KR960001501B1 - 용액 중의 1,4-디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오 타이드(nadh)의 정량 측정을 위한 전류 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 1회용 효소 전극 - Google Patents
용액 중의 1,4-디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오 타이드(nadh)의 정량 측정을 위한 전류 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 1회용 효소 전극 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 본 발명에 따른 전극의 NADH 반응을 시험하기 위해 사용되는, 변형된 "랭크 브라더스(Rank Brothers)" 전기화학 전지의 도식도이다.
제2도는 본 발명에 따른 백금화 탄소 페이퍼(PCP)전극을 사용하여 전지에 NADH를 연속적으로 첨가하는 전극 반응을 도시한 것이다.
제3도는 Ag/AgCl 참조 전극에 대한 여러 평형 전위에서 NADH에 대한 PCP 전극의 반응을 도시한 것이다.
제4도는 락테이트 탈수소효소(LDH)의 존재하에서 피루브산에 대한 전극의 반응을 도시한 것이다.
제5도는 알코올 탈수소효소(ADH)의 존재하에서 아세트 알데히드에 대한 전극의 반응을 도시한 것이다.
제6도는 본 발명에 따르는 NADH 농도에 대한 백금화된 탄소 페이퍼 전극의 반응을 나타내는 또다른 그래프이다.
제7도는 피르브산에 대한 전극의 반응을 포함한 다른 실험 결과를 도시한 것이다.
제8도는 글루코즈 탈수소효소를 사용하는 글루코즈의 효소적 산화에 의해 동일반응계 내에서 생성된 NADH에 대한 전극의 반응을 도시한 것이다.
제9도는 백금 산화물 함유 전극에 대한 유사한 반응곡선을 도시한 것이다.
제10도는 팔라듐화된 활성탄 전극에 대한 반응 곡선을 도시한 것이다.
본 발명은 용액 중의 1,4-디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH)의 정량적 측정 방법에 관한 것이다.
NADH 및 이의 산화된 대응물 NAD+는 많은 효소 촉매된 산화환원 반응에서의 조인자이다. 몇몇 경우에는, 효소 기질이 조인자 NAD+및 적당한 산화효소 또는 탈수소효소의 존재하에 산화되어 용액 중에 NADH가 생성되고 ; 다른 경우에는 효소기질이 조인자 NADH의 존재하에 환원되어 용액 중에 NAD+가 생성된다. 많은 경우에, NADH 농도의 측정이 기질 농도의 척도로서 또는 NADH(또는 NAD+)가 관여하는 효소 반응 과정을 추적하는 수단으로서 사용될 수 있다.
용액중 NADH 농도는 비색계로 측정할 수 있으나, 비색계 측정 방법은 대체로 단점이 있다. 훨씬 유리한 방법은 전기 화학적 방법이지만, 전기화학적으로 NADH를 측정하려는 시도는 이제까지 성공율이 높지 않았다. 예를 들어, NADH 농도는 NADH를 조절된 고정 전위의 전극에서 산화시키는 전류 측정 분석법(적합한 조건하에서 흐르는 전류는 NADH 농도에 비례한다)에 의해 측정할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 불행하게도, NADH의 전기화학적 산화는 높은 과전위를 요구하고 NADH는 일반적으로 전극 표면에서 깨끗하게 산화되지 않으며 ; 예를 들어, 많은 경우에 전극의 표면이, 전기화학적 반응의 크기 및 속도에 영향을 미치는 표면 막이 형성됨으로써 신속히 오염된다. [참조 ; I. Moiroux and P. J.Elving, J. Amer. Chem. Soc.(1980)102, 6533-6538, and D.G . Johnson, M.D Ryan and G.S. Wilson, Analyt. Chem.(1986) 58, 42R]. 이러한 문제를 피하기 위한 많은 시도가 있었다. 예를 들어, 전도성 유기염 층으로 피복된 변형된 적극을 사용하는 것이 제안되었다. [참조 ; J.J Kulys, Bisensors(1986 2,3-13)]. 다른 방도로는, 메도라스 블루(Meldola's Blue)와 같은 흡착된 산화환원 매개제를 사용하여 산화 반응을 전극에 좀 더 효율적으로 커플링(coupling)시키고 /시키거나 산화 전위를 낮추는 것이 제안되었다. [참조 ; L. Gorton et al, J. Electroanalyt. Chem. (1804), 161, 103-20]. 또 다른 제안으로는, 산화환원 매개제를 유리(free)용액중에 사용하는 것이다. 예를 들어, 메톡시 페나진 메토설페이트가 변형된 열분해 흑연 전극과 함께 사용되어 왔다. [참조 ; Y. Kimura and K. Nihi, Analytical Sciences(1985), 1,274-4]. 다른 실험들도 백금, 흑연 및 유리 탄소 전극을 사용하여 수행되어 왔지만 NADH 측정을 위한 신속하고도 재현 가능한 전기화학적 방법은 아직까지 개발되지 않았다.
본 발명에 따라, NADH만을 함유하는 완충 용액 중에서 효소, 효소기질 및 NADH를 함유하는 용액중에서, 천연 또는 합성 수지 결합제, 바람직하게는 합성소수성 결합제, 예를들어, 플루오로카본 수지, 더욱 바랍직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌과 결합된, 바랍직하게는 백금화 또는 팔라듐화(여기에 사용된 상기 용어는 백금 및/ 또는 팔라듐 산화물로 처리된 또는 이들 함유하는 물질뿐 아니라 백금 또는 팔라듐 금속을 함유하거나 이로 처리된 물질을 포함한다) 탄소 또는 흑연 입자를 함유하는 귀금속의 수지-결합된 이질층을 포함하는, 연료 전지 기술에 사용하는 유형의 활성탄 전극을 사용하여 NADH를 우수한 전류반응으로 깨끗하게 산화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 바람직하게는, 탄소 또는 흑연 입자를 결합시키기 전에 분말 입자의 표면상에 콜로이드성 백금 또는 팔라듐 금속, 또는백금 또는 팔라듐 산화물을 흡착 또는 부착시킴으로써 백금화 또는 팔라듐화하여, 형성된 전극이 콜로이드성 백금 또는 팔라듐, 또는 상응하는 산화물이 층 전체에 걸쳐 거의 일정하게 분포되어 있는 이질 다공성 활성탄 분말층을 함유하는 백금화 또는 팔라듐화된 활성탄 전극을 사용한다. 백금화 또는 팔라듐화된 활성탄 또는 활성 입자의 수지-결합된 층은 자체-지지될 수 있으나, 일반적으로 지지부재(member), 바람직하게는 전기적으로 전도성인 지지부재에 의해 지지되며, 백금화 또는 파라듐화 탄소 또는 흑연 입자가 표면층으로서 결합 되거나 탄소 섬유 웹내로 함침되어 있는 전기적으로 전도성인 탄소 페이퍼 층이 지지부재일 수 있다. 한편, 백금화 및 팔라듐화 물질이 바람직하지만, 다른 귀금속-함유 활성탄 전극, 예를 들면 금-함유 전극을 사용할 수 있다.
본원에서 "백금화" 및 "팔라듐화"라는 용어는 달리 언급하지 않는 한 산화물을 포함한다.
또한, 본원의 "활성"탄, "활성"흑연 등은 매우 다공성이며, 50㎡/g 이상의 표면적, 보다 일반적으로는 200㎡/g 이상, 예를 들어 200 내지 600㎡/g 이상의 표면적을 갖는 높은 표면적의 탄소 및 흑연 물질을 말한다. 이러한 높은 표면적을 갖는 물질은 예를 들어, 증기 또는 CO2중 탄소 또는 흑연 분말을 열처리하여 수득함으로써 본 기술에서 일반적으로 "활성탄"으로서 언급되는 높은 표면적의 생성물을 제공한다.
이미 언급한 안전성, 재현성 및 신속한 반응 시간과는 별도로, 본 발명의 물질의 또 다른 특정한 잇점은 유리질 탄소 또는 흑연 전극을 사용하여 NADH 농도를 모니터하는데 필요한 750mV 이상의 전위와 비교하여 비교적 낮은 전위(예 : 0내지 660mV) 또는 표준 Ag/AgCl 참조 전극을 기준으로 음전위에서 조차도 NADH농도를 모니터할 수 있다는 것이다. 따라서 본 전극은 비교적 낮은 백그라운드(background) 전류를 특징으로 하며, 따라서 강도가 향상된다. 또한, 당해 전극은 생물학적 또는 임상적 샘플에 빈번하게 존재하는 요산과 같이 전위적으로 간섭하는 물질에 대한 반응이 낮은 것이 특징이다.
본 발명에 따라서 사용되는 바람직한 전극 기질은 사실상 매사추세츠주 뉴톤 하이랜드 소재 프로토테크 캄파니(Prototech Company)에 의해 시판되는 물질이며, 연료 전지 중의 전기촉매적 기체 확산 전극으로 사용된다. 참조로 이러한 물질의 제조에 관해서는 미합중국 특허 제 4,044,193호, 미합중국 특허 제 4,166,143호, 미합중국 특허 제 4,293,396호 및 미합중국 특허 제 4,478,696호에 상세히 기술되어 있다. 그러나, 더욱 상세하게는, 입자 크기 범위가 15내지 25Å(1.5 내지 2.5㎚)인 클로이드성 백금을 탄소 분말(입자 크기 50 내지 300 Å:5 내지 30nm)의 표면상에, 예를 들어 졸 (Sol)용 핵화제로서 작용하는 분말상 탄소의 존재하에 동일 반응계 내에서 백금 졸을 형성시킴으로써 흡착시킨다. 그후, 백금화 탄소 입자를 합성 수지 결합제, 바람직하게는 불소화 탄화수소 수지, 및 특히 폴리테트라플루오로에틸렌을 사용하여 전기 전도성 지지 구조물, 예를 들어, 전기 전도성 탄소 페이퍼 상으로 성형시킨다. 또다른 방법으로는, 유사한 입자 크기 범위를 갖는 백금 또는 팔라듐 산화물을 콜로이드성 백금 대신에 사용할 수 있고, 유사한 방법으로는 탄소 또는 흑연 입자상에 흡착시킬 수 있다.
미합중국 제 4,923,396호에 기술되어 있는 또 다른 방법에서는 백금화 탄소 입자를 미리 형성된 다공성 탄소 클로오드(cloth)에 함침시켜 플루오로카본 수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌을 사용하여 이와 결합시킨다. 그러나, 본 발명은 프로토테크 물질을 사용하는데에 제한되지 않고, 백금화 또는 팔라듐화되거나, 또는 활성탄 또는 홀성 흑연 입자들이 함유하는 다른 귀금속의 다공성 수지-결합된층을 함유하는 다른 유사한 기질 물질도 포함하는 것으로 이해해야 한다.
백금화 또는 팔라듐화 탄소 또는 흑연 입자를 결합시키기 위해 사용되는 수지 결합제로는 소수성 플루오로카본 수지, 특히 폴리테트라플루오로에틸렌이 바람직하지만, 다른 적합한 천연 또는 합성 수지 결합제, 예를 들면, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리카보네이트, 폴리(4-메틸펜텐-1)폴리이소프렌, 폴리클로로프렌, 폴리(1,3-부타티엔), 실리콘 고무 및 젤라틴을 사용할 수 있다.
귀금속 함유 활성탄 또는 활성 흑연 입자에 대한 결합제의 비율은, 중량을 기준으로 하여, 결합제 10 내지 75% 및 활성탄 또는 흑연 90 내지 25%, 바람직하게는 결합제 20 내지 50% 및 활성탄 또는 활성 흑연 80 내지 50% 의 범위일 수 있다. 활성탄 또는 활성 흑연 입자상에 대한 귀금속, 예를 들어, 백금 또는 팔라듐, 또는 이의 상응하는 산화물, 또는 금의 ㅂ하량은 활성탄 또는 활성 흑연과 결합제의 전체 중량을 기준으로 하여, 1내지 10%, 바람직하게는 2 내지 8%, 가장 바람직하게는 4 내지 6%의 범위일 수 있다.
수지/활성화된 백금화 또는 팔라듐화 탄소 분말을 적당한 지지부재(예를 들어, 전기 전도성 탄소 페이퍼)의 표면상으로 직접 성형시키는 대신, 결합제와 백금화 또는 팔라듐화 탄소 분말의 혼합물을 적합한 불활성 매질에 현탁시키고, 스크린 프린팅 기술에 의해 기질의 표면에 적응시켜 기질의 표면상에서 수지-결합된 백금화 또는 팔라듐화 탄소 입자의 박막을 제공할 수 있다.
용액 중의 NADH를 직접 정량적으로 측정하는것 뿐만아니라, 본 발명의 전극 및 방법은, 예를 들어, 효소와 이의 조인자간의 효소적 반응에 의해서 동일 반응계 내에서 생성 되거나 소모되는 NADH 의 정량적 측정에 사용할 수 있다.
이러한 반응은, 예를 들어 락테이트 탈수소효소에 의해 피루베이트를 락테이트로 전환시키는 반응(이 반응은 NADH농도 감소에 의해 모니터될 수 있다.) ; 및 글루코즈를 글루코노락톤으로 산화시키는 반응(이 반응은 반응이 진행됨에 따라 NADH 농도 증가에 의해 모니터 될 수 있다)이 포함된다.
이를 위해, 본 발명에 따라서 사용되는 백금화 또는 팔라듐화 활성탄 전극은 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 EP-A 제 0,247,850호에 교시되어 있는 효소 고정화 기술에 의해서 수지-결합된 탄소 층에 혼입되거나 이에 고정된 락테이트 탈수소효소 또는 글루코즈 탈수소효소와 같은 효소를 함유할 수 있다.
이러한 개념의 또다른 변형에 있어서 본 발명은 또한 효소 전극 자체가 고정된 효소 뿐 아니라, 경우에 따라 상기 효소에 적합한 조인자인 NAD+또는 NADH를 함유하는 1회용 효소 전극 및 방법에 관한 것으로, 조인자가 전극 자체에 의해 공급되므로, 샘플이 필요한 조인자를 함유하는지에 관계없이, 상기 효소와 관련된 기질을 함유하는 샘플(예: 임상적 또는 생물학적 샘플)과 접촉하는 경우, NADH농도 변화에 의해 측정되는, 효소의 활성에 전류적으로 반응하는 능력을 갖는 효소 전극일 수 있다. NAD+또는 NADH조인자는 NAD+또는 NADH의 적합한 용액으로 함침시키고, 건조시키는 것과 같은 적당항 방법으로 전극에 함침시킬 수 있다.
또한 본 분야에 공지된 바와 같이, 전극 물질의 표면은 예를 들어 약 0.03㎛의 기공 크기를 갖는 폴리카보네이트막과 같은 다공성 막에 의해 보호되거나 보호되지 않을 수 있다. 다른 적합한 막 물질도 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 첨부된 도면을 참고하여 기술된다 :
하기 실시예에서는, 변형된 랭크(Rank) 산소전극 시스템(Rank Brothers, Bottisham, Cambridge)에서 NADH에 대한 각종 백금화 또는 팔라듐화 탄소페이퍼(PCP)의 전극의 반응을 실험하였으며 도면에 나타나있다(제1도). 변형된 랭크 전지 시스템은 베이스(1) 및 물 챔버(h)를 둘러 싸는 고리모양의 쟈켓(2)으로 이루어진 2-부분 전지로 구성되어 있으며, 이를 통해 물을 순화시켜 전지의 온도를 조절할 수 있고 이 두 부분은 고정된 나삿니들 갖는 칼라(Collar)(3)에 의해 함께 연결 되어 있다. 베이스(1)의 중앙에는 페이퍼 전극 물질의 시험디스크(a)상에 위치하는 백금 접촉 버튼 (d)이 있고, 전지의 두 부분이 함께 커플링되는 경우, 이 버튼 (d)는 고우 O-링 실(O-ring seal)(e) 및 (f)에 의해 백금 접촉부 상에 지지된다.
조정할 수 있는 칼라(g)에 의해 지지되며 백금 카운터 전극(b) 및 Ag/Agcl 참조 전극(c)이 놓여 있는 스토퍼(stopper)(4)가 NADH-함유 시험 용액을 함유하는 전지의 맨 윗 부분에 삽입된다. 시험은 AG/AgCl전극을 기준으로 100내지 600mV의 범위의 각종 전위에서 평형을 이룬 작업 전극으로 수행한다.
기타의 시험은 EP-A 제 0 247 850호의 제16도에 나타낸 것과 같은 두개의 전극 전지에서 수행되며 여기에, 상세히 기술되어 있다. 두전극 전지의 양태에서, 전극 물질은 폴리카보네이트(기공 크기0.03㎛)막에 의해 전지의 베이스에 있는 백금 접촉 버튼에 대해 고정되어 있으며 버튼에 NADH함유 샘플이 적용된다.
고리형 Ag/AgCl 참조 전극은 전지의 베이스에서 백금 접촉면을 둘러싸고 있으나 단연 슬리이브(sleeve)에 의해 이로부터 분리되어 있다. 전극 전지는 Ag/AgCl 참조 전극에 비해 각종 전위에서 분극되어 있으며 전류는 각종 전위에서 모니터된다.
본 발명은 하기 실시예에 설명되어 있으며, 실시예에서 전극 물질은 미합중국 매사추제츠 뉴톤 하일 랜드 소재의 프로토테크 캄파니가 공급하여 이들에 의해 기체 확산 전극으로서 개발된 백금화된 탄소페이퍼(PCP)이다. PCP전극 물질은, 미합중국 제 4,044,193호의 방법에 따라 처음에는 H2O2를 사용하여 탄소 분말이 존재하에 착물 백금 아황산을 산화적으로 분해하여 탄소 분말 입자의 표면에 입자 크기 1.5 내지 2.5㎚의 콜로이드성 백금을 부착시켜 탄소 분말 입자(Vulcan XC-72, 공칭 입자크기30㎚)를 백금화시킴으로써 제조한다. 백금화시킨 후, 백금화된 탄소 분말을 연속해서 성형시키고 결합제로서 폴리테트라플루오로에틸렌 약 50중량% (백금화된 탄소 분말의 중량을 기준함)를 사용하여, 시판용의 흑연화된 전기전도성 탄소 페이퍼의 표면에 결합시킨다. 생성된 백금화된 탄소 페이퍼 전극 물질은 두께가 0.1 내지 0.5㎜의 범위이고 백금 부하량은 0.24㎎·㎝-2이다. 하기 시험(실시예 1 내지 3)을 위해, 탄소 페이퍼 전극 물질을 직경이 5㎜인 디스크 형태로 절단하고 첨부되는 제1도에 나타낸 전지 시스템의 백금화된 작업 전극에 올려놓는다. 각 경우 샘플에 노출된 탄소 페이퍼 전극의 실제 면적은 대략 0.16㎠이다. 수득된 결과는 다음과 같다 :
[백금화된 탄소 페이퍼(PCP)상에서의 NADH의 전기화학적 산화]
표준 정전위(potentiostatic)기술을 사용하여 트리스/HC1(pH 9)완충제 중 20mM NADH 용액의 샘플을 0.1M 포스페이트(pH 1)/1M KCl 완충 용액 2ml를 함유하는 전지에 가한다. 백금화된 탄소 페이퍼 전극(PCP)을 Ag/AgCl 참조 전극에 대해 다양한 전위에서 평형시킨다. 대전극은 백금이다. NADH 농도(표 1및 제3도)에 비례하는 안정한 전류 평탄역(plateau)을 얻었다. (제 2도)
[표 1]
[다양한 평형 전위에서 NADH에 대한 백금화된 탄소페이퍼의 전류반응]
[실시예]
락테이트 탈수소효소(LDH)의 존재하에서 피루부산에 대한 NADH-전극 시스템의 반응 25℃에서 포스페이트(pH 7)/KCl 완충액 2㎖중의 12.5㎖ NADH 및 10mM 피루브산을 함유하는 유사한 전지를 설치한다.
작업 전극, 대전극 및 참조 전극은 실시예1에서와 같다. 작업 전극은 400mV 에서 평형을 이루고 백그라운드 보다 170㎂ 높은 안정한 시그널을 나타낸다. LDH의 120유니트(소의 심장형 XV)첨가에 따라 전류는 분당 92㎂의 초기 속도로 감소하며(제4도), 이는 피루베이트 락테이트로의 효소적 전환이 전극에 전기 화학적으로 커플링된 NADH를 통해 효과적으로 모니터됨을 보여준다.
[실시예3]
PCP전극상의 알코올 탈수소효소(ADH)의 존재하에서 아세트알데히드에 대한 NADH-전극의 반응
25℃에서 트리스(pH 8)/HCl 완충액 2㎖ 중 3mM NADH 및 35nM 아세트알데히드를 함유하는 전지를 설치한다. 작업 전극, 대전극 및 참조 전극은 실시예1 에서와 같다. 작업 전극은 400mV 에서 평형을 이루고 상기 백그라운드 보다 40㎂ 높은 안정한 시그널을 나타낸다. ADH 2유니트(말의 간)를 첨가하면 전류는 130㎂/분의 초기속도로 감소하며(제 5 도, 이는 아세트알데이드의 에탄올로 효소적 전환이 전극에 전기화학적으로 커플링된 NADH를 통해 충분히 모니터된다는 것을 보여준다.
하기의 실시예에서, 2개의 전극 전지 또는 3개의 전극 전지 배열을 사용한다. 3개의 전극 전지는 본 명세서에 기술된 바와 같으며, 제1도에 제시되어 있다. 2개의 전극 전지는 보다 상세히 하기 위해 참조한 EP-A제 0 247 850호의 제16도에 제시된 구조와 동일하다.
[실시예4(제6도)]
데이터는 200mV에서 분극된 2개의 전극 배열을 사용하여 집계하였다. 16㏖/1 NaH2PO4, 53m㏖/1 Na2HPO4, 52m㏖/ NaCl, 1.5m㏖/1 에틸렌디아민 테트라아세트산(pH 7.4)의 완충액이 사용된다. 이 완충액 중에서 안정한 백그라운드 전류를 얻은 후, 완충액으로 막을 세척한 다음, 동일한 완충액 중에 NADH 샘플로 대체한다. 피크(peak) 전류를 기록한다. 제 6 도는 프로토테크 캄파니에서 시판중인, 전기 전도성 탄소 페이퍼 지지 사이트(backing sheet)상에 부착된 수지-결합된 백금화 탄소 입자를 포함하는 백금화 탄소 페이퍼 전극(이때, 수지-결합된 백금화 탄소층은 폴리테트라플루오로에틸렌 50중량 %, 미세하게 나누어진 탄소(Vulcan XC 72 45중량% 및 탄소 분말상에 예비 흡착된 콜로이드성 백금 5중량%를 포함한다)으로부터의 반응이 도시되어 있다. 백그라운드 전류를 최소화시키기 위해, 5㎎/㎖의 단백질 용액 (글루코즈 산화효소)를 NADH 측정 전에 전극상에 밤새 흡착시킨다. 글루코즈 산화 효소는 적합한 단백질의 일례일 뿐임을 알아야 한다.
[실시예5(제7도)]
본 실시예는 NADH- 이용 효소의 기질측정에 대한 본 발명의 작용 가능성을 보여준다. 앞서 기술한 3개의 전극 전지가 사용되나, 자기 교반봉이 부착되어 있다. 작업 전극은 실시예4와 같이 탄소 페이퍼를 백금화시킨 것이지만, l-락테이트 탈수소효소(소의 심장으로 부터 추출한 EC 1.1.1.27)는 카보디이미드 커플링을 통하여 전극에 고정(참조 : EP-A 제0247850호)시키되, 1㎎/㎖의 락테이트 탈수소효소(제조원 : Sigma Chemicals, 형태 XV, 단백질 1㎎당 50유니트) 용액을 사용한다. 전지는 0.1㏖/1 인산염/1㏖/1 KCl 완충액 (pH 7) 중에 처음에 12.5m㏖/1 NADH를 함유한다. 분극 전위는 350mV이다. 도면에서 보는 바와 같이, 피루브산 분취량을 전지에 가할 경우에 장치를 사용하여 NADH의 소모를 모니터 할 수 있다.
[실시예6(제8도)]
실시예 5를 반복하되, 고정된 락테이트를 탈수소효소 대신에 유사한 방법으로 전극상에 고정화시킨 글루코즈 탈수소효소[바실루스(Bacillus)종으로부터 추출한 EC 1.1.1.47, 제조원 : Sigma, 100-300U/㎎ 단백질]를 사용한다. 반면에, 락테이트 탈수소효소는 NADH소모를 모니터하여 피루브산을 측정하는데 사용된다.
글루코즈 탈수소효소는 NADH 생성에 따라 글루코즈를 측정하는데 사용된다.
전지는 0.1㏖/1 인산염/0.1㏖/1 NAD+, pH 7을 함유한다.
[실시예 7(제9도)]
실시예 4의 방법에 따라, 탄소전극을 함유하는 백금산화물의 전류출력을 다양한 NADH농도에서 두개의 전극 전지 중에서 200mV에서 측정하며(Ag/AgCl 참조전극에 대해), 백금화된 탄소 페이퍼 전극의 반응과 동일한 거의 선형 반응을 보인다.
이 경우에, 전극 물질은 탄수 분말 입자상에 예비흡착된 5중량%(수지-결합된 입자의 총중량을 기준으로 함)의 백금 산화물 ; 50중량%의 결합제 및 45중량%의 탄소를 함유하는 수지-결합된(폴리테트라플루오로에틸렌)탄소 입자(Vulcan XC 72)층으로 이루어지며, 전기 전도성 토레이(Toray ; 상표명) 탄소 페이퍼 표면에 결합된다.
[실시예 8 (제10도)]
다시 한번, 실시예 4의 방법에 따라, 팔라듐화 탄소 페이퍼 전극의 전류 출력을 두개의 전극 전지 배열을 사용하여 다양한 NADH 농도에서 측정한다. 반응(제10도)은 거의 직선이다. 전극물질은 실시예 7에 기술된 바와 같으며, 수지-결합된 탄소 입자는 미세하게 나누어지고 예비흡착된 5중량 %의 팔라듐을 함유한다.
상기 실시예는 신속하고 재현 가능한 NADH의 산화를 일으키는 전극 물질의 용도를 보여준다. 이들 반응은 백금, 유리상 탄소, 또는 흑연 전극 물질을 사용하는 비교 실험에서 입증되는 바와 같이 대부분의 전극물질에 의해 나타내는 반응과 현저히 대조되며, 이는(거의 예외 없이)대체로 완만하며, 비교적 민감하지 못하고, 재현성이 훨씬 우수하지 못하다. 본 발명자들이 사용한 백금화 또는 팔라듐화탄소 전극의 효과는 그들의 특정한 이질성 구조 및 생물학적 분자(예 : NADH 및 효소)와의 적합성의 결과인 것으로 보인다. NADH의 산화는 또한 효소 및 기질의 존재하에 효과적으로 진행되며, 신속한 NADH-커플링된 효소적 분석을 위한 근거로서 사용될 수 있다. 피루베이트(LDH 사용) 및 아세트알데히드(ADH 사용)의 효과적인 분석을 위한 잠재성은 상기 실시예로 부터 명확히 알 수 있지만, 또한 다른 효소 및 기질을 상용하여 상당히 많은 유사한 분석이 가능하다.
본 명세서에는 용액 중의 NADH측정에 대해서만 기술하고 있지만, 인산화된 1,4- 디하이로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADPH), 즉, 인산화된 NADH를 동일한 기술로 직접 측정할 수 있다. 더우기, NADPH(또는NAD+) 보다 오히려 효소 촉매화 반응의 선택된 그룹에 있어서 조인자이며, 본 발명의 기술은 상기 반응을 동일한 방법, 즉 용액중 NADPH의 소모 또는 생성을 전류적으로 측정함으로써 정확히 모니터할 수 있다. 따라서, NADH 또는 NAD+에 대한 모든 사항은 달리 언급이 없는한 인사화된 유도체를 포함하는 것으로 간주된다.
Claims (16)
1,4-디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH)함유 용액을 전극과 접촉시키고, 전극 표면에서 NADH의 산화가 일어나기에 유효한 조절된 고정 전위로 탄소 전극을 유지시켜 탄소전극으로부터 전류 출력을 측정함으로써 용액중의 NADH를 정량적으로 측정하는 방법에 있어서, 미세하게 나누어진 귀금속 또는 상용하는 산화물이 활성탄 또는 활성 흑연 입자상에 예비 흡착되어 있고 천연 또는 합성수지 결합제와 함께 결합되어 있는, 활성탄 또는 활성 흑연 입자의 수지-결합된 다공성 이질 층을 포함하는 귀금속-함유 활성탄 전극을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 수지 결합제가 플루오로카본 수지인 방법.
제2항에 있어서, 플루오로카본 수지가 폴리테트라플루오로에틸렌인 방법.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 수지-결합된 귀금속-함유 탄소 또는 입자가 하부에 위치하는 지지부재(member)상의 수지-결합된 표면층으로서 형성되는 방법.
제4항에 있어서 하부 지지부재가 전기적으로 전도성인 방법.
제5항에 있어서, 전기적으로 전도성인 지지부재가, 귀금속-함유 탄소 또는 흑연 입자가 표면층으로 결합되어 있는 전기적으로 전도성인 탄소 페이퍼 층인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수지-결합된 귀금속-함유 탄소 또는 흑연 입자가 탄소 섬유 웹에 함침되어 지지되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 귀금속-함유 탄소, 또는 흑연 입자가 5 내지 30㎚범위의 입자 크기를 갖는 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 탄소 또는 흑연 입자가, 미세하게 나누어진 백금 또는 팔라듐 또는 상응하는 산화물이 흑연 또는 탄소 입자상에 예비 흡착되어 있는, 예비-백금화 또는 예비-팔라듐화 입자인 방법.
제8항에 있어서, 예비-백금화 또는 에비-팔라듐화 탄소 또는 흑연 입자로서, 표면에 입자 크기 범위가 1.5 내지 2.5㎚인 콜로이드성 백금 또는 팔라듐 금속의 입자가 예비 흡착되어 있는 탄소 또는 흑연 입자를 포함하는 백금화 또는 팔라듐화 탄소 전극을 사용하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, NADH 또는 NAD+가 조인자로서 관여하는 효소와 이의 기질 간의 효소적 반응적 NADH의 생성 또는 소모를 모니터 하는데 적용되는 방법.
제11항에 있어서, 효소가 혼합되어 있거나 고정되어 있는 귀금속-함유 탄소 전극을, 효소와 이의 기질 간의 효소적 반응에 관여하는 조인자로서 NAD+또는 NADH의 존재하에 효소 기질을 함유하는 샘플과 접촉시키는 경우에, NADH 농도의 병화를 통한 효소의 활성을 모니터 하는데 사용하는 방법.
제12항에 있어서, 효소가 혼입되어 있거나 고정되어 있는 귀금속 함유 전극을, 경우에 따라, NADH 또는 NAD+조인자와 함께 사용함으로써 NADH 또는 NAD+조인자를 전극을 통해 샘플내로 도입시키는 방법.
미세하게 나누어진 귀금속 또는 상응하는 산화물이 예비흡착되어 있고 합성 소수성 수지 결합제와 함께 결합되어 있는, 효소용 조인자로서의 NAD+또는 NADH와 함께 효소가 고정되어 있는 활성탄 또는 활성 흑연의 수지 결합된 다공성 이질층으로 이루어지거나 이를 포함하여 기질 및 경우에 따라 NAD+또는 NADH의 존재하에서 효소의 활성에 전류적으로 반응하는 할성탄 전극을 포함하는 제13항의 방법에 사용하기 위한 1회용 효소 전극.
제14항에 있어서, 활성탄 전극이, 플루오로카본 수지와 결합되어 있고 하부 지지부재 상에 지지되어 있는 예비-백금화 또는 예비-팔라듐화 활성탄 또는 활성 흑연 입자의 수지-결합된 다공성 이질 표면층을 포함하여, 효소 및 조인자가 고정되어 있는 1회용 효소 전극.
제15항에 있어서, 예비-백금화 또는 예비-팔라듐화된 활성탄 또는 활성 흑연 입자의 수지-결합 층에 대한 하부 지지 부재가 전기적으로 전도성인 탄소 페이퍼를 포함하는 1회용 효소 전극.
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