JP2002365290A - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの測定方法Info
- Publication number
- JP2002365290A JP2002365290A JP2001170890A JP2001170890A JP2002365290A JP 2002365290 A JP2002365290 A JP 2002365290A JP 2001170890 A JP2001170890 A JP 2001170890A JP 2001170890 A JP2001170890 A JP 2001170890A JP 2002365290 A JP2002365290 A JP 2002365290A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- antibody
- measuring
- solid phase
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】糖化ヘモグロビンを特異的に精度良くしかも簡
便・迅速に測定できる方法を提供する。 【解決手段】固相表面上に糖化ヘモグロビンを含むヘモ
グロビン試料を接触させ、ヘモグロビンを固相表面に捕
獲し、固相上に捕獲されたヘモグロビン分子の触媒活性
を利用することで総ヘモグロビン量を測定する。さらに
標識抗糖化ヘモグロビン抗体又はその断片を固相表面に
反応させた後、固相表面に捕獲された標識抗糖化ヘモグ
ロビン抗体又はその断片の量を測定することで糖化ヘモ
グロビンを特異的に測定する。また、これらの測定工程
を組合わせて測定を行い、試料中の総ヘモグロビン量に
対する糖化ヘモグロビン量を求める。
便・迅速に測定できる方法を提供する。 【解決手段】固相表面上に糖化ヘモグロビンを含むヘモ
グロビン試料を接触させ、ヘモグロビンを固相表面に捕
獲し、固相上に捕獲されたヘモグロビン分子の触媒活性
を利用することで総ヘモグロビン量を測定する。さらに
標識抗糖化ヘモグロビン抗体又はその断片を固相表面に
反応させた後、固相表面に捕獲された標識抗糖化ヘモグ
ロビン抗体又はその断片の量を測定することで糖化ヘモ
グロビンを特異的に測定する。また、これらの測定工程
を組合わせて測定を行い、試料中の総ヘモグロビン量に
対する糖化ヘモグロビン量を求める。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は臨床検査分野で、と
りわけ赤血球を含む試料中の糖化ヘモグロビンの測定方
法およびその測定試薬に関する。
りわけ赤血球を含む試料中の糖化ヘモグロビンの測定方
法およびその測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病を罹患した個体は、膵臓が、炭水
化物代謝を調節するに十分な量の活性ホルモンインスリ
ンを血流中に分泌しないので、概して異常に高い血糖レ
ベルを有している。過血糖状態として知られる異常に高
い血糖レベルが長期間継続すると、個体は、網膜症、腎
症、神経障害および心臓血管疾患を含む糖尿病の慢性合
併症となる。
化物代謝を調節するに十分な量の活性ホルモンインスリ
ンを血流中に分泌しないので、概して異常に高い血糖レ
ベルを有している。過血糖状態として知られる異常に高
い血糖レベルが長期間継続すると、個体は、網膜症、腎
症、神経障害および心臓血管疾患を含む糖尿病の慢性合
併症となる。
【０００３】糖化ヘモグロビンは、長時間にわたって血
液中に残留する傾向をもっているので、血液中の糖化タ
ンパク質の優れた指標となる。糖化ヘモグロビンは３つ
の成分、即ちヘモグロビンA1a（HbA1a）, ヘモグロビン
A1b（HbA1b）, ヘモグロビンA1c（HbA1c） からなる。
特にHbA1c レベルが、測定の前の６〜８週間の血中グル
コース治療の有効性を反映するので、糖尿病の診断に有
効なマーカーであり、血糖値の測定と併用して糖尿病の
診断及び進行度の測定に利用されている。
液中に残留する傾向をもっているので、血液中の糖化タ
ンパク質の優れた指標となる。糖化ヘモグロビンは３つ
の成分、即ちヘモグロビンA1a（HbA1a）, ヘモグロビン
A1b（HbA1b）, ヘモグロビンA1c（HbA1c） からなる。
特にHbA1c レベルが、測定の前の６〜８週間の血中グル
コース治療の有効性を反映するので、糖尿病の診断に有
効なマーカーであり、血糖値の測定と併用して糖尿病の
診断及び進行度の測定に利用されている。
【０００４】従来、糖化ヘモグロビンの測定は、高速液
体クロマトグラフィーを利用したカラム法又は抗糖化ヘ
モグロビン抗体を用いる免疫学的方法が実施されてき
た。
体クロマトグラフィーを利用したカラム法又は抗糖化ヘ
モグロビン抗体を用いる免疫学的方法が実施されてき
た。
【０００５】免疫学的方法は、別途調製したポリハプテ
ンとヘモグロビンの糖化部位の競合反応を利用した免疫
凝集を原理とする方法及びラテックス粒子に吸着した糖
化ヘモグロビン分子に抗糖化ヘモグロビン抗体を反応さ
せて生じるラテックス凝集反応等が利用されていた。し
かし、これらの方法は何れも凝集反応を利用しているた
め、特異性及び測定精度に問題があった。
ンとヘモグロビンの糖化部位の競合反応を利用した免疫
凝集を原理とする方法及びラテックス粒子に吸着した糖
化ヘモグロビン分子に抗糖化ヘモグロビン抗体を反応さ
せて生じるラテックス凝集反応等が利用されていた。し
かし、これらの方法は何れも凝集反応を利用しているた
め、特異性及び測定精度に問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、糖化
ヘモグロビンを特異的に精度良くしかも簡便・迅速に測
定できる方法を提供することである。
ヘモグロビンを特異的に精度良くしかも簡便・迅速に測
定できる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、固相表面上に糖
化ヘモグロビンを含むヘモグロビン試料を接触させ、ヘ
モグロビンを固相表面に捕獲し、固相上に捕獲されたヘ
モグロビン分子の触媒活性を利用することにより総ヘモ
グロビン量を測定し、さらに標識抗糖化ヘモグロビン抗
体又はその断片を固相表面に反応させた後、固相表面に
捕獲された標識抗糖化ヘモグロビン抗体又はその断片の
量を測定することで糖化ヘモグロビンを特異的に測定し
うることに着目し、これらの測定工程を組合わせること
により上記課題を解決することを見出し、本発明を完成
した。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、固相表面上に糖
化ヘモグロビンを含むヘモグロビン試料を接触させ、ヘ
モグロビンを固相表面に捕獲し、固相上に捕獲されたヘ
モグロビン分子の触媒活性を利用することにより総ヘモ
グロビン量を測定し、さらに標識抗糖化ヘモグロビン抗
体又はその断片を固相表面に反応させた後、固相表面に
捕獲された標識抗糖化ヘモグロビン抗体又はその断片の
量を測定することで糖化ヘモグロビンを特異的に測定し
うることに着目し、これらの測定工程を組合わせること
により上記課題を解決することを見出し、本発明を完成
した。
【０００８】すなわち本発明は、 １．固相とヘモグロビンを含む試料と接触させることに
より固相表面にヘモグロビンを捕獲し、該固相上に捕獲
されたヘモグロビン量をヘモグロビン分子の触媒活性を
利用して測定する工程(a)、および標識された抗糖化ヘ
モグロビン抗体若しくは該抗体の断片を、上記固相上に
捕獲されたヘモグロビンと反応させ、反応した標識抗糖
化ヘモグロビン抗体若しくは該抗体の断片の量を測定す
る工程(b)を含んでなる、総ヘモグロビン量及び糖化ヘ
モグロビン量の測定方法、あるいは総ヘモグロビン量に
対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法、 ２．ヘモグロビン分子の触媒活性の利用が、ペルオキシ
ダーゼ活性又はオキシダーゼ活性であり、その活性を発
色、蛍光又は発光測定により測定する前項１に記載の測
定方法、 ３．ヘモグロビン分子のヘム核を還元、メト化、アジ化
メト化、又はシアンメトのいずれか１又は２以上の処理
を行う前項１または２に記載の測定方法、 ４．固相表面にヘモグロビンと結合しうる接合体を固定
化し、ヘモグロビンを該固相上に捕獲することを特徴と
する前項１〜３のいずれか１に記載の測定方法、 ５．ヘモグロビンと結合しうる接合体が抗ヘモグロビン
抗体若しくは該抗体の断片又はハプトグロビンであるこ
とを特徴とする前項４に記載の測定方法、 ６．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法を実施す
るために使用する測定試薬、 ７．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法を実施す
るために使用する少なくとも１以上の測定試薬及び／ま
たは固相を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンの測
定試薬キット、からなる。
より固相表面にヘモグロビンを捕獲し、該固相上に捕獲
されたヘモグロビン量をヘモグロビン分子の触媒活性を
利用して測定する工程(a)、および標識された抗糖化ヘ
モグロビン抗体若しくは該抗体の断片を、上記固相上に
捕獲されたヘモグロビンと反応させ、反応した標識抗糖
化ヘモグロビン抗体若しくは該抗体の断片の量を測定す
る工程(b)を含んでなる、総ヘモグロビン量及び糖化ヘ
モグロビン量の測定方法、あるいは総ヘモグロビン量に
対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法、 ２．ヘモグロビン分子の触媒活性の利用が、ペルオキシ
ダーゼ活性又はオキシダーゼ活性であり、その活性を発
色、蛍光又は発光測定により測定する前項１に記載の測
定方法、 ３．ヘモグロビン分子のヘム核を還元、メト化、アジ化
メト化、又はシアンメトのいずれか１又は２以上の処理
を行う前項１または２に記載の測定方法、 ４．固相表面にヘモグロビンと結合しうる接合体を固定
化し、ヘモグロビンを該固相上に捕獲することを特徴と
する前項１〜３のいずれか１に記載の測定方法、 ５．ヘモグロビンと結合しうる接合体が抗ヘモグロビン
抗体若しくは該抗体の断片又はハプトグロビンであるこ
とを特徴とする前項４に記載の測定方法、 ６．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法を実施す
るために使用する測定試薬、 ７．前項１〜５のいずれか１に記載の測定方法を実施す
るために使用する少なくとも１以上の測定試薬及び／ま
たは固相を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンの測
定試薬キット、からなる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の具体的な実施態様を以下
に説明する。本発明に使用する固相は、通常の酵素免疫
測定法で用いられる固相を使用することができ、抗体の
固定化法も公知の方法を採用することができる。固相
は、例えばマイクロタイタープレート、チューブ、ビー
ズ、あるいは磁性粒子等を使用することができる。ま
た、上記の固相に予めヘモグロビン抗体、ヘモグロビン
抗体のFab断片またはハプトグロビンのようにヘモグロ
ビン分子と結合しうる接合体を固定化したものを使用す
ることができる。接合体の固定化方法は、一般的に抗体
やタンパク質等を固相に吸着する方法を採用することが
でき、例えば物理吸着又は化学結合方法が知られてい
る。
に説明する。本発明に使用する固相は、通常の酵素免疫
測定法で用いられる固相を使用することができ、抗体の
固定化法も公知の方法を採用することができる。固相
は、例えばマイクロタイタープレート、チューブ、ビー
ズ、あるいは磁性粒子等を使用することができる。ま
た、上記の固相に予めヘモグロビン抗体、ヘモグロビン
抗体のFab断片またはハプトグロビンのようにヘモグロ
ビン分子と結合しうる接合体を固定化したものを使用す
ることができる。接合体の固定化方法は、一般的に抗体
やタンパク質等を固相に吸着する方法を採用することが
でき、例えば物理吸着又は化学結合方法が知られてい
る。
【００１０】例えば、ヘモグロビンを含む測定試料を例
えばマイクロタイタープレートのウェルに分注し、一定
時間反応させる。試料中のヘモグロビン分子は該ウェル
表面に物理的に吸着されて固相に捕獲される。ウェルに
予め接合体が固定されている場合には、試料中のヘモグ
ロビン分子は該接合体と結合し、固相に捕獲される。試
料中のヘモグロビン分子を固相に捕獲した後、残余の試
料を除去し、洗浄液で固相表面を洗浄する。
えばマイクロタイタープレートのウェルに分注し、一定
時間反応させる。試料中のヘモグロビン分子は該ウェル
表面に物理的に吸着されて固相に捕獲される。ウェルに
予め接合体が固定されている場合には、試料中のヘモグ
ロビン分子は該接合体と結合し、固相に捕獲される。試
料中のヘモグロビン分子を固相に捕獲した後、残余の試
料を除去し、洗浄液で固相表面を洗浄する。
【００１１】その後、酵素標識した抗糖化ヘモグロビン
抗体（例えば、抗HbA1a抗体、抗HbA1b抗体、抗HbA1c抗
体）あるいはその断片を含む溶液を上記ウェルに加え、
一定時間反応させ、上記測定試料中に含まれる糖化ヘモ
グロビンに結合させる。抗糖化ヘモグロビン抗体は、公
知の方法（特開平2-8743）により調製することができ
る。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
の何れも用いることが可能である。糖化ヘモグロビンと
該溶液を反応させた後、残余の溶液を除去し、洗浄液で
固相表面を洗浄する。
抗体（例えば、抗HbA1a抗体、抗HbA1b抗体、抗HbA1c抗
体）あるいはその断片を含む溶液を上記ウェルに加え、
一定時間反応させ、上記測定試料中に含まれる糖化ヘモ
グロビンに結合させる。抗糖化ヘモグロビン抗体は、公
知の方法（特開平2-8743）により調製することができ
る。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
の何れも用いることが可能である。糖化ヘモグロビンと
該溶液を反応させた後、残余の溶液を除去し、洗浄液で
固相表面を洗浄する。
【００１２】ヘモグロビン分子の触媒活性を利用して、
固相に捕獲したヘモグロビン量を測定する。ヘモグロビ
ン量の測定は、上記酵素標識抗糖化ヘモグロビン抗体等
と糖化ヘモグロビンと反応させる前または後のいずれに
行っても良い。
固相に捕獲したヘモグロビン量を測定する。ヘモグロビ
ン量の測定は、上記酵素標識抗糖化ヘモグロビン抗体等
と糖化ヘモグロビンと反応させる前または後のいずれに
行っても良い。
【００１３】ヘモグロビン分子の触媒活性、具体的には
ヘモグロビン分子のペルオキシダーゼ活性を利用したヘ
モグロビンの測定方法として、発色法、蛍光法、発光法
などが挙げられる。発色法として、過酸化水素とテトラ
メチルベンジジン、過酸化水素とジアミノベンジジン等
による発色度からペルオキシダーゼ活性を光学的に測定
する方法が挙げられる。発光測定法として、ルミノール
と過酸化水素による発光度からペルオキシダーゼ活性を
測定する方法が挙げられる。また、蛍光測定法として、
過酸化水素とｐ−メトキシフェノールによる蛍光度から
ペルオキシダーゼ活性を測定する方法等が挙げられる。
またこれらの測定において、色原体の安定化剤及び増感
剤等を適宜含ませることも可能である。
ヘモグロビン分子のペルオキシダーゼ活性を利用したヘ
モグロビンの測定方法として、発色法、蛍光法、発光法
などが挙げられる。発色法として、過酸化水素とテトラ
メチルベンジジン、過酸化水素とジアミノベンジジン等
による発色度からペルオキシダーゼ活性を光学的に測定
する方法が挙げられる。発光測定法として、ルミノール
と過酸化水素による発光度からペルオキシダーゼ活性を
測定する方法が挙げられる。また、蛍光測定法として、
過酸化水素とｐ−メトキシフェノールによる蛍光度から
ペルオキシダーゼ活性を測定する方法等が挙げられる。
またこれらの測定において、色原体の安定化剤及び増感
剤等を適宜含ませることも可能である。
【００１４】ヘモグロビン分子中に含まれるヘム核が酸
素型、還元型、あるいはメト型によってヘモグロビンの
吸収スペクトルに大きな変化があることは一般に広く知
られている。従って、酸素を飽和させて酸素ヘモグロビ
ン、一酸化炭素を飽和させてCOヘモグロビン、ハイドロ
サルファイト等で還元して還元ヘモグロビン、フェリシ
アン化カリウム等でメト化してメトヘモグロビン、さら
にシアンメトヘモグロビン等として測定することが可能
である。尚、試料中のヘモグロビン中には、少なからず
酸化型、還元型等が混合して存在することから、むし
ろ、上記のような処理を行い、一定のヘム核にした状態
で測定することが有利である。
素型、還元型、あるいはメト型によってヘモグロビンの
吸収スペクトルに大きな変化があることは一般に広く知
られている。従って、酸素を飽和させて酸素ヘモグロビ
ン、一酸化炭素を飽和させてCOヘモグロビン、ハイドロ
サルファイト等で還元して還元ヘモグロビン、フェリシ
アン化カリウム等でメト化してメトヘモグロビン、さら
にシアンメトヘモグロビン等として測定することが可能
である。尚、試料中のヘモグロビン中には、少なからず
酸化型、還元型等が混合して存在することから、むし
ろ、上記のような処理を行い、一定のヘム核にした状態
で測定することが有利である。
【００１５】次いでヘモグロビン測定後の反応液を除去
し、ウェルを洗浄後する。標識抗糖化ヘモグロビンの量
を、基質液と一定時間反応させ、吸光度を測定すること
により求める。
し、ウェルを洗浄後する。標識抗糖化ヘモグロビンの量
を、基質液と一定時間反応させ、吸光度を測定すること
により求める。
【００１６】抗糖化ヘモグロビンがアルカリホスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）で標識されている場合には、p-ニトロフ
ェニルリン酸等の基質を加えて測定する。標識物質と検
出のための基質の組み合わせは、公知のものを利用する
ことができる。この実施態様ではヘモグロビンの触媒活
性、主にペルオキシダーゼ活性を利用しているため、こ
こで用いる標識物質はペルオキシダーゼの反応に影響し
ないか、あるいは影響されない物質が有利である。その
例として、前述のＡＬＰとp-ニトロフェニルリン酸の組
み合わせの他、ＡＬＰとフェニルリン酸、ＡＬＰとジオ
キセタン誘導体による発光性基質、エクオリン標識とＣ
ａによる発光測定等が挙げられる。
ーゼ（ＡＬＰ）で標識されている場合には、p-ニトロフ
ェニルリン酸等の基質を加えて測定する。標識物質と検
出のための基質の組み合わせは、公知のものを利用する
ことができる。この実施態様ではヘモグロビンの触媒活
性、主にペルオキシダーゼ活性を利用しているため、こ
こで用いる標識物質はペルオキシダーゼの反応に影響し
ないか、あるいは影響されない物質が有利である。その
例として、前述のＡＬＰとp-ニトロフェニルリン酸の組
み合わせの他、ＡＬＰとフェニルリン酸、ＡＬＰとジオ
キセタン誘導体による発光性基質、エクオリン標識とＣ
ａによる発光測定等が挙げられる。
【００１７】本発明の方法を用いて総ヘモグロビンと糖
化ヘモグロビン及びその割合を測定する方法を具体的に
説明する。
化ヘモグロビン及びその割合を測定する方法を具体的に
説明する。
【００１８】（試料液の調製）一定量の血液試料を適当
な溶血剤で処理し、ヘモグロビンを含む測定試料を調製
する。溶血剤としては一般に界面活性剤を含む緩衝液が
一般に用いられる。このとき、ヘム核の状態を一定にす
るために、シアン加フェリシアン化カリウムを加えてヘ
モグロビンをシアンメト化することも可能である。
な溶血剤で処理し、ヘモグロビンを含む測定試料を調製
する。溶血剤としては一般に界面活性剤を含む緩衝液が
一般に用いられる。このとき、ヘム核の状態を一定にす
るために、シアン加フェリシアン化カリウムを加えてヘ
モグロビンをシアンメト化することも可能である。
【００１９】（固相と試料液の反応）調製した試料液を
清浄なマイクロタイタープレートのウェルに分注し室温
で５〜１０分放置し、試料中のヘモグロビンをウェル表
面に捕獲させる。そして残余の試料液を吸引除去し、0.
15Ｍ NaCl添加20mMリン酸緩衝液（pH7.2）でウェルを洗
浄する。次いで、ＡＬＰ標識抗糖化ヘモグロビン抗体
（例えば抗HbA1c抗体）をウェルに加え、室温で１〜30
分間、好ましくは３〜10分間おき、ウェルに捕獲された
ヘモグロビンの内、糖化ヘモグロビン（例えばHbA1c）
と抗糖化ヘモグロビン抗体（例えば抗HbA1c抗体）を反
応させる。反応後、残余のＡＬＰ標識抗体を含む溶液を
除去し、ウェルを洗浄する。
清浄なマイクロタイタープレートのウェルに分注し室温
で５〜１０分放置し、試料中のヘモグロビンをウェル表
面に捕獲させる。そして残余の試料液を吸引除去し、0.
15Ｍ NaCl添加20mMリン酸緩衝液（pH7.2）でウェルを洗
浄する。次いで、ＡＬＰ標識抗糖化ヘモグロビン抗体
（例えば抗HbA1c抗体）をウェルに加え、室温で１〜30
分間、好ましくは３〜10分間おき、ウェルに捕獲された
ヘモグロビンの内、糖化ヘモグロビン（例えばHbA1c）
と抗糖化ヘモグロビン抗体（例えば抗HbA1c抗体）を反
応させる。反応後、残余のＡＬＰ標識抗体を含む溶液を
除去し、ウェルを洗浄する。
【００２０】第２実施態様として、マイクロタイタープ
レートのウェルに抗ヘモグロビン抗体やハプトグロビン
のようなヘモグロビンと結合性を有する接合体を固定化
したものを準備し、その固相と試料液を反応させること
によってウェルにヘモグロビンを捕獲する。そして残余
の試料液を吸引除去し、上述のようにリン酸緩衝液で洗
浄し、ＡＬＰ標識抗HbA1c 抗体を反応させる。反応後、
残余のＡＬＰ標識抗体を含む溶液を除去し、ウェルを洗
浄する。
レートのウェルに抗ヘモグロビン抗体やハプトグロビン
のようなヘモグロビンと結合性を有する接合体を固定化
したものを準備し、その固相と試料液を反応させること
によってウェルにヘモグロビンを捕獲する。そして残余
の試料液を吸引除去し、上述のようにリン酸緩衝液で洗
浄し、ＡＬＰ標識抗HbA1c 抗体を反応させる。反応後、
残余のＡＬＰ標識抗体を含む溶液を除去し、ウェルを洗
浄する。
【００２１】（ヘモグロビンの測定）ヘモグロビンを固
相表面に捕獲させた後、過酸化水素とテトラメチルベン
ジジンの混合溶液を分注し、ヘモグロビン分子のペルオ
キシダーゼ様活性により発色させる。一定時間反応後に
波長630nm の吸光度を測定し、総ヘモグロビン量を求め
る。マイクロタイタープレートを使用する場合は、市販
のマイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定する
ことができる。該ヘモグロビンの測定は、試料中のヘモ
グロビンを固相に捕獲後であればいつでも測定すること
ができる。例えば、抗糖化ヘモグロビンと糖化ヘモグロ
ビンを反応させる前に測定しても良いし、反応後に測定
しても良い。さらに、糖化ヘモグロビンの測定前に該ヘ
モグロビンを測定しても良いし、糖化ヘモグロビンの測
定後に測定しても良い。
相表面に捕獲させた後、過酸化水素とテトラメチルベン
ジジンの混合溶液を分注し、ヘモグロビン分子のペルオ
キシダーゼ様活性により発色させる。一定時間反応後に
波長630nm の吸光度を測定し、総ヘモグロビン量を求め
る。マイクロタイタープレートを使用する場合は、市販
のマイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定する
ことができる。該ヘモグロビンの測定は、試料中のヘモ
グロビンを固相に捕獲後であればいつでも測定すること
ができる。例えば、抗糖化ヘモグロビンと糖化ヘモグロ
ビンを反応させる前に測定しても良いし、反応後に測定
しても良い。さらに、糖化ヘモグロビンの測定前に該ヘ
モグロビンを測定しても良いし、糖化ヘモグロビンの測
定後に測定しても良い。
【００２２】（糖化ヘモグロビンの測定）ウェルに捕獲
されたヘモグロビンの内、糖化ヘモグロビン（例えばHb
A1c）と抗糖化ヘモグロビン抗体（例えば抗HbA1c 抗
体）を反応させた後、反応液を除去し、0.15Ｍ NaCl添
加20mMリン酸緩衝液（pH7.2）を用いてウェルを洗浄す
る。洗浄後、p-ニトロフェニルリン酸溶液を基質液とし
て加え、ＡＬＰと一定時間反応させ、ＡＬＰ標識抗糖化
ヘモグロビンの量を波長405nm の吸光度により測定し、
糖化ヘモグロビンの量を求める。吸光度の測定は、市販
のマイクロプレートリーダーを用いて測定することがで
きる。該糖化ヘモグロビンの測定は、糖化ヘモグロビン
と抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させた後であればいつ
でも測定することができる。例えば、ヘモグロビンの測
定前に測定しても良いし、ヘモグロビンの測定後に測定
しても良い。
されたヘモグロビンの内、糖化ヘモグロビン（例えばHb
A1c）と抗糖化ヘモグロビン抗体（例えば抗HbA1c 抗
体）を反応させた後、反応液を除去し、0.15Ｍ NaCl添
加20mMリン酸緩衝液（pH7.2）を用いてウェルを洗浄す
る。洗浄後、p-ニトロフェニルリン酸溶液を基質液とし
て加え、ＡＬＰと一定時間反応させ、ＡＬＰ標識抗糖化
ヘモグロビンの量を波長405nm の吸光度により測定し、
糖化ヘモグロビンの量を求める。吸光度の測定は、市販
のマイクロプレートリーダーを用いて測定することがで
きる。該糖化ヘモグロビンの測定は、糖化ヘモグロビン
と抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させた後であればいつ
でも測定することができる。例えば、ヘモグロビンの測
定前に測定しても良いし、ヘモグロビンの測定後に測定
しても良い。
【００２３】（総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビ
ンの割合）上記の方法で求めた総ヘモグロビン量と糖化
ヘモグロビン量を比較することにより、総ヘモグロビン
に対する糖化ヘモグロビンの割合を求めることができ
る。
ンの割合）上記の方法で求めた総ヘモグロビン量と糖化
ヘモグロビン量を比較することにより、総ヘモグロビン
に対する糖化ヘモグロビンの割合を求めることができ
る。
【００２４】なお本発明は、糖化ヘモグロビン測定方法
に使用する測定試薬、たとえば抗糖化アルブミン抗体お
よび発色法、蛍光法、発光法等に使用する基質液、洗浄
液、反応停止液等にも及ぶ。さらに、これらの試薬のう
ち少なくとも１以上を含み、および／または固相を含む
測定試薬キットにもおよぶ。
に使用する測定試薬、たとえば抗糖化アルブミン抗体お
よび発色法、蛍光法、発光法等に使用する基質液、洗浄
液、反応停止液等にも及ぶ。さらに、これらの試薬のう
ち少なくとも１以上を含み、および／または固相を含む
測定試薬キットにもおよぶ。
【００２５】
【実施例】以下に実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
【実施例１】市販の酵素免疫測定用の９６ウェルマイク
ロタイタープレート（ヌンク社製）に５μg/mLのヒトハ
プトグロビンを100μLずつ分注し、室温で１時間放置
後、ハプトグロビン液を除去し、ハプトグロビン固定化
プレートを調製した。調製したプレートの各ウェルに１
％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を3
00μLずつ分注した後、一夜冷蔵庫内で放置した。
ロタイタープレート（ヌンク社製）に５μg/mLのヒトハ
プトグロビンを100μLずつ分注し、室温で１時間放置
後、ハプトグロビン液を除去し、ハプトグロビン固定化
プレートを調製した。調製したプレートの各ウェルに１
％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を3
00μLずつ分注した後、一夜冷蔵庫内で放置した。
【００２７】市販のグリコHbコントロール（国際試薬社
製）のレベルII（10.7％）を生理食塩水で4/5、3/5、2/
5と順次希釈したものを検量線用試料として測定した。
各試料液10μLを各ウェルに分注し、さらに１％ウシ血
清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を100μLを
分注した後、室温で10分間反応させた。反応終了後、ウ
ェル内の試料液を吸引除去し、20mMリン酸緩衝液（pH7.
0）300μLを用いて４回洗浄した。
製）のレベルII（10.7％）を生理食塩水で4/5、3/5、2/
5と順次希釈したものを検量線用試料として測定した。
各試料液10μLを各ウェルに分注し、さらに１％ウシ血
清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を100μLを
分注した後、室温で10分間反応させた。反応終了後、ウ
ェル内の試料液を吸引除去し、20mMリン酸緩衝液（pH7.
0）300μLを用いて４回洗浄した。
【００２８】その後、市販のp-ペルオキシダーゼ活性測
定用の3,3,5,5−テトラメチルベンジジン-過酸化水素基
質発色液（ICN社製）100μLを加え、室温で10分間反応
後、波長650nmでの吸光度を測定し、総ヘモグロビン量
を測定した。
定用の3,3,5,5−テトラメチルベンジジン-過酸化水素基
質発色液（ICN社製）100μLを加え、室温で10分間反応
後、波長650nmでの吸光度を測定し、総ヘモグロビン量
を測定した。
【００２９】上記基質発色液を除去し、上記のリン酸緩
衝液で２回洗浄した。次いでＡＬＰ標識抗HbA1c 抗体を
含む溶液を100μLずつ分注し、室温で30分間反応させ
た。反応終了後にウェル内の溶液を除去し、上記リン酸
緩衝液で３回洗浄し、p-ニトロフェニルリン酸を含む基
質液を各ウェルに100μL分注し、室温で20分間反応させ
た。波長405nmでの吸光度を測定し、HbA1cの検量線を求
めた。総ヘモグロビン濃度およびHbA1cの測定結果を図
１に示した。
衝液で２回洗浄した。次いでＡＬＰ標識抗HbA1c 抗体を
含む溶液を100μLずつ分注し、室温で30分間反応させ
た。反応終了後にウェル内の溶液を除去し、上記リン酸
緩衝液で３回洗浄し、p-ニトロフェニルリン酸を含む基
質液を各ウェルに100μL分注し、室温で20分間反応させ
た。波長405nmでの吸光度を測定し、HbA1cの検量線を求
めた。総ヘモグロビン濃度およびHbA1cの測定結果を図
１に示した。
【００３０】
【実施例２】市販の酵素免疫測定用の９６ウェルマイク
ロタイタープレート（ヌンク社製）に実施例１で調製し
た検量線用試料液20μLを各ウェルに分注し、さらに20m
Mヘペス緩衝液（pH7.3）100μLを分注した。攪拌後室温
で20分間放置して試料中のヘモグロビン分子をウェル表
面に捕獲させた。その後、ウェル内の溶液を吸引除去
し、１mg/mLの牛血清アルブミンを含む20mMヘペス緩衝
液（pH7.3）で２回洗浄した。
ロタイタープレート（ヌンク社製）に実施例１で調製し
た検量線用試料液20μLを各ウェルに分注し、さらに20m
Mヘペス緩衝液（pH7.3）100μLを分注した。攪拌後室温
で20分間放置して試料中のヘモグロビン分子をウェル表
面に捕獲させた。その後、ウェル内の溶液を吸引除去
し、１mg/mLの牛血清アルブミンを含む20mMヘペス緩衝
液（pH7.3）で２回洗浄した。
【００３１】次いでＡＬＰ標識抗HbA1c抗体を含む溶液1
00μLを各ウェルに加え、室温で20分間反応させた。反
応終了後に溶液を除去し、実施例１で用いたリン酸緩衝
液で３回洗浄した。p-ニトロフェニルリン酸基質液100
μLを各ウェルに添加し、室温で20分間反応させた後、
波長405nmの吸光度を測定し、HbA1cの検量線を求めた。
00μLを各ウェルに加え、室温で20分間反応させた。反
応終了後に溶液を除去し、実施例１で用いたリン酸緩衝
液で３回洗浄した。p-ニトロフェニルリン酸基質液100
μLを各ウェルに添加し、室温で20分間反応させた後、
波長405nmの吸光度を測定し、HbA1cの検量線を求めた。
【００３２】測定後、p-ニトロフェニルリン酸基質液を
除去し、リン酸緩衝液で洗浄後、市販のペルオキシダー
ゼ活性測定用の3,3,5,5−テトラメチルベンジジン−過
酸化水素基質発色液（ICN社製）を100μL各ウェルに添
加し、室温で10分間反応させた後、１Mの希硫酸100μL
を各ウェルに加えて反応を止め、波長450nmでの吸光度
を測定し、総ヘモグロビンの検量線を求めた。総ヘモグ
ロビン濃度およびHbA1cの測定結果を図２に示した。
除去し、リン酸緩衝液で洗浄後、市販のペルオキシダー
ゼ活性測定用の3,3,5,5−テトラメチルベンジジン−過
酸化水素基質発色液（ICN社製）を100μL各ウェルに添
加し、室温で10分間反応させた後、１Mの希硫酸100μL
を各ウェルに加えて反応を止め、波長450nmでの吸光度
を測定し、総ヘモグロビンの検量線を求めた。総ヘモグ
ロビン濃度およびHbA1cの測定結果を図２に示した。
【００３３】
【発明の効果】以上説明したように本発明の糖化ヘモグ
ロビンの測定方法により、糖化ヘモグロビンを特異的に
精度良くしかも簡便・迅速に測定できる。
ロビンの測定方法により、糖化ヘモグロビンを特異的に
精度良くしかも簡便・迅速に測定できる。
【図１】総ヘモグロビン(Hb)量およびHbA1c量を本発明
の方法で測定した結果を示す図である。（実施例１）
の方法で測定した結果を示す図である。（実施例１）
【図２】総ヘモグロビン(Hb)量およびHbA1c量を本発明
の方法で測定した結果を示す図である。（実施例２）
の方法で測定した結果を示す図である。（実施例２）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永松 剛 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内
Claims (7)
- 【請求項１】固相とヘモグロビンを含む試料と接触させ
ることにより固相表面にヘモグロビンを捕獲し、該固相
上に捕獲されたヘモグロビン量をヘモグロビン分子の触
媒活性を利用して測定する工程(a)、および標識された
抗糖化ヘモグロビン抗体若しくは該抗体の断片を、上記
固相上に捕獲されたヘモグロビンと反応させ、反応した
標識抗糖化ヘモグロビン抗体若しくは該抗体の断片の量
を測定する工程(b)を含んでなる、総ヘモグロビン量及
び糖化ヘモグロビン量の測定方法、あるいは総ヘモグロ
ビン量に対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法。 - 【請求項２】ヘモグロビン分子の触媒活性の利用が、ペ
ルオキシダーゼ活性又はオキシダーゼ活性であり、その
活性を発色、蛍光又は発光測定により測定する請求項１
に記載の測定方法。 - 【請求項３】ヘモグロビン分子のヘム核を還元、メト
化、アジ化メト化、又はシアンメトのいずれか１又は２
以上の処理を行う請求項１または２に記載の測定方法。 - 【請求項４】固相表面にヘモグロビンと結合しうる接合
体を固定化し、ヘモグロビンを該固相上に捕獲すること
を特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の測定方
法。 - 【請求項５】ヘモグロビンと結合しうる接合体が抗ヘモ
グロビン抗体若しくは該抗体の断片又はハプトグロビン
であることを特徴とする請求項４に記載の測定方法。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１に記載の測定方
法を実施するために使用する測定試薬。 - 【請求項７】請求項１〜５のいずれか１に記載の測定方
法を実施するために使用する少なくとも１以上の測定試
薬及び／または固相を含むことを特徴とする糖化ヘモグ
ロビンの測定試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001170890A JP2002365290A (ja) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001170890A JP2002365290A (ja) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002365290A true JP2002365290A (ja) | 2002-12-18 |
Family
ID=19012740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001170890A Withdrawn JP2002365290A (ja) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002365290A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015064701A1 (ja) * | 2013-10-31 | 2015-05-07 | 日立化成株式会社 | グリコアルブミンの測定キットおよび測定方法 |
| WO2015099123A1 (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-02 | 京セラ株式会社 | センサ |
| JP2015165827A (ja) * | 2010-04-09 | 2015-09-24 | 東洋紡株式会社 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
| WO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ |
| WO2020067396A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 積水メディカル株式会社 | 糖化ヘモグロビン（％）の測定方法 |
-
2001
- 2001-06-06 JP JP2001170890A patent/JP2002365290A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015165827A (ja) * | 2010-04-09 | 2015-09-24 | 東洋紡株式会社 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
| WO2015064701A1 (ja) * | 2013-10-31 | 2015-05-07 | 日立化成株式会社 | グリコアルブミンの測定キットおよび測定方法 |
| WO2015099123A1 (ja) * | 2013-12-26 | 2015-07-02 | 京セラ株式会社 | センサ |
| US10976326B2 (en) | 2013-12-26 | 2021-04-13 | Kyocera Corporation | Sensor |
| WO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ |
| JPWO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2017-04-13 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマー、ならびにそれを用いたセンサおよび検出方法 |
| WO2020067396A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 積水メディカル株式会社 | 糖化ヘモグロビン（％）の測定方法 |
| JP7382071B2 (ja) | 2018-09-28 | 2023-11-16 | 積水メディカル株式会社 | 糖化ヘモグロビン（％）の測定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220365103A1 (en) | Methods and compositions for assaying vitamin d | |
| US20100323450A1 (en) | System for quantitative measurement of glycohemoglobin and method for measuring glycohemoglobin | |
| JP3551678B2 (ja) | ヘモグロビンＡ１ｃの測定法及びキット | |
| US8921052B2 (en) | Hemoglobin derivative measurement method, and reagent composition, measurement kit, analysis device and analysis system for use in the method | |
| JP2008525791A (ja) | 検査用デバイスおよび血液混合希釈方法 | |
| JP2000508075A (ja) | 発光特異的結合アッセイ | |
| JP3646097B2 (ja) | 前進性グリコシル化終末産物を含有しない特異的結合アッセイの試薬および固相成分 | |
| WO2001092885A1 (fr) | Methode immunologique de turbidimetrie provoquee par du latex et reactif pour la mise en oeuvre de ladite methode | |
| JPS6015559A (ja) | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 | |
| EP3923806B1 (en) | Calibrators and controls for the determination of the percentage of glycated hemoglobin in a patient's liquid test sample | |
| JP2002365290A (ja) | 糖化ヘモグロビンの測定方法 | |
| EP2309265B1 (en) | Method of assaying complex and kit to be used therefor | |
| WO2015116961A1 (en) | Methods and compositions for assaying vitamin d | |
| JPH0783922A (ja) | 糖化蛋白の測定方法 | |
| JP2002340895A (ja) | 糖化ヘモグロビンの測定方法 | |
| Nechaeva et al. | Rapid Automatic Determination of Four Cardiomarkers in the Blood Plasma of Patients with Cardiopathologies | |
| JP3171681B2 (ja) | 糖化蛋白の測定方法 | |
| JP3181390B2 (ja) | タンパク質の糖化割合の測定方法 | |
| JPH07103978A (ja) | 遊離ヘモグロビン測定 | |
| JPH08313530A (ja) | 総ヘモグロビン測定方法及び測定キット | |
| JP3292766B2 (ja) | 糖化蛋白の測定方法 | |
| JP2001099838A (ja) | 化学発光反応に基づく糖尿病診断のための多項目検査項目の同時測定方法 | |
| JP2003130868A (ja) | 生活習慣病発症者または生活習慣病危険因子保有者のスクリーニング方法およびスクリーニング用キット | |
| JP2001343387A (ja) | 複合体を形成する物質の測定方法及び測定試薬 | |
| JPH05172809A (ja) | 糞便潜血の特異的検出方法と同方法を用いた糞便潜血定量キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20050930 |
|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080902 |