DE69730612T2

DE69730612T2 - Elektroden und ihre verwendung in assays

Info

Publication number: DE69730612T2
Application number: DE69730612T
Authority: DE
Inventors: Charles Stephen El Granada WILLIAMS; Bernadette Yon-Hin; Neil Blair
Original assignee: Cambridge Sensors Ltd
Current assignee: Cambridge Sensors Ltd
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: CA2269459A1; EP0937242A1; DE69730612D1; US6309535B1; EP0937242B1; ATE275723T1; JP2001503864A; WO1998020331A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Elektroden und deren Verwendung in Analysen, insbesondere zum Nachweis und zur Quantifizierung von Analyten, die nur mit geringem Gehalt vorliegen.
Hintergrund der Erfindung
Elektroden wurden durch Aufbringen von leitenden Druckfarbenmaterialien auf feste Substrate hergestellt. Solche Vorrichtungen können eine feste Schicht eines Edelmetalls, beispielsweise Gold oder Platin, auf einem Keramiksubstrat aufweisen. Sie können beispielsweise durch Dickschichtabscheidung (TFD) auf ein Druckfarbenmaterial, welches mit fein verteilten Partikeln des Metalls beladen ist, hergestellt werden; Trocknen der Druckfarbenschicht bei extremen Temperaturen (im Allgemeinen über 500°C) beseitigt alle Druckfarbenkomponenten , wie Bindemittel und Lösungsmittel und verschmelzt die Partikel des Edelmetalls, um so einen durchgehenden Metallfilm auf dem Substrat zu bilden.
Das Betriebsverhalten solcher Vorrichtungen als Elektrodenmaterial ist stark an ideale Materialien, das heißt feste, maschinell bearbeitete reine Metallelektroden aus (besagtem) Gold und Platin angenähert und durch hohe Leitfähigkeit, hohe Empfindlichkeit bezüglich des Analyts von Interesse, geringem Rauschpegel und einem Ansprechverhalten gegenüber dem Analyt, das vergleichsweise unabhängig von der Temperatur ist, charakterisiert. Solche Vorrichtungen sind jedoch teuer in der Herstellung, da die Druckfarbenmaterialien extrem hohe Metallanreicherung haben müssen und teure Hochtemperatur Trocknungs- und Aushärteinrichtungen benötigen.
Alternative Elektrodenmaterialien sind offenbart worden, welche durch TFD eines Druckfarbenmaterials hergestellt werden, das aus fein verteilten Edelmetallpartikeln, welche innig mit Kohlenstoff vermischt oder darauf abgelagert wurden, aus einem Harzbindemittel und, falls erforderlich, einem Lösungsmittel besteht. Solche Vorrichtungen sind deutlich preiswerter als die oben beschriebenen, da die Druckfarbenmaterialien einen wesentlich geringeren Gehalt an Edelmetall aufweisen und bei geringen Aushärttemperaturen des Druckfarbenmaterials hergestellt werden; der Kohlenstoffgehalt der Druckfarbe ist so ausgelegt, dass dadurch der Verlust der Leitfähigkeit aufgrund der Reduzierung des Edelmetallgehalts kompensiert wird.
Solche auf Kohlenstoff basierenden Vorrichtungen sind beispielsweise in GB-A-2191003 beschrieben. Sie sind von drei Hauptproblemen betroffen. Erstens ist das Edelmetall / Kohlenstoff Gemisch stark heterogen, so dass die Produkte aufgrund der inhomogenen Verteilung des Edelmetalls im Druckfarbenmaterial unter einer sehr geringen Genauigkeit leiden. Zweitens liegen hohe Hintergrundströme während der Analyse vor, die von den großen Oberflächen der Kohlenstoffkomponenten hervorgerufen werden (Trägerfrequenzrauschen); nicht-Faradaysche Komponenten, d.h. kapazitive Ladeströme, sind eine direkte Funktion der Oberfläche der Kohlenstoffpartikel. Drittens nimmt die Temperaturabhängigkeit des Hintergrundstroms mit zunehmender Temperatur zu; im Allgemeinen ist diese einer Funktion der flexiblen Natur des Polymerbinders, welcher im hohen Maße bei steigender Temperatur aufweicht und somit die Oberflächentopographie der Elektrode verändert.
Diabetes ist die am weitesten verbreitete endokrine Krankheit und hat starke gesundheitsschädliche Konsequenzen für den Erkrankten. Die Sterblichkeitsrate aufgrund dieser Krankheit kann durch eine Blutzuckerüberwachungsroutine reduziert werden, bei der die Patienten Proben ihres Blutes verwenden, um ihren Blutzuckergehalt zu überwachen und die Diäten, die Medikamente und die Insulintherapie an den Blutzuckergehalt anpassen. In extremen Fällen wird solche eine Überwachung verwendet, um hypoglykämische Attacken, die Koma und nachfolgenden Tod auslösen können, zu vermeiden. Blut für die Analyse wird jedoch durch einen Fingerstich oder einen Venenprobe gewonnen, was dem Patienten Schmerz und Unbehagen bereitet. Schweiß sammelnde Vorrichtungen sind bekannt. Dies sind im Allgemeinen Hautpflaster aus Hydrogel, die Permeationsverbesserer enthalten. Der gesammelte Schweiß oder das Exsudat wird entweder in Wasser eingebracht, damit die Glucose aus dem Hydrogel diffundieren kann und dann analysiert wird oder dem Hautpflaster wird die Konzentration des Schweißes im Pflaster durch Vertreiben des angesammelten Wassers ermöglicht und es wird ein spezieller Bindungspartner im Pflaster verwendet, der eine visuelle Identifizierung seiner Anwesenheit im Pflaster anzeigt. Diese Methoden sind beide von qualitativer Natur. Der Patient hat ferner einige Handgriffe vorzunehmen, die insbesondere bei Krankheit des Patienten oder bei Eintritt des hypoglykämischen Komas schwer vorzunehmen sind.
GB-A-2191003 (siehe oben) offenbart, dass ein Enzym, wie Glucose-Oxidase, auf den harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitpartikeln einer Elektrode adsorbiert oder immobilisiert werden sollte. Beispielsweise wird das Enzym in den Poren einer sauerstoft-permeablen, harzgebundenen Schicht gehalten.
WO-A-9702811 offenbart ein Hydrogel-Pflaster, welches Glucose-Oxidase enthält. Dieses kann mit einer Standardelektrode als Glucosesensor verwendet werden.
US-A-5429735 offenbart eine Elektrode, die eine leitende Schicht, die Graphit und Ruß in einem Polymerbinder enthält und ein nichtleitendes Substrat umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Elektrode gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine leitende Schicht, welche beispielsweise durch ein Dickschichtdruckverfahren auf eine nichtleitendes Substrat, beispielsweise aus Kunststoff aufgebracht ist. Die leitende Schicht umfasst Graphitpartikel (Größe bis zu 20μm, Oberfläche 1–50m²/g), welche gleichmäßig mit einem Edelmetall, wie Platin, beschichtet sind und unbeschichtete Kohlenstoftpartikel, die durch einen Polymerbinder ausreichend dicht zusammengehalten werden, um einen elektrischen Kontakt zwischen den Partikeln herzustellen.
Elektroden der Erfindung ermöglichen die amperometrische Bestimmung von elektroaktiven Analytarten bei geringen Konzentrationen mit verbesserten Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der Verwendung von Graphitträgern mit geringer Oberfläche; die verbesserte Homogenität der Metallbeschichtung auf der Oberfläche der Graphitpartikel verbessert die Elektrode zu Elektrode Genauigkeit und die Vernetzung durch den Polymerbinder reduziert die Empfindlichkeit des Ansprechverhaltens der Elektrode auf Temperaturschwankungen.
Beschreibung der Erfindung
Bei der Herstellung von Produkten der Erfindung können die wesentlichen Komponenten der Erfindung als eine einzelne Elektrode, eine Mikroelektrode oder ein Mikroelektrodenarray aufgebracht werden. Die Elektrode kann in Verbindung mit einer Referenz- / Gegenelektrode, welche auf dasselbe Substrat aufgebracht ist, verwendet werden. Eine Elektrodenvorrichtung kann durch Aufbringen einer Edelmetall, modifiziertes Graphit, Kohlenstoff und Polymerbinder enthaltenden, leitenden Schicht auf ein nichtleitendes Substrat und durch Aufbringen einer leitenden, an der ersten Schicht anliegenden zweiten Schicht, welche Silber / Silberchlorid aufweist und als Referenz- / Gegenelektrode fungiert, hergestellt werden.
Das nichtleitende Substratmaterial kann ein Polyesterfolien-Material sein, oder aus Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polypropylen hoher Dichte oder Polypropylen niedriger Dichte hergestellt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polyesterfolienmaterial um ihr Formbeständigkeit zu verleihen vor der Aufbringung der leitenden Schichten hitzestabilisiert.
Das Edelmetall für die leitende Schicht ist beispielsweise Platin, Rhodium, Palladium, Iridium, Ruthenium oder Osmium. Die Graphitkomponente hat eine durchschnittliche Partikelgröße von weniger als 20μm und eine typische Oberfläche von weniger als 50m²/g und ist inhärent leitfähig; es kann aus natürlichen Quellen stammen oder synthetisch hergestellt werden. Das Edelmetall wird gleichmäßig auf die Oberfläche des Graphitmaterials aufgebracht. Die Metallmenge beträgt bevorzugt 5 – 20 Gewichtsprozent bezogen auf das Graphit.
Die Kohlenstoffkomponente hat eine durchschnittliche Partikelgröße von weniger als 1 μm, zum Beispiel 5 – 70 nm, und eine typische Oberfläche von weniger als 150, zum Beispiel 1 – 150, m²/g. Wie die Graphitkomponente ist sie inhärent leitfähig. Der Polymerbinder kann aus einer der diversen Polymerfamilien abgeleitet sein. Er weist bevorzugt chemische funktionelle Gruppen, die eine kovalente Vernetzung ermöglichen, auf, wie Carboxylat- , Hydroxyl-, Amin-, Thiol-, Ester-, Epoxid- oder Amidgruppen.
Das leitende Elektrodenmaterial kann durch konventionelle Druckverfahren auf das nichtleitende Substrat aufgebracht werden, beispielsweise Dickschichtdruck (auch als Siebdruck bekannt), Lithographie, Buchdruck, Aufdampfung, Spritzbeschichten, Tintenstrahldruck, Laserstrahldruck, Aufwalzen oder Vakuumbedampfung.
Im Anschluss an die Aufbringung des leitenden Elektrodenmaterials kann der Polymerbinder durch eine Anzahl konventioneller Verfahren stabilisiert oder ausgehärtet werden, Belüftungstrocknen, Belüftungstrocknen bei erhöhten Temperaturen, Infrarotbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, lonenstrahlbestrahlung oder Gammabestrahlung. All diese Prozesse führen zu einem unterschiedlichen Vernetzungsgrad der individuellen Moleküle des Polymerbinders. Die Verwendung von Ultraviolettbestrahlung setzt die Einbettung eines photoempfindlichen Reagens in das leitende Elektrodenmaterial voraus, um die Polymer-Vernetzungsreaktion auszulösen.
In einer alternativen Ausgestaltung wird die vernetzte Schicht durch eine Druckfarbe aufgebracht, die einen hohen Gehalt an Graphit, Kohlenstoff, Vernetzer und Binder aufweist. Das Graphit, der Kohlenstoff und das Polymer sind im Wesentlichen, wie oben beschrieben wurde.
Die erfindungsgemäßen Elektroden haben verschiedene Eigenschaften, die ihre Verwendung zur Messung von in geringer Konzentration vorliegender Analyten wünschenswert macht. Die Elektroden zeigen beispielsweise geringes elektrochemisches Hintergrundrauschen, was von besonderer Bedeutung bei der Messung von elektrischen Schwachströmen ist.
Die Gegenwart eines Edelmetalls in der leitenden Schicht ermöglicht die Oxidation / Reduktion der Analytarten bei schwächeren Potenzialen als im Vergleich bei alleiniger Verwendung von Graphit / Kohlenstoff. Die Gleichmäßigkeit der Aufbringung des Edelmetalls bietet eine hohen Grad an Präzision von Elektrode-zu-Elektrode in Bezug auf das Ansprechverhalten. Ferner ist die Temperaturabhängigkeit des Ansprechverhaltens der Elektrode gegenüber dem Analyt durch die Vernetzung des Polymerbinders reduziert.
Die erfindungsgemäßen Elektroden können zur Analyse von Analyten / Arten verwendet werden, die unmittelbar durch Entfernen oder Zugabe von Elektronen an einer Elektrode oxidiert oder reduziert werden können. Sie können auch dazu verwendet werden, Analyte / Arten zu detektieren, welche ohne weiteres durch ein Enzym in ein Produkt umgewandelt werden können, welches unmittelbar durch Entfernen oder Zugabe von Elektronen an einer Elektrode oxidiert oder reduziert werden können. Es wird bevorzugt, dass ein Gegenstand der Erfindung solch ein Enzym, beispielsweise Glucose-Oxidase umfasst.
Das Enzym wird bevorzugt in einer Schicht gehalten, welche separiert von der leitenden Schicht aber im unmittelbaren Kontakt hiermit steht. Beispielsweise ist eine Hydrogel-, Sol-Gel- oder poröse Schicht, welche das Enzym enthält, durch Bedrucken auf die leitende Schicht aufgebracht. Alternativ wird ein Gel zur Kontaktierung mit der Haut verwendet, aber das Enzym wird in einer Zwischenschicht gehalten, beispielsweise in einer mikroporösen Membran; dies kann helfen, das Enzym trocken und daher stabil zu halten und auch die Absorption von Schweiß zu verbessern.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung, die, falls sie in direkten Kontakt mit der Haut gebracht wird, fähig ist, Permeation oder Schwitzen einer Versuchsperson zu bewirken. Deren Verwendung umfasst das Sammeln von interessierendem Analyt in unmittelbarer Nähe der messenden Elektroden und das amperometrische Messen von geringen Gehalten an aktivem Analyt. Eine Leiterbahn wird verwendet, um thermisch Schwitzen und so den Transport des aktiven Analyt zu bewirken. In einer anderen Ausgestaltung kann die Vorrichtung Elektroden umfassen, die Schwitzen durch lontophorese bewirken. Die Messelektrode besteht aus einer Arbeitselektrode, die empfindlich gegenüber geringen Konzentrationen des Analyts ist und einer Referenz- / Gegenelektrode. Die Vorrichtung ist empfindlich gegenüber mikromolaren Glucosekonzentrationen. Die Vorrichtung kann in situ wieder verwendet werden; das Detektiersystem erfordert es nicht, dass die Probe zuerst in einer separaten Membran oder Vorrichtung vor der Analyse gesammelt wird. Dadurch kann eine schnelle Bestimmung des Glucosegehalts, der durch die Haut diffundiert, ohne eine große Anzahl von Handgriffen am Patienten oder Auswechseln von Membranen vorgenommen werden können.
Genauer, solch eine Vorrichtung kann dazu verwendet werden, Glucose zu messen, wenn sie in direktem Kontakt mit der Haut gebracht ist. Die Elektrodenvorrichtung umfasst gedruckte Elektroden, die in Kontakt stehen mit einem Gel (obwohl auch alternative System, wie oben beschrieben, verwendet werden können), eine leitende Schicht aus Silber oder Kohlenstoff, die fähig ist, ein Schwitzen thermisch zu bewirken, eine zweite leitende Schicht, wie oben offenbart, die als Arbeitselektrode fungiert, und eine dritte leitende Schicht aus Silber oder Silberchlorid, die als Referenz- / Gegenelektrode fungiert.
Die leitende Schicht aus Silber wird als Heizkreis verwendet, um Schwitzen des Patienten hervorzurufen. Der Schweiß wird im Gel benachbart zur Haut gesammelt und, um den Durchgang von Glucose durch die Haut zu bewirken, kann die Vorrichtung optional Schweiß- oder Durchlässigkeitsverbesserer in der Gelschicht umfassen. Die Gelschicht enthält zusätzliche Gucose-Oxidase-Enzyme, um Glucose in Wasserstoffperoxid umzuwandeln. Die Gegenwart eines Edelmetalls in der leitenden Schicht ermöglicht die Oxidation des Wasserstoffperoxids.
Bei der Verwendung wird die Vorrichtung direkt gegen die Epithelmembran angeordnet, so dass inniger Kontakt zwischen der Oberfläche der Vorrichtung und der Haut hergestellt wird. Nach einem festen Zeitabschnitt diffundiert Glucose durch die Haut in das Gel unter Verwendung eines Heizkreises, der Schwitzen bewirkt oder unter Aktivität eines Durchlässigkeitsverbesserers, der im Gel vorliegt. Glucose, das in der Gelschicht angesammelt wird, wird durch Glucose-Oxidase oxidiert und Wasserstoffperoxid wird gebildet.
Wird ein Potenzial, beispielsweise 500mV, zwischen der Arbeitselektrode und der Referenz- / Gegenelektrode angelegt, wird eine Stromanzeige aufgrund des Oxidation des Wasserstoffperoxids erhalten. Der gemessene Strom ist direkt proportional zur Glucosekonzentration des Patienten.
Das folgende Beispiel illustriert die Erfindung.
Beispiel
Ein leitendes Druckfarbenmaterial wurde auf einer nichtleitenden, 125μm dicken Polyesterfolie im Siebdruckverfahren aufgebracht. Das Druckfarbenmaterial weist eine dreifach in der Walzenmühle gemahlene Mischung aus 32g mit 5% Platin beschichteten Graphitpartikeln (durchschnittliche Partikelgröße 1 μm; Oberfläche 15 m²/g), aus 0,98g Kohlenstoffpartikeln (durchschnittliche Partikelgröße 40nm; Oberfläche 100 m²/g), aus 35g eines 30% Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymerbinders in 52g eines organischen Lösungsmittels (Polyspeed von Coates), 15 phr eines bifunktionellen Vernetzungsmittel (Hexamethoxymethylmelamin) und aus 1 % saurem Katalysator. Nach Aufbringen der leitenden Druckfarbe wurden die Lösungsmittel in einem Umluftofen entfernt. Durch Erhitzen auf 140°C wurde die Vernetzung des Polymerbinders durch das bifunktionelle Amin ausgelöst.
Eine im Siebdruckverfahren aufgebrachte, Silber- / Silberchlorid-Referenz- oder Referenz- / Gegenelektrode wurde angrenzend an die Kohlenstoffschicht auf dem Polyesterträger angeordnet. Eine leitende Kohlenstoff-Gegenelektrode wurde in der Nähe der Arbeits- und Referenzelektroden angeordnet. Eine Silber-Leiterbahn wurde um die Arbeits-, Referenz- und Gegenelektroden angelegt, um Mittel zur elektrischen Beheizung der Vorrichtung zu schaffen. Eine Glucose-Oxidase enthaltende, hydrophile Polymerschicht oder Hydrogel wurde dann auf die Elektroden aufgebracht.
Die Vorrichtung wird verwendet, indem das Polymer oder Hydrogel auf die Haut einer Versuchsperson aufgebracht wird. Durch elektrische Erwärmung der Vorrichtung wird Schwitzen bewirkt. Der Schweiß diffundiert in das Polymer oder Hydrogel, wo er mit Glucose-Oxidase reagiert, um Wasserstoffperoxid zu produzieren. Wird ein Potenzial zwischen der leitenden Pt / Kohlenstoffelektrode und der Silber / Slberchloridelektrode angelegt, kann die Elektrodenvorrichtung mit Hilfe der Chronoamperometrie zur Messung des Wasserstoffperoxids verwendet werden. Die Empfindlichkeit des Vorrichtung gegenüber Wasserstoffperoxid beträgt 50 – 100 nA/μM.
Die Vorrichtung zeigt sehr geringes Hintergrundansprechen im Puffer (7nA) und im Hydrogel (22nA), bei Potenzialen von 0,6 bzw. 0,5 V. Die Auswirkung der Temperatur auf das Hintergrundsignal ist auch gering.

Claims

Elektrode umfassend ein nichtleitendes Substrat und eine leitende Schicht, die in einer Verbundmatrix Graphitpartikel und unbeschichtete Kohlenstoffpartikel umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Graphitpartikel eine Größe von bis zu 20 μm und eine Oberfläche von 1 – 50 m²/g aufweisen und dass die Graphitpartikel mit einem Edelmetall beschichtet sind.
Elektrode gemäß Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffpartikel eine Größe von 5 –70 nm und eine Oberfläche von weniger als 150 m²/g aufweisen.
Elektrode gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Edelmetall Platin ist.
Elektrode gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Graphitpartikel mit 5 –20 Gewichtsprozent des Metalls beschichtet sind.
Elektrode gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Matrix ein vernetztes Polymer ist.
Elektrode gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, welche zusätzlich auf der leitenden Schicht eine weitere Schicht aufweist, die ein Enzym beinhaltet.
Elektrode gemäß Anspruch 6, welche zusätzlich eine separate, leitende, beheizbare Schicht aufweist.
Elektrode gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das Enzym Glucose-Oxidase ist.
Verwendung einer Elektrode gemäß Anspruch 8 als ein Glucose-Sensor.