DE4323277A1 - Quantitativer Analysator - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gerät zur Durchführung quantitativer Analysen unter Verwendung einer enzymatischen Reaktion, das auf dem Gebiet der Medizin, Pharmazie, chemi­ schen Analyse und Lebensmittelindustrie eingesetzt wird.

Herkömmlicherweise wird als Gerät zur Durchführung quanti­ tativer Analysen mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion im allgemeinen ein Enzymstrom-Injektionsanalysator benutzt. Dieses System beinhaltet, wie in Fig. 5 gezeigt wird, eine Pumpe 7 zum Erzeugen eines Stroms einer Trägersubstanz 9, eine Probenführung 8 zum Einführen einer bestimmten Proben­ menge in die strömende Trägersubstanz, einen Abschnitt für die enzymatische Reaktion 3, in die ein Füllstoff mit dem verfestigten Enzym eingefüllt wird, um eine chemische Reak­ tion mit einer Zielsubstanz zu bewirken, deren Gehalt in der Probe gemessen werden soll, und einen Nachweisabschnitt 5 zum Nachweis einer Menge des Produkts der enzymatischen Reaktion bzw. einer Veränderung der Menge der Substanz innerhalb des Trägers, die von der enzymatischen Reaktion verursacht wird. Für den Nachweisabschnitt wird ein Absorptionsdetektor zur quantitativen Feststellung durch Absorption einer Substanz, ein elektrochemischer Detektor, der auf elektrochemischem Weg durch Elektroden eine Substanz oxydiert und reduziert, um vom Oxidations-Reduktionstrom, der zu diesem Zeitpunkt fließt, eine mengenmäßige Feststellung treffen zu können, und der­ gleichen benutzt.

Ferner wurde als Detektor für den Enzymfluß-Injektionsanaly­ sator ein chemischer Lumineszenzdetektor, wie er in Fig. 6 gezeigt wird und der mit Hilfe einer chemischen Lumineszenz­ reaktion eine mengenmäßige Bestimmung ermöglicht, auf den Markt gebracht. Das System des Enzymfluß-Injektionsanaly­ sators weist hinter dem Abschnitt 3 der enzymatischen Re­ aktion eine Pumpe 7 zum Einleiten eines chemisch-lumines­ zierendes Reagens 2, einen Mischer zum Vermischen des Pro­ dukts der enzymatischen Reaktion mit dem chemischen Lumines­ zenzreagens, eine spiralförmige Flußzelle 20 zum Erfassen der chemischen Lumineszenz, und einen Photomultiplikator 21 zum Umwandeln der chemischen Lumineszenzlichtstärke in elektri­ sche Signale auf.

In solchen Enzymfluß-Injektionsanalysatoren sind die einzel­ nen Teile gesondert angeordnet und mit Schläuchen bzw. Draht­ leitungen im Einsatz auf geeignete Weise verbunden.

Auf dem Stand der Technik sind jedoch bei den Enzymfluß- Injektionsanalysatoren, weil ja jede Einheit als gesonderter Teil angeordnet wird und die Teile mit Rohrleitungen und dergleichen verbunden sind, insbesondere die enzymatische Reaktionskolonne und der Detektor getrennte Teile, und die Enzymkolonne und der Detektor werden maschinell erzeugt und daher ist ihre Miniaturisierung nur eingeschränkt möglich, ferner diffundiert eine bei der enzymatischen Reaktion ge­ bildete Substanz beim Durchfluß durch die Detektorsektion, es ist daher schwierig, eine sehr kleine Probenmenge quantitativ zu bestimmen und einen niedrigen Konzentrationsbereich zu messen.

Ferner kommt es zu Problemen, weil bei einem Absorptions­ detektor eine Lichtquelle erforderlich ist, es ist daher schwierig, das Gerät zu verkleinern weil der elektrochemische Detektor anfällig für Interferenzen durch die elektroden­ aktiven Substanzen ist, die in der Probe enthalten sind. Ferner muß, weil das Gesamtvolumen des Geräts verhältnismäßig groß ist, der Durchsatz des Trägers während der Messung mindestens 1 ml/min. betragen und der Verbrauch an Reagens steigt dementsprechend, wenn eine kontinuierliche Messung durchgeführt wird.

Das Verfahren auf dem Stand der Technik, das mit dem Erfassen der chemischen Lumineszenz arbeitet, hat ähnliche Probleme, nämlich, daß die in der enzymatischen Reaktionskolonne er­ zeugte Substanz beim Strömen durch den Mischer diffundiert wird, daß die im Mischer generierte chemische Lumineszenz beim Fließen zur spiralförmigen Flußzelle, die der Nach­ weisabschnitt ist, abnimmt, und deshalb ist es schwierig, sehr kleine Probenmengen quantitativ zu bestimmen und einen sehr niedrigen Konzentrationsbereich zu messen, und ferner wird der Verbrauch an Trägersubstanz und chemischem Lumineszenzreagens sehr hoch.

Hinzu kommt noch, daß gewisse Probleme auftreten, weil ja maschinelle Bearbeitung bei der Herstellung der enzymatischen Reaktionskolonne, des Mischers und der Spiralflußzelle ein­ gesetzt wird, dadurch die Miniaturisierung an eine gewisse Grenze stößt und sich die Kosten erhöhen, weil ja auch eine Präzisionsbearbeitung vorausgesetzt ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen quantita­ tiven Analysator bereit zustellen, der diese Probleme des Standes der Technik löst durch Integrieren des enzymatischen Reaktionsabschnittes mit dem Mischabschnitt und dem Nach­ weisabschnitt auf einer einzigen Unterlage.

Zur Lösung dieser obigen Aufgabe benutzt der quantitative Analysator der vorliegenden Erfindung die chemische Lumines­ zenzreaktion als Nachweismittel. Somit läßt sich das Gerät, weil ja zum Nachweis keine Lichtquelle nötig ist, auf ein­ fache Weise verkleinern und der Einfluß von Interferenzsub­ stanzen innerhalb der Probe wird reduziert.

Ferner werden gleichzeitig der enzymatische Reaktions­ abschnitt, der Mischabschnitt und der Nachweisabschnitt auf der gleichen Unterlage zusammengefaßt, so daß sich der Abstand zwischen dem enzymatischen Reaktionsabschnitt und dem Nachweisabschnitt minimiert und die Diffusion der Substanz und die Schwächung der Lumineszenz verringert wird. Gleich­ zeitig wird auch das Gesamtvolumen des Geräts reduziert, um den Verbrauch an Trägersubstanz und Lumineszenzreagens ein­ zuschränken. Ferner wird, weil bei der Herstellung aniso­ tropes Ätzen der Siliziumunterlage anstatt der maschinellen Bearbeitung eingesetzt wird, die Fertigung in großen Stück­ zahlen unter entsprechender Senkung der Herstellungskosten möglich.

Im quantitativen Analysator der obigen Beschreibung wird eine zu messende Substanz, die in einer Probe als Grundsubstanz enthalten ist, durch eine enzymatische Reaktion in einem enzymatischen Reaktionsabschnitt verbraucht, um eine andere Substanz zu bilden. Dann wird in dem Mischabschnitt das Pro­ dukt dieser enzymatischen Reaktion mit einen chemisch lumi­ neszierenden Reagens vermischt, um ein Licht einer bestimmten Wellenlänge zu generieren. Dann wird beim Strömen der Sub­ stanz durch den Nachweisabschnitt die Stärke des Lichts durch eine Photodiode oder einen Photomultiplikator in eine ent­ sprechende Stärke eines elektrischen Signals (Stromwert, Spannungswert) umgewandelt. Die Stärke der elektrischen Signale entspricht der Stärke der chemischen Lumineszenz und die Stärke der chemischen Lumineszenz hängt ab von der Menge des bei der enzymatischen Reaktion entstehenden Produkts.

Natürlich hängt das Produkt der enzymatischen Reaktion von der Menge des Grundmaterials (der zu messenden Zielsubstanz) ab, die ursprünglich in der Probe enthalten war. Schließlich reflektiert die Stärke der gemessenen elektrischen Signale die Konzentration der zu messenden Zielsubstanz.

Ferner ist es möglich, aufgrund der Tatsache, daß der enzymatische Reaktionsabschnitt, der Mischabschnitt und der Nachweisabschnitt auf der gleichen Grundfläche aufgebaut sind, um die Abstände zwischen dem enzymatischen Reaktions­ abschnitt und dem Nachweisabschnitt zu minimieren, die Diffusion der Substanz und die Ausdünnung der Lumineszenz weitgehend gering zu halten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung eines erfindungs­ gemäßen quantitativen Analysators;

Fig. 2A ist eine Grundrißansicht, die den konkreten Aufbau des erfindungsgemäßen quantitativen Analysators zeigt;

Fig. 2B ist eine Querschnittsansicht, die die konkrete Struktur der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 3 ist ein Graph, der eine analytische Glucosekurve im erfindungsgemäßen quantitativen Analysator zeigt;

Fig. 4 ist ein Graph, der eine analytische Milchsäurekurve im erfindungsgemäßen quantitativen Analysator zeigt;

Fig. 5 ist eine schematische Zeichnung eines herkömmlichen Enzymfluß-Injektionsanalysators; und

Fig. 6 ist eine schematische Darstellung, die die Struktur eines herkömmlichen chemischen Lumineszenzdetektors zeigt.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Anhand der Zeichnungen sollen jetzt bevorzugte Ausführungs­ formen der vorliegenden Erfindung erläutert werden.

Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung eines erfindungs­ gemäßen quantitativen Analysators.

In der Figur wird eine Probe 1 durch eine Probenführung 8 gemessen und in einer bestimmten Menge in eine Trägersubstanz 9 eingespeist und durch eine Pumpe 7 in den enzymatischen Reaktionsabschnitt 3 gebracht, der in einer auf Siliziumglas haftenden Unterlage 30 angeordnet ist. Im enzymatischen Reaktionsabschnitt 3 wird eine spezifische Substanz, die in der Probe enthalten ist, durch eine enzymatische Reaktion verbraucht, um eine andere Substanz zu erzeugen. Das Produkt dieser enzymatischen Reaktion wird in einen Mischabschnitt 4 gebracht, wo es mit einem chemisch-lumineszierenden Reagens 2 vermischt wird, das durch eine andere Pumpe 7 eingespeist wird, um eine chemisch lumineszierende Reaktion zu ver­ ursachen. Dann wird das Lösungsgemisch zum Nachweisabschnitt 5 gebracht. Während es durch den Nachweisabschnitt 5 fließt, wird der chemische Lumineszenzanteil durch eine Photodiode 6 auf dem Nachweisabschnitt 5 in elektrische Signale umge­ wandelt. Weil die Stärke der elektrischen Signale die Konzentration der zu messenden Zielsubstanz widerspiegelt, wird es möglich, die Konzentration der Zielsubstanz quanti­ tativ festzustellen.

Fig. 2A ist eine Grundrißansicht, die die konkrete Struktur des erfindungsgemäßen quantitativen Analysators zeigt. Fig. 2B ist eine Querschnittsansicht der vorliegenden Erfindung gemäß Fig. 2A. Der quantitative Analysator der vorliegenden Erfindung hat eine Struktur, in der ein Siliziumsubstrat 18 und ein Glassubstrat 17 verbunden sind. Auf dem Silizium­ substrat 18 sind eine Trägersubstanz-Einführungsöffnung 10, eine Einführungsöffnung 11 für ein chemisches Lumineszenz­ reagens, ein enzymatischer Reaktionsabschnitt 12, ein Misch­ abschnitt 13 und eine Flußzelle 14 vorgesehen. Der enzymati­ sche Reaktionsabschnitt 12 ist mit einem Enzym-Festsubstanz- Füllstoff 15, auf dessen Oberfläche Enzymfeststoff angelagert ist, gefüllt. Ferner ist direkt auf dem Flußzellenabschnitt eine Photodiode 16 zur Umwandlung der chemischen Lumineszenz in elektrische Signale vorgesehen. Wenn eine Messung aus­ geführt werden soll, wird die eine Probe enthaltende Träger­ substanz von der (in den Fig. 2A und 2B nicht dargestellten) Pumpe über die Trägersubstanz-Einführungsöffnung 10 ein­ gespeist. Das Produkt der enzymatischen Reaktion, dessen Menge von der Menge der in der Probe zu messenden Ziel­ substanz abhängt, wird von der enzymatischen Reaktion im enzymatischen Reaktionsabschnitt 12 produziert und mit dem chemischen Lumineszenzreagens vermischt, das über die chemische Lumineszenzreagens-Einführungsöffnung 11 in den Mischabschnitt 13 eingespeist wird.

Die im Mischabschnitt 13 erzeugte chemische Lumineszenz wird von der Photodiode 16 gemessen während das vermischte Produkt durch den Flußzellenabschnitt 14 fließt. Zwar wird hier zum Messen der Lumineszenzstärke eine Photodiode eingesetzt, jedoch kann die Messung auch durch Einsatz eines Photomulti­ plikators anstatt der Photodiode ausgeführt werden.

(Meßbeispiel 1)

In diesem Beispiel wird die quantitative Bestimmung der in einer Probe enthaltenen Glucose durch den erfindungsgemäßen quantitativen Analysator mit eingefülltem Füllstoff mit ver­ festigter Glucoseoxidase im enzymatischen Reaktionsabschnitt erklärt.

In Fig. 1 wurden Glasperlen mit 100 um Durchmesser, an deren Oberfläche Glucoseoxidase durch Schiffsche Bindung unter Ver­ wendung von 3-Aminopropylethoxysilan und Glutaraldehyd ange­ lagert wurde, in den enzymatischen Reaktionsabschnitt 3 ein­ gefüllt. Die Trägersubstanz 9, die aus einer Phosphorsäure­ pufferlösung (pH 7) bestand, wurde durch Pumpe 7 mit 20 µl/min. zugegeben. Das chemische Lumineszenzreagens 2, be­ stehend aus einer Lösung von 0,4 mmol/l Luminol und 6,7 mmol/l Natriumferricyanid, wurde durch eine andere Pumpe 7 mit 60 µl/min. eingespeist. 0,2 ml Probe wurde durch die Probenführung 8 gemessen und in die Trägersubstanz ein­ geführt.

Fig. 3 zeigt eine mit dem erfindungsgemäßen quantitativen Analysator gewonnene analytische Kurve, bei der die Werte aus verschiedenen Glucosekonzentrationen in einer Kurve aufge­ tragen wurden. Wie in Fig. 3 dargestellt, wurde zwischen der Glucosekonzentration und dem Spitzenwert der gemessenen Lumineszenzlichtstärke im Konzentrationsbereich von 100 mg/dl bis 300 mg/dl ein lineares Verhältnis festgestellt.

Bei einer Messung des Glucosegehalts im Blutserum auf der Grundlage dieses Ergebnisses, stellten sich bei Vergleichs­ messungen mit einem handelsüblichen Meßgerät für klinische Glucosemessungen gut verträgliche Werte ein. Ferner dauerte eine Messung etwa 1 Minute und die eingesetzte Menge Träger­ substanz für diese Messung war etwa 20 µl und für das chemische Lumineszenzreagens etwa 60 µl.

(Meßbeispiel 2)

In diesem Beispiel wird die quantitative Bestimmung von in einer Probe enthaltener Milchsäure durch den erfindungs­ gemäßen quantitativen Analysator und mit Einfüllen eines Füllstoffs, auf dem Milchsäureoxidase in verfestigter Form angelagert war, in den enzymatische Reaktionsabschnitt erklärt.

In Fig. 1 wurden Glasperlen mit 100 um Durchmesser, an deren Oberfläche Milchsäureoxidase durch Schiffsche Bindung unter Verwendung von 3-Aminopropylethoxysilan und Glutaraldehyd angelagert war, in den enzymatischen Reaktionsabschnitt 3 eingefüllt. Die Trägersubstanz 9, die aus einer Phosphor­ säurepufferlösung (pH 7) bestand, wurde durch Pumpe 7 mit 20 µl/min. zugegeben. Das chemische Lumineszenzreagens 2, be­ stehend aus einer Lösung von 0,47 mmol/l Luminol und 6,7 mmol/l Natriumferricyanid, wurde durch eine andere Pumpe 7 mit 60 µl/min. eingespeist. 0,2 ml Probe wurde durch die Probenführung 8 gemessen und in die Trägersubstanz eingeführt.

Fig. 4 zeigt eine mit dem erfindungsgemäßen quantitativen Analysator gewonnene analytische Kurve, bei der die Werte aus verschiedenen Milchsäurekonzentrationen in einer Kurve auf­ getragen wurden. Wie in Fig. 4 dargestellt, wurde zwischen der Milchsäurekonzentration und dem Spitzenwert der ge­ messenen Lumineszenzlichtstärke im Konzentrationsbereich von 4,5 mg/dl bis 45 mg/dl ein lineares Verhältnis festgestellt.

Bei einer Messung des Milchsäuregehalts im Blutserum auf der Grundlage dieses Ergebnisses, stellten sich bei Vergleichs­ messungen mit einem handelsüblichen Meßgerät für klinische Glucosemessungen gut verträgliche Werte ein. Ferner dauerte eine Messung etwa 1 Minute und die eingesetzte Menge Träger­ substanz für diese Messung war etwa 20 µl und für das chemische Lumineszenzreagens etwa 60 µl.

Beim erfindungsgemäßen quantitativen Analysator werden der enzymatische Reaktionsabschnitt, der Mischabschnitt und der Bestimmungsabschnitt durch Integration und Ausätzen her­ gestellt, so daß das tote Volumen, das zur Verbindung der einzelnen Abschnitte erforderlich ist, im Vergleich zu quantitativen Analysatoren herkömmlicher Bauart weitgehend reduziert werden kann, und somit auch das Gesamtvolumen des Geräts verringert werden kann. Damit ist es auch möglich, daß sehr kleine Probenmengen nicht ins tote Volumen diffundieren und daß der Verbrauch an Reagentien auf einige 10 µl je Messung verringert wird. Ferner läßt sich das Gerät noch weiter verkleinern, weil einem Absorbanzdetektor auch keine Lichtquelle erforderlich ist. Weil dieses Gerät ferner durch Ätzen in Massenfertigung hergestellt werden kann, lassen sich auch die Herstellungskosten senken.

Claims (4)

1. Ein quantitativer Analysator zur quantitativen Bestim­ mung einer in einer Lösung enthaltenen Substanz mittels der Stärke der chemischen Lumineszenz unter Verwendung einer enzymatischen Reaktion und einer chemischen Lumineszenz­ reaktion, wobei dieser quantitative Analysator enthält:
einen Abschnitt für die enzymatische Reaktion, in dem die enzymatische Reaktion durchgeführt wird;
einen Mischabschnitt zum Vermischen eines Produkts der enzymatischen Reaktion und eines chemischen Lumineszenz- Reagens zum Hervorrufen der chemischen Lumineszenzreaktion; und
einen Bestimmungsabschnitt zum Bestimmen der chemischen Lumineszenzreaktion;
wobei der Abschnitt für die enzymatische Reaktion, der Mischabschnitt und der Bestimmungsabschnitt auf einer gemein­ samen Grundplatte und integral mit derselben ausgeführt sind.

2. Ein quantitativer Analysator gemäß Anspruch 1, in dem diese Grundplatte eine Platte aus einem Silizium-Einkristall und eine an diesem Silizium-Einkristall haftende Glasplatte umfaßt.

3. Ein quantitativer Analysator gemäß Anspruch 1, in dem der Abschnitt für die enzymatische Reaktion und der Misch­ abschnitt mittels anisotroper Ätzung der Silizium-Ein­ kristallunterlage erzeugt werden.

4. Ein quantitativer Analysator gemäß Anspruch 1, in dem der Bestimmungsabschnitt eine Flußzelle enthält, die mittels anisotropem Ätzen auf der Silizium-Einkristallunterlage hergestellt wird und ein Photodetektor auf dieser Flußzelle vorgesehen ist.