JPH03503931A - 酵素電極及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）マトリクスを形成することができる導電性粉末と少なくとも１つの酵素と を均質に混合して、その混合物に機械力、特に圧縮力をかけて、酵素を物理的に 閉じ込めた固体マトリクスを作製することを特徴とする請求項１９に記載の方法 。

（２１）　　メディエータ及び／または補酵素をペーストまたは混合物に混ぜ合 わせることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。

なわち−ｍゲル」にのポリマーの中に酸坐を連線的に閏１１拭め酵素電極及びそ の製造方法 本発明は、（フランスの）国立科学中央研究所（（：ｅｎｔｒｅておく包括法、 ■グルタルアルデヒドのような二官能性化学分子によって酵素分子を互いに架橋 させるかまたはゼラチン及びアルブミンのような不活性蛋白質と架橋させる架橋 化法、■小さい分子のみを透過する多孔質膜によって、定量すべき溶液から分け られた区画の内側の溶液に酵素が存在するようにする閉じ込め法（ｃｏｎｆｉｎ ｅｍｅｎｔ）　、■活性化表面に担持された官能基と、酵素の触媒活性に関与し ない酵素の官能基との反応による共有結合法が知られている。

溶液中に溶解している酸素量に対する酵素反応の依存性は、成る場合には、特に 生物学的液体における定量の場合には、その測定技術を制限する要因になること もある。実際、酸素圧の変化は、電極のレスポンスに重大な変動をもたらすこと もあり、同様に、存在する酸素の量が少なくなると、そのレスポンスが歪む。こ の欠点のために、酸素置換体、特にメディエータ（媒介物質）と称されるフェロ セン及びその誘導体の使用が推奨されている。かかの場合における反応は、メデ ィエータとしてフェロセンを使用するグルコースオキシダーゼＣＯＤ電極による グルコースの定量の例では、以下のようである。

グルコース十ＣＯＤ、。。＋Ｈ２０→ グルコン酸＋ＣＯＤ　（ｒｅｄｌ・・・（１）Ｇ　ＯＤ　ｉｒ＠ｄ＋　＋　２　 （ＣｓＨｓ）　２Ｆ　Ｂ”　　→Ｇ　　ＯＤ　　（ＯＸ＋　　＋　２　　（Ｃｓ Ｈｓン２ＦＣ＋　２　Ｈへ　　・　　・　（２）２（ＣｓＨｓ）２Ｆｅ　　−− ２（ＣｓＨｓ）２Ｆｅ＋＋２ｅ−−−−（３）電気化学的検出は、フェロセンの “裸”の電極のフェリジニウム陽イオン（反応３）への酸化である。従って、グ ルコ−スに対する触媒量のフェロセンを導入することができ、その電気化学的な 再生による電流が、グルコースの検出／定量信号として機能する。

この方法により、満足できる結果を得ることができる。しかし、この方法は、媒 体に対して異物となり且つ有害となる場合もある物質を導入する大きな欠点があ る。

従来、酵素電極においては、酵素は、電極の表面近くに保持されている。例えば 、「農業生化学（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）Ｊ４９（２９）、　 ５４１−５４３．１９８５及び「農業生化学（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　Ｊ　５０（４）、　８８３−８９０．１９８６においてイケダ（ Ｔ、　ＩＫＥＤＡ）により発表されたＣＯＤ電極がその電極に相当する。そのＣ ＯＤ装荷電極の表面は、ニトロセルロースの被膜で覆われている（Ｅ　Ｐ−Ａ− １７７，７４３参照）。［分析化学（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ） 　Ｊ　１９ｇ５年１２月号、第１巻、４５５〜４５７頁において、イケダ（ＩＫ ＥＤＡ）他は、電極に適用されたＣＯＤ層が、透析膜、金製に細かい格子、及び ナイロンの網で覆われているＣＯＤ電極を発表している。

従って、電極の表面に酵素を固定する従来の技術によるならば、溶液に対しては 透過性で、酵素は透過しない“被覆”で酵素を保護する必要があることがわかる 。更に、酵素を化学的な支持体に固定することが提案されている。

上記した酵素電極によれば、いくつかの具体的な定量を実施することができるが 、それら酵素電極は、使用時、非常にデリケートである。なぜならば、酵素電極 は、各使用の前に、詳細に規定された調製が必要であり、また、酵素電極は直ぐ に飽和する。

更に、電極の表面はすぐに使用不能になり、信号が失われ、再現性が低下する。

実際、その都度再生処理を実施しない限り表面は更新できない。更に、化学反応 により酵素を固定する場合、特に電極の表面に数種の異なる酵素を固定する場合 、障害または競合が生じ、しばしば電極の調製を制御不能にする。

本発明によるならば、導電性マトリクス内に酵素を閉じ込めることを提案する。

分析のためには、絶縁材料で作られた、例えばガラスまたはプラスチック材料で 作られた不活性シース内にこのマトリクスを収容することが効果的である。その 場合、不活性シースからマトリクスの一端が露出して、有効表面を備える。測定 の前に、必要であることが判明したならば、使用された表面層を数オングストロ ームの深さ除去するように、例えば紙片で簡単に擦るなどして電極を簡単にクリ ーニングする。その後、この方法により表面が再生された電極を、分析すべき液 体媒体の中に浸漬する。

本発明の電極は、製造が非常に低費用で容易にでき、容易に保守でき、何時も直 ぐに使用可能であり、操作が非常に容易であり、そして、再現可能な結果を与え ることができる。

また、全く問題なく、複合酵素系、並びに、電子メディエータ及び／または補酵 素を含むことができる。更に、１回しか使用できない使い捨てにすることもでき る。

それ故、本発明による酵素電極は、酵素部分と検出部分とが組合わさており、検 出のための導電性粉末から形成されたマトリクスを具備しており、該マトリクス は、導電性粉末と均質に混合されて均一な塊をなしている少なくとも１つの固定 化された酵素を含有し、電極が、透過性または半透過性の中間膜を使用すること なく、定量すべき基質に直接接触することを特徴とする。

フェブスーレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）第５９巻、第２号（１９７５ 年１１月）において、カルボ（Ｃ，Ｃａ１ｖｏｔ）他が、血漿アルブミン及びグ ルタルアルデヒドを含む溶液とリジンデカルボキシラーゼとを混合し、磁性酸化 鉄イオンの粒子を添加し、フレート上でサスペンションを成形して均一の厚さの 膜を得て、雲囲気温度で２時間架橋し、形成されたフィルムを剥がすことより、 膜を作製することを開示している。このフィルムは、（磁石によって・・これは 、膜内の磁性酸化鉄粒子の存在を示すものである）ｐｃＯ２電極上に固定される 。そのｐ　ＣＯ２電極には、多孔質シート及び気体透過性の膜を存在させること ができる。かくして、この公知の電極では、酵素反応がフィルムで生じ、二酸化 炭素が拡散し、電極で検出される。それ故、酵素部分と検出部分とが独立してい る。本発明が基づく着想は、電極のこの２つの古典的な部分を一緒にしたことで ある。これにより、酵素部分と検出部分とが独立していることによる問題の全て を直ちに解消することができる。公知の構造において酵素部分と検出部分きが別 れていることにより、透過性従って拡散と、検出と、信号の再現性に影響する拡 散運動の問題が生じる。更に、酵素膜を使用する場合には、検出体本体に適用す る膜を、生成物の適正な拡散を保証するように一定な厚さに作製することに伴う 困難が絡んでくる。

最後に、膜を使用する場合には、時間の経過にかかわらず一定した組成を保証す ることが困難であり、この問題は、測定の反復性に悪影響を与える。

酵素部分と検出部分との分離は、アメリカ特許第４２２４１２５号明細書及びヨ ーロッパ特許出願公報Ｅ　Ｐ　−Ａ−１７７７４３号に開示される酵素電極にも みることができる。

分析すべき基質に反応する、及び／または、分析すべき基質を示す電気信号を与 えることができる他のどのような基質に反応する酵素は、どのようなものでも、 本発明による電極において酵素として使用することが可能である。

最も一般的に使用される酵素は、具体的には、酸化還元酵素であり、この酸化還 元酵素は、電子の伝達のためのメディエータと称する物質を使用することが必要 である。一方、本発明による電極は、電気化学的手段によって直接的にまたは間 接的に検出可能な反応を有している性質のみを利用しているので、酵素の系統は 一切重要ではない。

更に、所与の酵素と一緒に、電気化学的手段により検出可能な補酵素を使用する こともできる。これは、例えば、各種のヒドロゲナーゼの場合にあたる。

導電性マ）　ＩＪクス内に存在する酵素の量は、それぞれの酵素の固有な活性に 応じて、広い範囲内において変えることができる。酵素の活性が高ければ高いほ ど、マトリクス内の酵素の重量は少ない。しかし、厳密に考えても、酵素の割合 を過剰にしても、測定の妨げにならない。しかし、言うまでもなく費用が嵩む。

しかしながら、実際に利用可能な測定信号を与える最小量の酵素がなければなら ないことは言うまでもない。例えば、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）電極で は、酵素単位（ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　１口）　＝　２００の場合、０．４重量％ から１５重量％の範囲で、特に好ましくは１重量％から５重量％の範囲で割合を 変えることができる。

導電粉末の粒子サイズの分布は重要ではない。しかし、１布の粉末を使用したと き、良好な結果が得られた。

特に、導電性粉末は、カーボン粉末またはグラファイト粉末から選択される。

不活性な、すなわち、使用電圧範囲において反応しないバインダと粉末とを混合 してマトリクスを形成することが好ましい。そのバインダは、得られるペースト 状導電性マトリクスに対して１０重量％から４０重量％の量で使用される。バイ ンダは、疎水性バインダが効果的である。パラフィン油、アルファブロモナフタ レン及びシリコーン油が良好な結果を示した。バインダを選択する場合には、ア ダムス（Ｒ，Ｎ、　ＡＤＡＭＳ）著「固体電極の電気化学（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　ａｔ　５ｏｌｉｄ　ｅｌｅｃｔ＝ｒｏｄｅｓ）Ｊ　（ＢｄｌＭ ａｒｃｅｌ　ＤＥにＫＥＲ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６９）を参考にすること ができる。ある場合には、例えばカーボン粉末がマトリクスを形成できる状態に ある場合には、バインダは必須ではない。

過剰なバインダのために７トリクスの流動性が余り高くならないように、反面、 バインダ不足のためにマトリクスがぼろぼろにくずれないように、バインダの量 は選択する。

更に、少なくとも１つの架橋剤によって、または、電極例えばカーボンのマトリ クス内に物理的に閉じ込める手段によって、導電性材料のマトリクス内に酵素を 固定化する。架橋剤として、グルタルアルデヒドを挙げることができる。

本発明によるならば、導電性マトリクスに対して０．０１重量％から３重量％の 量の、特に０．０５重量％から１重量％の量の少なくとも１つのメディエータ物 質を更に含む導電性マ）　ＩＪクスを作製することもできる。そのメディエータ は、フェロセン、ニッケロ七ン及びそれらの誘導体、更に、ベンゾキノン及び他 の電子伝達物質から選択される。

例示するならば、「分析化学（Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、）　Ｊ　１９８４．５６ ゜６６７−６７１のガス（Ａ、　Ｅ、　Ｇ、　ＧＡＳＳ）による「溶液中のメデ ィエータｊに記載されたフェロセン誘導体を、本発明によるマトリクスに混ぜ合 わせることができる。

本発明による電極のマトリクスは、少なくとも１つの補酵素を含むこともできる 。

本発明による酵素電極を製造するために、第１の実施例では、以下のものが均質 に混合される。

○　導電性粉末とバインダとを均質に混合して得られる均一なペーストまたはマ トリクス ○　少なくとも１つの酵素 ○　酵素架橋溶液 第２の実施例では、マトリクスを形成することができる導電性粉末と少なくとも １つの酵素とを均質に混合して、その混合物に機械力、特に圧縮力をかけて、酵 素を物理的に閉じ込めた固体マトリクスを作製する。

上記した２つの実施例において、メディエータ及び／または補酵素を、ペースト またはマトリクスまたは混合物に混ぜ合わせることができる。

ペーストまたはマトリクスまたは混合物がメディエータを含んでいる場合には、 有機溶液で導電性粉末とメディエータとを混合し、溶媒を蒸発させることにより 、均一にメディエータを含有している少量の導電性粉末を作製することができる 。そして、その少量の導電性粉末を、酵素を含む導電性マトリクスと混合する。

定量のために本発明の電極を使用する回路は、従来からの回路である。電極の一 方の端を、測定容器内の溶液に接触させ、電極の他方の端を電位計の電気回路に 接続する。

本発明による酵素電極は、様々な形態、特に反復使用用または使い捨て用の携帯 可能な形をとることができる。

以下、本発明を、添付図面及び以下の実施例を参照して説明する。しかし、本発 明は以下の説明に限定されるものではない。なお、以下の説明において、格別表 示しない限り％は重量％である。

第１図から′ｓ１９図は、本発明による電極を使用して実施された定量及び測定 の結果を示す図であり、そして、第２０図は、全体に筒状の、本発明の１実施例 による電極を概略的に図解する図である。

電極１が第２０図に概略的に図示されている。その電極１は、電極ホルダ２を有 し、その電極ホルダの一端には読み取り窓３が設けられ、他端はコンタクト４と なっている。このコンタクト付近では、電極ホルダの直径は小さくなり、その小 径部分５にはネジ６が設けられている。酵素を含む本発明によるマトリクス７が 、円筒状のシース８の中に配置されて、そのシース８の一端において露出して電 極の有効面９を構成している。シース８の反対側の端部は、マトリクス７を越え て延びており、電極ホルダ２のネジ６と協動するネジ１１が設けられた部分ＩＯ を形成している。コンタクト４は、有効面９と反対側の面９ａに常時載っている 。

更に、表面９と一緒の縁の付近のシース８には外ネジ１２が設けられ、その外ネ ジ１２は、キャップ１５の周辺スカート部１４の内ネジ１３と協動する。キャッ プ１５の底１６には、濾紙またはフェルトまたは同様な材料の小片１７が置かれ ている。補助及び／または基準の電極１８が酵素電極７に付属している。

使用するときは、キャップ１５を外す。使用した後ごとにキャップ１５を交換し 、有効面１９を再生するために、電極ホルダ２を僅か回転して、有効面１９を小 片１７に対して摩擦する。

例１：分析媒体中にメディエータとしてフェロセンモノカルボン酸を存在させて 、グルコースオキシダーゼを含むカーボンペースト電極を使用してのグルコース の定量（ａ）　　電極の製造 平均値５μｍの粒子サイズ分布のカーボン粉末１　ｇ　（ＣａｒｂｏｎｅＬｏｒ ｒａｉｎｅ）とパラフィン油０．３６ｍ／とを、均一なペーストが得られるまで 混合する。

そのようにして得られたカーボンペースト３００■を、以下の配合の架橋溶液０ ．３ｄ及び適量のグルコースオキシダーゼと均質に混合する。

２．５％グルタルアルデヒド・・・・・・・２５％１５％牛アルブミン・・・・ ・・・・・・２９％ＰＨ６，８のホスフェート緩衝液・・・・・・５６％そのよ うにして得られた混合物を、乳鉢内に４℃で１０分から３０分の間装置する。乳 鉢から掻き取り、一種の粉末を得て、パラフィン油０．０６ｄに取る。

（ｂ）　　グルコースの定量 この定量は、メディエータとしてのフェロセンモノカルボン酸の存在下で実施さ れる。これに伴う反応は、フェロセンについて本明細書の前文で説明したものと 同様である。

分析媒体は、ＰＨ８〜９のホスフェート緩衝媒体である。

第１図（ａ）は、フェロセンモノカルボン酸が溶液中にあるときに本電極を使用 してサイクリックポルタンメトリーにより得られた信号の形を示している。その ようにして得られた曲線ｉ　＝　ｆ　（Ｅ）は、上記した酸がそれに対応するフ ェロセニック陽イオンに酸化することに、対応している。

第１図（ｂ）は、グルコースを上記した溶液に加えた時に得られた。グルコース の存在により酸化電流の増大が見られる。

メディエータが溶液中にないときは、たとえ溶液がグルコースを含有していても 、電極の電位では全く電流は検出されないことが指摘されねばならない。

第２図は、以下の条件において、電極のカーボンペーストにおける様々なＣＯＤ 濃度の場合について、グルコース濃度の関数としての電極のレスポンス白線１＝ ｆ（Ｃ）をプロットした。

分析媒体中のメディエータ濃度：　０．５Ｘ　１０−’ＭＰＨ：　８．９ 走査速度：２ｍＶ／ｓ 第２図の説明 横軸ニゲルコース濃度＜　ｍ　Ｍ　） 縦軸：電流密度（μＡ） 第２図は、グルコース濃度の関数として電極の直線のレスポンスを示している。

第２図の４つの直線は、電極ペースト中のＧＯＤ１１度が高ければ高いほど、信 号が大きく、従って、検出感度が高くなることを示している。

第３図は、以下の条件において、様々なグルコース濃度の場合について、メディ エータ濃度の関数としての電極のレスポンス白線ｉ　＝　ｆ　（Ｃ）をプロット した。

ペースト中のＣＯＤ濃度：１．５重量％（ペースト１ｇ当たり１０″単位） ＰＩ（：　８．８ 走査速度：２ｍＶ／ｓ 第３図の説明 横軸：分析媒体中のメディエータ濃度（ｍ　Ｍ　）縦軸：電流密度（μＡ） 第３図は、メディエータ濃度が高くなるほど信号の感度が高いをことを示してい る。

例２ニゲルコースオキシダーゼとメディエータとしてのｐ−フェロセニルアニリ ンを含むカーボンペースト電極を使用してのグルコースの定量 （ａ）　　電極の製造 選択した量のｐ−フェロセニルアニリン（ＣｓＨｓ）Ｆｅ（ＣｓＨ４−Ｃ，Ｈ， −ＮＨ２）をメチレンクロライドに溶解し、得られた溶液に、例１と同様な特定 の量のカーボン粉末を加える。混合物を撹拌しながらメチレンクロライドを蒸発 させる。溶媒が完全に蒸発した後に、メディエータを均一に含有するカーボン粉 末が得られる。

電極として機能するペーストを製造するためには２つの方法を使用することがで きる。

（ａ）　　上記粉末１ｇとパラフィン油０．３６ｄとを、均一なペーストが得ら れるまで混合し、そのようにして得られたカーボンベース）　３００ｍｇを、例 １に従って製造したＣＯＤ含有ペースト３００■と均質に混合する。

（ｂ）例えば１ｇのカーボン粉末と、例１に従って酵素を含有する架橋溶液１７ ２とを混合して、その混合物を４℃で１０分から３０分の間装置し、細かな粉末 が得られるように掻き取ることにより、酵素を含む粉末を得ることができる。そ して、例えば、この粉末１ｇと、メディエータを含む粉末１ｇ及びパラフィン油 ０．７２−とを混合することにより、電極のためのペーストを製造することがで きる。

（ｂ）　　グルコースの定量 随伴する反応は例１と同様である。分析媒体は、ＰＨ！＝ｉ８．８のホスフェー ト緩衝媒体である。

第４図（ａ）は、ＣＯＤ及びメディエータを含む電極を使用しての、上記した緩 衝媒体でグルコースが存在しない場合の、サイクリックポルタンメトリーにより 得られた信号曲線ｉ＝ｆ　（Ｅ）の形を示している。第４図（ｂ）は、グルコー スを加えた時に得られた同じ信号を示している。

第５図には、曲線１／Ｒ＝ｆ（１／Ｃ）がプロットされている。ここで、Ｒは、 グルコースが存在するときに得られた信号と、グルコースが存在しないときに得 られた信号との比であり、Ｃは、ｍＭで表したグルコース濃度である。条件は以 下の通りであった。

ペースト中のメディエータの量二〇、４％ペースト中のＣＯＤ量ニアｘｌＯ’Ｕ ／ｇ走査速度：２ｍＶ／ｓ 線型相関関係が１／Ｒと１／Ｃとの間に得られている。

１／Ｒと１／Ｃとの間の線型関係は、メディエータの量及び電極中の酵素の濃度 を変えても同様に得ることができた。

第６図では、信号ｉの振幅（単位μＡ）と溶液中のグルコースの濃度（単位ミリ モル）との関係を示す曲線がプロットされている。第７図は、その曲線の真っ直 ぐな部分、すなわち、グルコース濃度が１０−２モル／ｌ以下の部分を示してい る。

上記した２つの例での条件は以下の通りであった。

ペースト中のメディエータの量：　０．４６％ペースト中のＣＯＤ量＋　５．１ ５ｘ　１０’Ｕ／　ｇ走査速度：２ｍＶ／ｓ ＯｏＩＭのホスフェート緩衝液：　ｐｌ＝　７第８図には、（ペースト全体に対 する％として表した）メディエータの濃度の関数としてのＲの変化を表す曲線を プロットした。条件は以下の通りであった。

分析媒体中のグルコース濃度＋　２０Ｘ　１０”Ｍ電極中のＣＯＤ量＝２．９％ （これは６．２５ｘｌＯ’Ｕ／ｇである）ｐＨ＝８．９ 走査速度：２ｍＶ／ｓ が検出できている反面、０．１５％当たりの濃度で信号が最大となっていること を示している。

第９図には、ペースト全体に対するメディエータ濃度が０．１５％及び０．２％ 度の場合（曲線ａ及びｂにそれぞれ対応）の（ペーストのＣＯＤのＵ／ｇとして 表した）電極中のＣＯＤ濃度の関数としてのＲの変化を表す曲線をプロットした 。条件は以下の通りであった。

グルコース濃度：　２０ｘ　１０’Ｍに固定ｐＨ＝８．９ 走査速度：２ｍＶ／ｓ 電極がＣＯＤを約５Ｘ１０”酵素単位／ｇ含む場合に最適信号が得られることが わかる。しかし、信号は、常時有意に保たれ、その値の何れの側の濃度でも利用 可能である。

例３ニガラクトースオキシダーゼとｐ−フェロセニルアニリンを含むカーボンペ ースト電極を使用してのガラクトースの定量 （ａ）　　電極の製造 ＣＯＤをガラクトースオキシダーゼに代えて、例２の（ａ）と同様な手順を行う 。

（ｂ）　　ガラクトースの定量 第１０図（ａ）は、ガラクトースが存在しない場合にｐＨ＃　８．９のホスフェ ート緩衝媒体で電極を使用した場合にあけるサイクリックポルタンメトリーによ り得られた信号ｉ　−ｆ　（Ｅ）の形を示している。第１Ｏ図（ｂ）は、ガラク トースを加えた時に得られた同じ信号を示している。

シンの定量 （ａ）　　電極の製造 ＣＯＤをＬ−アミノ酸オキシダーゼに代えて、例２の（ａ）と同様な手順を行う 。

（ｂ）　　Ｌ−ロイシンの定量 第１１図（ａ）は、Ｌ−ロイシンが存在しない場合にｐｕ　Ｌ＝、８．９のホス フェート緩衝媒体で電極を使用して得られた信号の形を示している。第１１図（ ｂ）は、Ｌ−ロイシンを加えた時に得られた同じ信号を示している。

例５ニゲルコースオキシダーゼとニラケロセンを含むカーボンペースト電極を使 用してのグルコースの定量（ａ）　　電極の製造 ｐ−フェロセニルアニリンをニラケロセン（ＣｓＨｓ）　２Ｎ　ｉに代えて、例 ２の（ａ）と同様な手順を行う。

ら）グルコースの定量 第１２図は、グルコースが存在しない場合（曲線ａ）とグルコースを加えた後の 場合（曲線ｂ）との、ｐＨ−８，９のホスフェート緩衝媒体で電極を使用して得 られた信号を示している。

例６：グルコースオキシダーゼとベンゾキノンを含むカーボンペースト電極を使 用してのグルコースの定量（ａ）　　電極の製造 ｐ−フェロセニルアニリンをベンゾキノンに代えて、例２の（ａ）と同様な手順 を行う。

ｂ）　グルコースの定量 ３４１３図は、グルコースが存在しない場合（曲線ａ）とグルコースを加えた後 の場合（曲線ｂ）との、ｐｎ　！ｑ　８．９のホスフェート緩衝媒体で電極を使 用して得られた信号の形状を示している。

溶液中のメディエータとしてのフエロセンモノ力Ｊレボン酸を含むカーボンペー スト電極を使用してのスクロースの定量 （ａ）　　電極の製造 Ｃ０Ｄ２０■（ペーストの６３０００／ｇ）とインベルターゼ２０■（ペースト の２４０００　Ｕ　／　ｇ　）を使用し、カーボン粉末の合計量を３００ｍｇと して、例１の同様な手順で行う。

（ｂ）　　スクロースの定量 第１４図は、スクロースが存在しない場合（曲線ａ）とスクロースを加えた後の 場合（曲線ｂ）との、ｐＨ’、８．９のホスフェート緩衝媒体で電極を使用して 得られた信号の形状を示している。

第１５図は、スクロース濃度（ｍＭで表示）の関数としてのＩ−Ｉ。の変化を、 以下の条件においてプロ・ソトした。

ホスフェート緩衝媒体ｐＨＬ＝８．９ 走査速度：２ｍＶ／ｓ 信号とスクロース濃度との関係は、線型関係である。

してのスクロースの定量 （ａ）　　電極の製造 以下の濃度で例２の（ａ）　、：同様な手順を行う。

ＧＯＤ　：ペーストの３００Ｕ／ｇ インベルターゼ：ペーストの２８０００Ｕ／ｇｐ−７エロセニルアニリン：ペー ストの０．１ｔｕｌＬ％（ｂ）　　スクロースの定量 第１６図は、スクロースが存在しない場合（曲線ａ）とスクロースを加えた後の 場合（曲線ｂ）との、ｐＨ’＝　８．９のホスフェート緩衝媒体で電極を使゛用 して得られた信号の形状を示している。

！１７図は、スクロース濃度（ｍＭで表示）の関数としてのＩの変化を、以下の 条件においてプロットした。

ホスフェート緩衝媒体ｐ）ｌ＃８．９ 走査速度：２ｍＶ／ｓ 信号とスクロース濃度との関係は、線型関係である。

（インベルターゼのために形成される）グルコースのαアノマーとβアノマーと の間にある平衡を、電極で直接検出できるβアノマー側にシフトさせる働きを有 するムタロターゼ（ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）を、（ａ）に説明したペーストの中 に混入して、三酵素電極によりスクロースの定量を効果的に実施することができ る。この形式の三酵素電極は、２酵素電極で得られる信号より強い信号を与え、 非常に低いスクロース濃度を測定することを可能にする。

例９：アルコールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋を含むカーボンペースト電極を 使用してのエタノールの定量（ａ）　　電極の製造 ＮＡＤ＋をメディエータの代わりとし、選択した量のＮＡＤ”を水に溶かし、カ ーボン粉末に加えることを除いて、例２の（ａ）き同様な手順を行う。

ら）　エタノールの定量 第１８図は、エタノールが存在しない場合（ｔｆｂ線ａ）とエタノールを加えた 後の場合（曲線ｂ）との、ＰＨ’＝＝　８．９のホスフェ−ト緩衝媒体で電極を 使用して得られた信号の形状を示している。

第１９図は、エタノール／水の濃度（ｖ／ｖ）の関数としてのＩの変化をプロッ トした。条件は以下の通りである。

ホスフェート緩衝媒体ＰＨ？８．９ 走査速度：５０ｍＶ／ｓ 関係は、線型関係である。

本発明による酵素電極は、酵素反応を利用する全ての分野において、例えば、化 学工業、医学及び生物学の分野、農産食料品工業における定量のために、その選 択性から得られる効果を利用して、活用することができる。

ＲＧ、１ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）１１国際出願番号　ＰＣ Ｔ／ＦＲ８９１０Ｏ’ｌ　８２３、特許出願人 住　　所　　フランス国７５００７バリケアナトールフランス１５ ４、代理人 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　〔１通〕請求の範囲 （１）　　酵素部分と検出部分とが組合わされてなる酵素電極にして、検出のた めの導電性粉末から形成されたマ）　ＩＪクスを具備しており、該マトリクスは 、導電性粉末と均質に混合されて均一な塊をなしている少なくとも１つの酵素、 メディエータ物質及び／または補酵素を含有し、上記メディエータ物質及び／ま たは補酵素は上記マ）　ＩＪクスに共有結合しておらず、電極が、透過性または 半透過性の中間膜を使用することなく、基質に直接接触することを特徴とする酵 素電極。

（２）表面領域が常に同じ状態にあるように摩擦または切除により更新可能な表 面を備えることを特徴とする請求項１に記載の電極。

（３）１回しか使用できない使い捨て型であることを特徴とする請求項ｌに記載 の電極。

（４）　　上記導電性粉末は、カーボン粉末またはグラファイト粉末であること を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。

（５）導電性ペーストに対して１０〜４０重量％の割合で使用される不活性バン イダと上記粉末との均質な混合物により上記マトリクスが形成されていることを 特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電極。

（６）上記バインダは疏水性バインダであることを特徴とする請求項５に記載の 電極。

（７）上記バインダは、パラフィン油、アルファブロモナフタレンまたはシリコ ーン油からなることを特徴とする請求項６に記載の電極。

（８）　　−１：、記酵素は、少なくとも１つの架橋剤により導電材料のマトリ クスの内部に固定されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記 載の電極。

（９）上記架橋剤はグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求項８に記載 の電極。

ＱＯマ）　ＩＪクスを形成し且つ上記酵素を物理的に閉じ込めることができる導 電性粉末を備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極。

０υ　マトリクス内に固定化された数種の酵素を有することを特徴とする請求項 １〜１０のいずれか１項に記載の電極。

０３　　上記メディエータは、フェロセン、ニラケロセン及びそれらの誘導体、 更に、ベンゾキノン及び他の電子伝達物質から選択されることを特徴とする請求 項１〜１１のいずれか１項に記載の電極。

Ｑ３　　少なくとも１つの補酵素を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいず れか１項に記載の電極。

６４　　前記マトリクスは、不活性シース内に収容され、該シースから該マｌ− ＩＪクスの一端が露出して電極の有効面を構成していることを特徴とする請求項 １〜１３のいずれか１項に記載の電極。

α９　前記酵素はグルコースオキシダーゼであり、前記導電性マトリクスは、ｐ −フェロセニルアニリン、ニラケロセン及びベンゾキノンから選択されたメディ エータを含むことを特徴とする、グルコースの定量のための請求項１〜１４のい ずれか１項に記載の電極。

Ｑｅ　　固定化された酵素は、インベルターゼとグルコースオキシダーゼ、また はインベルターゼとグルコースオキシダーゼとムタロターゼであることを特徴と する、スクロースの定量のための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の電極。

α力　前記酵素は、ＮＡＤ＋と結合されたアルコールデヒドロゲナーゼであるこ とを特徴とする、エタノールの定量のための請求項１〜１４のいずれか１項に記 載の電極■　導電性粉末とバインダとを均質に混合して得られる均一なペースト またはマトリクスと、少なくとも１つの酵素と、酵素架橋溶液と、メディエータ 物質及び／または補酵素とを均質に混合することを特徴とする請求項１〜１７の いずれか１項に記載の電極を製造する方法。

αの　マトリクスを形成することができる導電性粉末と少なくとも１つの酵素と を、メディエータ物質及び／または補酵素と均質に混合して、その混合物に機械 力、特に圧縮力をかけて、酵素を物理的に閉じ込めた固体マトリクスを作製する ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願番号　ＰＣＴ／Ｆ Ｒ８９１００１８２３、特許出願人 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　〔１通〕プ １ニ 請求の範囲 （１）　　酵素部分と検出部分とが組合わされてなる酵素電極にして、検出のた めの導電性粉末から形成されたマトリクスを具備しており、該マ）　ＩＪクスは 、導電性粉末と均質に混合されて均一な塊をなしている少なくとも１つの、固定 化された酵素、または固定化された酵素及びメディエータ物質及び／または補酵 素を含有し、上記メディエータ物質及び／または補酵素は上記マｌ−Ｕクスと架 橋しておらず、電極が、透過性または半透過性の中間膜を使用することなく、基 質に直接接触することを特徴とする酵素電極。

（２）表面領域が常に同じ状態にあるように摩擦または切除により更新可能な表 面を備えることを特徴とする請求項ｌに記載の電極。

（３）１回しか使用できない使い捨て型であることを特徴とする請求項１に記載 の電極。

（４）上記導電性粉末は、カーボン粉末またはグラファイト粉末であることを特 徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。

（５）導電性ペーストに対して１０〜４０重量％の割合で使用される不活性バン イダと上記粉末との均質な混合物により上記マトリクスが形成されているこ々を 特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電極。

（６）上記バインダは疏水性バインダであることを特徴とする請求項５に記載の 電極。

（７）上記バインダは、パラフィン油、アルファブロモナフタレンまたはシリコ ーン油からなることを特徴とする請求項６に記載の電極。

（８）上記酵素は、少なくとも１つの架橋剤により導電材料のマトリクスの内部 に固定されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の電極。

（９）上記架橋剤はグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求項８に記載 の電極。

００　　マトリクスを形成し且つ上記酵素を物理的に閉じ込めることができる導 電性粉末を備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極。

０１）マ）　ＩＪクス内に固定化された数種の酵素を有することを特徴とする請 求項１〜１０のいずれか１項に記載の電極。

αの　上記メディエータは、フェロセン、ニラケロセン及びそれらの誘導体、更 に、ベンゾキノン及び他の電子伝達物質から選択されることを特徴とする請求項 １〜１１のいずれか１項に記載の電極。

ＯＪ　　前記マトリクスは、不活性シース内に収容され、該シースから該マトリ クスの一端が露出して電極の有効面を構成していることを特徴とする請求項１〜 １２のいずれか１項に記載の電極。

Ｏａ　　前記酵素はグルコースオキシダーゼであり、前記導電性マトリクスは、 ｐ−フェロセニルアニリン、ニラケロセン及びベンゾキノンから選択されたメデ ィエータを含むことを特徴とする、グルコースの定量のための請求項１〜１３の いずれか１項に記載の電極。

ＱＳＩ　　固定化された酵素は、インベルターゼとグルコースオキシダーゼ、ま たはインベルターゼとグルコースオキシダーゼとムタロターゼであることを特徴 とする、スクロースの定量のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の電極 。

Ｏｅ　　前記酵素は、ＮＡＤ”と結合されたアルコールデヒドロゲナーゼである ことを特徴とする、エタノールの定量のための請求項１〜１３のいずれか１項に 記載の電極αつ　導電性粉末とバインダとを均質に混合して得られる均一なペー ストまたはマトリクスき、少なくとも１つの酵素と、酵素架橋溶液とを均質に混 合し、次いで、メディエータ物質及び／または補酵素を混ぜ合わせることを特徴 とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の電極を製造する方法。

ｃｉユ　　マトリクスを形成することができる導電性粉末と少なくとも１つの酵 素とを、メディエータ物質及び／または補酵素と均質に混合して、その混合物に 機械力、特に圧縮力をかけて、酵素を物理的に閉じ込めた固体マ）　ＩＪクスを 作製することを特徴とする請求項１７に記載の方法。

国際調査報告 １．、、、ｌア０．１Ｎａ　　　ＰＣｒ／ＦＲ８９１００１，８２国際調査報告 ＦＲ８９００１８２ ＳＡ　　　　２８４０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）酵素部分と検出部分とが組合わされてなる酵素電極にして、検出のための 導電性粉末から形成されたマトリクスを具備しており、該マトリクスは、導電性 粉末と均質に混合されて均一な塊をなしている少なくとも１つの固定化された酵 素を含有し、電極が、透過性または半透過性の中間膜を使用することなく、定量 すべき基質に直接接触することを特徴とする酵素電極。 （２）表面領域が常に同じ状態にあるように摩擦または切除により更新可能な表 面を備えることを特徴とする請求項１に記載の電極。 （３）１回しか使用できない使い捨て型であることを特徴とする請求項１に記載 の電極。 （４）上記導電性粉末は、カーボン粉末またはグラファイト粉末であることを特 徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。 （５）導電性ペーストに対して１０〜４０重量％の割合で使用される不活性バン イダと上記粉末との均質な混合物により上記マトリクスが形成されていることを 特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電極。 （６）上記バインダは疏水性バインダであることを特徴とする請求項５に記載の 電極。 （７）上記バインダは、パラフィン油、アルファブロモナフタレンまたはシリコ ーン油からなることを特徴とする請求項６に記載の電極。 （８）上記酵素は、少なくとも１つの架橋剤により導電材料のマトリクスの内部 に固定されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の電極。 （９）上記架橋剤はグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求項８に記載 の電極。 （１０）マトリクスを形成し且つ上記酵素を物理的に閉じ込めることができる導 電性粉末を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電極。 （１１）マトリクス内に固定化された数種の酵素を有することを特徴とする請求 項１〜１０のいずれか１項に記載の電極。 （１２）導電性材料のマトリクスは少なくとも１つのメディエータ物質を含んで いることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の電極。 （１３）上記メディエータ物質は、フェロセン、エツケロセン及びそれらの誘導 体、更に、ベンゾキノン及び他の電子伝達物質から選択されることを特徴とする 請求項１２に記載の電極。 （１４）少なくとも１つの補酵素を含むことを特徴とする請求項１〜１３のいず れか１項に記載の電極。 （１５）前記マトリクスは、不活性シース内に収容され、該シースから該マトリ クスの一端が露出して電極の有効面を構成していることを特徴とする請求項１〜 １４のいずれか１項に記載の電極。 （１６）前記酵素はグルコースオキシダーゼであり、前記導電性マトリクスは、 ｐ−フェロセニルアニリン、エツケロセン及びベンゾキノンから選択されたメデ ィエータを含むことを特徴とする、グルコースの定量のための請求項１〜１５の いずれか１項に記載の電極。 （１７）固定化された酵素は、インベルターゼとグルコースオキシダーゼ、また はインベルターゼとグルコースオキシダーゼとムタロターゼであることを特徴と する、スクロースの定量のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の電極。 （１８）前記酵素は、ＮＡＤ＋と結合されたアルコールデヒドロゲナーゼである ことを特徴とする、エタノールの定量のための請求項１〜１５のいずれか１項に 記載の電極（１９）導電性粉末とバインダとを均質に混合して得られる均一なペ ーストまたはマトリクスと、少なくとも１つの酵素と、酵素架橋溶液とを均質に 混合することを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の電極を製造す る方法。 （２０）マトリクスを形成することができる導電性粉末と少なくとも１つの酵素 とを均質に混合して、その混合物に機械力、特に圧縮力をかけて、酵素を物理的 に閉じ込めた固体マトリクスを作製することを特徴とする請求項１９に記載の方 法。 （２１）メディエータ及び／または補酵素をペーストまたは混合物に混ぜ合わせ ることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。