JPH029302B2 - - Google Patents

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JPH029302B2
JPH029302B2 JP56158780A JP15878081A JPH029302B2 JP H029302 B2 JPH029302 B2 JP H029302B2 JP 56158780 A JP56158780 A JP 56158780A JP 15878081 A JP15878081 A JP 15878081A JP H029302 B2 JPH029302 B2 JP H029302B2
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JP
Japan
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enzyme
electrode
creatine
enzyme electrode
membrane
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JP56158780A
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JPS5861459A (ja
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Hiroyuki Myagi
Yumiko Abe
Yoshitada Takada
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Hitachi Ltd
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Hitachi Ltd
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Biotechnology (AREA)
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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液や尿などの体液中のクレアチンと
クレアチニンの分析装置に関する。
血液および尿中のクレアチンとクレアチニンの
濃度は腎臓機能の診断指標として重要な臨床検査
項目とされている。従来、クレアチニンを分析す
るにはピクリン酸のアルカリ性溶液中での発色反
応を利用するJaffe′反応が用いられ、クレアチン
は試料に酸を加えて加熱脱水することによつてク
レアチニンに変化させてから同様に分析してい
た。しかし、Jaffe′反応は必ずしもクレアチニン
に特異的ではなく他の物質とも反応する可能性が
あるので、クレアチニン濃度を正確に分析するこ
とは困難とされていた。
近年になつて酵素試薬を用いるクレアチニンの
分析法がいくつか報告されている。例えば森下氏
等はクレアチニンデイミナーゼ(E.C.3.5.4.2)溶
液とアンモニアガス電極を用いる方法を提案して
いる(衛生検査、28,174,1969)。また、
Mayerhoff氏等はアンモニア電極の先端に膜を包
んだ酵素溶液を装着する酵素電極を使用する方法
を提案している(Anal.Chim.Acta,85,277,
1976)が、これらはいずれも日常分析法としては
採用されていない。
本発明は生体液中のクレアチンとクレアチニン
と同時に分析できる簡便な分析装置を提供するこ
とを目的とし、その特徴とするところは、クレア
チンアミジノヒドロラーゼとザルコシンオキシダ
ーゼを固定化した酵素膜を感応面に装着した第1
の酵素電極と、クレアチニンアミドヒドロラーゼ
とクレアチンアミジノヒドロラーゼとザルコシン
オキシダーゼを固定化した酵素膜を感応面に装着
した第2の酵素電極とを設置し、第1の酵素電極
の出力よりクレアチンの濃度を求め、第2の酵素
電極と第1の酵素電極の出力差よりクレアチニン
の濃度を求めるごとく構成したことにある。
第1図は本発明の一実施例である分析装置の系
統図である。試料溶液11を収容した測定容器1
9には第1酵素電極1と第2酵素電極3とが垂直
に挿入されており、第1酵素電極1の下端は次の
物質を含む感応膜で封止されている。
すなわち、この第1の感応膜はクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ(E.C.3.5.3.3.以後CIと記す)と
ザルコシンオキシダーゼ(E.C.1.5.3.1.以後SOD
と記す)を含む感応膜で、以後CI―SOD膜2と
記す。
また、第2酵素電極3の下端は次の物質を含む
感応膜で封止されている。
すなわち、この第2の感応膜は上記CIとSOD
にクレアチニンアミドヒドロラーゼ(E.C.3.5.2.n.
以後CNと記す)を追加した感応膜で、以後CN
―CI―SOD膜4と記す。
なお、これらの感応膜は次のような酵素接触反
応を行う。
クレアチニン+H2OCN ――→ クレアチン ……(1) クレアチン+H2OCI ――→ 尿素+ザルコシン ……(2) ザルコシン+O2+H2OSOD ―――→ ホルムアルデヒド +グリシン+H2O2 ………(3) すなわち、クリアチン(2),(3)式の反応を利用し
て(3)式のO2を検出することによつて求める。こ
の場合は下地電極として酵素電極を用いてO2
検出しているが、過酸化水素電極を下地電極とし
て用いて(3)式のH2O2を検出することも行われる。
また、クレアチニンの分析は(1)〜(3)式により
CN,CI,SOD酵素を利用し、クレアチンと同じ
検出法で分析することができる。なお、検出器と
しては上記のごとく下地電極として酵素電極又は
過酸化水素電極を用いることが感応膜との組合わ
せ上適当で、第1酵素電極1、第2酵素電極3は
いずれかの電極を内蔵している。
このように構成された第1酵素電極1の出力は
第1増幅器15に送られて増幅され演算器17に
入力される。同様に第2酵素電極3の出力は第2
増幅器16に送られて増幅され演算器17に入
る。この演算器17では所定の演算を行つてクレ
アチンおよびクレアチニンの分析値を同時に表示
する。上記は測定系であるが、この分析操作を円
滑に行うためには次のような操作系が用いられて
いる。即ち、感応膜であるCI―SOD膜2、CN―
CI―SOD膜4に新鮮な試料溶液11を常に接触
させるためのスターラー10を用い、その撹拌子
9を測定容器19中に設置している。また、血
清・尿等の試料5と緩衝溶液6の吸引管を分注器
7に接続し、分注器7の吐出ノズル8は測定容器
19内に開口させている。一方、測定終了した排
液14は測定容器19の試料溶液11内に先端を
挿入した吸引ノズル12よりシツパ13を作動さ
れることによつて排液容器内に排出される。
この分析装置による分析法の概略を次に説明す
る。試料5とその緩衝溶液6は分注器7によつて
測定容器19中に送られ、スターラー10を作動
させて撹拌子9を回転させることによつて常に新
鮮な液をCI―SOD膜2やCN―CI―SOD膜4に接
触させる。この時試料中のクレアチニンは酵素
CIおよびSODの接触作用で分解され、(3)式によ
つて感応膜中の酵素濃度は減少し、過酸化水素が
生成する。したがつて、指示電極として酸素電極
を用いる場合は、第1酵素電極はクレアチン濃度
に関係する負の信号が得られ、また、過酸化水素
電極を用いればクレアチン濃度に関する正の信号
が得られるので、これらの内いずれかの出力信号
を増幅器16に導いて増幅した後、演算器17で
濃度換算し、表示器18にクレアチン濃度として
表示する。
一方、CN―CI―SOD膜4を装着した第2酵素
電極3では(1)〜(3)式によりクレアチニンが分解さ
れるが、同時にクレアチンも(2),(3)式によつて分
解される。したがつて、第2酵素電極3ではクレ
アチンとクレアチニンの合量に関する信号が得ら
れるので、この出力信号を増幅した後演算器17
にてはこの信号と第1酵素電極1の信号との差を
クレアニチン濃度と定めて表示する。
第2図は第1図の分析装置による検量線図で、
横軸はクレアチン又はクレアチニンの濃度を
mg/dlで示し、縦軸にはそれらの成分のピーク
高さを示している。この場合の試料を希釈する緩
衝溶液にはリン酸緩衝溶液PH7.5を用い、固定化
酵素膜は第6図Bに示している2層製造のものを
採用し、これを過酸化水素電極に装着して使用し
た。
なお、この検量線を作成するに当つて予めザル
コシンの溶液を緩衝溶液の流れに注入し、第1酵
素電極1と第2酵素電極3の出力感度の比較を行
い、クレアチニン濃度を分析する場合には第1酵
素電極の出力を校正した後で差を求めた。第2図
に示すごとくクレアチンはクレアチニンよりも高
感度で検出されるが、共に良好な比例性を示して
いる。
本実施例の分析装置は、測定容器に収容された
試料溶液中にCI―SOD膜を取付けた第1酵素電
極とCN―CI―SOD膜を取付けた第2酵素電極を
浸漬して試料溶液を撹拌し、各酵素電極の出力信
号を増幅・演算処理して表示することにより、試
料中のクレアチン、クレアチニンの濃度を同時に
高精度に分析することができるという効果が得ら
れる。
第1図の装置はデイスクリート方式の分析装置
であり微小量の試料でも測定可能であるが、試料
5を緩衝溶液6で希釈しているので低濃度試料の
場合はS/N比が低下することがあり、十分な分
析精度は得られない。これを改善したのが次の実
施例である。
第3図は本発明の他の実施例である分析装置の
系統図であり、第1図と同じ部分には同一符号を
付してある。この場合はフロー方式を採用してお
り、キヤリアー溶液20を送液ポンプ21で吸引
圧送して第1酵素電極1を収容する第1フローセ
ル23aと、第2酵素電極3を収容する第2フロ
ーセル23bとで構成されている。なお、キヤリ
アー溶液20は第1図の場合の緩衝溶液を使用す
ることができる。
試料5は試料注入部22に注入されてキヤリア
ー溶液20の流れに乗り、まず第1フローセル2
3aに運ばれる。第1フローセル23aにはCI
―SOD膜2が装着された第1酵素電極1が設置
されており、CI―SOD膜2は試料流に接触する。
したがつて、第1酵素電極1ではクレアチン濃度
に関する信号が得られる。
この試料5を含むキヤリアー溶液20の層は第
2のフローセル23bに導入される。この第2フ
ローセル23bにはCN―CI―SOD膜4を装着し
た第2酵素電極3が設置されており、クレアチン
とクレアチニンの合量に関係する信号が得られ
る。第1酵素電極1と第2酵素電極3の出力信号
は夫々増幅され、演算器17で第1酵素電極1の
出力はクレアチン濃度に、また、第1酵素電極と
第2酵素電極の出力信号の差がクレアチニン濃度
に換算され、夫々の値が表示器18に表示され
る。
第4図は第3図の分析装置の記録線図であり、
第1酵素電極1の出力をA、第2酵素電極3の出
力をBとすると、この2つのピークは完全に分離
しており、均斉のとれたピーク形状を示してい
る。また、濃度の異なる数種の試料を分析した時
は、第2図と同様にそのピーク高さは良好な直線
性が得られることを確認した。
本実施例の分析装置は、一対のフローセルを連
通させ、第1のフローセルにはCI―SOD膜を取
付けた第1酵素電極を設置し、第2のフローセル
にはCN―CI―SOD膜を取付けた第2酵素電極を
設置して試料成分を測定することによつて、極め
て少量の試料でも迅速正確に分析できるという効
果が得られる。
第5図は第3図の変形例であるフローセルの説
明図で、この場合は第1酵素電極1と第2酵素電
極3を1個のフローセル24に並設してある。こ
のようにすればフローセル24の設置場所が節約
できると共に流路25が短縮されるので、更に短
時間で分析できるという利点が得られる。
上記のCI―SOD膜2やCN―CI―SOD膜4等の
酵素膜を作成する時は、例えば多孔性膜内に各酵
素を注入して膜母材と架橋結合させる方法、酵素
溶液を2枚の多孔性膜内に封し込める方法、多孔
性膜表面にゲル状の酵素の塗布する方法等各種の
酵素膜製法が適用である。また、上記のごとく複
数種の酵素を一枚の膜内に固定化する場合は、次
のような方法も用いられる。
第6図は複数種の酵素を一枚の酵素膜内に固定
化した状態の説明図で、第6図AはCN,CI,
SOD等を混合して膜母材に一様に含ませて固定
化したもの、第6図Bは2層よりなる酵素膜で、
例えば試料に接する側にはCNとCIの酵素を混合
して固定化した層27を配置し、下地電極に接す
る側にはSODを固定化した層26を配置するこ
とによつて好結果が得られる。第6図cは三層構
造よりなる酵素膜で、試料に接する側にはCNを
含む層29を、中間層にはCIを含む層28を、
下地電極側にはSODを固定化した層26を配置
したものである。これはCN―CI―SOD膜4の場
合であるが、CI―SOD膜2の時は、第4図A、
第4図Bの方法が採用できるし、第4図Bの場合
は試料側にはCI、電極側にSODを固定化する。
本発明のクレアチンとクレアチニンの分析装置
は、CIとSODを固定化した酵素膜を感応面に装
着した第1酵素電極と、CIとSODとCNを固定化
した酵素膜を感応面に装着した第2酵素電極とが
試料液と接触する際に生じる出力信号を処理する
ことにより、迅速正確にその目的を達することが
できるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の一実施例である分析装置の系
統図、第2図は第1図の分析装置による検量線
図、第3図は本発明の他の実施例である分析装置
の系統図、第4図は第3図の分析装置の記録線
図、第5図は第3図の変形例であるフローセルの
説明図、第6図は複数種の酵素を一枚の酵素膜内
に固定した状態の説明図である。 1……第1酵素電極、2……CI―SOD膜、3
……第2酵素電極、4……CN―CI―SOD膜、5
……試料、6……緩衝溶液、7……分注器、8…
…吐出ノズル、9……撹拌子、10……スターラ
ー、11……試料溶液、12……吸引ノズル、1
3……シツパ、14……排液、15,16……増
幅器、17……演算器、18……表示器、19…
…測定容器、20……キヤリアー溶液、21……
送液ポンプ、22……試料注入部、23,24…
…フローセル、25……流路。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 酵素電極を用いたクレアチンとクレアチニン
    の分析装置において、クレアチンアミジノヒドロ
    ラーゼとザルコシンオキシダーゼを固定化した酵
    素膜を感応面に備えた第1の酵素電極と、クレア
    チニンアミドヒドロラーゼとクレアチンアミジノ
    ヒドロラーゼとザルコシンオキシダーゼを固定化
    した酵素膜を感応面に備えた第2の酵素電極とを
    設置し、上記第1および第2の酵素電極の下地電
    極には酵素電極又は過酸化水素電極を設け、上記
    第1の酵素電極の出力よりクレアチンの濃度を求
    め、上記第2の酵素電極と上記第1の酵素電極の
    出力差よりクレアチニンの濃度を求めるごとく構
    成したことを特徴とするクレアチンとクレアチニ
    ンの分析装置。 2 上記第1の酵素電極と第2の酵素電極は、そ
    の酵素膜が試料液に接し得るように測定容器内に
    挿入されていることを特徴とする特許請求の範囲
    第1項記載のクレアチンとクレアチニンの分析装
    置。 3 上記第1の酵素電極と第2の酵素電極は、フ
    ローセルの流路にその酵素膜が露出するように設
    置されていることを特徴とする特許請求の範囲第
    1項記載のクレアチンとクレアチニンの分析装
    置。
JP56158780A 1981-10-07 1981-10-07 クレアチンとクレアチニンの分析装置 Granted JPS5861459A (ja)

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JP56158780A JPS5861459A (ja) 1981-10-07 1981-10-07 クレアチンとクレアチニンの分析装置

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JPS5861459A JPS5861459A (ja) 1983-04-12
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Families Citing this family (8)

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