装置の一例を示す図である。図８Ａはカートリッジ８１０と装置８０２の位置関係を上から見た図を示し、図８Ｂはカートリッジ８１０と装置８０２の試薬供給口および電極・端子の接続関係を横から見た図を示している。装置８０２にカートリッジ８０１をセットすることで、カートリッジ８０１の試薬供給口７１７、７１８、７２７、７２８と装置８０２の試薬供給口８１１、８１２、８１６、８１７が流体的に接続され、カートリッジ８０１の端子７２４〜７２６と装置８０２の端子８１３〜８１５が電気的に接続される。試薬供給口８１１には、ポンプ８２５によって抗体試薬液８２６が供給され、試薬供給口８１２には、ポンプ８２３によって検体希釈液８２４が供給され、試薬供給口８１６には、ポンプ８２７によって洗浄液８２８が供給され、試薬供給口８１７には、ポンプ８２１によって基質液８２２が供給される。検体希釈液８２４と洗浄液８２８は同じ組成の溶液でもよい。また、試薬供給口は１から３箇所で、試薬供給口に接続している流路を分岐させることで複数の試薬が供給されるようにしてもよい。端子８１４と端子８１５には交流電源８３３と交流電流計８３４が接続されている。端子８１３には電圧計８３２が接続されており、電圧計８３２のもう一方の端子は試薬供給口８１７に接続された流路に配置されている参照電極８３１に接続されている。ポンプ８２１、８２３、８２５、８２７の制御は制御部８０３によって行われ、交流電源８３３、交流電流計８３４、電圧計８３２の制御と計測は計測部８０４によって行われる。装置８０２は測定結果やメッセージを表示するための表示部８０５、ユーザが操作を入力する入力部８０６を有する。ポンプ８２１、８２３、８２５、８２７は、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。参照電極８３１は一定の電位を示すものであれば、内部液型の銀塩化銀参照電極や、むき出しの銀塩化銀電極や、もしくは、イオン選択電極であってもよい。

図９は、グリコアルブミン測定キットの一例を示す図である。グリコアルブミン測定キット９０１は、図７に示す抗アルブミン抗体が固定化された抗体固定化部位７１６および電位測定用電極７１５が設けられた固相７０１と、図８に示す抗体試薬液８２６を収容した容器からなる。

図１０は、測定装置にカートリッジを装着した状態の一例を示す模式図である。測定装置８０２にカートリッジ８０１をセットし、フタ１００１を閉じる。

図１１は、図７のカートリッジと図８の装置を用いた測定方法の一例を示す図である。流路上に設けられた検体導入口７１２に検体を添加する（Ｓ２０１）。検体としては、生体試料から採取した体液等そのものや、必要に応じて遠心分離やろ過、希釈等の前処理をしたものであってもかまわない。検体保持部７１１はろ紙のような吸収体でできており、さらに、検体保持部７１１の周囲は境界部７２２で囲まれているため、添加した検体は検体保持部７１１で保持される。カートリッジは装置にセットされ、ポンプ８２３を用いて装置の試薬供給口８１２からカートリッジの試薬供給口７１８に検体希釈液８２４を導入する（Ｓ２０２）。検体希釈液はTris Buffered Saline（以下、ＴＢＳという）やPhosphate Buffered Saline（以下、ＰＢＳという）などの緩衝液を用いる。検体導入口７１２まで検体希釈液８２４を導入するため、溶液導入検知用電極７１３と７１４を用いる。例えば、交流電源８３３を用いて溶液導入検知用電極７１３と７１４の間に交流電圧を印加しておくと、検体希釈液８２４導入前はほぼゼロであった電流が、検体希釈液８２４が溶液導入検知用電極７１４まで達すると溶液導入検知用電極７１３と７１４が電気的に接続されるために増大する。この電流の増大を計測部８０４で監視することで検体希釈液８２４が溶液導入検知用電極７１４に到達したことを検知できる。溶液導入検知用電極７１４で検体希釈液８２４の到達を検知したら（Ｓ２０３）、試薬供給口７１８からの検体希釈液８２４の導入を停止する（Ｓ２０４）。検体保持部７１１と検体希釈液８２４が接触した状態で一定時間保持する（Ｓ２０５）と、検体保持部７１１に保持された検体中の成分が検体希釈液８２４中に拡散する。検体希釈液８２４中に拡散する検体中の成分量は保持時間に依存するため、保持時間により検体の希釈倍率を制御できる。

試薬供給口７１８から検体希釈液８２４を若干量吸引し、検体希釈液８２４中に拡散した検体の成分を抗体固定部位７１６まで搬送する（Ｓ２０６）と、検体中のヒトアルブミンが抗体固定部位７１６に固定された抗ヒトアルブミン抗体に捕捉される。一定時間保持した後に、試薬供給口７１８からさらに検体希釈液を導入するなどして、廃液溜め接続口７２０を通じて検体を含む検体希釈液８２４を廃液溜め７１９に廃棄する（Ｓ２０７）。試薬供給口７２７から導入した洗浄液８２８で流路を洗浄し（Ｓ２０８）、抗体固定部位７１６に固定された抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されていないヒトアルブミンを除去する。洗浄に用いた洗浄液８２８も廃液溜め７１９に廃棄される。ポンプ８２５を用いて装置の試薬供給口８１１からカートリッジの試薬供給口７１７に抗体試薬液８２６を導入する（Ｓ２０９）。抗体試薬液８２６にはアルカリホスファターゼ標識抗ＧＡ抗体（標識抗ＧＡ抗体）などを含む液を用いる。すると、抗体試薬液８２６中の標識抗ＧＡ抗体は抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されたＧＡに結合する。一定時間保持した後、試薬供給口７２７から洗浄液８２８を導入し、流路を洗浄する（Ｓ２１０）ことで、未結合の標識抗ＧＡ抗体を除去する。抗体試薬液８２６や洗浄液８２８は廃液溜め７１９に廃棄される。

ポンプ８２１を用いて装置の試薬供給口８１７からカートリッジの試薬供給口７２８に基質液８２２を導入する（Ｓ２１１）。基質液には、アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸とメディエータであるフェリシアン化カリウムを含む液などを用いる。抗体固定部位７１６に存在する抗ヒトアルブミン抗体−ＧＡ−標識抗ＧＡ抗体の複合体のアルカリホスファターゼにより基質液８２２中のアスコルビン酸リン酸が加水分解され、生成したアスコルビン酸がフェリシアン化カリウムと反応してフェロシアン化カリウムを生成し、電位測定用電極７１５の電位が変化する。そのため、電圧計８３２で電位測定用電極７１５と参照電極８３１の間の電位差を測定する（Ｓ２１２）ことで、捕捉されたＧＡ量すなわち検体中のＧＡ／アルブミン比が求まる。より精度よくＧＡ／アルブミン比を求めるために、別に用意したカートリッジにおいてＧＡ／アルブミン比が既知の試料を用いてＧＡ／アルブミン比と測定電位の関係を表す検量線を作成し、ＧＡ／アルブミン比が未知の試料の値を計算してもよい。

図１２を用いて、Ｓ２０１〜Ｓ２０６におけるカートリッジ流路への検体の導入方法について実施例の詳細を示す。図１２はカートリッジ流路への検体の導入方法の詳細を示す説明図である。ステップ１として、流路の一部に設けたフィルタ等からなる検体保持部７１１に検体を滴下する。ステップ２として、流路に緩衝液を導入して検体保持部７１１に接触させ一定時間保持する。ステップ３として、検体保持部７１１に保持された検体の成分が緩衝液中に拡散する。この操作により緩衝液で検体を希釈した場合と同等の希釈検体液が得られる。希釈検体液の希釈倍率は緩衝液の保持時間で制御できる。最後にステップ４として、希釈検体液を抗体固定部位７１６に搬送し、抗原抗体反応を行う。緩衝液を導入する側を上流として、抗体固定部位７１６が検体保持部７１１よりも上流にあるため、その後のＳ２０７〜Ｓ２１２における溶液の導入において、検体保持部７１１より溶液に拡散した検体成分が抗体固定部位７１６を通過することを抑制できる。

図１２において、緩衝液を導入する側を上流として、抗体固定部位７１６が検体保持部７１１よりも下流にあっても構わない。図１２と同様の手順で抗体固定部位７１６に希釈検体液を搬送することができる。抗体固定部位７１６が検体保持部７１１よりも下流にあるため、希釈液を流し続けても検体保持部７１１から拡散した検体成分が抗体固定部位７１６に供給される。そのため、ステップ２〜３のように希釈液を保持する代わりに、希釈液を送液し続けてもよく、その場合送液速度により供給される希釈検体液の希釈倍率を制御する。

検体の導入をフィルタなどからの拡散を利用するため、検体を流路中に導入する場合に懸念される流路のつまりや流路への非特異的な検体成分の吸着を抑制することができる。また、１００倍程度の高い希釈倍率を実現するときの課題となり得る微量検体の計量が不要である。また、毛管力によって検体保持部７１１に検体が保持されるため、カートリッジを取り扱う際の検体の飛散を抑制できる。

検体保持部７１１は、アラミド繊維製、ガラス繊維製、セルロース繊維製、ナイロン繊維製、ビニロン繊維製、ポリエステル繊維製、ポリオレフィン繊維製、レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。他には、一つや複数の細孔を代わりに用いることもできる。これらの材料を用いることで、検体保持部７１１でカートリッジ流路の詰まりの原因となり得る検体中の物質を除去もしくは低減することができる。また、これらの材料に活性炭や疎水性樹脂を混合することで、免疫反応系の阻害の要因と成り得る検体中の脂質などを除去もしくは低減することができる。このとき、これらの材料はヒトアルブミンおよびＧＡの存在量の極度な減少、ＧＡ／アルブミン比の変動を防ぐため、タンパク質や糖質に対する反応性の低い物質であることが望ましい。

図１３を用いて、以下にＳ２１２における電気化学センサを用いた電位測定方法について実施例の詳細を示す。抗原抗体反応の検出ステップにおいて、検出抗体の修飾酵素アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸と、メディエータであるフェリシアン化カリウムを添加することで、抗原抗体反応を電気化学的な信号として検出できる。アルカリホスファターゼによりアスコルビン酸リン酸は加水分解されてアスコルビン酸となる。その後、アスコルビン酸からデヒドロアスコルビン酸が生成するとともに、フェリシアン化カリウムが還元されフェロシアン化カリウムが生成する。その結果、反応溶液中の酸化物質と還元物質の濃度比が変わり反応液の電位が変動する。図１３Ａは流路内に存在するアルカリホスファターゼの作用によって時間経過に伴い変動した電位の測定結果を示す。ただし、アルカリホスファターゼの代わりにネガティブコントロールであるＢＳＡが存在しても電位は変動しない。また図１３Ｂは、電位をネルンストの式（４）を用いて生成したフェロシアン化カリウムの濃度に換算したグラフである。

［式４］

Ｅ^o：標準電極電位．Ｒ＝気体定数，Ｔ＝絶対温度，Ｆ：ファラデー定数，
[Ox]：フェリシアン化カリウム濃度，[Red]：フェロシアン化カリウム濃度

あらかじめ決まったＧＡ／アルブミン存在比のアルブミン・ＧＡ混合試料を用いて行った測定結果をキャリブレーションに利用し、検体の測定結果から検体中のＧＡ／アルブミン存在比を求める。用いる測定結果としては、一定時間後の生成フェロシアン化カリウム濃度、単位時間当たりのフェロシアン化カリウム生成量の他に、図１３Ａに示すような変曲点を用いることもできる。この変曲点は式（４）によればフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムが等量ある点である。任意の時刻における電位からフェロシアン化カリウム濃度を求めるのには標準電極電位が必要なのに対し、変曲点では必ず標準電極電位となる。そのため、変曲点を用いた測定では、測定ごとに生じる標準電極電位の変動の影響を受けない。

電位計測法は測定感度が測定体積に依存しないため、酸化還元電流法や吸光光度法と比べて測定感度に影響せず測定試料を微量化できる。また、電位計測法は酵素標識抗体の濃度の対数に比例した信号が得られるため、酵素標識抗体の濃度に比例した信号が得られる酸化還元電流法や吸光光度法と比べて広いダイナミックレンジが得られる。

検出のための抗体の修飾酵素、その基質およびメディエータの組み合わせはアルカリホスファターゼとアスコルビン酸リン酸、フェリシアン化カリウムといった加水分解酵素と基質の組み合わせに限らず、グルコースオキシダーゼとグルコース、フェリシアン化カリウムといった酸化還元酵素と酸化還元物質の組み合わせでもよい。メディエータの濃度は基質濃度よりも低いことが望ましく、基質とメディエータの濃度比により測定感度を調節できる。

電位測定用電極７１５としては電気化学計測が可能なものとして、金、白金などの貴金属、グラファイト、カーボンブラックなどのカーボン素材のもの、カーボン素材と貴金属を混合したものを用いる。電極面積が測定電流に影響を与える電流計測と違い、電位計測では電極の大きさを厳密に調整する必要はない。

図１４を用いて、電位計測用電極７１５と抗体固定部位７１６の関係を説明する。図１４Ａは電極上にのみ抗体を固定化した場合、図１４Ｂは電極を含む電極よりも広い範囲に抗体を固定化した場合、図１４Ｃは電極には抗体を固定せず電極を中心として流路の上流と下流方向から挟む位置に抗体を固定化した場合を示す。それぞれのグラフは、固定化抗体−抗原−酵素標識抗体の複合体が形成された状態で基質を添加したときの反応生成物の濃度を示している。添加された基質は固定化抗体−抗原−酵素標識抗体の複合体の酵素によって分解され反応生成物が生じ、拡散によって広がる。電極上にのみ抗体を固定した場合、反応生成物の分布は図１４Ａのように電極上で濃度差が生じる。この図の例では、電極の端では電極の中央の半分程度である。これに対し、電極を含む電極よりも広い範囲に抗体を固定化した場合、図１４Ｂのように電極上での濃度差は抑制され、ほぼ一定濃度となる。また、図１４Ｃのように、電極には抗体を固定せず電極を中心として流路の上流と下流方向から挟む位置に抗体を固定化した場合、電極上で若干の濃度差は生じるものの、その差はこの例では７％と図１４Ａのように電極上にのみ抗体を固定した場合よりも小さい。電位計測において、電位は反応生成物の濃度に応じて変動するため、電極上で反応生成物の濃度が一定になるように、抗体固定部位７１６は図１４Ｂもしくは図１４Ｃのように電極よりも広い領域で電極を囲むように配置するのが望ましい。他にも、抗体固定部位７１６は図１４Ｄや図１４Ｅのように電極を四方から囲むように配置してもよく、電極上にも抗体が固定されていても構わない。抗体固定部位で電極を挟み込む場合においても、電極を囲む場合においても、抗体固定部位７１６は電極に隣接していることが望ましい。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１０１ 固相
１０２ 抗ヒトアルブミン抗体
１０３ ヒトアルブミン
１０４ ＧＡ
１０５ 酵素修飾抗ＧＡ抗体
１０６ 基質
１０７ 産物
１０８ 酵素修飾抗アルブミン抗体
７０１ 固相
７０２ 流路部
７０３ 液体保持部
７１１ 検体保持部
７１２ 検体導入口
７１３、７１４ 溶液導入検知用電極
７１５ 電位測定用電極
７１６ 抗体固定部位
７１７、７１８、７２７、７２８ 試薬供給口
７１９ 廃液溜め
７２０ 廃液溜め接続口
７２１ 空気穴
７２２、７２３ 境界部
７２４〜７２６ 端子
８０１ カートリッジ
８０２ 装置
８０３ 制御部
８０４ 計測部
８０５ 表示部
８０６ 入力部
８１１、８１２、８１６、８１７ 試薬供給口
８１３〜８１５ 端子
８２１、８２３ ポンプ
８２２ 基質液
８２４ 検体希釈液
８２５、８２７ ポンプ
８２６ 抗体試薬液
８２８ 洗浄液
８３１ 参照電極
８３２ 電圧計
８３３ 交流電源
８３４ 交流電流計
９０１ グリコアルブミン測定キット
１００１ フタ
１２０１ 検体

Claims (11)

1. 固定化抗アルブミン抗体と、電極とが設けられた固相と、
   酵素標識された抗グリコアルブミン抗体と
   を含むグリコアルブミン測定キット。
2. 請求項１のグリコアルブミン測定キットにおいて、
   前記電極が電位測定用であることを特徴とするグリコアルブミン測定キット。
3. 請求項１のグリコアルブミン測定キットにおいて、
   前記固相は、検体導入口を有することを特徴とするグリコアルブミン測定キット。
4. 請求項３のグリコアルブミン測定キットにおいて、
   前記検体保持部は、ろ紙、不織布、多孔質繊維のいずれかを用いることを特徴とするグリコアルブミン測定キット。
5. 請求項１のグリコアルブミン測定キットにおいて、
   前記抗アルブミン抗体と前記電極は流路中に配置されており、
   前記抗アルブミン抗体は、少なくとも前記電極の上流と下流に配置されていることを特徴とするグリコアルブミン測定キット。
6. 請求項５のグリコアルブミン測定キットにおいて、前記固相は、前記流路に接続された検体導入口を有することを特徴とするグリコアルブミン測定キット。
7. 抗アルブミン抗体と、酵素標識抗グリコアルブミン抗体とを用いて、電位測定により検体中のアルブミンに対するグリコアルブミンの割合を定量化することを特徴とするグリコアルブミンの測定方法。
8. 請求項７に記載の測定方法において、前記抗アルブミン抗体が固相に固定化された固定化抗体であり、
   前記固相に検体を供給する工程と、
   前記固定化抗体に前記検体中のアルブミンとグリコアルブミンを結合させる工程と、
   前記固相に酵素標識抗グリコアルブミン抗体を供給する工程と、
   前記酵素標識抗体を前記固相に結合したグリコアルブミンに結合させて固定化抗アルブミン抗体−グリコアルブミン−酵素標識抗グリコアルブミン抗体の複合体を形成させる工程と、
   前記固相に基質を供給する工程と、
   前記基質を前記複合体の酵素と反応させて反応産物を生成させる工程と、
   前記反応産物濃度を電位測定により測定する工程と、前記反応産物の濃度を検体中のグリコアルブミン濃度に換算する工程と、
   を順に有することを特徴とするグリコアルブミン測定方法。
9. 請求項８記載のグリコアルブミン測定方法において、
   希釈液を用いて希釈した検体を用いることを特徴とするグリコアルブミン測定方法。
10. 請求項９記載のグリコアルブミン測定方法において、
    前記希釈の希釈倍率は１０倍以上１０００倍以下であることを特徴とするグリコアルブミン測定方法。
11. 請求項８記載のグリコアルブミン測定方法において、前記固相は検体保持部を有し、
    前記固相に検体を供給する工程の後に、前記固相に希釈液を供給する工程を有し、
    前記検体保持部に保持させた前記検体と前記希釈液を接触させることによって検体を希釈することを特徴とするグリコアルブミン測定方法。

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