DE602004000077T2

DE602004000077T2 - Nanopartikeln für optische Sensoren

Info

Publication number: DE602004000077T2
Application number: DE602004000077T
Authority: DE
Inventors: Valerie Desprez; Norbert Oranth; Jürgen Spinke; James Kenneth Tusa
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2024-07-09
Also published as: ATE303451T1; JP2005151972A; DE602004000077D1; US20050019849A1; US7427491B2; CA2473342A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polymerschicht für einen Sensor, wobei in der Polymerschicht Nanopartikel eingebettet sind, welche der Polymerschicht erkennende Eigenschaften sowie Transducereigenschaften verleihen, einen Sensor, der eine solche Schicht umfasst und die Verwendung des Sensors für den Nachweis oder/und die Quantifizierung eines Zielanalyten.
Verschiedene Sensoren sind bisher für die qualitative und quantitative Bestimmung von Substanzen von Interesse beschrieben worden. Insbesondere auf den Gebieten der Umwelttechnik und Nahrungsmitteltechnologie, Medizin und Biotechnologie ist die Entwicklung von genauen analytischen Mitteln und Verfahren von großem Interesse. Zum Beispiel werden Sensoren auf Grundlage von Enzymen mit elektrochemischer oder optischer Transduktion vielfach verwendet, um Analyten im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten zu bestimmen.
Im Allgemeinen bestehen klassische Sensoren aus einer mehrschichtigen Struktur. Zum Beispiel beschreibt U.S. Patent Nr. 6,107,083 einen optischen Sensor auf Grundlage von Enzymen mit einer mehrschichtigen Struktur, welcher in der Schichtabfolge umfasst: (a) eine sauerstoffempfindliche Schicht, die einen lumineszierenden Farbstoff in einer lichtdurchlässigen, sauerstoffdurchlässigen Matrix enthält, (b) eine enzymatische Schicht, die ein oxidatives Enzym in einer hydratisierbaren und sauerstoffdurchlässigen Matrix enthält, und (c) eine schnell hydratisierende, gasdurchlässige Deckschicht, die über der Enzymschicht angeordnet ist.
Die Hauptnachteile solcher Sensoren mit einer mehrschichtigen Struktur stellen der komplizierte Aufbau der Sensoren dar, der Probleme mit der Überzugsverträglichkeit der mehrfachen Schichten mit sich bringt, die begrenzte Dichte der funktionalen Elemente, die auf einer ebenen Oberfläche verfügbar ist, und die Schwierigkeit bei der genauen Steuerung der Dicke jeder Schicht, um reproduzierbare Diffusionsverfahren beizubehalten. Diese Verfahren werden von unbefriedigenden Sensorantworten und verminderten Signalausbeuten begleitet.
In U.S. Patent Nr. 6,238,930 ist ein unterschiedlicher Ansatz für eine Schichtstruktur für die Bestimmung einer Substanz durchgeführt worden durch Bildung eines mizellaren Erkennungssystems aus zwei nicht mischbaren Phasen, einer oberflächenaktiven Substanz und einem erkennenden Bestandteil sowie durch Einbringen dieses Systems in eine Schicht. Die Substanz von Interesse wird anschließend durch Wechselwirkung mit dem erkennenden Bestandteil und einem Transduktionsschritt, welche beide in der Schicht erfolgen, nachgewiesen. Die Konstruktion der Schichtstruktur gemäß U.S. 6,238,930 ist kompliziert und die Flexibilität und der Anwendungsbereich solcher Systeme ist aufgrund des Erfordernisses der Bildung geeigneter Mizellen begrenzt. Verglichen mit den klassischen Sensoren mit einer mehrschichtigen Struktur konnte keine wesentliche Vereinfachung erreicht werden.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Sensor mit einer vereinfachten und reproduzierbaren Sensorausgestaltung bereitzustellen, welche die genaue Bestimmung eines Analyten von Interesse zulässt.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird durch einen Sensor gelöst, der eine Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften umfasst, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer bereitgestellt werden, die in einem oder mehreren, in die Polymerschicht eingebetteten Nanopartikeln enthalten sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Anzahl an Schichten in dem Sensor vermindert, was zu einer vereinfachten Sensorherstellung führt, wobei der erkennende Bestandteil und der Transducer in einer einzelnen Schicht bereitgestellt werden. Darüber hinaus können durch Kombination des erkennenden Bestandteils und des Transducers in unmittelbarer Umgebung in einer einzigen Schicht schnelle Sensorantworten erreicht werden und die Wirksamkeit des Sensors ist weniger von der Schichtdicke abhängig, was zu einer besseren Reproduzierbarkeit der Beschichtung führt. Insbesondere kann durch Bereitstellung von Nanopartikeln, welche der Schicht erkennende und Transducer-Eigenschaften verleihen, das Sensorsystem in geeigneter Weise für verschiedene Sensoranwendungen durch Variieren der Bestandteile und Ausgestaltung der Nanopartikel eingestellt werden. Zum Beispiel kann die Größe und Dichte sowie Anordnung der Bestandteile variiert werden. Auf diese Weise ist es zum Beispiel möglich, die Gesamtmenge des erkennenden Bestandteils oder des Transducers in der Polymerschicht einzustellen. Zusätzlich ermöglicht die Verwendung von funktionalisierten Nanopartikeln in der Polymerschicht gemäß der Erfindung die Einstellung der Empfindlichkeit und der Aussteuerungsbereich durch Veränderung der Dichte der Nanopartikel in der Polymerschicht. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Sensors liegt darin, dass er aufgrund leichter Regeneration der Polymerschicht für die Durchführung vielfältiger Messungen geeignet ist.
Der verbesserte erfindungsgemäße Sensor ist zur Anwendung auf den Gebieten der Pharmazie, Medizin, Biotechnologie, Umwelttechnik und Nahrungsmitteltechnologie und Trink- und Abwasserüberwachung geeignet. Der erfindungsgemäße Sensor wird daher mit der Probe zusammengebracht, welche die nachzuweisende Substanz enthält, was zu einer Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem erkennenden Bestandteil in der Polymerschicht führt. Die Wechselwirkung zwischen dem erkennenden Bestandteil und dem Analyten führt zu einem Produkt oder einer Veränderung der Bedingungen in der Polymerschicht. Im Folgenden wird diese Wechselwirkung als Erkennungsschritt bezeichnet. In unmittelbarem Kontakt zu dem erkennenden Bestandteil wird der Transducer bereitgestellt, welcher aus einem Bestandteil besteht, welcher gegenüber einem Produkt oder einer Veränderung der Bedingungen, die sich aus dem Erkennungsschritt ergeben, empfindlich ist. "Empfindlichkeit" gegenüber dem Produkt oder der Veränderung der Bedingungen bedeutet, dass die Transducer-Eigenschaften durch den Einfluss des Produktes oder der unterschiedlichen Umgebungsbedingungen verändert werden, wobei die Veränderung der Eigenschaften des Transducers nachgewiesen werden kann.
Besonders geeignet für den Nachweis einer oxidierbaren Substanz sind Sensoren auf Grundlage der Reaktion eines oxidativen Enzyms. Bei der enzymatischen Oxidation wird Sauerstoff in der Umgebung des Enzyms verbraucht, was zu einer Veränderung der Sauerstoffkonzentration in der Polymerschicht führt, welche direkt mit der Menge des Analyten in der Probe in Verbindung steht. Diese Veränderung der Sauerstoffkonzentration kann zum Beispiel durch Verwendung eines sauerstoffempfindlichen lumineszierenden Farbstoffes sichtbar gemacht werden. Mittels eines solchen Farbstoffes kann die Menge des Analyten in der Probe durch Messung der Veränderung der Lumineszenz des Farbstoffes nachgewiesen werden. Im Allgemeinen wird die Lumineszenz durch Sauerstoff gequencht, d.h. aufgrund des Verbrauchs an Sauerstoff führt die enzymatische Umsetzung zu einer stärkeren Lumineszenz, und die Veränderung der Lumineszenzintensitität kann als eine Funktion der Menge des Analyten in der Probe nachgewiesen werden.
Die Kombination der erkennenden und Transducer-Eigenschaften in einer einzelnen Polymerschicht in dem erfindungsgemäßen Sensor wird durch Einbetten funktionalisierter Nanopartikel in die Polymerschicht durchgeführt. Es können zwei Arten von funktionalisierten Nanopartikeln verwendet werden: Partikel, die einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer umfassen, und Nanopartikel, die jeweils nur einen der zwei Bestandteile umfassen. Diese Nanopartikel können wie gewünscht kombiniert werden, müssen jedoch so ausgewählt werden, dass die Polymerschicht sowohl erkennende als auch Transducer-Eigenschaften aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind in der Polymerschicht des Sensors erste Nanopartikel, die einen erkennenden Bestandteil umfassen, und zweite Nanopartikel, die einen Transducer umfassen, eingebettet.
In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind in der Polymerschicht des Sensors Nanopartikel eingebettet, die sowohl einen erkennenden Bestandteil als auch einen Transducer umfassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der erkennende Bestandteil eine chemische oder biologische Substanz, welche in der Lage ist, mit einem Analyten in einem Erkennungsschritt selektiv zu wechselwirken. Durch diese Wechselwirkung kann der Analyt nachgewiesen oder/und quantifiziert werden. Zum Beispiel stellt der Erkennungsschritt eine Reaktion oder Kopplung zwischen dem erkennenden Bestandteil und dem Analyten dar, was zu einem nachweisbaren Verbrauch einer Substanz, der Bildung eines nachweisbaren Produktes oder zu einer nachweisbaren Veränderung der Umgebungsbedingungen führt.
Bevorzugt ist der erkennende Bestandteil ein biologisch aktiver Bestandteil oder lebende Zellen oder Bakterien. Insbesondere ist der biologisch aktive Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, synthetischen und genmanipulierten Enzymen und Antikörpern, Peptiden, Kohlenhydraten, Lectinen, Lipiden und Gemischen davon. Stärker bevorzugt ist der biologisch aktive Bestandteil ein Enzym, welches, abhängig von der nachzuweisenden Substanz, ausgewählt sein kann aus Hydrolasen, Proteasen und Oxidasen. Oxidative Enzyme sind besonders geeignet. Zum Beispiel können Analyten, welche durch Enzyme oxidierbar sind, wie zum Beispiel Glucose, Cholesterin, Lactat oder Sarcosin, durch Verwendung oxidativer Enzyme nachgewiesen werden. Das oxidative Enzym kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase, Lactatoxidase, Sarcosinoxidase und Gemischen davon.
Gemäß der Erfindung kann der erkennende Bestandteil auch aus verschiedenen chemischen Substanzen oder/und biologischen Substanzen bestehen, was zu einem kaskadenartigen Erkennungssystem führt. Dies ist besonders geeignet, wenn der Analyt von Interesse nicht direkt durch Wechselwirkung mit dem erkennenden Bestandteil zu einem nachweisbaren bzw. quantifizierbaren Signal führt. In diesem Fall reagiert oder wechselwirkt ein zweiter oder weiterer erkennender Bestandteil mit dem Produkt aus einem der vorhergehenden Erkennungsschritte, um ein geeignetes Produkt oder eine Veränderung in den Umgebungsbedingungen zu ergeben und ein Signal zu erzeugen.
Der erfindungsgemäße Transducer besteht aus einem Bestandteil, welcher gegenüber einem Bestandteil des Erkennungsschritts oder gegenüber einer Veränderung der Umgebungsbedingungen, die durch diesen Schritt verursacht wird, empfindlich ist. Es kann ein optischer oder elektrochemischer Transducer sein, d.h. die sich ergebende Messvariable ist ein optisches Signal bzw. ein elektrisches Signal.
Ein optischer Transducer besteht aus einem Bestandteil, welcher in der Lage ist, seine Spektraleigenschaften in Abhängigkeit von der Veränderung der Umgebungsbedingungen, die durch den Erkennungsschritt verursacht wird, zu verändern. Die Eigenschaften können durch Veränderung des pH-Wertes, der Anwesenheit spezifischer Ionen oder Moleküle, Oxidationsmittel oder Reduktionsmittel verändert werden. Zum Beispiel kann eine Veränderung der Strahlungsintensität, die von dem optischen Transducer emittiert wird, durch eine Verbindung beeinflusst werden, welche in dem Erkennungsschritt verbraucht oder erzeugt wird, und diese Veränderung kann mit der Anwesenheit oder/und Menge der Substanz von Interesse in Beziehung gesetzt werden. Eine solche Intensitätsveränderung kann aufgrund des Quenchens der Emission, zum Beispiel durch Sauerstoff, erfolgen. Information über die Art oder/und die Menge des Analyten kann entweder durch Nachweis einer Ab- oder Zunahme an Lumineszenzintensität – abhängig davon, ob der Erkennungsschritt Sauerstoff erzeugt oder verbraucht – erreicht werden. Im Allgemeinen führt das Dämpfen der emittierten Strahlung, d.h. die Anwesenheit von Sauerstoff, zu einer Abnahme, während eine Zunahme bei Verbrauch von Sauerstoff nachgewiesen wird. Weiterhin kann der optische Transducer ebenso aus einer Substanz bestehen, welche zunächst kein optisches Signal erzeugt, aber welche durch ein Produkt oder mittels einer Veränderung der Umgebungsbedingungen umgewandelt wird, die sich aus dem Erkennungsschritt ergibt, um ein optisches Signal zu erzeugen.
Ein elektrochemischer Transducer reagiert zum Beispiel auf eine Veränderung der Stromstärke, des Potenzials oder der Leitfähigkeit, die durch den Erkennungsschritt hervorgerufen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Transducer in dem Sensor ein optischer Transducer. Bevorzugt besteht der optische Transducer aus einem Farbstoff, welcher gegenüber einem Bestandteil empfindlich ist, welcher in dem Erkennungsschritt verbraucht oder gebildet wird. Stärker bevorzugt ist die Verwendung eines lumineszierenden Farbstoffes. Geeignete Farbstoffe zur Verwendung in dem Sensor der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium(II)-, Osmium(II)-, Iridium(III)-, Rhodium(III)- und Chrom(III)-Ionen, die mit 2,2'-Bipyridin, 1,10-Phenanthrolin, 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin, 4,7-Dimethyl-1,10-phenanthrolin, 4,7-disulfoniertem-Diphenyl-1,10-phenanthrolin, 5-Brom-1,10-phenanthrolin, 5-Chlor-1,10-phenanthrolin, 2,2'-Bi-2-thiazolin, 2,2'-Dithiazol komplexiert sind sowie aus VO²⁺, CU²⁺, Zn²⁺, Pt²⁺, Pd²⁺, die mit Porphyrin, Chlor und Phthalocyanin und Gemischen davon komplexiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der lumineszierende Farbstoff [Ru(diphenylphenantrolin)₃], Octaethyl-Pt-porphyrin, Octaethyl-Pt-Porphyrinketon, Tetrabenzo-Pt-porphyrin, Tetraphenyl-Pt-porphyrinmeso-tetraphenyl-tetrabenzo-Pt-porphyrin, Tetracyclohexenyl-Pt-porphyrin, Octaethyl-Pt-chlor, Tetraphenyl-Pt-chlor oder ein Gemisch davon.
Weitere mögliche Transducer enthalten zum Beispiel Indikatoren, wie zum Beispiel Redoxindikatoren, welche zu einem optischen Signal durch die Oxidation/Reduktion des Indikators führen, pH-Indikatoren, die auf eine Veränderung der Protonenkonzentration ansprechen, und Ionophore oder andere geeignete Chelatbildner, welche mit Ionen oder/und Molekülen, die in dem Erkennungsschritt gebildet werden, optisch detektierbare Chelate oder Komplexe bilden.
Die Nanopartikel, welche den erkennenden Bestandteil oder/und den Transducer umfassen, sind bevorzugt Feststoffpartikel oder halbfeste Partikel. Stärker bevorzugt ist die Verwendung von Feststoffen, wie zum Beispiel feste Polymermaterialien. Das Material der Feststoffpartikel oder der halbfesten Partikel kann im Allgemeinen ausgewählt sein aus einem beliebigen anorganischen oder organischen synthetischen oder natürlichen Material. Bevorzugt werden die Nanopartikel aus Polymermaterialien oder Halbleitermaterialien (zum Beispiel sogenannte Quantenpunkte) hergestellt. Beispiele geeigneter anorganischer Materialien sind SiO₂, BaSO₄, Glas etc. Organische Materialien können aus synthetischen und natürlichen Polymeren ausgewählt sein. Beispiele von natürlichen Polymeren sind Alginate, Cellulose oder Cellulosederivate.
Spezifische Beispiele geeigneter Polymere sind Polyolefine, Vinylpolymere, Polyamide, Polyester, Polyacetale, Polycarbonate, Polyurethane, Polysiloxane und Copolymere und Gemische davon. Insbesondere sind die Nanopartikel aus Polystyrol, Poly(tert-butylstyrol), Polyethylen, Polypropylen, Polybuten, Polyisobuten und Copolymeren und Gemischen davon hergestellt.
Mit Oxidaseenzymen als erkennendem Bestandteil werden die Nanopartikel bevorzugt aus Polymeren oder Copolymeren mit einer hohen Sauerstoffdurchlässigkeit hergestellt. Spezifische Beispiele geeigneter Polymere sind Silikon, Polybutadien, Poly-(tert.-butylstyrol).
Die Nanopartikel können Bestandteile umfassen, um physikalische Eigenschaften (zum Beispiel Dichte, Reflexionsindex) und die Eigenschaften der aktiven Bestandteile zu verändern. Die Größe der Nanopartikel kann von 10 bis 500 nm mittlerer Partikeldurchmesser variieren. Bevorzugt beträgt der mittlere Durchmesser der Nanopartikel 30 bis 300 nm, stärker bevorzugt 100 bis 200 nm. Die Größe der Partikel hängt zum Beispiel von der Menge der in den Nanopartikel einzubringenden aktiven Bestandteile oder von der gewünschten Dichte der aktiven Bestandteile in den Nanopartikeln ab.
Der erkennende Bestandteil oder/und der Transducer ist innerhalb des Nanopartikels bzw. des Nanopartikelmaterials eingeschlossen, an die Nanopartikel bzw. das Nanopartikelmaterial konjugiert oder an die Nanopartikel bzw. das Nanopartikelmaterial angebracht.
Zum Beispiel sind der erkennende Bestandteil oder/und der Transducer innerhalb des Nanopartikels eingeschlossen, d.h. sie sind nicht kovalent an das Nanopartikelmaterial gebunden, sondern werden nur durch physikalischen Einschluss darin gehalten. Insbesondere sind die aktiven Bestandteile darin homogen verteilt. Es ist ebenso möglich, den erkennenden Bestandteil oder/und den Transducer an das Nanopartikelmaterial an der Oberfläche des Nanopartikels oder/und innerhalb des Nanopartikels zu konjugieren. Konjugation findet aufgrund von Intermolekularkräften, wie zum Beispiel elektrostatischer Wechselwirkung, Induktionskräften und Wasserstoffbrückenbindungen oder Ionenbindung statt. Es ist weiter möglich, die Bestandteile auf der Oberfläche der Nanopartikel oder/und des Nanopartikelmaterials innerhalb der Nanopartikel anzubringen, d.h. kovalent zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Transducer innerhalb des Nanopartikels eingeschlossen und der erkennende Bestandteil ist kovalent an der Oberfläche des Nanopartikels angebracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Nanopartikel sowohl den Transducer als auch den erkennenden Bestandteil, wobei der Transducer innerhalb des Nanopartikels eingeschlossen ist und der erkennende Bestandteil kovalent an der Oberfläche des Nanopartikels angebracht ist.
In dem erfindungsgemäßen Sensor sind die Nanopartikel, wie oben beschrieben, in eine Polymerschicht eingebettet, um der Schicht erkennende sowie Transducer-Eigenschaften zu verleihen. Die Einbettung wird durch physikalischen Einschluss oder/und kovalente Verknüpfung oder/und Konjugation der Nanopartikel an die Polymerschicht ausgeführt. Bevorzugt werden die Nanopartikel in der Polymerschicht dispergiert und durch physikalischen Einschluss darin gehalten.
Die Nanopartikel können in der Polymerschicht homogen verteilt sein oder es kann gewünscht sein, dass die Nanopartikel verschiedene Dichten innerhalb der Polymerschicht aufweisen. Zum Beispiel kann es bevorzugt sein, dass sich mehr Nanopartikel in der Nähe der Kontaktoberfläche des Sensors als innerhalb oder auf der anderen Seite der Schicht befinden.
Im Allgemeinen können die Polymerschichten aus einem beliebigen anorganischen oder organischen natürlichen oder synthetischen Polymer hergestellt werden, wobei es bevorzugt ist, dass das Polymer schnell hydratisierbar ist. Weiterhin kann es bevorzugt sein, dass die Polymerschicht sauerstoffdurchlässig ist, insbesondere wenn Sauerstoff an dem Transducerschritt beteiligt ist.
Beispiele geeigneter Polymere für die Polymerschicht in dem erfindungsgemäßen Sensor sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyolefinen, Vinylpolymeren, Polyamiden, Polyestern, Polyacetalen, Polycarbonaten, Polyurethanen und Copolymeren und Gemischen davon. Die Polymerschicht besteht bevorzugt aus einem oder mehreren Polyurethanen.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Sensors liegt darin, dass die Empfindlichkeit und der Aussteuerungsbereich des Sensors durch Variieren der Dichte der Nanopartikel in der Schicht und durch Variieren der Menge des erkennenden Bestandteils oder/und Transducers in jedem Nanopartikel eingestellt werden kann. Daher können schnelle Sensorantworten, zum Beispiel durch eine hohe Dichte der Nanopartikel in der Schicht, erreicht werden.
Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sensor, umfassend (a) ein lichtdurchlässiges Substrat, (b) eine Polymerschicht mit erkennenden und optischen Transducer-Eigenschaften, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen optischen Transducer bereitgestellt werden, die in der Polymerschicht, welche auf (a) aufgebracht ist, enthalten sind, und (c) eine Membranschicht auf der Polymerschicht.
Das lichtdurchlässige Substrat in dieser Ausführungsform der Erfindung sollte zum Anregen des optischen Transducers, welcher bevorzugt ein lumineszierender Farbstoff ist, durchlässig für Strahlung sein. Zusätzlich muss für den Nachweis die Strahlung, welche vom Transducer emittiert wird, das lichtdurchlässige Substrat in entgegengesetzter Richtung passieren. Bevorzugt sollte das lichtdurchlässige Substrat eine geringe Durchlässigkeit für Gas, insbesondere Sauerstoff, aufweisen. Insbesondere kann bei Verwendung eines Transducers, welcher empfindlich gegenüber Gas ist, insbesondere sauerstoffempfindlich, eine Verzerrung der Antwort des Transducers dadurch vermieden werden. Geeignete Materialien für das lichtdurchlässige Substrat sind organische oder anorganische Materialien, insbesondere Polymermaterialien, zum Beispiel Glas, insbesondere MYLAR^TM-Glas, Polyethylenterephthalat (PET) und Polyvinylidenchlorid (PVO).
Auf diese Schicht ist eine Polymerschicht, wie oben beschrieben, aufgebracht und eine Membranschicht (c) bedeckt die Polymerschicht.
Die Membranschicht stellt bevorzugt optische Isolierung bereit und ist auf der Polymerschicht zum Einstellen von Diffusionsverfahren beschichtet. Sie kann so konstruiert sein, dass nur bestimmte Substanzen, zum Beispiel der nachzuweisende Analyt, passieren können, und sie ist bevorzugt schnell hydratisierbar.
Mögliche Materialien für die Membranschicht sind wasserunlösliche Polymere und bevorzugt Polyurethan, Polyacrylamid, Polystyrol, Polyvinylester und Copolymere von zum Beispiel Butadien und Styrol. Bevorzugt wird Ruß in die Membranschicht zur optischen Isolierung eingebracht.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Sensor für den Nachweis von Glucose in einer Probe. In dieser Ausführungsform ist der erkennende Bestandteil das oxidative Enzym Glucoseoxidase und der optische Transducer ist ein lumineszierender Farbstoff. Die in der Probe vorhandene Glucose wird durch die Glucoseoxidase und Sauerstoff oxidiert, wobei sie Sauerstoff in der Polymerschicht verbraucht. Der Transducer, welcher aus einem lumineszierenden Farbstoff besteht, welcher sauerstoffempfindlich ist, reagiert auf die Sauerstoffabnahme durch Zunahme der Lumineszenzintensität, welche spektroskopisch nachgewiesen werden kann.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Sensors besteht darin, dass er schnell regeneriert werden kann. Zum Beispiel kann die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Polymerschicht des Sensors, welche während der enzymatischen Reaktion mit dem Zielanalyten verbraucht wurde, schnell regeneriert werden, wenn der Sensor als ein oxidativer Sensor auf Grundlage eines Enyzms verwendet wird.
Eine weitere spezifische Ausführungsform der Erfindung ist ein Sensor, welcher für den Nachweis von Analyten geeignet ist, welche nicht in einem einzelnen Schritt enzymatisch oxidiert werden können, wie zum Beispiel Creatinin. In diesem Fall besteht der erkennende Bestandteil aus verschiedenen Enzymen, und Creatinin wird durch ein erstes Enzym in ein oxidierbares Zwischenprodukt (Sarcosin) überführt, welches anschließend durch ein oxidatives Enzym (Sarcosinoxidase) oxidiert werden kann. Der Sauerstoffverbrauch bei der enzymatischen Oxidation kann durch einen sauerstoffempfindlichen Farbstoff, welcher mit dem oben beschriebenen Glucosesensor vergleichbar ist, nachgewiesen werden.
Der erfindungsgemäße Sensor ist zur qualitativen oder quantitativen Untersuchung einer Probe, wie zum Beispiel einer Körperflüssigkeitsprobe, besonders geeignet.
Folglich ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Sensors für den Nachweis oder/und die Quantifizierung eines Zielanalyten. Zum Beispiel kann der erfindungsgemäße Sensor für den Nachweis einer spezifischen Substanz in Umwelt-, Nahrungsmittel-, Abwasser-, Trinkwasser- und medizinischen Proben oder zur Untersuchung auf dem Gebiet der Biotechnologie verwendet werden. Der erfindungsgemäße Sensor ist besonders geeignet für medizinische Anwendungen, wie zum Beispiel den Nachweis oder/und die Quantifizierung von Targetanalyten in Körperflüssigkeitsproben, wie zum Beispiel Blut oder Serum, Urin und Speichel in reiner oder verdünnter Form. Insbesondere ist der Zielanalyt von Interesse ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Lactat, Sarcosin, Creatinin und Gemischen davon, wobei der Sensor besonders nützlich für den Nachweis oder/und die Quantifizierung von Glucose ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer bereitgestellt werden, die in einem oder mehreren, in die Polymerschicht eingebetteten Nanopartikeln enthalten sind.
Spezifische Beispiele von geeigneten Polymermaterialien, Transducern und erkennenden Bestandteilen sind oben angegeben.
Die Polymerschicht ist insbesondere zum Einbringen in einen Sensor, wie oben beschrieben, geeignet.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors, umfassend eine Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (a) Bereitstellen eines lichtdurchlässigen Substrats, (b) Aufbringen einer Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften auf das Substrat, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer bereitgestellt werden, welche in einem oder mehreren, in der Polymerschicht eingebetteten Nanopartikeln enthalten sind, und (c) Beschichten der Oberseite der Polymerschicht mit einer Membranschicht.
Bevorzugt wird die Polymerschicht nach Schritt (b) mit einer Membranschicht beschichtet, in welche Ruß eingebracht ist (Schritt (c)). Diese Schicht stellt optische Isolierung und das Einstellen von Diffusionsprozessen bereit.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines Nanopartikels, der einen erkennenden Bestandteil oder/und einen Transducer in einem Sensor oder einer Polymerschicht gemäß der Erfindung umfasst.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.
1 ist eine schematische Zeichnung, die zwei bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. (A) stellt die erfindungsgemäße Polymerschicht dar, welche Nanopartikel umfasst, die mit einem lumineszierenden Farbstoff dotiert und mit einem oxidativen Enzym konjugiert sind. (B) stellt eine Ausführungsform der Erfindung dar, wobei zwei Populationen von Nanopartikeln in die Polymerschicht eingebettet sind, Nanopartikel mit einem lumineszierenden Farbstoff dotiert sind und Nanopartikel mit einem oxidativen Enzym konjugiert sind.
2 zeigt einen herkömmlichen Sensor mit einer mehrschichtigen Struktur, wobei der erkennende Bestandteil (Enzym) und der Transducer (sauerstoffempfindlich) in getrennten Schichten enthalten sind.
Beispiel 1
Ein Glucosesensor wird gemäß 1B konstruiert und enthält 30 mg Poly(tert-butylstyrol)-Nanopartikel, die mit einem Rutheniumkomplex [Ru(diphenylphenanthrolin)₃] dotiert sind und 50 mg Polystyrol-Nanopartikel, die mit Glucoseoxidase konjugiert sind, welche in einer Polyurethanmatrix dispergiert ist.
Auf der Oberseite der mehrfunktionellen Schicht wird anschließend eine Membran, in die Ruß eingebracht ist, für die optische Isolierung und für das Einstellen von Diffusionsprozessen beschichtet.
Die Tabelle unten veranschaulicht die Fluoreszenzsignalantwort [kinetische Messungen: Veränderung der Fluoreszenzintensität pro Sekunde (ΔI pro Sekunde)] bei verschiedenen Glucosekonzentrationen in Kontrolllösungen, welche bei 150 Torr Sauerstoffpartialdruck mit einem Tonometer eingestellt wurden.
Nach Injektion jeder Kontrolllösung wurde die Kassette 5 mal mit dem Opti-Puffer, welcher bei 90 Torr Sauerstoff mit einem Tonometer eingestellt wurde, manuell gewaschen, bevor sie extern mit einem Gas, welches 90 Torr Sauerstoff enthielt, zur Rekalibrierung gespült wurde (Dauer der Rekalibrierungen betrug weniger als 60 s).

Claims

Sensor, umfassend eine Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer bereitgestellt werden, die in einem oder mehreren, in die Polymerschicht eingebetteten Nanopartikeln enthalten sind.
Sensor nach Anspruch 1, wobei in der Polymerschicht erste Nanopartikel, die einen erkennenden Bestandteil umfassen, und zweite Nanopartikel, die einen Transducer umfassen, eingebettet sind.
Sensor nach Anspruch 1, wobei in der Polymerschicht Nanopartikel eingebettet sind, die sowohl einen erkennenden Bestandteil als auch einen Transducer umfassen.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erkennende Bestandteil ein biologisch aktiver Bestandteil ist.
Sensor nach Anspruch 4, wobei der biologisch aktive Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, synthetischen und genmanipulierten Enzymen.
Sensor nach Anspruch 5, wobei der biologisch aktive Bestandteil ein oxidatives Enzym ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase, Lactatoxidase, Sarcosinoxidase und Gemischen davon.
Sensor nach Anspruch 6, wobei das oxidative Enzym Glucoseoxidase ist.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Transducer ein optischer Transducer ist.
Sensor nach Anspruch 8, wobei der optische Transducer aus einem lumineszierenden Farbstoff besteht.
Sensor nach Anspruch 9, wobei der lumineszierende Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus [Ru(diphenylphenantrolin)₃], Octaethyl-Pt-porphyrin, Octaethyl-Pt-porphyrinketon, Tetrabenzo-Pt-porphyrin, Tetraphenyl-Pt-porphyrin, Meso-tetraphenyl-tetrabenzo-Pt-porphyrin, Tetracyclohexenyl-Pt-porphyrin, Octaethyl-Pt-chlor, Tetraphenyl-Pt-chlor und Gemischen davon.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel Polymernanopartikel sind.
Sensor nach Anspruch 11, wobei das Polymermaterial der Nanopartikel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyolefinen, Vinylpolymeren, Polyamiden, Polyestern, Polyacetalen, Polycarbonaten, Polyurethanen, Polysiloxanen und Copolymeren und Gemischen davon.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel 10 bis 500 nm beträgt.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerschicht aus einem Polymer besteht, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyolefinen, Vinylpolymeren, Polyamiden, Polyestern, Polyacetalen, Polycarbonaten, Polyurethanen und Copolymeren und Gemischen davon.
Sensor nach Anspruch 14, wobei die Polymerschicht aus einem oder mehreren Polyurethanen besteht.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erkennende Bestandteil und der Transducer innerhalb eines oder mehrerer Nanopartikel eingeschlossen sind, an einen oder mehrere Nanopartikel konjugiert sind oder an einen oder mehrere Nanopartikel angebracht sind, welche in der Polymerschicht eingebettet sind.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend (a) ein lichtdurchlässiges Substrat, (b) eine Polymerschicht mit erkennenden und optischen Transducer-Eigenschaften, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen optischen Transducer bereitgestellt werden, die in einem oder mehreren Nanopartikeln in der Polymerschicht, die auf (a) aufgebracht ist, eingebettet sind, und (c) eine Membranschicht auf der Polymerschicht.
Verwendung eines Sensors nach einem der vorhergehenden Ansprüche für den Nachweis oder/und die Quantifizierung eines Zielanalyten.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Zielanalyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Lactat, Sarcosin, Creatinin und Gemischen davon.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Zielanalyt Glucose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei ein Zielanalyt in einer Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen oder/und quantifiziert wird.
Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften, wobei diese Eigenschaften durch einen erkennenden Bestandteil und einen Transducer bereitgestellt werden, welche in einem oder mehreren Nanopartikeln enthalten sind, die in der Polymerschicht eingebettet sind.
Polymerschicht nach Anspruch 22, wobei der erkennende Bestandteil ein biologisch aktiver Bestandteil ist.
Polymerschicht nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Transducer ein optischer Transducer ist.
Verfahren zur Herstellung eines Sensors, umfassend eine Polymerschicht mit erkennenden und Transducer-Eigenschaften, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (a) Bereitstellen eines lichtdurchlässigen Substrats, (b) Aufbringen einer Polymerschicht nach einem der Ansprüche 22 bis 24 auf das Substrat und (c) Beschichten der Oberseite der Polymerschicht mit einer Membranschicht.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei in die Membranschicht Ruß eingebracht ist.
Verwendung eines Nanopartikels, der einen erkennenden Bestandteil oder/und einen Transducer in einem Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eine Polymerschicht nach einem der Ansprüche 22 bis 24 umfasst.