DE68911299T3

DE68911299T3 - Enzymelektrode und verfahren zur herstellung.

Info

Publication number: DE68911299T3
Application number: DE68911299T
Authority: DE
Inventors: Nabil El Murr; Mohamed Slilam
Original assignee: GWENT SENSORS Ltd
Current assignee: Gwent Sensors Ltd Pontypool Gb
Priority date: 1988-04-20
Filing date: 1989-04-19
Publication date: 2001-06-21
Anticipated expiration: 2009-04-20
Also published as: WO1989010395A1; DE68911299D1; DE68911299T2; FR2630546B1; FR2630546A1; EP0409896B1; EP0409896A1; JPH03503931A; EP0409896B2; US5272087A

Description

Die vorliegende Erfindung wurde im Laboratoire R. M. N. et Réactivité Chimique de l'Universite de Nantes, Unité associée au Centre National de la Recherche Scientifique N. 472 gemacht.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine enzymatische Elektrode, insbesondere auf eine Elektrode mit durch Abreiben oder Abschneiden erneuerbarer Oberfläche, in einer Weise, daß ihre brauchbare Oberfläche immer gleich bleibt, was auch immer die Form und die Anwendung der Elektrode sei. Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf eine enzymatische Elektrode, die weggeworfen werden kann. Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf das Verfahren zur Herstellung dieser Elektrode.
Eine enzymatische Elektrode ergibt sich durch die Vereinigung einer elektrochemischen Einfangverbindung mit einem insbesondere immobilisierten Enzym. Das Funktionieren einer derartigen Elektrode basiert auf dem Prinzip, daß ein enzymatischer Abbau des zu bestimmenden Substrats durchgeführt und parallel dazu das Auftreten oder Verschwinden eines der Reaktionsprodukte gemessen wird.
So ist im Fall der Glucose-Elektrode, die als Enzym Glucose- Oxydase umfaßt, die enzymatische Reaktion die folgende:
Verschiedene Arten des elektrochemischen Nachweises sind denkbar, und zwar die Messung des Verschwindens von O&sub2;, oder die Messung des Auftretens des H&spplus; -Ions und die anodische Oxidation des H&sub2;O&sub2; (Platinelektrode) zur angelegten Spannung und die Messung des daraus resultierenden Stroms.
Zur Immobilisierung der Enzyme sind verschiedene Verfahren bekannt, nämlich das Einschließen, gemäß dem das Enzym auf mechanische Weise in einem Polymer in Form eines Gels eingeschlossen wird, die Vernetzung gemäß der bifunktionelle chemische Moleküle wie Glutaraldehyd die Vernetzung der Enzymmoleküle unter sich erlauben oder ihre Co-Vernetzung mit inaktiven Proteinen wie Gelatine und Albumin, die Abkapselung, gemäß der das genannte Enzym in Lösung, im Inneren eines Bereichs von der zu bestimmenden Lösung, durch eine poröse Membran abgetrennt ist, die nur kleine Moleküle hindurchläßt und die kovalente Fixierung, die durch Reaktion zwischen funktionellen Gruppen, welche durch eine aktivierte Oberfläche gestützt werden, und funktionellen Gruppen des Enzyms, die nicht zur katalytischen Aktivität derselben beitragen, erfolgt.
Zudem kann die Abhängigkeit der enzymatischen Reaktion von der in der Lösung gelösten Sauerstoffmenge in bestimmten Fällen, insbesondere bei Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten, ein einschränkender Faktor für dieses Bestimmungsverfahren sein. Tatsächlich können Veränderungen des Sauerstoffdrucks zu bedeutenden Schwankungen der Anzeige der Elektrode führen; gleichermaßen sind diese Anzeigen falsch, wenn die vorliegende Sauerstoffmenge gering wird.
Diese Nachteile haben dazu geführt, die Verwendung von Sauerstoff-Substituten zu empfehlen, insbesondere Ferrocen und seine Derivate, die man als Überträger bezeichnet. Die sich in diesem Fall ergebenden Reaktionen sind für den Fall der Bestimmung von Glucose durch eine Glucose-Oxydase-GOD-Elektrode mit Ferrocen als Überträger die folgenden:
Glucose + GOD[OX] + H&sub2;O → Gluconsäure + GOD[red] (1)
GOD[red] + 2(C&sub5;H&sub5;)&sub2; Fe&spplus; → GOD[OX] + 2(C&sub5;H&sub5;)&sub2;Fe + 2 H&spplus; (2)
2(C&sub5;H&sub5;)&sub2;Fe 2(C&sub2;H&sub5;)2Fe&spplus; + 2e&supmin; (3)
Der enzymatische Nachweis ist die Oxidation der "nackten" Elektrode des Ferrocens zum Ferricinium-Kation (Reaktion 3). Das Ferrocen kann nun in katalytischer Menge in bezug auf Glucose zugeführt werden und der sich aufgrund seiner elektrochemischen Rückbildung ergebende Strom dient als Signal für den Nachweis und die Bestimmung der Glucose.
Dieses Verfahren erlaubte es zufriedenstellende Ergebnisse zu erhalten, es beinhaltet jedoch zuweilen den überwiegenden Nachteil, eine Substanz zuzufügen, die dem Milieu fremd ist und die sich als toxisch erweisen kann.
Herkömmlicherweise werden die Enzyme in den enzymatischen Elektroden nahe den Oberflächen der Elektrode gehalten. Dies ist insbesondere bei der GOD-Elektrode der Fall, die von T. IKEDA et al. in Agric. Biol. Chem. 49(29), 541-543, 1985 und Agric. Biol. Chem. 50(4), 883-890, 1986 beschrieben wird, wobei die mit GOD beladene Oberfläche der Elektrode mit einer Folie aus Nitrocellulose (siehe Europäische Patentanmeldung EP-A-177 743) überzogen ist. In der Veröffentlichung "Analytical Sciences, Dezember 1985, Bd. 1", Seiten 455-457 beschreiben IKEDA et al. eine GOD-Elektrode, bei welcher die Schicht aus GOD, die auf die Elektrode aufgebracht ist, mit einer Dialyse-Membran, einem Mini-Gitter aus Gold und einem "Nylon"-Netz überzogen ist.
Es wird festgestellt, daß gemäß dem älteren Verfahren der Fixierung des Enzyms an der Oberfläche der Elektrode, man gezwungen ist, das Enzym durch eine gegenüber der Lösung durchlässigen und gegenüber dem Enzym nichtdurchlässigen "Haube" zu schützen. Es wurde gleichermaßen vorgeschlagen, das Enzym auf einem chemischen Träger zu fixieren.
Die vorher erwähnten enzymatischen Elektroden erlauben es eine bestimmte Anzahl von spezifischen Nachweisen durchzuführen, sie sind jedoch häufig in der Anwendung problematisch, denn sie benötigen vor jeder Messung eine sehr genaue Herstellung und sie sättigen sich ziemlich schnell.
Darüber hinaus kann die Oberfläche der Elektrode leicht beschädigt werden, woraus ein Signalverlust und eine Verminderung der Reproduzierbarkeit resultiert. Tatsächlich ist die Oberfläche nicht erneuerbar, es sei denn, man führt jedes Mal eine Regenerierungs-Behandlung durch. Übrigens können sich im Fall der Enzymfixierung durch chemische Reaktion, insbesondere bei der Fixierung mehrerer unterschiedlicher Enzyme an der Oberfläche der Elektrode, Überlagerungen oder Konkurrenzreaktionen ausbilden, die oft die Herstellung der Elektrode unkontrollierbar machen.
Es wird gemäß der Erfindung vorgeschlagen, Enzyme in einer leitfähigen Matrix einzuschließen. Für die Analysen ist diese Matrix vorteilhafterweise in einer inerten Hülle, in einem Isoliermaterial, z. B. aus Glas oder einem Kunststoffmaterial enthalten, aus dem sie an einem äußersten Ende austritt, um die geeignete Oberfläche zu bilden. Vor der Messung genügt es, falls es sich als notwendig erweist, kurz die Elektrode z. B. durch einfaches Abreiben auf einem Stück Papier zu reinigen, wodurch die verwendete Oberflächenschicht von einigen Angström entfernt wird, dann taucht man die Elektrode, deren Oberfläche derartig regeneriert worden ist, in das flüssige, zu analysierende Milieu ein.
Die Elektrode der Erfindung ist zu geringsten Kosten leicht herstellbar, sie läßt sich leicht aufbewahren, sie ist immer gebrauchsbereit, sie ist sehr gut handhabbar und liefert reproduzierbare Ergebnisse. Sie kann ohne Schwierigkeiten ein multienzymatisches System einschließen, ebenso wie einen Elektronenüberträger und/oder ein Coenzym. Sie kann ebenso für den einmaligen Gebrauch und zum Wegwerfen bestimmt sein.
Die enzymatische Elektrode gemäß der Erfindung entspricht somit dem Anspruch 1.
In FEBS Letters, Band 59, Nr. 2, November 1975 beschreiben C. Calvot et al. die Herstellung einer Membran durch Vermischen von Lysin-Decarboxylase mit einer Lösung, die Plasma- Albumin und Glutaraldehyd enthält, der Zugabe von magnetischen Eisenoxid-Teilchen, Ausgießen der Suspension auf eine Platte, um eine Membran von homogener Dicke zu erhalten, Härtung während 2 Stunden bei Umgebungstemperatur und Abtrennen der gebildeten Folie. Diese Folie wird (durch einen Magneten, was die Gegenwart von magnetischem Eisenoxid-Teilchen in der Membran erklärt) auf einer Elektrode auf pCO&sub2; fixiert, auf welcher man das Vorliegen eines porösen Blattes und einer gasdurchlässigen Membran feststellen kann. Somit erfolgt mit dieser bekannten Elektrode eine enzymatische Reaktion auf dem Niveau der Folie, anschließend eine Diffusion des CO&sub2;-Gases, dann einen Nachweis auf dem Niveau der Elektrode. Der enzymatische Teil und der Nachweisteil sind somit voneinander unabhängig. Die ursprüngliche Idee, auf der die vorliegende Erfindung beruht, war es, diese zwei herkömmlichen Teile der Elektrode zu kombinieren, was es erlaubt, die Gesamtheit an Problemen, die letztere mit sich bringen, zu lösen. Die in den bekannten Strukturen bestehende Trennung zwischen dem enzymatischen Teil und dem Nachweisteil ergibt Probleme der Permeabilität, also der Diffusion und des Nachweises, der Diffusionskinetik, die auf die Reproduzierbarkeit des Signals einwirken. Übrigens führt der Gebrauch einer enzymatischen Membran zu Schwierigkeiten, die verbunden sind mit der Herstellung von Membranen, die auf den Körper des Detektors aufgebracht werden und die von konstanter Dicke sein sollen, um die korrekte Diffusion der Produkte zu gewährleisten. Schließlich ist es schwierig, bei einer Membran eine konstante Zusammensetzung im Laufe der Zeit zu gewährleisten, was einen nachteiligen Einfluß auf den repetitierenden Charakter der Messungen hat.
Die Trennung der enzymatischen Teile und des Nachweises wird gleichermaßen bei enzymatischen Elektroden beobachtet, die in dem amerikanischen Patent US-A-4 224 125 und in der europäischen Patentanmeldung EP-A-177 743 beschrieben werden. Das Dokument US-A-4 321 123 beschreibt eine enzymatische Elektrode, bei der das Enzym nicht in der Elektrodenmasse aufgenommen wird, sondern an der Oberfläche der Elektrode gebunden ist.
Als Enzym läßt sich in der Elektrode gemäß der Erfindung, jedes Enzym verwenden, das befähigt ist, eine Reaktion mit dem zu analysierenden Substrat und/oder mit jeder anderen Substanz einzugehen, die ein repräsentatives, elektrisches Signal des zu analysierenden Substrats liefern kann.
Die geläufigsten Enzyme sind insbesondere die Oxydoreduktasen, die die Verwendung eines Reagens, genannt Überträger, für die Elektronenübertragung voraussetzen. Der Ursprung des Enzyms ist auf keinen Fall entscheidend, denn die Elektrode gemäß der Erfindung beruft sich nur auf ihre Reaktionseigenschaft, die direkt oder indirekt auf elektrochemischem Weg nachgewiesen werden kann.
Es ist ebenfalls möglich, gemeinsam mit einem gegebenen Enzym sein Co-Enzym zu verwenden, welches selbst auf elektrochemischem Weg nachgewiesen werden kann. Dies ist z. B. bei verschiedenen Deshydrogenasen der Fall.
Die in der leitfähigen Matrix vorliegende Enzymmenge kann in großen Grenzen in Abhängigkeit von der eigenen Aktivität eines jeden Enzyms variieren. Je höher die Aktivität des Enzyms ist, um so geringer ist die Gewichtsmenge an Enzym in der Matrix, wobei beobachtet wird, daß übertriebene Enzymmengen nicht bei der eigentlichen Messung stören, jedoch unnötigerweise teuer sind. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die minimale Enzymmenge derartig sein soll, daß sie ein praktisch auswertbares Meßsignal liefert. Zum Beispiel können für die Glucose-Oxydase (GOD)-Elektrode die Mengen zwischen 0,4 bis 15 Gew.-%, bei einem Enzym mit einem UI = 200 und insbesondere von 1,5 bis 5 Gew.-%, variieren.
Die Korngröße des leitfähigen Pulvers ist nicht bedeutsam; es wurden gute Ergebnisse mit einem Pulver einer Korngröße von 1 um bis 25 um, z. B. einem Mittelwert von 5 um, erhalten.
Das leitfähige Pulver wird insbesondere aus Kohlenstoffpulvern oder Graphitpulvern ausgewählt.
Vorzugsweise wird die Matrix aus einer Mischung des Pulvers mit einem inerten Bindemittel gebildet, d. h. das nicht im betrachteten Spannungsbereich reagiert und welches insbesondere zu 10 bis 40 Gew.-% in bezug auf die so erhaltene, pastenförmige, leitfähige Matrix verwendet wird.
Das Bindemittel ist vorzugsweise ein hydrophobes Bindemittel; mit Paraffinöl, α-Bromnaphthalin und Silikonöl erhielt man gute Ergebnisse. Bezüglich der Wahl des Bindemittels, kann man sich auf R. N. Adams in "Electrochemistry at solid electrodes", Herausg. Marcel DEKKER, New York, 1969 beziehen. In bestimmten Fällen kann auf das Bindemittel verzichtet werden, wenn sich z. B. das Kohlenstoffpulver im matrixfähigen Zustand befindet.
Die Menge des Bindemittels wird derartig ausgewählt, daß die Matrix nicht zu fluid durch Bindemittelüberschuß wird und sie umgekehrt nicht durch Mangel an Bindemittel brüchig wird.
Übrigens wird das Enzym im Kern der Matrix des leitfähigen Materials durch Vermittlung wenigstens eines Vernetzungsmittels oder auch durch physikalischen Einschluß in der Basismatrix der Elektrode, z. B. aus Kohlenstoff, immobilisiert. Als Vernetzungsmittel läßt sich Glutaraldehyd aufführen.
Gemäß der Erfindung läßt sich ebenfalls vorhersehen, daß die Matrix des leitfähigen Materials darüber hinaus wenigstens einen Überträger in einer Menge von 0,01 bis 3 Gew.-%, insbesondere von 0,05 bis 1 Gew.-% bezogen auf die Matrix, umfaßt, wobei dieser Überträger insbesondere ausgewählt ist aus Ferrocen, Nickelocen und ihren Derivaten, ebenso wie dem Benzochinon und anderen Elektronenübertragungs-Reagenzien.
Zum Beispiel können Derivate des Ferrocens, die als Überträger in Lösung von A. E. G. Gass et al. in "Anal. Chem. 1984, 56, 667-671" beschrieben werden, in die Matrix der Erfindung eingebaut werden.
Die Matrix der Elektrode gemäß der Erfindung kann gleichermaßen wenigstens ein Coenzym umfassen.
Zur Herstellung der enzymatischen Elektrode gemäß der Erfindung, vermischt man in einer ersten Ausführungsform innig:
- eine Paste oder homogene Matrix, die sich aus der innigen Vermischung eines leitfähigen Pulvers mit einem Bindemittel ergibt
- wenigstens ein Enzym
- eine Vernetzungslösung für das Enzym;
und in einer zweiten Ausführungsform vermischt man innig ein leitfähiges, zu einer Matrix verarbeitbares, Pulver und wenigstens ein Enzym und unterwirft diese Mischung mechanischen Beanspruchungen, insbesondere Drücken, um eine feste Matrix zu erhalten, die das Enzym physikalisch gebunden einschließt.
In beiden Fällen kann man der Paste oder der Matrix oder der Mischung einen Überträger und/oder ein Coenzym einverleiben.
In dem Fall, in dem die Paste oder Matrix oder die Mischung einen Überträger umfaßt, kann man eine Fraktion des leitfähigen Pulvers, das in homogener Form den Überträger einschließt, durch Vermischen des letzteren in organischem Lösungsmittel mit dem leitfähigen Pulver, anschließendem Verdampfen des Lösungsmittels und Zumischen dieser Fraktion zur leitfähigen Matrix, die das Enzym umfaßt, herstellen.
Für die Analysen ist die Anordnung unter Verwendung der Elektrode der Erfindung eine herkömmliche, wobei das eine der äußeren Enden der Elektrode mit der Lösung in der Meßzelle in Kontakt gebracht wird und das andere mit dem elektrischen Stromkreis des Potentiostats. Die enzymatische Elektrode gemäß der Erfindung kann unterschiedliche Formen annehmen, unter anderem eine tragbare Form für den erneuten Gebrauch oder für den einmaligen Gebrauch.
Die Erfindung wird, ohne in irgendeiner Weise durch die nachfolgende Beschreibung eingeschränkt zu werden, anhand der beigefügten Zeichnungen und der nachstehenden Beispiele, in denen die Prozentgehalte gewichtsbezogen sind, es sei denn, es wird etwas Gegenteiliges angegeben, erläutert:
- Die Fig. 1 bis 19 sind Diagramme, welche die Ergebnisse der Analysen und Ergebnisse der Messungen zeigen, die mit den Elektroden gemäß der Erfindung durchgeführt wurden:
- Die Fig. 20 zeigt schematisch eine Elektrode gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, wobei diese Elektrode eine allgemein röhrenförmige Form aufweist.
Die Elektrode 1 wird in schematischer Form in der Fig. 20 gezeigt. Sie ist aus einer Träger-Elektrode 2, an deren einem äußeren Ende ein Ablesefenster 3 angebracht ist und die am anderen Ende mit einem Kontakt 4 abschließt, zusammengesetzt. In der Nähe dieses Kontaktes besitzt die Träger-Elektrode einen sehr kleinen Durchmesser; dieser Teil 5 des sehr kleinen Durchmessers trägt ein Gewinde 6. Die Matrix 7 gemäß der Erfindung, die das Enzym umfaßt, ist in einer zylindrischen Umhüllung 8 angeordnet, dergestalt, daß sie an einer der äußeren Enden der Umhüllung 8 herausragt, um die geeignete Oberfläche 9 der Elektrode zu bilden. Die Umhüllung 8 verlängert sich zum entgegengesetzten äußeren Ende, jenseits von der Matrix 7, um einen Teil 10 zu bilden, der ein Gewinde 11 umfaßt, das zum Zusammenwirken mit dem Gewinde 6 der Träger- Elektrode 2 bestimmt ist, wobei der Kontakt 4 konstant auf der Fläche 9a der Matrix 7, entgegengesetzt zur Oberfläche 9, gestützt wird.
Darüber hinaus umfaßt die Umhüllung 8 in der Nähe ihres Randes, der mit dieser Oberfläche 9 verbunden ist, ein Außengewinde 12, das zum Zusammenwirken mit dem Innengewinde 13 des peripheren Mantels 14 einer Kappe 15 bestimmt ist, auf deren Boden 16 eine Scheibe 17 aus Filterpapier oder Filz oder einem analogen Material aufgebracht ist. Eine Hilfselektrode und/oder Referenzelektrode 18 ist mit der enzymatischen Elektrode 7 verbunden.
Bei der Anwendung wird die Kappe 15 abgeschraubt. Nach jedem Gebrauch bringt man die Kappe 15 wieder an und um die brauchbare Oberfläche 9 zu regenerieren, kann man die Träger-Elektrode 2 leicht drehen, was das Abreiben dieser Oberfläche 9 gegen die Scheibe 17 gewährleistet.

Beispiel 1:

Glucosemessung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Glucose-Oxydase enthält, in Gegenwart der Monocarbonsäure des Ferrocens als Überträger im analytischen Medium.

a) Herstellung der Elektrode

Man vermischt 1 g eines Kohlenstoff-Pulvers mit einer mittleren Korngröße von 5 um (Carbone Lorraine) und 0,36 ml Paraffinöl bis zum Erhalt einer homogenen Paste.
Man vermischt innig 300 mg der so erhaltenen Kohlenstoffpaste mit 0,3 ml einer Vernetzungslösung, die die folgende Formulierung aufweist:
2,5%iger Glutaraldehyd............................ 25%
15%iges Kälberalbumin............................... 29%
Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert = 6,8................. 56%
sowie mit einer ausgewählten Menge an Glucose-Oxydase.
Man läßt die so erhaltene Mischung in einer Reibschale bei 4ºC während 10 bis 30 Minuten stehen. Es wird abgeschabt, um eine Art Pulver zu erhalten, das mit 0,06 ml Paraffinöl aufgenommen wird.

b) Analyse der Glucose

Diese Analyse wird in Gegenwart der Monocarbonsäure des Ferrocens als Überträger durchgeführt; die durchgeführten Reaktionen waren die gleichen wie sie in der Einleitung der vorliegenden Beschreibung für das Ferrocen aufgeführt wurden. Das analytische Medium ist eine Phosphat-Pufferlösung vom pH- Wert 8-9.
Die Fig. 1a) zeigt die Form des in cyclischer Voltametrie erhaltenen Signals mit dieser Elektrode, während sich die Monocarbonsäure des Ferrocens nur in Lösung befindet. Die so erhaltene Kurve i = f(E) entspricht der Oxidation der genannten Säure in das entsprechende Ferrocenyl-Kation.
Die Fig. 1b) wird erhalten, wenn Glucose der vorhergehenden Lösung zugegeben wird. Man stellt eine Zunahme des Oxidationsstromes in Gegenwart der Glucose fest.
Es muß bemerkt werden, daß kein Strom mit der Elektrode bei dieser Spannung zu entdecken ist, da der Überträger nicht in der Lösung vorliegt, selbst wenn die Lösung Glucose enthält.
In der Fig. 2 sind die Empfindlichkeits-Kurven i = f(C) dieser Elektrode, in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration, für verschiedene GOD-Konzentrationen in der Kohlenstoff-Paste der Elektrode, unter den folgenden Bedingungen aufgetragen:
- Überträger-Konzentration im analytischen Milieu:
0,5 · 10&supmin;³ M
- pH-Wert = 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s

Legend der Fig. 2

Abszissen: Glucose-Konzentration in mmol

Ordinaten: Stromstärke in gA

Kurve Anzahl der Einheiten an GOD · 10&supmin;³ pro Gramm Kohlenstoffpaste

a) 1,4
b) 2,8
c) 4,3
d) 5,8
Die Fig. 2 zeigt die Linearität der Empfindlichkeit der Elektrode in Abhängigkeit von der Glucose-Konzentration. Die 4 Geraden dieser Figur zeigen, daß je höher die Konzentration an GOD in der Paste der Elektrode ist, desto größer ist das Signal, d. h. desto empfindlicher ist der Nachweis.
In der Fig. 3 sind die Empfindlichkeits-Kurven i = f(C) dieser Elektrode, in Abhängigkeit von der Konzentration des Überträgers, für verschiedene Glucose-Konzentrationen unter den folgenden Bedingungen aufgetragen:
- Konzentration an GOD in der Paste: 1,5 Gew.-% (10³ Einheiten pro Gramm Paste)
- pH-Wert = 8,8
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s

Legende der Fig. 3

Abszissen: Überträger-Konzentration im analytischen Milieu in mmol

Ordinaten: Stromstärke in uA

Kurve Glucose-Konzentration in 10&supmin;³ M

a) 0
b) 6
c) 12
d) 18
e) 21
f) 30
Die Fig. 3 zeigt, daß die Empfindlichkeit des Signals umso höher ist, je größer die Konzentration der Lösung an Überträger ist.

Beispiel 2

Glucosemessung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Glucose-Oxydase und p-Ferrocenyl-Anilin als Überträger enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Man löst eine ausgewählte Menge an p-Ferrocenyl-Anilin (C&sub5;H&sub5;)Fe(C&sub5;H&sub4;-C&sub6;H&sub4;-NH&sub2;) in Methylenchlorid und fügt der erhaltenen Lösung eine bestimmte Menge an Kohlenstoff-Pulver, analog zum Beispiel 1, hinzu. Unter Rühren der Mischung läßt man das Methylenchlorid verdampfen. Nach dem Verdampfen des gesamten Lösungsmittels erhält man ein Kohlenstoff-Pulver, das den Überträger in homogener Form enthält.
Es können zwei Verfahren zur Herstellung der Paste, die als Elektrode dient, angewendet werden:
a) Man vermischt 1 g dieses Pulvers, mit 0,36 ml Paraffinöl bis man eine homogene Paste erhält, dann vermischt man innig 300 mg der so erhaltenen Kohlenstoff-Paste mit 300 mg der gemäß Beispiel 1 hergestellten, GOD enthaltenden, Paste.
b) Man stellt ein das Enzym enthaltendes Pulver her, indem man z. B. 1 g des Kohlenstoff-Pulvers mit 1 ml der Vernetzungslösung, die das Enzym enthält, gemäß Beispiel 1 vermischt und läßt bei 4ºC während 10 bis 30 Minuten stehen, dann wird abgeschabt, um eine Art feines Pulver zu erhalten. Die Paste für die Elektrode wird nun hergestellt, indem man z. B. 1 g dieses Pulvers mit 1 g des Pulvers vermischt, das den Überträger und 0,72 ml Paraffinöl enthält.

b) Analyse der Glucose

Die durchgeführten Reaktionen sind analog den in Beispiel 1 aufgeführten. Das analytische Milieu ist ein Phosphatpuffer vom pH-Wert von ca. 8,8.
Die Fig. 4a) zeigt die Form des in cyclischer Voltametrie erhaltenen Signals i = f(E) in dem vorstehenden Puffer und in Abwesenheit von Glucose, mit einer Elektrode, die GOD und den Überträger enthält. Die Fig. 4b) zeigt das gleiche Signal nach der Zugabe von Glucose.
In der Fig. 5 sind die Kurven 1/R = f(1/C) aufgetragen, wobei R das Verhältnis des in Gegenwart von Glucose erhaltenen Signals zu dem in Abwesenheit von Glucose erhaltenen Signals ist und C die Konzentration an Glucose, ausgedrückt in mmol, ist. Die Bedingungen waren die folgenden:
- Menge des Überträgers in der Paste: 0,4%;
- Menge an GOD in der Paste: 7 · 10³ E/g;
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s
Es wird eine lineare Korrelation zwischen 1/R und 1/C erhalten.
Es wurden ebenfalls lineare Korrelationen zwischen 1/R und 1/C erhalten, wenn man die Konzentration des Überträgers und die des Enzyms in der Elektrode veränderte.
In der Fig. 6 ist die Kurve aufgetragen, die die Amplitude des Signals i in uA zur Konzentration der Glucoselösung in mmol in Beziehung setzt. In der Fig. 7 wurde der lineare Teil dieser Kurve aufgetragen, d. h. für Glucose- Konzentrationen, die gleich oder geringer als 10&supmin;² Mol · 1&supmin;¹ sind.
Die Bedingungen in diesen zwei Fällen waren die folgenden:
- Menge an Überträger in der Paste: 0,46%;
- Menge an GOD in der Paste: 5,15 · 10³ E/g;
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s
- Phosphat-Pufferlösung: 0,1 M; pH-Wert = 7
In der Fig. 8 ist die Kurve aufgetragen, die die Veränderung von R in Abhängigkeit der Überträger-Konzentration (ausgedrückt in % bezogen auf die gesamte Paste) zeigt. Die Bedingungen waren die folgenden:
- Glucose-Konzentration im analytischen Milieu: 20 · 10&supmin;³ M
- GOD-Konzentration in der Elektrode: 2,9% (entspricht 6,25 · 10³ E/g)
- pH-Wert = 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s
Diese Kurve zeigt, daß, obwohl ein bedeutendes Signal für alle Überträger-Konzentrationen (von 0 bis 0,6%) analysiert wird, geht dieses durch ein Maximum für Konzentrationen, die ungefähr 0,15% betragen.
In der Fig. 9 ist die Kurve aufgetragen, die die Veränderung von R in Abhängigkeit von der GOD-Konzentration in der Elektrode (ausgedrückt in E GOD/g Paste), für Überträger-Konzentrationen von 0,15 und 0,2% (die jeweiligen Kurven a und b) in bezug auf die gesamte Paste unter den folgenden Bedingungen darstellt:
- Glucose-Konzentration, festgelegt auf 20 · 10&supmin;³ M;
- pH-Wert = 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s
Man bemerkt hier ebenfalls, daß ein Signal-Optimum erhalten wird, wenn die Elektrode etwa 5 · 10&supmin;³ Einheiten an GOD/g enthält. Das Signal bleibt jedoch für Konzentrationen unterhalb und oberhalb dieses Wertes immer stark und auswertbar.

Beispiel

Galactosemessung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Galactose-Oxydase und p-Ferrocenyl-Anilin als Überträger enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 2a) verfahren, wobei GOD durch Galactose-Oxydase ersetzt wird.

b) Analyse der Galactose

Die Fig. 10a) zeigt die Form des in cyclischer Voltametrie erhaltenen Signals 1 = f(E) mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9, in Abwesenheit von Galactose und die Fig. 10b) zeigt dieses gleiche Signal nach der Zugabe von Galactose.

Beispiel 4:

L-Leucin-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die die L-Aminosäure-Oxydase und p-Ferrocenyl-Anilin enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 2a) verfahren, wobei GOD durch die L-Aminosäure-Oxydase ersetzt wird.

b) Analyse des L-Leucins

Die Fig. 11a) zeigt die Form des mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltenen Signals in Abwesenheit von L-Leucin und die Fig. 11b) zeigt die Auswirkung der Zugabe von L-Leucin.

Beispiel 5:

Glucose-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Glucose-Oxydase und Nickelocen (C&sub5;H&sub5;)&sub2;Ni enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 2a) verfahren, wobei p-Ferrocenyl- Anilin durch Nickelocen (C&sub5;H&sub5;)&sub2;Ni ersetzt wird.

b) Analyse der Glucose

Die Fig. 12 zeigt das mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltene Signal, in Abwesenheit von Glucose (Kurve a) und nach der Zugabe von Glucose (Kurve b).

Beispiel 6:

Glucose-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Glucose-Oxydase und Benzochinon enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 2a) verfahren, wobei p-Ferrocenyl- Anilin durch Benzochinon ersetzt wird.

b) Analyse der Glucose

Die Fig. 13 zeigt die Form des mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltenen Signals, in Abwesenheit von Glucose (Kurve a) und nach der Zugabe von Glucose (Kurve b).

Beispiel 7:

Saccharose-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Invertase und Glucose-Oxydase und die Monocarbonsäure des Ferrocens als Überträger in Lösung enthält.

a) Darstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, unter Verwendung von 20 mg GOD/ (6300 E/g Paste) und 20 mg Invertase (24 000 E/g Paste), wobei die Gesamtmenge an Kohlenstoff-Pulver 300 mg beträgt.

b) Analyse der Saccherose

Die Fig. 14 zeigt die Form des mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltenen Signals, in Abwesenheit von Saccharose (Kurve a) und nach der Zugabe von Saccharose (Kurve b).
In der Fig. 15 sind die Veränderungen von I-Io Abhängigkeit von der Konzentration an Saccharose (ausgedrückt in mmol), unter den folgenden Bedingungen aufgetragen:
- Phosphatpuffer-Milieu eines pH-Werts von ca. 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s.
Die Beziehung zwischen dem Signal und der Saccharose-Konzentration ist linear.

Beispiel 8:

Saccharose-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Invertase und Glucose-Oxydase und p-Ferrocenyl- Anilin enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Es wird wie im Beispiel 2 verfahren, unter Verwendung der folgenden Konzentrationen:
- GOD: 300 E/g Paste
- Invertase: 28 000 E/g Paste
- p-Ferrocenyl-Anilin: 0,1 Gew.-%, auf die Paste bezogen

b) Analyse der Saccharose

Die Fig. 16 zeigt die Form des mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltenen Signals, in Abwesenheit von Saccharose (Kurve a) und nach der Zugabe von Saccharose (Kurve b).
In der Fig. 17 sind die Veränderungen von I in Abhängigkeit von der Konzentration an Saccharose (ausgedrückt in mmol), unter den folgenden Bedingungen aufgetragen:
- Phosphatpuffer-Milieu eines pH-Werts von ca. 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 2 mV/s.
Die Beziehung zwischen dem Signal und der Saccharose-Konzentration ist linear.
Die Messung der Saccharose kann vorteilhafterweise mit Hilfe einer Elektrode aus 3 Enzymen durchgeführt werden, indem man der unter a) beschriebenen Paste Mutarotase einverleibt, die das bestehende Gleichgewicht zwischen den Anomeren α und β der Glucose (das sich aufgrund der Invertase bildet) zugunsten der letzteren verschiebt, welche nun direkt durch die Elektrode nachgewiesen werden kann. Eine derartige Elektrode aus 3 Enzymen zeigt nun ein Signal an, daß viel stärker ist als das, welches durch die Elektrode mit zwei Enzymen gegeben ist, und sie erlaubt somit die Messung von sehr geringen Saccharose-Konzentrationen.

Beispiel 9:

Ethanol-Messung mit Hilfe einer Elektrode aus Kohlenstoffpaste, die Alkohol-Deshydrogenase und NAD&spplus; enthält.

a) Herstellung der Elektrode

Die Elektrode wird wie im Beispiel 2a) hergestellt, mit der Abänderung, daß der Überträger durch NAD&spplus; ersetzt wird und wobei die ausgewählte Menge an NAD&spplus; in Wasser gelöst wird und anschließend zum Kohlenstoff-Pulver hinzugefügt wird.

b) Analyse des Ethanols

Die Fig. 18 zeigt das mit dieser Elektrode in einem Phosphatpuffer-Milieu vom pH-Wert von ca. 8,9 erhaltene Signal, in Abwesenheit von Ethanol (Kurve a) und nach der Zugabe von Ethanol (Kurve b).
In der Fig. 19 ist die Kurve aufgetragen, die die Veränderung von I in Abhängigkeit von der Konzentration (v/v) an Ethanol/Wasser darstellt. Die Bedingungen sind die folgenden.
- Phosphatpuffer-Milieu eines pH-Werts von ca. 8,9
- Abtastgeschwindigkeit: 50 mV/s.
Die Beziehung ist linear.
Die enzymatische Elektrode gemäß der Erfindung kann in allen Bereichen, in denen sich enzymatische Reaktionen abspielen, verwendet werden, wobei man von ihrer Selektivität profitieren kann, z. B. für Analysen in der industriellen Chemie, in medizinischen und biologischen Bereichen ebenso wie bei Nahrungsmittel-Industrien.

Claims

1. Enzymatische Elektrode, die eine durch Reibung oder Abschneiden erneuerbare Oberfläche aufweist, welche ohne dazwischenliegende, permeable oder semipermeable Membran mit dem zu bestimmenden Substrat in direktem Kontakt steht, umfassend einen enzymatischen Teil und einen analytischen Teil, die kombiniert sind und mit einem Stromkreis verbunden sind, wobei die Elektrode aus einer Matrix besteht, die aus einem leitenden Pulver hergestellt ist, das den Nachweis sicherstellt und, innig mit dem Pulver vermischt, wenigstens ein immobilisiertes Enzym oder ein immobilisiertes Enzym und einen Überträger oder ein Coenzym einschließt, die in homogener Form in die Matrix eingebracht sind, wobei der Überträger und/oder das Coenzym nicht mit der Matrix vernetzt sind, die Matrix in einer inerten Hülle enthalten ist, aus der sie an einem Ende herausragt, um die brauchbare Oberfläche der Elektrode auszumachen, wobei eine Kontaktstelle des Stromkreises ständig auf das andere Ende der Matrix drückt.

2. Elektrode gemäß Ansprüche 1, dadurch gekennzeichnet, daß das leitende Pulver Kohlenstoffpulver oder Graphitpulver ist.

3. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix durch inniges Vermischen des Pulvers mit einem inerten Bindemittel gebildet wird, welches insbesondere im Verhältnis von 10 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die leitende Paste, eingesetzt wird.

4. Elektrode gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel ein hydrophobes Bindemittel ist.

5. Elektrode gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel aus Paraffinöl, α-Bromnaphthalin oder Silikonöl besteht.

6. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit Hilfe wenigstens eines Vernetzungsmittels innerhalb der leitenden Matrix fixiert ist.

7. Elektrode gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd ist.

8. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein leitendes, zu einer Matrix formbares Pulver umfaßt, welches das Enzym physikalisch gebunden einschließt.

9. Elektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehrere, in der Matrix blockierte Enzyme enthält.

10. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Überträger aus Ferrocen, Nickelocen und deren Derivaten sowie Benzochinon und anderen Elektronen-Übertragungsreagenzien ausgewählt ist.

11. Enzymatische Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Bestimmung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glucoseoxidase ist und die leitende Matrix außerdem einen Überträger einschließt, der aus p-Ferrocenylanilin, Nickelocen und Benzochinon ausgewählt ist.

12. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Bestimmung von Saccharose, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Enzyme Invertase und Glucoseoxidase oder auch Invertase, Glucoseoxidase und Mutarotase sind.

13. Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Bestimmung von Ethanol, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an NAD&spplus; assoziierte Alkoholdehydrogenase ist.

14. Verfahren zur Herstellung der enzymatischen Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß:

- eine homogene Paste oder Matrix, die aus dem innigen Vermischen eines leitenden Pulvers mit einem Bindemittel entstanden ist;

- wenigstens ein Enzym;

- eine Lösung zur Vernetzung des Enzyms; zudem

- ein Übertragungsreagens und/oder ein Coenzym. innig vermischt werden.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein leitendes, zu einer Matrix formbares Pulver und wenigstens ein Enzym mit einem Übertragungsreagens und/oder einem Coenzym innig vermischt werden, und diese Mischung einer mechanischen Einwirkung, insbesondere Druck, ausgesetzt wird, um eine feste Matrix zu erhalten, die das Enzym physikalisch gebunden einschließt.