CN115950868B - 一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置及其测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗体‑斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置及其测试方法，该抗体‑斑点法进行糖化白蛋白测定的方法，包括如下步骤：测试时用末梢血采血针和毛细管采血后，将毛细管插入滴液瓶中；混匀后滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内，流入到NC膜上；加入清洗液，然后滴入显色剂A，加入清洗液，再滴入溴甲酚绿或溴甲酚紫或双缩脲试剂到NC膜上，并在一定温度下反应一段时间后在反射/荧光分析仪中测定信号强度；测定GA的浓度；测定总蛋白的浓度。本发明方法具有双重特异性，使产品的特异性更好，抗干扰能力更强，充分满足临床使用要求，测试方法成本低、操作简单，检测时间短，不需要大型昂贵的仪器设备。
Description
技术领域
本发明涉及糖化白蛋白检测技术领域，特别涉及一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置及其测试方法。
背景技术
糖尿病是一种代谢紊乱的终身性疾病，在2015年全球将影响到4.15亿人，预计到2040年，这一数字将增加到6.42亿人。据估计，将会有二分之一的人未被诊断出患有这种疾病。该疾病是一组以胰岛素分泌障碍、胰岛素作用障碍或两者共同引起的高血糖为特征的代谢紊乱。糖尿病患者更有可能患上影响眼睛、神经、心脏、血管和肾脏的疾病。
因此，监测血糖是必要的，以避免并发症，包括但不限于，体温过低、心血管疾病、妊娠疾病和肾脏疾病。糖化血红蛋白A1c（HbA1c）的检测是糖尿病血糖控制中最常见的方法，但红细胞的寿命（120天）阻碍了其在短时间监测中的应用。此外，许多用户友好的设备提供廉价和快速的自血糖监测方法，可以直接测量血糖，但血糖含量在食物摄入后立即受到影响，因此它不能准确地代表基本血糖含量。它需要在白天多次给药来准确的血糖控制，这使得使用者多次注射针头给患者造成不适。反映过去2周平均血糖水平的糖化白蛋白（GA）可在比糖化血红蛋白更短的时间内用于血糖控制，比直接测量血糖的波动小。GA监测正在引起人们对血糖控制的关注，因为它可能是评估血液透析中糖尿病患者血糖水平变化的一个更好的指标。
非酶糖基化过程是一种自发的翻译后修饰过程，通过长时间接触还原性碳水化合物，如葡萄糖靶向赖氨酸残基中的游离氨基和蛋白质的n端。血清白蛋白在lys-199、lys-281、lys-439、lys-525和Asp-1的n端糖基化位点已确定用于体内糖基化。健康个体的血液GA含量范围为HSA的11-16%，但糖尿病患者的这一比例增加到20-30%。因此，GA含量的增加可以作为诊断糖尿病的工具。
糖化血红蛋白和糖化白蛋白的常规糖化蛋白检测方法包括亲和层析、液相色谱、比色法和免疫化学。他们的缺点是需要大型和昂贵的设备和费时费力的程序。采用Kouzuma等人于2002年发现的酶法，引入了专门靶向检测血白蛋白血清中GA的方法。该酶法使用白蛋白特异性蛋白酶消化将血清白蛋白中的肽键切割到单个氨基酸残基，然后用酮胺氧化酶处理，特异性地将糖化赖氨酸生成葡萄糖和过氧化氢作为产物。反应产物的定量采用常规比色法，采用TODB和4-氨基安替比林（4AA）体系，测定过氧化物酶存在下氧化缩合产物的吸光度。白蛋白糖基化的程度以糖基化白蛋白占血清中白蛋白总量的百分比来表示。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置及其测试方法。
本发明提供一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置，包括：滴液瓶、测试卡；
所述滴液瓶的滴液瓶盖上带有过滤全血的滤片，且滤片的边缘和滴液瓶盖无缝衔接；
所述测试卡包括下盖、与下盖适配的上盖、NC膜、吸水纸；所述下盖内设有容纳槽，容纳槽两侧还设有台阶位；所述NC膜、吸水纸置于容纳槽内；所述NC膜置于吸水纸上；
所述上盖开设有加液孔，用于滴液瓶进行滴液后，流入NC膜上，所述上盖底部还设有向外延伸的凸块；所述上盖置于下盖上时，对应的凸块置于台阶位上。
优选的，所述滴液瓶中放有和红细胞等渗的缓冲液用来稀释全血。
优选的，所述滤片的孔径为不大于5 µm。
优选的，所述NC膜为不小于1cm×1cm的方形，其中央位置设有圆形斑点。
优选的，所述吸水纸为不小于1 cm×1 cm的方形，且吸水纸的厚度为不小于2 mm。
本发明还提供一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、测试时用末梢血采血针和毛细管采血后，将毛细管插入滴液瓶中；
步骤S2、混匀后滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内，流入到NC膜上，再滴入清洗液；
步骤S3、然后滴入显色剂A，再滴入清洗液，再滴入溴甲酚绿(BCG)或溴甲酚紫(BCP)或双缩脲试剂到NC膜上，并在一定温度下反应一段时间后在反射/荧光分析仪中测定信号强度；
步骤S4、测定GA的浓度：根据荧光信号强弱和糖化白蛋白的浓度成正比，可以由此来计算GA的浓度；
步骤S5：测定总蛋白（GA+HSA）的浓度：根据吸光度的大小分别和总蛋白（GA+HSA）的浓度成正比，可以由此来计算总蛋白（GA+HSA）的浓度。
优选的，所述步骤S2中的NC膜选用赛多利斯CN140规格，用喷雾的方式喷人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点，然后在30℃～50℃鼓风干燥箱内烘干24～72 h，并切成不小于1cm×1cm的方形NC膜，并使圆形斑点居于中央位置。
优选的，所述人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点的材料包括0.5～2.0 mg/mL人血清白蛋白多克隆抗体、2.5～6%海藻糖、3～6%甲醇、0.01mol/L～0.02mol/LPBS缓冲液，且PH为7.2～7.6。
优选的，所述步骤S2中，滴2～3滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内；所述步骤S3中，显色剂A、溴甲酚绿(BCG)或溴甲酚紫(BCP)或双缩脲试剂均滴入1滴，其中，1滴稀释后的样本的体积为30～60µL，所述溴甲酚绿的PH为4.2，溴甲酚紫的PH为5.2；所述步骤S2中、步骤S3中清洗液均滴入1-2滴，所述清洗液的材料包括0.01～0.02mol/L PBS、0.05%～0.1%Tween-20。
优选的，所述步骤S3中的显色剂A的材料包括0.1%～0.3%曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐、0.3%～0.7%氯化铵、0.3%～0.5%脱氧胆酸钠、0.017%～0.025%NaOH，0.03%～0.08%叠氮钠、0.005%～0.03%TritonX-100，且PH为8.5-9.5。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：本发明将全血样本加入样本稀释液滴瓶稀释后，滴入测试卡的NC膜上，由于滴瓶瓶盖有滤片，可将红细胞过滤掉。血浆中的人血清白蛋白和糖化白蛋白与人血清白蛋白多克隆抗体因发生抗原抗体反应而被NC膜上的人血清白蛋白多克隆抗体捕获，其余非特异的蛋白则由于毛细管作用沿着NC膜向下流动到吸水纸中。加入显色剂A时，糖化白蛋白通过其顺式二醇结构和显色剂A中的曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐络合，从而将荧光显色剂曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐捕获。曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐在510 nm的激发光照射下，在580 nm波长有比较强的发射光，荧光强度越大，糖化白蛋白浓度越大，据此可以检测糖化白蛋白的浓度。加入双缩脲试剂时，因含有两个以上甲酰胺基（-CONH2-）基团的蛋白质肽链，在碱性溶液中与铜离子产生紫色络合反应，故含有甲酰胺基（-CONH2-）集团的人血清白蛋白和糖化白蛋白均可与双缩脲试剂发生反应，总蛋白（GA+HSA）的浓度和吸光度（540nm）成正比，可据此计算出总蛋白（GA+HSA）的浓度。糖化白蛋白的浓度/总蛋白（GA+HSA）的浓度即为糖化白蛋白的百分比浓度。在酸性环境中，加入溴甲酚绿(BCG)(pH4.2)或溴甲酚紫(BCP)(pH5.2)时，人血清白蛋白和糖化白蛋白带正电荷，具有与阴离子染料BCG和BCP结合的特性，球蛋白不结合这些染料，总蛋白（GA+HSA）的浓度和吸光度（BCG 600nm，BCP 585nm）成正比，可据此计算出总蛋白（GA+HSA）的浓度。糖化白蛋白的浓度/总蛋白（GA+HSA）的浓度即为糖化白蛋白的百分比浓度。BCG或BCP比双缩脲检测白蛋白的灵敏度更高一些。
本方法中，采用滤片过滤的方式，滤除红细胞，排除糖化血红蛋白和血红蛋白的干扰。另外采用多克隆抗体捕获的方法将特异性的人血清白蛋白和糖化白蛋白固定在NC膜上。根据苯基硼酸和糖化白蛋白可以发生特异性结合的原理，将荧光物质特异性固定在NC膜上，根据荧光信号的强弱来判断糖化白蛋白的浓度。本方法具有双重特异性，使产品的特异性更好，抗干扰能力更强，充分满足临床使用要求，测试方法成本低、操作简单，检测时间短，不需要大型昂贵的仪器设备。
附图说明
图1为本发明结构示意图；
图2为本发明结构剖视图；
图3为本发明方法和对比试剂的相关性系数r示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进一步说明。
参照图1-图2，本发明还提供一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的测试装置，包括：滴液瓶100、测试卡；所述测试卡包括下盖201、与下盖201适配的上盖204、NC膜203、吸水纸202；所述滴液瓶100的滴液瓶盖上带有过滤全血的滤片（未画出），且滤片的边缘和滴液瓶盖无缝衔接；所述滤片的孔径为5 µm；所述下盖201内设有容纳槽2011，容纳槽2011两侧还设有台阶位2012；所述NC膜203、吸水纸202置于容纳槽内；所述NC膜203置于吸水纸202上；所述NC膜203为cm×1cm的方形，其中央位置设有圆形斑点；所述吸水纸202为1 cm×1cm的方形，且吸水纸202的厚度为2 mm。所述上盖204开设有加液孔205，用于滴液瓶100进行滴液后，流入NC膜203上，所述上盖204底部还设有向外延伸的凸块2040；所述上盖204置于下盖201上时，对应的凸块2040置于台阶位2012上。所述滴液瓶100中放有和红细胞等渗的缓冲液用来稀释全血，加样时需盖紧瓶盖，挤压瓶身，使除了红细胞以外的样本滴到测试卡上。
本发明还提供一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的方法，包括如下步骤：
步骤S1、测试时用末梢血采血针和毛细管采血后，将毛细管插入滴液瓶中；
步骤S2、混匀后滴2～3滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内，流入到NC膜上，加清洗液（0.01mol/L PBS，0.05%Tween-20）1滴；
步骤S3、然后滴入1滴显色剂A，加清洗液（0.01mol/L PBS，0.05%Tween-20）1滴，再滴入1滴双缩脲试剂到NC膜上，并在37℃条件下反应5min后在反射/荧光分析仪中测定信号强度；
步骤S4、测定GA的浓度：荧光信号强弱和糖化白蛋白的浓度成正比，可以由此来计算GA的浓度；GA的浓度是先用校准品的浓度和OD值做一个校准曲线，然后将实测的样本的OD值代入校准曲线，从而得到临床样本的测试值；
步骤S5：测定总蛋白（GA+HSA）的浓度：吸光度的大小和总蛋白（GA+HSA）的浓度成正比，可以由此来计算总蛋白（GA+HSA）的浓度。
所述步骤S2中的NC膜选用赛多利斯CN140（无背衬）规格，用喷雾的方式喷人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点，然后37℃鼓风干燥箱内烘干48 h，并切成1cm×1cm的方形NC膜，并使圆形斑点居于中央位置。
所述人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点的材料包括1.0 mg/mL人血清白蛋白多克隆抗体抗、5%海藻糖、5%甲醇、0.01mol/LPBS缓冲液，且PH 为7.2～7.6。
所述步骤S3中1滴稀释后的样本的体积约为50 µL。
所述步骤S3中的显色剂A的材料包括0.1%～0.3%曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐、0.5%氯化铵、0.4%脱氧胆酸钠、0.017%NaOH，0.05%叠氮钠、0.01%TritonX-100，且PH为8.5-9.5。
反应原理：将全血样本加入样本稀释液滴液瓶100稀释后，滴入测试卡的NC膜203上，由于滴液瓶100瓶盖有滤片，可将红细胞过滤掉。血浆中的人血清白蛋白和糖化白蛋白与人血清白蛋白多克隆抗体因发生抗原抗体反应而被NC膜203上的人血清白蛋白多克隆抗体捕获，其余非特异的蛋白则由于毛细管作用沿着NC膜203向下流动到吸水纸202中。加入显色剂A时，糖化白蛋白通过其二醇结构和显色剂A中的曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐络合，从而将荧光显色剂曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐捕获。曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐在510 nm的激发光照射下，在580 nm波长有比较强的发射光，荧光强度越大，糖化白蛋白浓度越大，据此可以检测糖化白蛋白的浓度。加入双缩脲试剂时，因含有两个以上甲酰胺基（-CONH2-）基团的蛋白质肽链，在碱性溶液中与铜离子产生紫色络合反应，故含有甲酰胺基（-CONH2-）集团的人血清白蛋白和糖化白蛋白均可与双缩脲试剂发生反应，总蛋白（GA+HSA）的浓度和吸光度（540nm）成正比，可据此计算出总蛋白（GA+HSA）的浓度。糖化白蛋白的浓度/总蛋白（GA+HSA）的浓度即为糖化白蛋白的百分比浓度。
本发明方法中，采用滤片过滤的方式，滤除红细胞，排除糖化血红蛋白和血红蛋白的干扰。另外采用多克隆抗体捕获的方法将特异性的人血清白蛋白和糖化白蛋白固定在NC膜203上。根据苯基硼酸和糖化白蛋白可以发生特异性结合的原理，将荧光物质特异性固定在NC膜上，根据荧光信号的强弱来判断糖化白蛋白的浓度。本方法具有双重特异性，使产品的特异性更好，抗干扰能力更强，充分满足临床使用要求。
对比试剂为ASAHI KASEI PHARMA CORPORATION的糖化血红蛋白测定试剂盒（酶法），对比试剂的适用仪器为手工操作及全自动生化分析仪。全自动生化分析仪型号如下：日立：7600，7020，7080，7180；贝克曼：Unicel DxC800 Synchron, Synchron CX7 PRO,Synchron CX5 PRP, Synchron CX4 PRO, Synchron LX120;东芝：TBA-120FR、TBA-200FR；西门子（拜耳）：ADVIA 2400，ADVIA 1200；贝克曼（奥林巴斯）：AU400、AU560、AU600、AU640、AU800、AU1000、AU2700、AU5400；罗氏：COBAS INTEGRA 400 PLUS， COBAS INTEGRA 800。
本实施例适用仪器是反射/荧光分析仪，是小型POCT设备，低成本，操作简单，易于在基层推广。
测试结果如下表1所示：
表1
由表1和图3可知，本发明的方法和对比试剂的相关性系数r为0.9980，相关性极好。且本发明的测试方法成本低、操作简单，检测时间短，不需要大型昂贵的仪器设备。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、测试时用末梢血采血针和毛细管采血后，将毛细管插入滴液瓶中；
步骤S2、混匀后滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内，流入到NC膜上，再滴入清洗液；
步骤S3、然后滴入显色剂A，再滴入清洗液，再滴入溴甲酚绿(BCG)或溴甲酚紫(BCP)或双缩脲试剂到NC膜上，并在一定温度下反应一段时间后在反射/荧光分析仪中测定信号强度；
步骤S4、测定GA的浓度：根据荧光信号强弱和糖化白蛋白的浓度成正比，由此来计算GA的浓度；
步骤S5：测定总蛋白（GA+HSA）的浓度：根据吸光度的大小分别和总蛋白（GA+HSA）的浓度成正比，由此来计算总蛋白（GA+HSA）的浓度；
所述滴液瓶的滴液瓶盖上带有过滤全血的滤片，且滤片的边缘和滴液瓶盖无缝衔接；所述滤片用于滤除红细胞；
所述滴液瓶中放有和红细胞等渗的缓冲液用来稀释全血；
所述测试卡包括下盖、与下盖适配的上盖、NC膜、吸水纸；所述下盖内设有容纳槽；所述NC膜、吸水纸置于容纳槽内；所述NC膜置于吸水纸上；
所述上盖开设有加液孔，用于滴液瓶进行滴液后，流入NC膜上；
所述步骤S2中的NC膜选用赛多利斯CN140规格，用喷雾的方式喷人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点，然后在30℃～50℃鼓风干燥箱内烘干24～72 h，并切成不小于1cm×1cm的方形NC膜，并使圆形斑点居于中央位置；
所述人血清白蛋白多克隆抗体溶液圆形斑点的材料包括0.5～2.0 mg/mL人血清白蛋白多克隆抗体、2.5～6%海藻糖、3～6%甲醇、0.01mol/L～0.02mol/LPBS缓冲液，且PH为7.2～7.6；
所述步骤S3中的显色剂A的材料包括0.1%～0.3%曙红-5-硫代苯基硼酸三乙基铵盐、0.3%～0.7%氯化铵、0.3%～0.5%脱氧胆酸钠、0.017%～0.025%NaOH，0.03%～0.08%叠氮钠、0.005%～0.03%TritonX-100，且PH为8.5-9.5。
2.根据权利要求1所述的抗体-斑点法进行糖化白蛋白测定的方法，其特征在于，所述步骤S2中，滴2～3滴稀释后的样本到测试卡的加液孔内；所述步骤S3中，显色剂A、溴甲酚绿或溴甲酚紫或双缩脲试剂均滴入1滴，其中，1滴稀释后的样本的体积为30～60µL，所述溴甲酚绿的PH为4.2，溴甲酚紫的PH为5.2；所述步骤S2中、步骤S3中清洗液均滴入1-2滴，所述清洗液的材料包括0.01～0.02mol/L PBS、0.05%～0.1%Tween-20。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Dong Ting Inventor after: Shan Bowen Inventor after: Zhang Jiming Inventor after: Wang Rongguang Inventor after: Lin Qianyi Inventor before: Shan Bowen Inventor before: Zhang Jiming Inventor before: Wang Rongguang Inventor before: Dong Ting Inventor before: Lin Qianyi |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |