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Die
Erfindung betrifft einen eine Membran aufweisenden Biasensor und
ein Bestimmungsverfahren unter Einsatz des Biosensors. Die erfindungsgemäßen Biosensoren
dienen beispielsweise zur Bestimmung der Lactatmenge in Vollblut
(dies stellt ein Maß für den mit
Sauerstoff gesättigten
Gewebezustand dar).
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Biosensoren
werden zur Detektion der Anwesenheit und/oder der Menge einer ausgewählten Komponente
in einer Probe, beispielsweise Blut, eingesetzt. Bekanntlich umfassen
Biosensoren eine kombinierte Detektionseinheit aus einer Bioschicht,
beispielsweise aus einem Enzym, einem Transducer. Bestimmte Arten von
Biosensoren verfügen über eine
Membranstruktur, die eine oder mehrere Membranen aufweist und die (bei
Einsatz des Biosensors) die Detektionseinheit von der analysierten
Probe trennt. Die Membranstruktur kann eine biologische Komponente
(beispielsweise ein Enzym) enthalten, trennt jedoch gewöhnlich die
biologische Komponente von der Probe. Im Falle eines Enzyms findet
eine Reaktion mit den interessierenden Spezies zur Herstellung eines
Produktes statt, das dann mittels des Transducers detektiert wird;
dies stellt eine Art von Einheit für die indirekte Bestimmung
der interessierenden Spezies dar.
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In
der WO 94/02584 wird ein Biosensor zum Detektieren von Komponenten
in fluiden Proben beschrieben. Dieser Biosensor umfasst ein Elektrodensystem,
eine selektiv-permeable Membranbarriere, aufgebaut aus einer Mischung
von Polyvinylchlorid und Polyarylsulfonpolymeren und einer Enzymschicht
zwischen der Membran und dem Elektrodensystem. Die Polymerzusammensetzung
für die
Membranbarriere kann auch einen Weichmacher enthalten.
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Die
Membranstruktur des Biosensors weist im allgemeinen eine Außenmembran
aus einem synthetischen Polymermaterial auf, das modifiziert wurde,
um eine Membran zu ergeben, die für die interessierenden Spezies
permeabel ist (oder permeabler ist als eine ähnliche Membran, die aus einem
polymeren Material hergestellt wurde, das nicht modifiziert wurde).
Soll der Biosensor in Vollblut eingesetzt werden, dann muss die Außenmembran
(der Membranstruktur), die mit dem Blut in Kontakt kommt, hinsichtlich
Biokompatibilität
hohen Ansprüchen
genügen,
da eine Vorbehandlung der Probe vorzugsweise nicht stattfindet.
Die Membranoberfläche
stellt ein Ziel für
Plasmaproteine dar, die sich unmittelbar nach dem anfänglichen
Kontakt mit dem Blut zu adsorbieren beginnen. An die anfängliche
Proteinadsorption schließt
sich eine Komplementaktivierung, die Adhäsion von Zellen und Zellkomponenten
und die Bildung von Fibrinkoagulat an.
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Der
Einsatz in Vollblut stellt auch Anforderungen an den linearen Bereich
des Sensors, der wesentlich breiter sein muss als in dem Falle,
in dem keine Verdünnung
der Probe vor der Analyse stattfindet.
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Der
hier verwendete Ausdruck grenzflächenaktives
Agenz bezieht sich auch auf grenzflächenaktive Mittel; beide Ausdrücke können austauschbar
verwendet werden.
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Erfindungsgemäß wurde
gefunden, dass die Einverleibung eines grenzflächenaktiven Agenz in ein synthetisches
polymeres Material die aus diesem Material hergestellten Membranen
permeabel (oder permeabler) für
den Massentransport einer interessierenden Spezies macht, wobei
Membranen zur Verfügung
gestellt werden, die über
eine gute Blutkompatibilität
verfügen
und die eingesetzt werden können,
um eine ein Ansprechen linearisierende Diffusionsbarriere bereitzustellen.
Dies gilt insbesondere für
Enzyme, welche mit den interessierenden Spezies reagieren, wobei
die Geschwindigkeit bezüglich
der Substratkonzentrationen nicht linear ist, wenn diese hoch sind
(typischerweise weit über
der Michaelis-Konstante des Enzyms).
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Die
Membranen können
für ungeladene
Spezies oder für
geladene Spezies permeabel gemacht werden und können daher in Biosensoren zur Bestimmung
der Anwesenheit und/oder der Menge derartiger geladener Spezies
(beispielsweise der Lactatkonzentration in einer Probe) eingesetzt
werden.
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Die
Membranen verfügen über den
signifikanten Vorteil, dass sie blutkompatibel sind und daher in
Biosensoren zur Bestimmung der Menge einer Spezies in Vollblut eingesetzt
werden können.
Die Biosensoren sind besonders für
die Bestimmung der Lactatmenge in Vollblut geeignet. Die Membranen
können
jedoch auch für
andere Zwecke, beispielsweise für
die Dialyse und als permeable Deckschichten auf anderen Enzym- oder sogar
nicht-Enzym-Elektroden eingesetzt werden. Zudem können die
Membranen in Sensoren zur Bestimmung ungeladener Spezies, beispielsweise
Glukose, und in chemischen Sensoren, welche keine biologische Komponente
aufweisen, eingesetzt werden.
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Ein
weiterer Vorteil der Membranen besteht darin, dass sie eine linearisierende
Diffusionsbarriere für die
interessierende Spezies bereitstellen. Die Menge der in einer Probe
vorhandenen Spezies, die durch die Barriere diffundieren kann, ist
dann der Menge dieser Spezies in der Probe proportional; die Konzentration
jedoch, die erreicht wird, nachdem die Barriere durchquert wurde,
wird dadurch erniedrigt und liegt innerhalb des Bereiches, für das die
Chemikalie oder der Biosensor über
einen linearen Signaloutput verfügt.
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Bei
dem synthetischen polymeren Material handelt es sich vorzugsweise
um Poly(vinylchlorid). Das Poly(vinylchlorid) besitzt vorzugsweise
ein Molekulargewicht (Mg) im Bereich von 80 000 bis 250 000, weiterhin
bevorzugt von 150 000 bis 250 000 beispielsweise etwa 200 000.
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Die
Menge des in der Membran vorhandenen grenzflächenaktiven Agenz beträgt im allgemeinen
mindestens 1 Gew.-% des synthetischen Polymers, beispielsweise weiterhin
bevorzugt mindestens 2 %, weiterhin bevorzugt mindestens 3 % auf
der gleichen Basis. Im allgemeinen ist die Menge des grenzflächenaktiven Agenz
geringer als 250 Gew.-% des synthetischen Polymers. Wird die Membran
in einem Sensor als linearisierende Diffusionsbarriere eingesetzt,
dann hängt
die Menge des grenzflächenaktiven
Agenz von den beabsichtigten Einsatzgebiet des Sensors ab. Für einige
Anwendungen (beispielsweise bei Verwendung des Sensors bei kontinuierlichen
Flussbedingungen) kann es wünschenswert
sein, dass die Menge des grenzflächenaktiven
Agenz mindestens 50 Gew.-% des synthetischen Polymers ausmacht.
Für andere
Anwendungen kann die Menge des grenzflächenaktiven Agenz niedriger
sein als 50 Prozent (G/G) des synthetischen Polymers, beispielsweise
weniger als 30 % oder sogar weniger als 20 % bezogen auf die selbe
Grundlage. Für
den Einsatz als Dialysemembran ist ein hoher Massentransport (Permeabilität) erforderlich,
so dass größere Mengen an
grenzflächenaktivem
Agenz nötig
sind, typischerweise im Bereich von 100 % bis 200 % (weiterhin bevorzugt
150 % bis 200 %) (G/G) des synthetischen Polymers.
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Bei
dem grenzflächenaktiven
Agenz handelt es sich vorzugsweise um ein nicht-ionisches grenzflächenaktives
Agenz. Derartige nicht-ionische grenzflächenaktive Agentien können insbesondere
dazu eingesetzt werden, spezifische ionische Wechselwirkungen mit
diffundierenden gelösten
Stoffen zu vermeiden. In alternativer Weise kann es sich bei dem
grenzflächenaktiven
Agenz um ein kationisches oder anionisches grenzflächenaktives
Mittel handeln.
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Eine
Vielzahl von nicht ionischen grenzflächenaktiven Agentien kann eingesetzt
werden. Zu den grenzflächenaktiven
Agentien, die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können,
zählen
Verbindungen, die aus Polyoxyalkylenresten aufgebaut sind oder diese
enthalten. Bei dem Alkylenoxid kann es sich beispielsweise um Ethylenoxid
und/oder Propylenoxid handeln. Zu den Beispielen derartiger grenzflächenaktiver
Agentien zählen
Verbindungen der folgenden Formel (I)
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Das
Molekulargewicht der Verbindung (I) beträgt typischerweise 500 bis 800,
beispielsweise 600 bis 700. Ein besonders geeignetes Produkt der
Formel (I) besitzt ein Molekulargewicht von etwa 648 und ist unter dem
Handelsnamen Triton X-100 verfügbar.
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Als
weitere Beispiele für
grenzflächenaktiven
Agentien, welche Poly(alkylenoxid)-Reste aufweisen, sind Blockcopolymere
von Ethylenoxid und Propylenoxid. Geeignete Beispiele derartiger
Copolymere zum Einsatz als grenzflächenaktive Mittel verfügen über ein
Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 und vorzugsweise von 7000 bis
10 000.
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Das
Blockcopolymer kann der folgenden allgemeinen Formel (I) entsprechen
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Das
Blockcopolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid kann vorzugsweise
einen Ethylenoxidgehalt von mindestens 75 Gew.-%, vorzugsweise etwa
80 Gew.-%, bezogen auf das grenzflächenaktive Mittel, besitzen.
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Beispiele
für bevorzugte
grenzflächenaktive
Mittel, die aus Blockcopolymeren von Ethylenoxid und Propylenoxid
aufgebaut sind, sind unter dem Namen Pluronic erhältlich.
Ein besonders geeignetes Beispiel für ein derartiges Produkt ist
unter dem Namen Pluronic F-68 verfügbar und besitzt ein Molekulargewicht
von etwa 8400.
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Falls
das grenzflächenaktive
Agenz ein Blockcopolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid aufweist, dann
kann das grenzflächenaktive
Agenz beispielsweise 4,5 bis 100 Gew.-% des synthetischen Polymermaterials,
beispielsweise 6 Gew.-% bis 100 Gew.-%, weiter bevorzugt 10 Gew.-%
bis 90 Gew.-%, weiterhin bevorzugt 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% und am
meisten bevorzugt 50 Gew.-% bis 60 Gew.-%, bezogen auf die selbe
Basis, ausmachen.
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Bei
einem weiteren grenzflächenaktiven
Agenz, das Anwendung finden kann, handelt es sich um L-α-Phosphatidylcholindipalmitoyl
(C40 H80 NO8P) (Mg = 734). Dieses
grenzflächenaktive
Agenz kommt in der Natur als grenzflächenaktives Mittel in der Lunge
vor und hat hinsichtlich der Biokompatibilität Vorteile. Die Einverleibung
von grenzflächenaktiven
Agentien hat im allgemeinen zu einer Verbesserung der Hämokompatibilität im Vergleich
zu nicht-grenzflächenaktiven
PVC-Membranen geführt.
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Es
ist auch möglich,
Analoge der grenzflächenaktiven
Agentien zur Anwendung zu bringen. Derartige Analoge werden somit
durch den hier verwendeten Ausdruck grenzflächenaktives Agenz mit umfasst.
Ein besonders bevorzugtes analoges Agenz stellt bis (2-Ethylhexyl)Wasserstoffphosphat
dar, welches die folgende Formel besitzt:
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Die
oben wiedergegebene Verbindung wird hier als BEP bezeichnet.
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Ein
wichtiges Merkmal der aus PVC aufgebauten BEHHP enthaltenden Membran
besteht darin, dass die Membranpermeabilität sowohl von der Pufferzusammensetzung
als auch von dem pH-Wert abhängig
gemacht werden kann. Bei einem pH-Wert von 7 besitzt die PVC (BEHHP)-Membran in Puffern
sowohl auf Basis von Phosphat als auch von Carbonsäuren sehr
hohe Permeabilitätscharakteristika,
die solchen entsprechen, welche für PVC, das mit entweder Tween
80 oder Triton X-100
modifiziert wurde, beobachtet wurden. Wird das PVC (BEHHP) jedoch
mit Puffern auf Basis von Carbonsäuren (beispielsweise Succinatpuffer)
bei einem pH-Wert in Kontakt gebracht, bei dem der Säurepuffer
vorwiegend in der neutralen Form vorliegt (d.h. unter seinem pKa-Wert),
neigt das PVC (BEHHP) dazu, in einen niedrigen Permeabilitätszustand überzugehen. PVC
(BEHHP) könnte
daher als pH-sensitive,
gelöste
Stoffe ausblendende Membran eingesetzt werden.
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Bevorzugte
Membranen zum Einsatz in einem Lactatsensor (bezogen auf die Lactatbestimmng
in unverdünntem
Vollblut) weisen Polyvinylchlorid auf, in dem 10 bis 45 % (beispielsweise
18 % bis 45 %) (Gewicht/Gewicht; G/G) des nicht-ionischen grenzflächenaktiven
Agenz Triton-100 oder 4,5 bis 100 % (G/G) an Pluronic F-68 oder
1 bis 3 % (G/G) L-α-Phosphatidylcholindipalmitoyl
inkorporiert sind, wobei die Prozentangaben auf das Gewicht des
Poly(vinylchlorid)s bezogen sind. Diese Werte sind besonders für Sensoren
bevorzugt, die über
eine innere selektive Membran (man vgl. nachstehende Ausführungen)
verfügen.
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Wird
die Membran für
die Dialyse eingesetzt, dann beträgt die Menge des grenzflächenaktiven
Agenz vorzugsweise 150 % bis 200 % (G/G).
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Die
Membranen besitzen typischerweise eine Dicke von 0,1 bis 200 μ.
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Die
Membranen können
durch übliche
Gießtechniken
hergestellt werden. In alternativer Weise kann die Membran durch
eine sogenannte „spin
coating"-Technik
hergestellt werden, bei der eine Lösung des Polymers in einem
flüchtigen
Lösungsmittel
auf eine flache Trägeroberfläche aufgetragen
wird, die dann rotiert (üblicherweise
um eine vertikale Achse) wird, und zwar bei einer Geschwindigkeit,
welche dazu führt,
dass die Lösung
auf dem Träger
gleichmäßig verteilt
und das Lösungsmittel
verdampft wird, um so eine dünne
polymere Membran gleichmäßiger Dicke
zu produzieren. Mit Hilfe des „spin
coating"-Verfahrens
ist es möglich,
Membranen mit einer gleichmäßigen Dicke
von 2 bis 10 (beispielsweise 4–6) μm sehr schnell
zu produzieren, beispielsweise innerhalb von 10 sec bis 2 min. Die
Dicke der gemäß der „spin coating"-Technik produzierten Membranen kann
sehr leicht eingestellt werden. Die Lösung, aus der die Membran mittels
des „spin
coatings" gebildet
wird, besitzt im allgemeinen eine Konzentration von 1 bis 15 Gew.-%,
beispielsweise von 2 bis 10 Gew.-%. Zur Bildung der Membran wird
die Polymerlösung
auf die Achse aufgetragen, um die der Träger gedreht wird. Drehgeschwindigkeiten
von 250 bis 1500 UpM sind im allgemeinen geeignet. Der Träger wird
im allgemeinen für
einen Zeitraum bis zu 2 min gedreht, beispielsweise 90 sec, um die
gewünschte
Membran herzustellen. Eine geeignete Vorrichtung zur Herstellung
von Membranen durch „spin
coating" stellt
ein „Photoresist
Spinner" dar, wie
er zur Herstellung von Schichten von photoresistenten Materialien
eingesetzt wird. In allen Fällen
wird eine kontinuierliche Membran hergestellt, in der das mischbare
grenzflächenaktive
Agenz verteilt ist.
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Erfindungsgemäß wird eine
Biosensorvorrichtung gemäß der Lehre
des Anspruchs 1 bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß wird ferner
ein Verfahren zur Bestimmung der Menge einer ausgewählten Komponente
in einer Probe gemäß der Lehre
des Anspruchs 27 bereitgestellt.
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Bei
dem Detektionssystem handelt es sich um ein elektrochemisches Elektrodensystem.
Das elektrochemische Elektrodensystem ist vorzugsweise vom nicht-pozentiometrischen
Typ. Beispiele dafür
sind amperometrische, galvanische, photogalvanische und coulometrische
Typen. Am meisten bevorzugt umfasst der Biosensor eine amperometrische
Elektrode.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere für
die Bestimmung von Lactat im Vollblut unter Verwendung eines Elektrodendetektionssystems
geeignet. Bei einem derartigen Verfahren kann das Lactat indirekt
detektiert werden. So kann beispielsweise nach Diffusion durch die
Membran das Lactat mit einem Enzym auf der Elektrodenseite der Membran
derart in Wechselwirkung treten, dass diese Wechselwirkung zu der Produktion
oder dem Verbrauch einer Spezies führt, die dann direkt elektrochemisch
detektiert werden kann. Das Enzym wird in einer Schicht immobilisiert,
die zwischen der Membran und der Elektrode vorhanden ist. Diese
Schicht kann beispielsweise das Enzym vernetzt mit bovinem Serumalbumin
in einer Glutaraldehydmatrix aufweisen. Das Enzym kann in der Membran
eingeschlossen sein, welche die Probe direkt berühren kann oder eine zusätzliche,
ein grenzflächenaktives
Agenz enthaltene Membran aufweisen kann, die zwischen der das Enzym
enthaltene Membran und der Probe angeordnet ist.
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Bei
dem Enzym kann es sich beispielsweise um ein solches handeln, das
zur Produktion von Wasserstoffperoxid führt, das dann detektiert werden
kann. Ein geeignetes Enzym stellt beispielsweise eine Oxidase dar,
beispielsweise Lactatoxidase.
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Die
Enzymschicht kann gewünschtenfalls
Catalase enthalten.
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Die
Membran kann nicht nur permeabel für Lactat sein, sondern kann
zusätzlich
auch für
andere Spezies permeabel sein, die bei der Analyse einer bestimmten
Probe unter Verwendung eine Enzymelektrode stören könnten. Im Falle von Blut sind
störende
elektroaktive Elemente beispielsweise Ascorbat, Urat und Acetaminophen
(Paracetamol); alle diese Elemente diffundieren durch die Membran.
Erfindungsgemäße Sensoren enthalten
daher im allgemeinen zusätzlich
eine weitere Membran (zwischen dem Enzym und der Elektrode), um
eine Selektivität
gegenüber
den störenden
Elementen zu ermöglichen.
Am meisten bevorzugt besteht eine derartige selektive Membran aus
einem sulfonierten Poly(etherethersulfon)/Poly(ethersulfon)polymer (SPEES- PES) oder Celluloseacetat.
Ohne eine derartige selektive Membran oder eine selektive Bioschicht (beispielsweise
Enzym) ist sowohl eine direkte elektrochemische als auch eine andere
Detektion der elektrodenaktiven Spezies ohne ein externes Elektrodenfouling
möglich.
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Der
Sensor kann bei kontinuierlichen Flussbedingungen eingesetzt werden,
d.h. die zu analysierende Probe wird dem Sensor in einem kontinuierlichen
Fluss zugeführt.
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Dieses
Verfahren ist insbesondere für
die Lactatbestimmung im Vollblut unter Einsatz einer Sensorvorrichtung
geeignet, bei der die Detektionsmittel ein Enzymelektrodensystem
des oben beschriebenen Typs aufweisen; beispielsweise Lactatoxid
immobilisiert in einer Glutaraldehydmatrix. Beim Überwachen
der Lactatmenge im Vollblut bei kontinuierlichen Flussbedingungen
kann das Blut mit einem Antikoagulierungsagenz behandelt und dann
durch eine Durchlaufmesszelle geleitet werden. Der erforderliche
Fluss kann durch eine peristaltische Pumpe erzeugt werden.
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Zweckmäßigerweise
wird das zu untersuchende Blut in eine Richtung entlang des Innenlumens
eines Doppellumenkatheters geleitet, während das Antikoagulierungsagenz
in die entgegengesetzte Richtung durch das Außenlumen zur Vermischung mit
dem Blut, wenn es das Innenlumen erreicht, geleitet wird.
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Das
Antikoagulierungsagenz sollte in einer ausreichenden Konzentration
vorhanden sein, um eine Koagulierung zu verhindern. Bei dem Antikoagulierungsagenz
handelt es sich vorzugsweise um Heparin.
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Die
Flussgeschwindigkeit des Antikoagulierungsagenz kann zumindest derjenigen
des Blutes entsprechen. So kann beispielsweise das Blut 20 bis 50
%, beispielsweise 30 %, des gesamten Volumens der Mischung aus Blut
und Antikoagulierungsagenz ausmachen.
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Wird
die erfindungsgemäße Vorrichtung
eingesetzt, ist es möglich
(und kann gegebenenfalls gewünscht
sein), dass ein kontinuierlicher Leckverlust des grenzflächenaktiven
Agenz aus der Membranoberfläche,
die mit der Probe in Kontakt steht, stattfindet. In der Tat kann
ein kontinuierlicher Verlust an grenzflächenaktivem Agenz und sein
Ersatz an der Oberfläche
ein Fouling vermeiden; dies führt
zu einer Selbstregenerierung und dadurch zu einer Selbstreinigung
der Oberfläche.
In der Tat zählt
das mikroskopisch beobachtete Ausmaß an Fouling, das bei denen
die Membranen enthaltenen Vorrichtungen beobachtet wird, zu dem
niedrigsten für
jedes bekannte Membran- oder Polymermaterial, das Blut ausgesetzt
wurde.
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Es
kann daher wünschenswert
sein, eine zusätzliche
Quelle für
das grenzflächenaktive
Agenz bereitzustellen, um den Verlust aus der Membran zu ersetzen.
So kann beispielsweise ein Reservoir für das grenzflächenaktive
Agenz um die Außenzone
der Membran angeordnet werden (d.h. an einer oder an beiden Seiten der
hinter der Detektionsoberfläche
des Sensors erweiterten Membran). In alternativer Weise kann eine
Quelle für
das grenzflächenaktive
Agenz zuvor in die erweiterte Seite der Membran eingebracht werden,
die von dem Detektionsmittel und von dem Teil der Membran, die der
Probe ausgesetzt ist, entfernt ist, und kann dazu dienen, grenzflächenaktives
Agenz durch die Membran zum Ersatz des Verlustes durch den Teil
der Membran, der mit der Probe in Kontakt steht, zuzuführen.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden, nicht begrenzenden
Beispiele und unter Bezug auf die 1 bis 9 und 11 bis 14,
welche die Ergebnisse der Beispiele zeigen, und der 10,
welche einen Katheter zeigt, der in den Verfahren der Beispiele
8 bis 11 eingesetzt wird, näher
erläutert.
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Soweit
nichts anderes angegeben, beziehen sich alle Prozentangaben in den
Beispielen auf Gewicht/Gewicht (G/G).
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Beispiel 1:
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(i) PVC-Membranen
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Ein
Volumen aus 5 ml Tetrahydrofuran (THF) wurde mit 10 μl Triton
X-100 (ex Aldrich)
vermischt. Zu dieser Mischung wurden 0,06 g PVC (Molekulargewicht
200 000; ex BDH) hinzugegeben, und das Polymer konnte sich über Nacht
lösen.
Die resultierende Polymerlösung
wurde in eine Petrischale (Durchmesser=10cm) aus Glas gegossen,
die dann mit einem Glasdeckel bedeckt wurde und bei Raumtemperatur
während
eines Zeitraums von zwei Tagen stehen gelassen wurde, um ein langsames
Verdampfen des Lösungsmittel
zu ermöglichen.
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Die
resultierende Membran wies 18 % G/G Triton X-100 auf.
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Obige
Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei 15 μl, 25 μl und 50 μl Triton X-100 eingesetzt wurden, um
Membranen herzustellen, die 27 G/G, 45 % G/G und 90 % G/G Triton
X-100 enthielten.
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(ii) Enzymlaminat
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Eine
Lösung
mit einem Gehalt von 300 mg ml–1 bovinem Serumalbumin
(ex Sigma) und 15 mg ml–1 Lactatoxidase, LOD,
aus Pediococcus Spezies (40 U mg–1 ex
Sigma) wurde hergestellt. Eine vernetzte Enzymschicht wurde erhalten,
indem 6 μl
der Enzymlösung
mit 3 μl
einer 0,5 % (v/v) Glutaraldehydlösung
auf einer Dialysemembran vermischt wurden. Eine weitere Dialysemembran
wurde schnell oben auf die Enzymschicht aufgebracht, und das Laminat
wurde unter Verwendung von Objektträgern zusammengepresst. Nach
Entfernung der Glasträger
wurde das Laminat an der Luft einige Minuten getrocknet und mit
Puffer gewaschen, um jegliches überschüssiges Glutaraldehyd
zu entfernen.
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Es
wurden vier weitere Laminatmembranen hergestellt. Jede derartige
Laminatmembran wies eine der vier wie oben unter (i) beschrieben
hergestellte PVC-Membranen und eine Enzymschicht (hergestellt wie
unter (II)) auf. Die Laminatmembranen wurden in einer Sensorvorrichtung bewertet,
um das auf verschiedene Lactatkonzentrationen erhaltene Ansprechen
festzustellen. Der verwendete Sensor wies eine Rankelektrode (ex Rank
Brothers) auf, die aus einer Platinarbeitselektrode (polarisiert
bei +650 mV vs. Ag/AgCl zur Detektion von H2O2) und einer Silberkathode (wirkt als Pseudoreferenzelektrode)
bestand. Das Signalansprechen wurde mit einem x-t-Schreiber aufgezeichnet.
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Die
Ergebnisse für
die 4 Kompositmembranen sind in der 1 gezeigt,
in der die verschiedenen PVC-Membranen durch folgende Symbole dargestellt
sind:
∎ 90 % G/G Triton X-100
☐ 45 %
G/G Triton X-100
⦁ 27 % G/G Triton X-100
o 18
% G/G Triton X-100
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Aus
der 1 ist ersichtlich, dass alle Membranen für Lactat
permeabel waren und dass das Ansprechen in allen Fällen im
wesentlichen linear war. Die Lactatpermeabilität nahm mit Abnehmen der Menge
von Triton X-100 in der PVC-Membran ab. Dies führte zu einem erhöhten linearen
Bereich für
den Lactatsensor. Die am wenigsten permeablen Membranen verfügten über eine
Linearität,
die jenseits derjenigen liegt, die für klinische Messungen erforderlich
ist. Diese Eigenschaften kann jedoch bei anderen Anwendungen, beispielsweise
in der Nahrungsmittelindustrie nützlich
sein.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel zeigt die Eigenschaften einer Kompositmembran, aufgebaut
aus
- (i) einer PVC Membran enthaltend 23 % G/G
Triton X-100 (hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben)
- (ii) einer Enzymschicht (hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben)
und
- (iii) einer SPEES/PES Schicht (hergestellt wie nachstehend beschrieben)
bei
der Lactatbestimmung.
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Die
SPEES/PES-Schicht wurde hergestellt gemäß einem früheren Verfahren (S. Gosh, PhD
Thesis, University of Manchester 1994), das wie folgt modifiziert
wurde. 0,1 g SPEES/PES (Sulphonierungsverhältnis = 5; ex ICI) wurden in
einer Mischung aus 3,75 ml N,N-Dimethylformamid und 1,25 ml 2-Methoxyethanol
(ex ICI) gelöst.
Es wurde dem Polymer ermöglicht,
sich über
Nacht zu lösen.
Dann wurde die Membran unter Verwendung einer Glas-Petrischale gegossen.
Aufgrund der geringen Flüchtigkeit
der eingesetzten Lösungsmittel wurde
die Schale ohne eine Abdeckung bei Raumtemperatur und für einen
Zeitraum von vier Tagen stehen gelassen, bevor die Membran verwendet
wurde.
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Die
Kompositmembran, welche die Schichten (i), (ii) und (iii) aufwies,
ist in der 2 in Form eines Schaubildes
gezeigt. Diese Kompositmembran wurde in die im Beispiel 1 beschriebene
Rank Elektrode eingebaut und auf seine Eigenschaften zur Lactatbestimmung
in Lösung
getestet, und zwar bevor sie Vollblut ausgesetzt wurde (für insgesamt
etwa 1 h) und nachdem sie Vollblut ausgesetzt wurde. Näheres dazu
findet sich im Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt,
aus denen sich eine Kalibrierung der Elektrode vor, (☐)y
= 23,329x + 0.129, und nach (∎)y = 22,414x + 0,529 dem
Kontakt mit Blut zeigt. Aus der 3 ist ersichtlich,
dass die vor und nach dem Kontakt mit Blut erhaltenen Kalibrierungskurven
fast übereinander
gelegt werden können.
Dies deutet an, dass kein signifikantes Biofouling des Sensors eingetreten
ist. Diese Blutkompatibilität
ist einzigartig und kann nicht beobachtet werden bei einer Elektrode,
die der Probe zuvor nicht ausgesetzt wurde (präkonditioniert). Dies stellt
eine äußerst wertvolle
Eigenschaft eines Sensors für
klinische Anwendungen dar, wenn eine Elektrodenkonditionierung eliminiert
werden muß.
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Beispiel 3
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Eine
wie im Beispiel 2 beschriebene Enzymelektrode (enthielt eine Kompositmembran
aus den Schichten (i), (ii) und (iii)), wurde zur Bestimmung von
Lactatkonzentrationen für
eine Vielzahl von Vollblutproben eingesetzt. Die Elektrode wurde
jeder Blutprobe für
etwa 10 min ausgesetzt und zwischen den Messungen mit einer isotonischen
Pufferlösung
gewaschen. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die
mit einer Standardlactatanalysiervorrichtung (Yellow Spring Instruments)
erhalten wurden. Insgesamt wurden sechs Proben vermessen, was zu
einer Einwirkungszeit von mindestens 1 h führte.
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Die
Ergebnisse sind in der 4 dargestellt. Es wurde festgestellt,
dass die Enzymelektrode zu dauerhaft höheren Werten führte. Wichtiger
ist jedoch, dass die beiden Verfahren über eine gute lineare Korrelation
verfügten.
Ein wichtiger und beachtenswerter Unterschied zwischen den beiden
Verfahren besteht darin, dass die Blutprobe vor der Analyse in der
Standardanalysiervorrichtung hoch verdünnt wird, während die Messung mit der Enzymelektrode
mit unverdünntem
Vollblut durchgeführt
wird. Dieser Unterschied sollte beim Vergleich der beiden Verfahren
berücksichtigt
werden.
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Beispiel 4
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Eine
PVC-Membran wurde gemäß folgender
Vorgehensweise hergestellt.
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0,023
g Pluronic F-68 wurden in 7,5 mg Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Dann
wurden 0,5 g eines PVC-Pulvers (Molekulargewicht 200 000) zu der
Lösung
hinzugegeben. Das Polymer wurde über
Nacht stehen gelassen, um sich langsam zu lösen.
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Die
Lösung
wurde dann auf eine Cuprophandialysemembran gegeben, welche dann
für 90
sec mit 1000 Upm gedreht wurde, um eine dünne PVC-Membran herzustellen.
Die Dialysemembran fungierte als Trägermatrix für die PVC-Schicht.
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Eine
Kompositmembran des im Beispiel 2 beschriebenen Typs wurde dann
hergestellt, wobei allerdings die Schicht (i) durch die gemäß dem vorliegenden
Beispiel hergestellte PVC-Membran ersetzt wurde.
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Die
Kompositmembran wurde anschließend
in einen Sensor des oben beschriebenen Typs eingesetzt, der dann
sowohl bevor er Vollblut ausgesetzt wurde und auch nachdem er Vollblut
ausgesetzt wurde (die gesamte Einwirkungszeit betrug mindestens
40 min) kalibriert wurde; dies ist im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in der 5 gezeigt,
aus der sich eine Kalibrierung des Sensors, bevor er Vollblut ausgesetzt
wurde, von (☐)y = 6,664x – 0.507, und nachdem er Vollblut
ausgesetzt wurde, von (∎)y = 6,679x – 0.607 ergibt. Wie aus der 5 ersichtlich
ist, sind die Kalibrierungskurven vor und nach dem Ausgesetztsein
von Vollblut die gleichen. Dies zeigt deutlich, dass kein Biofouling
stattgefunden hat.
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Beispiel 5
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Eine
wie im Beispiel 4 beschriebene Enzymelektrode wurde zur Bestimmung
der Lactatkonzentrationen in insgesamt 8 Vollblutproben eingesetzt.
Die Elektrode wurde jeder Probe für etwa 5 min ausgesetzt und zwischen
den Messungen mit einer Pufferlösung
gewaschen. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die
mit einer Standardlactatanalysiervorrichtung (Yellow Spring Instruments)
erhalten wurden.
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Die
Ergebnisse sind in der 6 dargestellt. Es wurde festgestellt,
dass die Enzymelektrode zu dauerhaft höheren Werten führte. Wichtiger
ist jedoch, dass die beiden Verfahren über eine gute lineare Konzentration
verfügten.
Ein wichtiger und beachtenswerter Unterschied zwischen den beiden
Verfahren besteht darin, dass die Blutprobe vor der Analyse in der
Standardanalysiervorrichtung hoch verdünnt wird, während die Messung mit der Enzymelektrode
mit unverdünntem
Vollblut durchgeführt
wird. Dieser Unterschied sollte beim Vergleich der beiden Verfahren
berücksichtigt
werden.
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Beispiel 6
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0,06
g PVC wurden vollständig
in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst.
Zu der Lösung
wurden dann ein grenzflächenaktives
Mittel (100 ml) in einer Menge angegeben, die in der 7 wiedergegeben
ist. Die resultierende Lösung
wurde dann auf eine Glas-Petrischale (Innendurchmesser 9 cm) gegossen,
und die Schale wurde bedeckt, um eine langsame Verdampfung des Lösungsmittels
(2 d) zu bewirken. Die erhaltenen Membranen waren transparent, von
gleichmäßiger Dicke
und für
die Handhabung ausreichend robust.
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Die
Membranen wurden gemäß der folgenden
Vorgehensweise bewertet.
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Die
elektrochemische Zelle, polarisiert und konditioniert bei +650 mV
vs Ag/AgCl wurde mit einer Cuprophanmembran bedeckt, über die
ein Abschnitt der Testmembran gelegt wurde. Für eine Vielzahl von Spezies
(alle in einer Konzentration von 100 μM) wurde das Ansprechen bestimmt.
Dazu zählen
Ascorbat (Asc), Catechol (Cat), Hydrokaffeesäure (hydrocaffeic acid; HCA),
Wasserstoffperoxid (Per), Paracetamol (P'mol) und Dopamin (Dop). Die Ergebnisse
sind in der 7 gezeigt.
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Die
mit einem grenzflächenaktiven
Mittel modifizierten Membranen verfügt im allgemeinen über gute Permeabilitätseigenschaften,
welche denjenigen entsprachen, und möglicherweise besser waren als
diejenigen, welche mit der Cuprophanhämodialysismembran in einem
Phosphatpuffer erhalten wurden. Diese Permeabilität ist für die Hämodialyse
akzeptierbar und ist unabhängig
von dem pH-Puffer. In einem Puffer auf Basis einer Carbonsäure (Succinatpuffer
bei saurem pH) ändert
sich jedoch die Selektivität
des BEP (8) modifizierten PVC's zu derjenigen,
die mit PVC erhalten wurde, das mit Isopropylmyristat (man vergleiche WO-A-9216647)
weichgemacht wurde, indem polares Wasserstoffperoxid und Ascorbat
zurückgewiesen
wurden. Dieses „Änderungsverhalten" des mit BEP modifizierten
PVC müsste
bei vielen Anwendungen nützlich sein.
So kann es bei saurem Blut (pH 7,2) als eine hämodialysierende Membran bei Nierenbehandlungsanwendungen
eingesetzt werden. In alternativer Weise kann es bei pH >3 aufgrund seiner reduzierten
Permeabilität
als eine Außenmembran
einer amperometrischen Enzymelektrode zur Blutglucosebestimmung
eingesetzt werden.
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Beispiel 7
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Wie
bereits oben dargelegt wurde, kann es wünschenswert sein, dass ein
gewisses kontinuierliches Lecken des grenzflächenaktiven Mittels aus den
Membranen stattfindet. In diesem Beispiel wird der Verlust des grenzflächenaktiven
Mittels aus derartigen Membranen gezeigt.
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Membranen
aus PVC und 2 % V/V von entweder Teeen 80 oder Triton X-100 wurden nach den
oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Die erhaltenen Membranen
wurden anschließend
in destilliertem Wasser gewässert,
und der Gewichtsverlust der Membranen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten
während
des Zeitraumes von 12 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 9 gezeigt,
die aus sich selbst heraus verständlich ist.
Der Verlust des grenzflächenaktiven
Mittels hat hinsichtlich der Bereitstellung von sich selbst reinigenden Membranen
Vorteile.
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Beispiel 8
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Eine
gleichmäßige PVC-Membran
mit eingestellter Dicke wurde hergestellt, indem eine Lösung von PVC
(Molekulargewicht 20 000) in THF mit einem Gehalt von 12 Gew.-%
(bezogen auf das Gewicht des PVC) auf eine hoch-permeable Cuprophandialysemembran
aufgetragen wurde und die „spin
coating Technik" eingesetzt
wurde, um eine Laminatstruktur aus der Cuprophanmembran und der
PVC-Membran herzustellen, wobei letztere 10 % G/G Pluronic F-68
enthielt.
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Es
wurde eine Enzymelektrode hergestellt, welche aufwies:
- (i) eine Enzymschicht aus Lactatoxidase, die in einer Glutaraldehydmatrix
immobilisiert war,
- (ii) ein Laminat, das als Außenmembran beschrieben wird,
und
- (iii) eine selektive Innenschicht aus SPEES/PES (hergestellt
wie im Beispiel 2).
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Die
Enzymelektrode wurde in eine Durchflusszelle eingebaut, und Tests
wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
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Die
Elektroden wurden unter kontinuierlichen Flussbedingungen unter
Einsatz eines Doppellumenkatheters wie in der 10 gezeigt
getestet, der in einigen Tests eingesetzt wurde, um gepufferte Lactatlösung zur
Elektrode zu leiten und der in anderen Tests eingesetzt wurde, um
heparinisiertes Blut zur Elektrode zu leiten. Für letzterem Zweck strömt Heparin
von links nach rechts (wie in der 10 dargestellt)
entlang des Außenlumens
des Katheters hinein. Blut wird an dem linken Ende des Katheters
zugeführt,
so dass eine Mischung aus Heparin und Blut gebildet wird, die von
links nach rechts durch das Innenlumen des Katheters fließt. Das
resultierende hepariniserte Blut wird dann zu dem Sensor geführt.
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Es
wurden Tests mit Vollblut durchgeführt, das vermischt war mit
Heparin in einem Verhältnis
von 3 Volumenteilen Blut und 7 Volumenteilen Heparinlösung (200
IU ml–1).
Die Flussgeschwindigkeit betrug 10 ml h–1.
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11(a) zeigt die Ergebnisse, welche erhalten wurden
für die
Kalibrierung der Durchfluß-Lactat-Enzymelektrode
vor (☐)y = 54,366x – 2,237
und nach (∎)y = 50,678x – 1,743 der Überwachung
des gesamten Blutes während
eines Zeitraums von 3 h. Wie man sieht, blieb die Kalibrierung im
wesentlichen konstant.
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11(b) zeigt die Korrelation zwischen den Blutlactatkonzentrationen,
die on-line mit der Enzymelektrode und off-line mit einer Standardanalysiervorrichtung
bestimmt wurden: y = 1,042x + 0,078. r2 =
0,998. n = 9.
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11(c) zeigt die induzierten stufenweise Veränderungen
des Lactat in Vollblutproben, on-line überwacht mit einer Lactatenzymelektrode;
jedes Plateau entspricht dem im stationären Zustand gemessenen Werten.
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Beispiel 9
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Laminat
aus einer Cuprophandialysemembran und einer PVC-Membran wurden wie
im Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Dies gilt jedoch nicht für die Menge
des eingesetzten grenzflächenaktiven
Mittels.
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Für ein gemäß diesem
Beispiel hergestelltes Laminat enthielt das PVC (Molekulargewicht
215 000; ex Scientific Polymer Procuts Inc.) 60 Gew.-% (des PVC)
an Pluronic F-68. Dieses Laminat wurde eingesetzt, um eine Enzymelektrode
des im Beispiel 8 beschriebenen Typs zu konstruieren, wobei jedoch
die selektive Innenmembran weggelassen wurde.
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Ein
weiteres gemäß diesem
Beispiel hergestelltes Laminat enthielt eine Membran, die aus PVC
(Molekulargewicht 90 000; ex Fluka) mit einem Gehalt von 50 Gew.-%
an Pluronic F-68 hergestellt wurde und dazu eingesetzt wurde, eine
Enzymelektrode des im Beispiel 8 beschriebenen Typs zu konstruieren
(i.e. eine SPEES-PES Innenmembran wurde eingebaut).
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Mit
diesen Elektroden wurden Tests unter Einsatz eines Katheters des
in der 10 gezeigten Typs durchgeführt, wobei
eine Lösung
von 1 mM Lactat in Pufferlösung
(anstelle von heparinisiertem Blut) hergestellt wurde. Der Puffer,
pH 7,4, der für
diese und nachfolgende Beispiele eingesetzt wurde, war aufgebaut
aus 0,0528 M Na2HPO4,
0,0156 M NaH2PO4,
0,051 M NaCl und 0,0016 M K2EDTA.
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Die
Ergebnisse sind in der 12 gezeigt, in der
- (a) das Zeichen (✦) für die Elektrode steht, die über keine
selektive Innenmembran verfügte
und bei der das PVC 60 % G/G Pluronic F-68 enthielt, und
- (b) das Zeichen (✧) bezieht sich auf die Elektrode,
bei der eine SPEES-PES
Innenmembran vorhanden war und das PVC 50 % G/G Pluronic F-68 enthielt.
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Wie
aus der 12 ersichtlich ist, waren beide
Membranen für
Lactat permeabel. Bei derjenigen, welche durch die Linie (a) dargestellt
wird, fand ein Lecken des grenzflächenaktiven Mittels statt,
was dazu führte, dass
die Membran die Permeabilität
in einem derartigen Ausmaß verlor,
dass das Ansprechen auf Lactat schnell abnahm und innerhalb von
45 min auf die Grundlinie zurückging.
Die durch die Linie (b) wiedergegebene Membran hielt das grenzflächenaktive
Mittel in zufriedenstellender Weise zurück.
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Beispiel 10
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Es
wurde eine Enzymelektrode wie im Beispiel 8 hergestellt, jedoch
mit folgenden Ausnahmen:
- (i) Das PVC (Molekulargewicht
90 000) enthielt 50 Gew.-% (des PVC) an Pluronic F-68 und
- (ii) in die Enzymschicht waren zwei Katalaseeinheiten inkorporiert.
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Es
wurde eine ähnliche
Elektrode hergestellt, bei der jedoch die Katalase fehlte.
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13 zeigt
die Kalibrierung des Flusses durch die Lactatenzymelektroden, die
mit einem Doppellumenkatheter des in der 10 gezeigten
Typs kombiniert waren, wobei verschiedene Konzentrationen von in Puffer
gelöstem
Lactat eingesetzt wurden. In der 13 steht
(•) für das Enzymlaminat
mit Katalase und (o) steht für
Laminat ohne Katalase.
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Die
Katalase aufweisende Membran bewirkt ein niedriges Ansprechen, was
durch Bereitstellung einer nicht-diffusen „Vertiefung" für einen
Teil des produzierten Wasserstoffperoxids zu einem beschleunigten
dynamischen Ansprechen für
den Sensor führt.
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Beispiel 11
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Mehrere
Enzymelektroden des im Beispiel 8 beschriebenen Typs wurden hergestellt,
wobei jedoch
- (i) das PVC (Molekulargewicht
90 000) 60 Gew.-% (des PVC) an Pluronic F-68 enthielt und
- (ii) es sich bei der selektiven Innenmembran um PTFE, PS oder
SPEES-PES handelte.
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Die
SPEES-PES Membran wurde wie im Beispiel 2 hergestellt. Die PS (Polysulphon)
Membran wurde aus PS mit einem Molekulargewicht von 50 000 (ex Aldrich)
durch Lösen
von 2 % G/V in THF und Stehenlassen der Lösung über Nacht hergestellt. Die
Membranen wurden gemäß dem zuvor
beschriebenen „spin
coating"-Verfahren
(Beispiel 4) hergestellt. Es wurde ein Volumen von 100 bis 800 ml
der 2 % W/V Polymerlösung aufgetragen.
Bei der PTFE-Membran handelte es sich um nr 4106 ex Universal Sensors
Inc.
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Die
Enzymelektroden wurden mit einem Doppellumenkatheter des in der 10 gezeigten
Typs verbunden, der eingesetzt wurde, um verschiedene Konzentrationen
von Lactat, das in einem Puffer gelöst war, zur Durchführung der
Kalibrierung bereitzustellen.
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Die
Ergebnisse sind in der 14 gezeigt, in der (o) den Einsatz
der PTFE-Innenmembran, (•)
den Einsatz von PES und (☐) den Einsatz von SPEES-PES wiedergibt.
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Das
SPEES-PES war hinsichtlich Wasserstoffperoxidpermeabilität überlegen.
PTFE stellte jedoch eine gute Alternative dar, da die Selektivität und die
Ansprechzeit ähnlich
waren.