DE1773241A1 - Elektrochemischer Wandler - Google Patents

Elektrochemischer Wandler

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Description

betreffend
Elektrochemischer Wandler
Die Erfindung betrifft einen elektrochemischen Wandler, geeignet für biomedizinische Anwendungen in vivo, der hergestellt wird, indem eine gelatinöse Membran eines Enzymgels, z.B. eine Polyacrylamidmatrix mit darin verteilten olukoseoxydasemolekulen auf die messende Fläche eines Sauerstoff-Messfühlers, z.B. einer polarographischen Sauerstoffelektrode polymerisiert wird. Der Sauerstoff-Messfühler kann eine Einzelkathode oder ein Kathodenpaar enthalten mit dem Differenzialmessungen durch Deaktivieren des einer der Kathoden benachbarten Enzyms durchgeführt werden können.
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Die Fortschritte in der biomedizinischen Fernmessung wurden durch die kontinuierliche Fernüberwachung von physiologischen Variablen wie Temperatur, gastrointestinalera Druck und Blutdruck, Atmungsgeschwindigkeit und Biopotentialen (EKQ und EEG) ermöglicht. Es stehen auch Instrumente zur Verfügung, um kontinuierlich in vivo PO2, pCO2» pH-Wert und Elektrolyten des Blutes und den pH-Wert des Magensaftes zu messen. Die vorliegende Erfindung, eine Enzymelektrode ermöglicht eine weitere Ausdehnung des biomedizinischen Instrumentariums auf die kontinuierliche Messung in vivo von chemischen Substanzen des Zwischenstoffwechsels, z.B. Glukose.
Die erfindungsgemässe Enzymelektrode ist ein elektrochemischer Wandler der A) einen Sauer stof fr-Messfühler, der aus einem Anodensystem, das mindestens eine Anode umfasst, aus einem Aaede» auf dieses Anodensystem bezogenen Einzel- oder Doppelkathodensystem, aus einer dem Kathodensystem benachbarten Membran mit Sauerstoffspezifität und aus einer Elektrolytlösung zwischen Anodensystem und Kathodensystem besteht, sowie B) ein Enzym in geringem Abstand von der Membran des Sauerstoff-Messfühlers umfasst.
Zum besseren Verständnis werden nachstehend versohle- \ dene Ausführungsformen des Erfindungegegenstandes anhand der : beigefügten Zeichnungen im einzelnen näher erläutert·
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Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform der erf indungsgeraässen Enzymelektrode;
Fig. 2 zeigt eine andere Ausführungsform der erfindungsgemässen Elektrode mit Doppelkathode;
Fig. 3 zeigt eine Messaltung, mit der der Stromanstieg bzw. -auall einer EnzymelekbrocLe gemessen w«rd.ei kann;
Fig. ^ zeigt eine Form der Vorrichtung zum Polymerisieren eines Enzymgels auf einem Sauerstoff-Messfühler, und
Fig. 5 veranschaulicht graphisch das Ansprechen einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Enzymelektrode auf verschiedene Enzymgele.
Die folgende Beschreibung der Erfindung bezieht sich auf aus bestimmten Stoffen hergestellte Sauerstoff-Messfühler und ein besonderes Enzymgel, das aus einem bestimmten Polyacrylamid besteht, in welchem Moleküle des Enzyms Glukoseoxidase dispergiert sind. Es muß aber hervorgehoben werden, daß jeder beliebige Messfühler,
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der von dem Diffusionsfluse des Sauerstoffs durch eine Membran abhängt, Anwendung finden kann; daß die Verwendung eines Polyacrylamide, in der Tat die Verwendung eines beliebigen Polymeren, nur eine von vielen Möglichkeiten darstellt, um das Enzym mit Bezug auf die oben genannte Membran zu fixieren; und daß eine Spezifitat für andere Substrate z.B. für diejenigen der Dehydrogenaseenzym eingebracht und Cofaktoren wie Nikotinamidadenindinuoleotid (NAD) und Elektronenträger z.B. Phenazlnmethosulfat (PMS) zugesetzt werden.
Wie Fig. 1 zeigt, misst ein Sauerstoff-Messfühler 1 mit einer Anode 2, einer von einem Glasgehäuse 4 umschlossenen Kathode 3 und einer Elektrolytlösung 5 den Diffusionsfluss des Sauerstoffs durch eine Kunststoffmembran 6. Die Stromabgabe dieser Vorrichtung ist eine lineare Punktion des Sauerstoffdruckes, der sich seinerseits unmittelbar mit dem Diffusionsfluss des Sauerstoffs ändert. Spezifitat für Glukose wird erzielt, indem die Membran mit einem Enzymgel 7, bestehend aus Glukoseoxldase verteilt in einem Polyacrylamid^überzogen wird. Wird diese Enzymelektrode mit einer biologischen Lösung oder einem biologischen Gewebe in Berührung gebracht, so diffundieren Olukose und Sauerstoff in die Enzyragelschicht 7 ein, während entsprechend H9O9 und Glukonsäure ausfllessen. Der Saaerstoff- ά ά At:
χ)erzielt werden kann, indem z.B. ein - 5 -
Dehydrogenaseenzym
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Diffusionsfluss durch die Kunststoffmembran 6 wird in Gegenwart von Glukoseoxidase (GO) und Glukose durch die enzymkatalysierte Reaktion zwischen Glukose und Sauerstoff entsprechend der Gleichung
GO
Glukose + Og · ·■ ■ Glukonsäure +
verringert. Wenn Sauerstoff in nicht-geschwindlgkeitsbesohränkendem Überschuss vorhanden ist und die Glukosekonzentration ausreichend niedrig ist (wie später näher erläutert wird), besteht eine lineare Beziehung zwischen Glukosekonzentration und Abnahme des Sauerstoffdruckes. Der Ausgangsstrom der Ehzymelektrode wird gemessen, nachdem ausreichend Zeit verstrichen ist, damit der Diffusionsvorgang gleichmässig wird. Diese Zeitspanne schwankt zwischen etwa 30 seo bis zu 3 min für ein Ansprechen bei 98 % Konstanz und hängt primär von der Dicke der Kunststoffmembran 6 und der Enzymgelschicht 7 ab. Sauerstoff-Messfühler mit Sinzelkathode sind im Handel erhältlich oder können In Labor hergestellt werden. Bs ist zweckmässig, die im allgemeinen aus Platin oder Gold bestehende Kathodenspitz« auf einen kleinen Durchmesser (etwa 25M oder weniger) 8U beschränken, wenn Messungen In stehenden Lösungen vorgenommen werden sollen, ohne dabei die Gesamtkonzentration der Lösung zu verändern.
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Die folgende Beschreibung und die angegebenen Messwerte beziehen sich auf eine beispielhafte Enzymelektrode mit Doppelkathode, wie sie In Flg. 2 gezeigt wird. Ein etwa 35/U starkes mit Siliconharzbindemittel imprägniertes Nylonnetz 8 dient als Träger für die Enzymgelschicht über dem starren Sauerstoff-Messfühler 10. Feine Löcher vom Durchmesser 50 - 300 /U sind in dem imprägnierten Netz unmittelbar über den Spitzen der Kathoden 12 durch thermisches Punktieren mit einem heissen Platindraht mit feiner Spitze angebracht. Der Sauerstoff-Messfühler 10 kann hergestellt werden, indem A) ein Paar Platinkathoden 12 in gläsernen Kapillarrohren 13 bereitgestellt, B) diese Kathoden mit einer einzelnen Ag-AgCl Anode spiralig um- ' wunden und G) die Kathoden und die Anoden mit einem Glasgehäuse 15 umgeben werden, D) der obere Teil der Kathoden und der Anode durch eine Epoxidichtung 16 zwischen den Kathoden und der Anode einerseits und dem Gehäuse andererseits abgetrennt, E) diese oberen Teile mit einer Kunststoffmembran 17 bedeckt werden, die mit zwei Gummi "0" Ringen 18 festgehalten wird und F) eine Elektrolytlösung 19 zugesetzt wird. Das Imprägnierte Netz 8 wird
durch den um den Sauerstoff-Messfühler 10 angeordneten Kunststoffsockel 20 festgehalten. Diese Enzymelektrode kann mit einer einzelnen Kathode unmittelbar ale Binzelkathode-Enzymelektrode oder mit beiden Kathoden als
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Differential-Enzymelektrode Anwendung finden, wie nachstehend noch im einzelnen beschrieben wird.
Das elektrische Signal aus der Enzyraelektrode wird mit Hilfe einer Messchaltung, wie sie z.3. in Fig. 3 gezeigt wird, in einen ablesbaren Messwert gewandelt. In diesem Blockdiagramm wird ein Elektrometer-Schreiber 21 sowohl für die Kessungen mit der Einzelkathode als auch für die Messungen mit der Doppelkathode 22 und 23 verwendet. Ein Rückkopplungswiderstand 2k ist zwischen das Servopotentiometer 25 des Schreibers und dem Chopperkontakt 26 geschaltet. Das am Widerstand 2k stehende Potential dient als Vergleichsspannung 27. Wenn der Chopperkontakt 26 geerdet ist, wie dies bei der gezeichneten Stellung des Kontaktes 28 gezeigt ist, befindet sich der Servomotor 29 mit dem Verstärker 30 dann im Abgleich, wenn der Strom durch den Widerstand 2k dem Strom von der Anode 31 zur Kathode 22 gleicht, wobei das Potential am Punkt 32 dem Erdpotential gleich wird. Daher ist der Strom in der Enzymelektrode 33 gleich der Spannung 2? dividiert durch den Widerstand 2k entsprechend dem Ohm'sehen Gesetz. Steht der Kontakt 28 in der Schaltstellung J,kt so befindet sich der Servomotor 29 dann im Abgleich, wenn der Strom durch den Widerstand 2k gleich ist der Differenz zwischen den Strömen der beiden Kathoden 22 und 23.
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Gemäß einer Arbeitsweise zum Polymerisieren der Enzymgel schicht werden zwei Reagentien in 0,1m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,*l· hergestellt und zwar A) eine 50 %ige Acryl amidi ö sung und B) eine 3 #ige N,N-Methylenbisacrylamidlösung. Um das Enzym in der Polyraermatxix * einzuschllessen, werden 2 mg Glukoseoxidase (QO) in 2 Tropfen physiologischer Kochsalzlösung gelöst. V Tropfen des Acrylamidreagens werden mit 12 Tropfen der Bisacrylamidlösung vermischt und etwa 0,01 mg Riboflavin und 0,01 g Ammoniumpersulfat zugesetzt, um die Copolymerisationreaktion zu katalysieren. Unter einem Präpariermikroskop werden die winzig kleinen Punktursteilen in dem Trägernetz unmittelbar unter Verwendung einer Mikropipette mit Enzymgellösung gefüllt. Die Copolymerisation wird durch Sauerstoff gehemmt und benötigt Licht. Infolgedessen wird eine sauerstoffreie Polymer!sationskammer 35» die eine Natriumdithionatlösung 36 enthält, wie in Fig. % angegeben, zusammengebaut. Die zusammengesetzte Enzymelektrode 37 wird in die Kammer 35 gebracht und der Sauerstoff in der Kammer 35 mit Stickstoff, der durch das Bohr 38 eingeleitet und duroh die Öffnung 39 abgeblasen wird, verdrängt. Die photokatalytische Polymerisationsreaktion ist unter vorzugsweiser Verwendung einer Nr. 2 Photolampe *K) in weniger als 10 min beendet. Eine eingehende Beschreibung der Herstellung von
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verschiedenen Acrylamidgelen mit Enzymgelaktivität ist in der amerikanischen Patentanmeldung Ser. Nr. 631 716 gegeben.
Die Glukosekonzentration wird mit der Glukoseoxidase-Enzymelektrode in ähnlicher Weise gemessen, wie die
Wasserstoffionenkonzentration. Zunächst wird eine Standardkurve mit Standardglukoselösungen aufgenommen, darauf' ist die Elektrode gebrauchsfertig.
Die Eichkurve dieser analytischen Vorrichtung ist
bei niederen Substratkonzentrationen istt erster Ordnung und wird bei hohen Slubstratkonzentrationen nullter Ordnung. Eichkurven wurden in Abhängigkeit der Intragel Knzymkonzentration und Porenweite untersucht. Vier Eichkurven, die mit verschiedenen Gelen aufgenommen wurden, sind in Fig. 5 wiedergegeben. Die ausgezogenen Kurven
beziehen sich auf 1 000 mg GO/100 cnr Gel, die gestrichelten Kurven auf 100 mg GO/100 ciP Gel; die Kurven
mit ausgefüllten Kreisen entsprechen der Verwendung von Gelen mit 8 Gew.-% Monomere» und Vernetzungsmittel; die Kurven mit nichtausgefüllten Kreisen entsprechen der Vernendung von Gelen mit 19 Gew.-# Monomeren und Vernetzungsmittel.
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Mit zunehmender Konzentration an Monomeren und Vernetzungsmittel nimmt die Intragel-Porenweite ab und die Eichkurve wird nach rechts verschoben, wobei zwar der lineare Eichbereich verlängert, aber die Empfindlichkeit verringert wird. Mit zunehmender Intragel-Enzymkonzentration hingegen wird die Eichkurve nach links verlagert, wobei der lineare Bereich verringert, aber die Empfindlichkeit erhöht wird.
Die Glukoseoxidase-Enzymelektrode ist temperaturempfindlich und der Elektrodenafiag*88g nimmt im Bereich von 25 - 2K)0C um etwa 5,3 % je 0C zu,· sie kann so angelegt sein, daß sie mit weiter Ansprechempfindlichkeit bei O0C arbeitet. Die Nacheichung einer Enzymelektrode, die über Nacht in Pufferlösung von Raumtemperatur gelassen worden war, lag innerhalb + 10 % der Sichung des vorhergehenden Tages. Die Enzymmembranen können zur Rückgewinnung der Aktivität in Raumluft getrocknet und rehydratisiert werden.
Sauerstoff-Messfühler können vom Pliessen der Lösung praktisch unabhängig gemacht werden, indem eine Platinkathode mit Spitzendurchmesser < 25/U und 25/U starke oder stärkere Plastikmembranen verwendet werden. Unter diesen Bedingungen wird nur eine vernachläesigbare Menge Sauerstoff an der Oberfläche der tiikrokathode
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verbraucht und der Diffusionsfluss des Sauerstoffs durch die Plastikmembrane wird ein geschwindigkeitsbegrenzender Vorgang, der vom Säuerstoffdruck abhängt. In gleicher Weise wird um die Wirkung der Strömung auf das Ansprechen der Enzymelektrode auf ein Minimum herabzusetzen, der Durchmesser der Öffnung über der Kathode so klein gehalten, wie dies technisch nur möglich ist.
Die Einzelkathode-Glukoseoxidase-Enzymelektrode spricht auf Konzentrationsänderungen von Glukose und Sauerstoff an. Pur die Überwachung in vivo von Gewebsglukosekonzentration ist ein vom Sauerstoffdruck unabhängiger Glukosewandler erwünscht. Um praktisch die Ansprechempfindlichkeit gegenüber Änderungen des Sauerstoffdruckes, die nicht über die Glukoseoxidase vermittelt werden, auszuschalten, kann die in Fig. 2 gezeigte Doppelkathode-Enzymelektrode verwendet werden. Glukoseoxidasegel wird in beiden Mikropunkturstellen fixiert. Da die Aktivität der Glukoseoxidase über 700C schnell zerstört wird, kann die eine der beiden Enzymkathoden durch Inaktivieren Ihrer Enzymaktivität durch Wärme nicht ansprechbar auf Glukose gemacht werden. Diese durch Wärme inaktivierte Kathode bleibt jedoch ansprechbar auf Änderungen des Sauerstoffdruckes. Durch Aufzeichnen der Differenz zwischen
den Strömen
den-Auegaae· der beiden, auf dieselbe Ag-AgCl Elektrode
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bezogenen Kathoden wird eine Enzymelektrode erhalten, die ansprechbar ist auf Änderungen der Glukosekonzentration, jedoch relativ nicht ansprechbar auf Änderungen aes Sauerstoffdruckes.
Selbstverständlich können hinsichtlich der zur Erläuterung der Erfindung beschriebenen Einzelheiten,
Stoffe, Verfahrensstufen und Anordnung von Bauteilen zahlreiche Änderungen vorgenommen werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Patentansprüche
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Claims (1)

  1. DB. ING. F. WUESTHOFF ImÜNCHIK 9o1 773241
    DB .E. v. PECHMANN TUIroI »a οβ 51
    PATENTANWÄLTE
    1A-34 499
    Patentansprüche
    Elektrochemischer Wandler, umfassend erstens einen Sauerstoff-Meßfühler mit einer Anode, eine auf diese Anode bezogene Kathode, eine der Kathode benachbarte Membran mit Sauerstoffspezifizität und eine Elektrolytlösung, die so angeordnet ist, daß Anode und Kathode leitend miteinander verbunden sind, zweitens ein Enzymgel in geringem Abstand von der Membran des Sauerstoff-Meßfühlers, wobei das Enzymgel aus einer Matrix aus einem Polymeren sowie darin verteilten Molekülen eines aktiven Enzyms besteht«
    2* Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 1f dadurch gekennzeichnet , daß die Moleküle des aktiven Enzyme homogen in der Matrix aus dem Polymeren verteilt sind und praktisch mit dieser nicht reagieren und die Matrix aus dem Polymeren eine ausreichend kleine Porenweite aufweist, um die Enzymmoleküle zurückzuhalten·
    3· Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 1, dadurch gekennaeich.net, daß dae Polymer ein Acrylpoly- merisat ist·
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    ΛΗ
    4» Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Polyacrylamid ist,
    5» Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Copolymerisat aus Acrylamid und Ν,Ν-Methylenbisacrylamid ist·
    6· Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxldase ist»
    7· Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glükoeeoxidase ist»
    3. Elektrochemischer Wandler umfassend erstens einen Sauerstoff-Meßfühler mit einer Anode, einem auf diese Anode bezogenen Kathodenpaar, einer dem Kathodenpaar benachbarten Membran mit Sauerstoffspezifität und einer Elektrolytlösung, die so angeordnet ist, daß die Anode und das Kathodenpaar elektrisch leitend miteinander verbunden sind, sowie zweitens ein der Membran und dem Kathodenpaar des Sauerstoff-Hfßfühlers benachbartes Enzymgel, das aus einer Matrix aus einem Polymeren sowie darin eingebetteten Enzymmolekülen besteht, wobei die einer der beiden Kathoden benachbarten Enzymmoleküle inaktiv sind.
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    9β Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 8, dadurch
    gekennzeichnet , daß die Moleküle des aktiven Enzyms homogen in der Matrix des Polymeren verteilt sind und mit dieser praktisch nicht in Reaktion treten und die Matrix aus dem Polymeren eine ausreichend kleine Porenweite aufweist, um die Emzymmoleküle zurückzuhalten*
    10, Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymer ein Acrylpolymerisat ist.
    11. Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymer ein Polyacrylamid ist·
    12» Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymer ein Oopolymerisat aus Acrylamid und NtN-Methylenbisacrylamid ist.
    13· Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxidase ist.
    14. Elektrochemischer Wandler nach Anspruch 13» dadurc gekennzeichnet , daß das Enzym G-lukoseoxidase ist.
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    15. Elektrochemischer Wandler umfassend erstens einen Sauerstoff-Meßfühler, der aus einem Anodensystem, das mindestens eine Anode umfaßt, einem auf das Anodensystem bezogenen Kathodensystem, das mindestens e ine Kathode umfaßt, einer dem Kathodensystem benachbarten Membran mit Sauerstoffspezifität sowie einer derart angeordneten Elektrolytlösung, daß das Anodensystem und das Kathodensystem leitend miteinander verbunden sind, besteht, sowie zweitens ein der Membran des Sauerstoff-Meßfühlers benachbartes Enzym·
    16α Verfahren zum Messen der Konzentration βiner Verbindung in Lösung, dadurch gekennzeichnet , daß man erstens eine enzymatische Reaktion auslöst, indes man die Lösung mit mindestens einem Enzym der gewünschten enzymatisehen Reaktion in Berührung bringt, wobei mindestens die genannte Verbindung und Sauerstoff Reaktionsteilnehmer oder Produkte der enzymatischen Reaktion sind, worauf man zweitens die durch die genannte Reaktion hervorgerufene Änderung des Sauerstoffdruckes niet und drittens diese Änderung des Sauerstoffdruckes but Konsentration der Verbindung in Beziehung setzt·
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