KR950004906B1 - 고정된 효소 전극 - Google Patents

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내용 없음.

Description

고정된 효소 전극
제1도는 다른 형태의 탄소전극상에 고정된 글루코오스 산화효소와 비교한 본 발명에 따른 글루코오스 산화효소 전극의 감응성을 나타낸다.
제2도는 글루코오스 산화효소 전극의 안정성을 나타내는 제1그래프이다
제3도는 글루코오스 농도 범위에 대한 글루코오스 산화효소 전극의 감응성을 나타내는 제2그래프이다.
제4도는 변화하는 주위 산소 압력 조건하에 글루코오스 산화효소 전극의 감응성을 나타내는 그래프이다.
제5도는 실온에서 글루코오스 산화효소 전극의 보관 효과를 나타내는 그래프이다.
제6도는 실온에서의 선행기술 전극의 보관효과를 나타내는 대조용 그래프이다.
제7도는 본 발명의 글루타르알데하이드 고정된 글루코오스 산화효소 전극의 감응성과, 선행기술에 따른 글루타르알데하이드 고정된 글루코오스 산화효소 전극의 감응성을 비교하여 나타낸다.
제8도는 제7도에 상응하지만, 카보디이미드 고정화를 이용한다.
제9도는 본 발명의 카보디이미드 고정된 락테이트 산화효소 전극의 감응성과, 선행기술에 따른 카보디이미드 고정된 락테이트 산화효소 전극의 감응성을 비교하여 나타낸다.
제10도 및 제11도는 각각 본 발명에 따른 갈락토오스 산화효소 전극 및 락테이트 산화효소 전극의 감응성 프로파일을 나타낸다.
제12도는 본 발명에 따른 혼합된 글루코오스 산화효소/베타-갈락토시다제전극의 감응성 프로파일이다.
제13도는 백금 도금된 탄소분말용 결합제로서 폴리테트라플루오로에틸렌 대신 폴리비닐 아세테이트를 사용한 본 발명에 따른 글루코오스 산화효소 전극의 감응성 프로파일을 나타낸다.
제14도는 글루코오스 산화효소가 수지 결합된(폴리테트라플루오로에틸렌) 팔라듐 도금된 탄소분말의 표층을 포함하는 카본지 전극상에 고정되는, 본 발명에 따른 글루코오스 산화효소 전극의 감응성 프로파일을 나타낸다.
제15도는 본 발명에 따른 전극의 작동 특성을 측정하는데 사용된 변형된 랜크 전기 화학 전지를 나타낸다.
제16도는 특정한 측정을 위해 사용된 2-전극 배열을 나타낸다.
본 발명은 효소의 촉매 작용을 받는 기질 존재하에 효소의 촉매 활성에 대해 전류로써 감응하는, 전기전도성 기체(substrate)위에 고정된 효소를 포함하는 효소 전극에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이에 한정되지는 않지만, 산화 환원 효소(예 : 글리코오스 산화효소)가 고정된 전기전도성 기체를 포함하며, 글루코오스-함유 시료내로 도입되는 경우 고정된 효소의 촉매 활성에 대해 전류로써 감응하는, 시험관내 및 생체내 모두에게 글루코오스 농도를 검출하는데 사용할 수 있는 효소 전극에 관한 것이다.
생촉매(biocatalyst)로서 효소를 도입한 전류성 바이오센서(biosensor)의 잇점은 하기 문헌에 더욱 상세히 검토되어 있다[참조 : Aston and Turner,(1984) Biotech. Genet. Eng. Rev.(ed. G. Russell), 1, 89-120. Intercept. Newcastle-upon-Tyne, and Davis G.,(1985) Biosensors, 1, 161-178]. 상기 바이오센서는 신호변환 방식이 다양하며 각기 상이한 형태의 바이오센서는(a) 전기적 감응이 전극에서 효소반응 생성물의 산화로부터 전기적 감응이 발생되는 형태,(b) 산화-환원("redox") 시약에 의해 효소로부터 전극으로 전자가 이동하는 "매개체-보조된" 형태 ; 또는(C) 상기 보조 매개체가 필요없는 "직접적인 전자이동"(DET) 형태로서 대략 분류할 수 있다.
[종류 (a)]
상기 종류는 다음 반응에 따라 효소가 과산화수소를 생성시키는 특정한 산화효소(예 : 글리코오스 산화효소, 알코올 산화효소)의 작용을 참조로 하여 설명될 수 있다.
기질+O2‥(산화효소)‥→산화 생성물+H2O2
이 방법에서, 과산화물은 고정 전위로 유지된 전극에서 산화된다.
H2O2‥→O2+2H++2e
전기신호는 과산화물로부터 전극으로 전자가 이동함에 따라 생성되며, 적합한 조건하에 효소-촉매화된 전류의 흐름은 분석물 농도에 비례한다.
다수의 글루코오스 측정용 기구가 기술되어 있으나, 이들 대부분이 감응 재현성 및 속도, 및 도달가능한 글루코오스 농도범위에 대해 한계치를 갖는다. 적당히 성공적인 시판의 방법들중 일부는 상기 개요된 바와 같이 과산화물의 사용에 의존하여, 이때 글루코오스는 기질이고 산화 생성물은 글루코노-1,5-락톤이다.
다른 방법들은 과산화물의 제2차 반응물(예 : 비색분석) 또는 전도도와 같은 물리 화학적 측정에 의존한다. 그러나, 이들 방법은 일반적으로 감응이 느리고, 매우 다양한 시료중의 산소압력에 대해 다소 민감한 단점을 가진다. 저산소 압력하에서 선형 전류 감응에 대한 상한치는 간단하고 정확한 분석을 위해 요구되는 것보다 더 낮을 수 있다. 이와 유사한 고찰이 글루코오스 이외의 기질에 대한 간접적 분석방법에 적용된다.
종류 (b)-매개체 보조된 바이오센서
이 기구에서, 효소는 농도가 측정되는 분석물인 기질과의 이의 반응결과로서 환원된("전자가 풍부한") 상태로 유지된다. 실제의 센서의 경우 전자공급원(효소내의 몇몇의 전자가 풍부한 "활성부위")과 전극 자체 사이에 전기적 커플링(electrical coupling)이 요구된다. 그러나 활성부위는 거대 분자 효소 구조내의 틈(cleft) 또는 접힌 부분(fold)내에 존재하는 경향이 있으므로 이들 부위에 대한 접근이 완전히 또는 부분적으로 차단되어 있으므로 신뢰성 있고 민감한 신호 변환에 충분히 유효한 전기적 연결부를 설치하는 것은 다소 어렵다. 그러나, 효소와 전극간의 전자이동은, 산화 형태가 효소로부터 전자를 흡수한 다음, 환원상태가 전자를 전극으로 이동시키고, 전극에서 이들을 재산화시키는 전자 운반체 또는 "매개체"를 포함함으로써 촉진될 수 있다.
매개체의 사용은 탄소 전극에 고정된 글루코오스 산화 효소를 사용하는, 최근에 기술된 바이오센서에 의해 설명될 수 있다. 한 가지 형태의 바이오센서는 염화 시아누르산 방법[참조 : Jonsson and Corton, 1985, Biosensors, 1, 355, 369]에 의해 고정된 공유결합 효소를 사용하며, 우수한 안정성(수개월)을 제공한다고 주장하고 있다. 그러나, 상기 센서는 사용되는 매개체인 N-메틸 펜아지늄 이온(펜아진 메토설페이트)이 불안정 하고 또한 쉽게 소모되어 사용시 매일 대체해야 한다는 점에 있어서 매우 불리하다. 또한, 매개체에 의한 전기화학적 변환이 산소 환원반응과 경쟁한다는 것이 입증되었지만, 전극은 산소 농도에 민감하다. 고정된 글뤼코오스 산화효소가 도입된 또다른 바이오센서는 매개체로처 페로센 또는 이의 유도체들중 하나를 사용한다[참조 : Cass et at.,(1984) Analyt. Chem. 56, 667-673 및 유럽특허원 제0078 636호]. 매개체에 의한 전극으로의 전자이동은 다음과 같이 진행된다.
글루코오스+효소[산화형]‥→글루코노-1.5-락톤-효소[환원형]
효소[환원형]+페로센[산화형]‥→효소[산화형]+페로센[환원형]
(페리시늄 이온)
페로센[환원형]‥‥(전극으로의 전자이동)‥·→페리시늄 이온
상기 전극 작동의 기계적인 상세한 설명은 명확하지 않다. 특히, 매우 불용성인 환원된 형태의 페로센 운반체가 전극으로 전하를 이동시켜 사이클릭 매개체 활성을 유지하는(이 목적은 이온성 페로센 유도체에 대해서는 적용되지 않을 수도 있다) 방법은 설명되고 있지 않다. 또한, 관련된 공지의 효소반응 속도로부터 예상할 수 있는 가능한 매우 빠른 감응에 비해 상기 전극의 감응은 다소 느리며, 전극은 효소의 제한된 안정성에 기인된 제한된 수명을 갖는다.
신호 변환에 매개체를 사용하는 경우 몇몇 불이익이 수반된다 : 생촉매를 함유하는 영역으로부터 매개체의 침출가능성, 산화 및/또는 환원 형태의 확산 제한성, 및 매개체 그 자체의 고유한 불안정성.
종류(c)-직접적인 전자이동(DET) 바이오센서
매개체를 포함하지 않는 바이오센서의 제조 가능성이 생전기촉매화에 대한 최근의 보고서에 제시되어 있다[참조 : Tarasevich. (1985) Bioelectrochemisty 10. 231-295]. 상기 기구는 "시약부재" 또는 "매개체 부재"로서 지칭할 수 있다. 매개체 부재 효소전극의 예는 타라세비치의 보고서에 인용되어 있으나, 이들은 예를 들어, 전극의 특성을 변형시키고 매개체의 역할을 수행하는, 메틸 바이올로젠(viologen)의 것과 유사한 구조단위를 함유하는 전도성 유기 중합체 및/또는 전도성 유기염(예 : NMP+TCNQ-(N-메틸 펜아지늄 테트라시아노-4-퀴노디메탄)을 도입한다. 또한 변형된 전극에 의한 산화환원 단백질로부터의 다수의 전자 변환 방법이 이 범주에 포함된다.
다수의 전도성 유기 중합체 및 염의 고유 불안정성이 주목할만 하다. 따라서 알코올 바이오센서에 사용된 NMP/TCNQ-변형된 전극의 활성 반감기는 약 15일이다. 상기 전극은 또한, 산소에 민감하다.
제시된 증거에 따라, 대부분 탄소 기재 전극을 사용하는, 성공적이지 못한 다수의 시도가 기록되어 있을지라도, 소수의 실제로 매개체 부재한 효소전극이 이미 고안된 것으로 보인다. 글루코오스 산화효소의 사용에 대한 최근의 문헌[참조 Jonsson and Corton, 상기 참조]은 입체구조적 제한점 또는 다른 제한점으로 인해 전자이동 능력이 억제되는 경향이 있으므로 매개체를 포함해야할 필요가 있는 효소의 고정화에 주문제가 있음을 제시한다.
탄소 또는 백금상에 고정된 매우 활성인 산화효소의 예는 드물다. 예를 들어, 하기 문헌에는 글루코오스산화효소 및 L-아미노산 산화효소가 염화 시아노르산 방법에 의해 흑연 전극에 공유결합되어 있는 매개체 부재 센서가 기재되어 있다[참조 laniello et al, 1982 Analyt. Chem. 54, 1098-1101] 그러나, 효소전극의 작동 수명은 20 내지 30일로 제한되어 있다[참조 : laniello and Yacynych.(1981) Analyt. Chem, 53, 2090-2095], 전극의 산소 민감성에 대한 어떠한 정보도 제공되지 않았다.
상기 원리에 따라 작동하는 다수의 바이오센서, 특히 글루코오스 센서가 선행기술에서 기술되었으며, 대표적인 선별예가 이미 인지되었으나, 본 목적을 위해 특히 관련된 하나의 문헌에 대해 주시하여야 한다[참조 : Matsushita Electric Appliance Industry Company, 미심사된 일본국 특허 공보 제56-163447호]. 상기 문헌은 글루코오스 산화효소의 존재하에 글루코오스 산화에 의해 생성된 과산화수소가 백금 전극의 표면에서 산화되어 시료의 기질(글루코오스)농도에 비례하는 산화전류 전위를 형성시키는 간접적인 글루코오스 전극을 기술하고 있다 :
글루코오스-O2‥→글루코노락톤-H2O2
효소
H2O2‥→2H++2e-+ O2
전극은 고정된 효소, 예를 들어 고정된 글루코오스 산화효소의 층을 지지하는 전기전도성 탄소기재를 포함한다. 전기전도성 기재 자체는 결합제로서 플루오로카본 수지 10중량부 이하를 함유하는 성형된 흑연 기재이며, 이 개지상에 예를 들어, 전해에 의해 또는 증착에 의해 백금 박막(1μm 미만)이 부착된다. 상기 발명은 이른바 백금 표면 상의 직접적인 효소 고정화와 관련된 문제가 발생되지 않으며, 빠른 감응시간(5초), 높은 민감성 및 내구성을 특징으로 하는 효소 전극을 제조한다. 그러나, 이러한 전극을 사용한 최근의 실험은 상기 잇점을 유도하는데 실패했다.
따라서, 신뢰성이 있고 재현가능하며, 빠른 감응 및 높은 민감성, 및 우수한 장기간 안정성을 나타내는, 한정적이진 않지만 특히 글루코오스 바이오센서에 사용하기 위한 효소 전극에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명에 따라, 더욱 개선된 감응성 및 안정성을 가진 전류성 센서의 제조를 가능하게 하는 더욱 유리한 방법으로 효소, 예를 들어 글루코오스 산화효소를 전극에 고정시키는 효소전극용으로 신규의 탄소 기체(substrate)가 사용된다. 상기 개선된 효소선극은 매개체 시약(비록 필요에 따라 첨가될 수 있을지라도)의 사용이 필요치 않으며 저농노의 용존 산소의 존재하에 작동하는 것으로 밝혀졌다. 이 전극은 높은 감응성, 예를 들어 10nM의 글루코오스 용액중에서 cm2당 100마이크로 암페어의 전류 밀도를 제공하며, 이는 이전의 전류성 효소 바이오센서에서 보다 더 큰 값으로 사료되며, 0 내지 100나노암페어를 생성하는 전극영역 1mm2미만의 소형 탐침 바이오센서 제조에 유리하게 사용될 수 있다. 이 전극은 또한 매우 소량의 고정된 효소를 사용하여 제조할 수 있다. 이것은 보호용 막의 부재하에 전형적으로 1 내지 2초, 및 막의 존재하에 10 내지 30초로, 공지된 글루코오스 센서에서 보다 더 빠르게 글루코오스에 대해 감응한다. 이 전극은 습윤상태, 및 실온에서 보관하는 경우에도 현저한 안정성을 나타낸다. 수개월 후 조차 전극은 우수한 감응성을 나타낸다. 이들 전극은 작동범위가 연장되며, 실질적으로 정상 작동전위보다 더 낮은 작동전위(통상의 650mV에 대해 325mV)를 필요로 하며 상기 작동전위에서 현저히 낮은 백그라운드(background)를 나타낸다.
본 발명의 근거는, 탄소 또는 흑연 입자들이 다공성 층을 형성하기 위해 결합하기 전에 미분된 백금족 금속이 개개 입자의 표면상에 부착 또는 흡착되거나 균질 혼합됨으로써 효소가 흡착되거나, 고정되는 다공성 기체층을 형성하는 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자의 다공성 층으로 이루어지거나 이를 포함하는 전기전도성 지지 부재의 표면상에서 고정된 효소를 포함하며, 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자의 이질성층의 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분산된 백금족 금속을 함유하는 수지 결합된 탄소 또는 흡연 입자의 이질성층이 특징적인 효소전극 또는 바이오센서이다. 따라서, 공개된 일본국 특허원 제56-163447호에 기술된 바와 같은 층이 형성된 비이질성 백금 도금된 탄소 지지체에 비해서, 본 발명에 따른 전극은 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자의 실질적으로 이질성인 층의 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분산된 백금족 금속을 갖는 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자의 실질적으로 이질성인 층으로 이루어지거나, 이를 포함한다. 바람직하게는, 수지 결합된 탄소 분말층은, 기체를 형성하기 위해 성형하기 전, 콜로이드성 백금 또는 팔라듐이 부착 또는 흡착된 수지 결합된 탄소 분말 입자에 의해 형성된다. 본 발명에 사용되는 전극 기체를 형성하기 위해 백금 도금된 탄소입자를 성형하는데 사용되는 바람직한 수지 결합제는 플루오카본 수지, 특히 폴리테트라플루오로에틸렌이다.
본 발명의 효소 전극 제조에 대해 더욱 상세히 언급하자면, 상기한 바와 같이, 바람직한 전극은 결합 전에 분말 입자의 표면상에 흡착된 백금족 금속, 예를 들어, 백금 또는 팔라듐을 함유하는 수지 결합된 탄소분말로 이루어지거나 이를 포함하는 전기전도성 기체를 포함한다.
탄소 분말로서는 효소가 용이하게 연속적으로 고정화될 수 있는 어떠한 적합한 탄소 또는 흑연 분말도 사용할 수 있으며, 이 목적을 위해, 효소를 약하게 결합하는 보다 양전기를 띄는 유리질 탄소에 대립되는 것으로서, 표면상에 카복실레이트, 아미노 및 황 함유 그룹과 같은 고밀도의 작용기를 가진 탄소 분말을 사용해야 한다. 입자 크기는 3 내지 50nm, 더욱 통상적으로 5 내지 30nm의 범위일 수 있다.
백금(또는 팔라듐)은 통상적인 방법, 예를 들어 증착, 전착 또는 콜로이드성 현탁액으로부터의 단순 흡착(바람직함)에 의해 탄소 입자상에 부착되어 탄소 중량을 기준으로 하여 1 내지 20중량%, 바람직하게는 5내지 15중량%의 백금족 금속 부하물(loadings)을 제공할 수 있다. 그러나 이 한계량은 절대적이기 보다는 오히려 실제적인 한계량이다. 백금족 금속이 약 1% 미만인 경우, 출력 신호는 실제적인 조건에서 매우 민감한 장치 이외에는 측정할 수 없을 정도로 너무 낮은 정도로 약해진다. 백금족 금속이 약 20% 이상이면, 감응시간, 민감성 등에 의한 부가의 잇점 없이 비경제적이 된다. 실제로, 극도로 많은 금속이 부하되면 민감성은 감소하기 시작한다. 바람직한 방법에 있어서, 탄소분말의 존재하에, 클로로플라틴산과 같은 백금 또는 팔라듐 화합물, 또는 더욱 바람직하게는 산화성 리간드와 백금 또는 팔라듐과의 착물을 산화분해시켜서 탄소분말을 백금 도금 또는 팔라듐 도금함으로써 예를 들어 영국 특허원 제1,357,494호, 미합중국 특허원 제4,044,193호 및 제4,166,143호에 교시된 방법으로 탄소입자의 표면상에 콜로이드 크기의 백금 또는 팔라듐을 직접 부착시킨다.
백금 도금 또는 팔라듐 도금에 있어서, 백금 도금 또는 팔라듐 도금된 탄소 분말을 적합한 방수 결합 수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 플루오로카본 수지를 사용하여 성형시켜서 본질적으로 수지 결합된 백금 도금되거나 팔라듐 도금된 탄소 분말 입자, 또는 더욱 통상적으로 전기 전도성 기체에 결합된 이러한 수지 결합된 입자, 예를 들어 금속, 탄소 또는 흑연의 다공성 성형 표층으로 이루어진 완전한 자가 지지 다공성 성형구조를 형성시킨다. 성형된, 수지 결합된 백금 도금 탄소층용으로 특히 바람직한 기체재료는, 미합중국 특허원 제4,229,490호에 교시된 카아본지(carbon paper) 또는 미합중국 특허원 제4,293,396호에 교시된 개공극 카아본 직물(open pore carbon cloth)이다. 최대 다공성을 유지하기 위해 결합제로서 사용된 수지의 양은, 비록 더 두꺼운 두께를 이용할 수 있을지라도 두께가 약 0.1 내지 0.5mm이하인 전극층 대해 기계적 통합성 및 안정성을 제공하는데 필요한 최소량이어야 한다. 구조적 통합성, 기계적 강도, 및 다공성에 의거해 볼때, 결합수지의 양은 결정적으로 중요하지는 않으며, 백금 도금되거나 팔라듐 도금된 탄소분말의 양을 기준으로 하여 5 또는 10중량% 정도 내지 80% 정도 이하의 범위일 수 있으나, 더욱 통상적으로 30 내지 70중량% 범위의 양일 수 있다. 전도성 또는 반전도성 수지를 포함하여, 다양한 수지가 사용될 수 있으나, 합성 플루오로카본 수지가 바람직하고, 특히 폴리테트라플루오로에틸렌이 바람직하다. 산화공정에서 산소에 대한 사소하나마 필수적인 요건을 고려해 볼때, 결합제가 산소에 대해 투과성인 것이 필요하다. 이 목적을 위해 결합제는 중합체 cm3당 2×10-3이상의 O2의 대기압(표준온도 및 압력에서 측정)에서 산소에 대해 최소의 용해도를 가져야 한다.
문헌[참조 : The Polymer Handbook(ed. J. Brandrup and E.H. Immergut) 1st ed. (1967), Interscience]에서 발췌한 적합한 결합제및 그의 공지된 산소 용해도는 다음과 같다 :
[표 1]
Figure kpo00001
본 발명에 따라 사용되는 바람직한 효소 전극 기체는 실제로, 매사추세츠 뉴톤 하이랜즈 소재의 프로토테크 캄파니(Prototech Company)에 의해 상품명 프로토테크(Prototech)로 시판되는 통상적으로 구입가능한 재료이며 지금까지 연료 전지중의 전기-촉매된 가스 확산 전극으로서 사용되었다. 이러한 재료의 제법은 미합중국 특허원 제4,044,193호, 제4,166,143호, 제4,293,396호 및 제4,478,696호에 상세히 기재되어 있으며, 이 참조문헌에 대해 더욱 상세한 언급이 있어야 한다. 광범위하게는 상술하면, 입자 크기가 15 내지 25Å(1.5 내지 2.5nm)인 콜로이드성 백금이 예를 들어, 백금 졸(sol)에 대해 핵 생성제로서 작용하는 분말 탄소의 존재하에 동일반응계내에서 백금 졸의 형성에 의해 분말 탄소(입자크기 50 내지 300Å : 5 내지 30nm)의 표면에 흡착된다. 백금 도금된 탄소 입자는 그후 합성수지 결합제, 바람직하게는, 플루오르화 탄화수소 수지, 및 특히 폴리테트라플루오로 에틸렌을 사용하여 전기전도성 지지 구조물, 예를 들어 카아본지의 시이트상에 성형된다.
미합중국 특허원 제4,293,396호에 기재된 대체물에 있어서, 백금 도금된 탄소입자는 예비형성된 다공성 카아본 직물내에 함침되고 플루오로카본 수지, 바람직하게는 폴리 테트라플루오로에틸렌을 사용하여 결합된다. 그러나, 본 발명은 프로토테크 재료의 사용에 제한되지 않으며, 수지 결합되고 성형된 백금 도금 또는 팔라듐 도금된 탄소분말을 포함하는 다른 유사한 기체 재료를 포함한다.
특히, 또한, 연료전지 전극으로서 미합중국 특허원 제4,229,490호에 기술된 형태의 재료, 즉 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 방수 수지로 함침되고, 예를 들어 스크린 인쇄에 의해 방수 수지와 결합되고, 바람직하게는 다시 폴리테트라플루오로에틸렌과 결합된 백금 블랙과 탄소 또는 흑연 입자의 균일 혼합물을 포함하는 수지결합된 촉매층이 부착되는 카아본지 지지부재를 포함하는 형태의 카아본지 전극을 사용할 수 있다는 것이 고려된다.
수지 결합되고, 백금 도금 또는 팔라듐 도금된 탄소-기체 표면상의 효소 고정화는 잘 설정된 다양한 고정화 방법, 예를 들어 카보디이미드 또는 카보닐디이미다졸 시약과의 공유결합, 1,6-디니트로-3,4-디플루오로벤젠(DFDNB)과의 공유결합, 또는 글루타르 알데하이드와의 가교결합 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
효소중 글루코오스 산화효소의 고정화를 위한 대표적인 프로토콜의 예는 하기와 같다.
A. 카보디이미드 처리 :
1. 프로토테크 전극 재료의 시이트로부터 적합한 크기의 전극편을 절단해 낸다.
2. 전극을 에탄올중에서 약 5분 동안 함침시켜 서 PTFE 피복된 결합제의 충분한 습윤 및 배킹(backing)을 보장한다.
3. 에탄올로부터 전극을 꺼내고 증류수로 전극을 완전히 세척하여 모든 미량의 에탄올을 제거한다.
4. pH 4.5의 0.1M 아세테이트 완충액중의 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노) 카보디이미드 p-메틸톨루엔 설포네이트의 0.15M 용액 5ml(또는 그 미만)를 제조하고, 전극을 실온에서 상기 용액중에 90분 동안 넣는다. 기계적인 진탕기를 사용하여 온화하게 교반시킬 수 있다. 전극이 용액 표면상에 뜨면 충분히 습윤되지 않은 경우이므로, 단계 2의 처리부터 다시 반복해야 한다.
5. 전극을 꺼내어 증류수로 완전히 세척한다. 전극을 적당한 기계적 진탕과 함께 실온에서 90분간 pH 5.6의 아세테이트 완충액중의 신선하게 제조된 글루코오스 산화효소 용액(5.0mg/ml)중에 넣는다.
6. 전극을 효소 용액에서 꺼내어 0.1M 아세테이트 완충액으로 완전히 세정한다 이제 전극을 사용해도 된다.
7. 전극을 pH 5.6의 0.1M 아세테이트 완충액중에서 4℃로 보관한다.
B. 카보닐디이미다졸 처리 :
1. 상기 단계 1을 수행하고 단계 2 및 3은 생략한다.
2. 무수 디메틸 포름아미드중의 N, N'-카보닐디이미다졸의 용액(40mg/ml)을 제조한다.
3. 필요에 따라 온화한 기계적 진탕과 함께 전극을 실온에서 90분 동안 상기 용액중에 넣는다.
4. 용액으로부터 전극을 꺼내고 신선하게 제조한 글루코오스 산화효소 용액중에 전극을 추가의 90분 동안 넣기 전에 과량의 카보닐디이미다졸 용액을- 건조시킨다.
5. 상기 단계 6 및 7을 수행한다.
C. DFDNB 처리.
1. 상기 A하에 단계 1 내지 3을 수행한다.
2. 전극을 붕산나트륨 완충액(0.1M, pH 8.5)중에서 철저히 세척한다.
3. 메탄올중의 1,6-디니트로-3, 4-디플루오로벤젠 용액(0.1021g/5ml)을 제조하고 전극을 실온에서 10분동안 이 용액중에 넣는다.
4. 전극을 꺼내어 실온에서 글루코오스 산화효소 용액중에 추가의 90분 동안 전극을 넣기 전에 이를 붕산염 완충액으로 철저하게 세척한다.
5. 상기 A하의 단계 6 및 7을 수행한다.
고정화 공정을 위해, 쇄길이가 변화가능한 이작용성시약, 예를 들어 디메틸말론이미데이트 또는 디메틸수버이미데이트와 같은 디이미데이트를 포함하여 다른 형태의 커플링제가 사용될 수 있다.
대체방법에서는, 가교결합없이 수지 결합된, 백금 도금되거나 팔라듐 도금된 탄소분말 지지체상의 효소의 단순 흡착은 일부효소, 특히, 글루코오스 산화효소를 사용하므로써 유효하다는 것이 밝혀졌다.
필수적이진 않지만, 통상적으로, 고정된 효소의 표층은, 물론, 측정되는 효소 기질(글루코오스)이 투과되어야 하는 적합한 다공성, 예를 들어, 폴리카보네이트, 필름 또는 막을 사용하므로써 물리적으로 보호될 것이다. 상기 막은 센서의 감응시간을 증가시키는데 다소 불리하지만, 그럼에도 불구하고 상기 막을 사용하여 본 발명의 센서는 통상의 효소 전극에 필적할만한 감응시간을 제공하며, 다수의 경우 통상의 효소전극보다 실질적으로 더 우수한 감응시간을 제공할 수 있다.
이미 제시된 바와같은, 본 발명은 특히 고정된 효소가 글루코오스 산화효소인 글루코오스 산화효소 전극에 관한 것이지만, 비록 동등한 효과를 제공하진 않을지라도 다른 산화 환원 효소도 사용될 수 있다는 것을 명백히 알 수 있을 것이다. 이는 반드시 효소의 고유한 무효성에 기인하는 것은 아니며 다른 요인에 기인한다. 예를 들어, 옥살레이트 산화효소를 사용하여 옥살산을 측정하는데 있어서, 옥살산 기질 자체가 기재 전극에서 전기화학적 산화작용을 하므로, 따라서 효소에 의한 효과가 대부분 은폐된다. 그러나, 다른 적합한 산화환원 효소는 락테이트 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 콜레스테롤 산화효소 및 다른 과산화물 생성효소 뿐만 아니라, 이산화 효소와 산화효소의 혼합물을 포함한 고정된 효소의 혼합물이 포함되며, 전자는 대상 기질상에 작용하여 산화효소에 대한 산화가능한 기질을 생성시키고, 후자는 산화가능한 생성물상에 작용하여 주요한 기질농도에 비례하는 측정가능한 전류를 발생시킨다. 이러한 혼합물중 하나는 베타-갈락토시다제와 글루코오스 산화효소의 혼합물(락토오스의 정략적 측정용), 또는 베타-글루칸 해중합 효소, 베타-글루코시다제와 글루코오스 산화효소의 혼합물(베타-글루칸 측정용)이다.
다른 형태의 센서 적용에서는 전구 반응에서 대상이 되는 제1기질과 상호작용하는 효소 시약 또는 비효소 시약 또는 공정의 이용이 포함되며, 이때 생성물은 본 발명에 따른 효소전극용 기질로서 작용하는 물질을 포함한다. 이러한 선구단계의 다수의 예가 면역화학 반응 분야에서 발견될 것이며, 면역 센서를 포함하여 본 발명에 따른 효소전극을 사용하는 센서의 제조시 이러한 반응들을 사용하는 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 명백히 인지될 것이다.
그러나, 본 발명에 따른 전극의 주요 적용은 시료, 특히 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 땀, 눈물 및 타액과 같은 임상 시료중의 산화가능한 기질, 특히 글루코오스의 검출 및/또는 정량적 측정용 바이오센서로서의 역할일 것이다.
기타 가능한 비임상적 적용으로는 다음과 같은 것이 포함된다. (a) 발효 모니터링, (b) 산업 공정 조절, (c) 환경 모니터링, 예를 들어 액체 및 가스의 유출 및 오염 조절, (d) 식품 시험, (e) 수의학적 적용, 특히 상기 제시한 임상적 적용과 동류적 작용, 본 발명에 따른 효소 전극 재료가 도입된 바이오센서 및 다른 센서가 다른 구조적 요소, 전기성 납, 비전기전도성(절연성) 지지체 또는 탐침 등을 포함할 수 있는 한, 구조물 중의 이러한 요소들은 통상적이며 상세히 기재할 필요가 없다. 통상의 경우에서와 같이, 전극 재료가 얇은 종이 시트 또는 웨이퍼인 경우, 바이오센서는 전극 재료가 적재되며 이에 의해 전극 재료가 시료 내로 도입될 수 있는 절연 지지 부재 또는 탐침을 포함한다. 이러한 경우에서, 전극 재료 편의 실제크기는 매우 작을 수 있으며, 수 mm2미만 또는 그보다 더 작을 수 있다. 전극 재료와의 전기접촉은 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 전극 재료를 전기 전도성 접촉물 또는 백금, 은 또는 다른 적합한 전도체의 말단과 면 대 면 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 전극 재료가 완전히 자가 지지되기에 충분한 두께 및 강도를 갖는 경우, 전극 재료용 절연 지지체 또는 운반체는 필요치 않을 수 있으며, 전기성 납은 전극 재료의 표면에 직접 결합될 수 있다.
반-전도성 표면, 예를 들어 전계 효과 트랜지스터(FET)의 표면, 또는 비전기전도성 표면과 같은 카아본지 이외의 지지부재가 사용될 수 있다. 후자의 경우, 전기 접촉이 백금족 금속 수지 결합된 탄소 또는 흑연 층에 직접 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 효소 전극 재료의 제조 및 그의 특성이 하기 실시예에 의해 예시된다.
[실시예 1](대조용)(선행기술)
선행기술에 따른 효소전극은 공칭 입자 크기가 30nm인 전도성 카아본 블랙 입자(Vulcan XC-72)를 포함하는 다공성 수지 결합된 카아본지로 이루어진 전기전도성 기재의 표면상에 백금박층(<1μm)을 전착시켜 제조하고, 결합제로서 10중량%의 폴리테트라플루오로에틸렌을 사용하여 통상적으로 입수가능한 흑연피복된 카아본지상에 성형한다.
아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로 부터의 글루코오스 산화효소를, 상기한 카보디이미드 처리 및 글루코오스 산화효소 수용액으로 백금 도금된 전극의 표면을 처리하여 글루타르알데하이드와 가교결합시키고, 건조시키며 이어서 25℃에서 글루타르알데하이드에 노출시켜 부착된 효소를 가교결합시키므로써 백금 도금된 카아본지의 상이한 재료표면상에 고정시킨다.
연속적인 시험을 위해 전극 재료는 계속해서 직경 2mm의 원판형으로 절단한다.
[실시예 2]글루코오스 전극
미합중국 매사추세츠 소재의 프로토테크 캄파니에 의해 상품명 "프로토테크"로 시판되며, H2O2를 사용하여 아황산 백금(Ⅱ) 착물의 산화성 분해에 의해 탄소분말(공칭 입자 크기 30nm)의 표면상에 콜로이드성 백금(입자크기 1.5 내지 2.5nm)을 부착시키고, 이어서 약 50중량, 폴리테트라플루오로에틸렌을 사용하여 시판되는 흑연 피복된 카아본지 표면상에 백금 도금된 탄소 분말을 성형 및 결합시킴으로써 미합중국 특허원 제4,044,193호의 실시예 1에 따라 제조된 백금 도금된 탄소분말입자(Vulcan XC-72)를 포함하는 백금 도금된 카아본지상에 아스퍼질러스 니거로부터의 글루코오스 산화효소를 고정시킨다. 최종 생성물의 백금 부하량은 0.24mg.cm-2이다.
글루코오스 산화효소는 상술한 처리, 즉, 카보디이미드로 처리, 카보닐디이미다졸 처리 및 DFDNB처리에 의해 각종 프로토테크 재료의 시료상에 고정된다.
각 실험에서, 글루코오스 산화효소는 글루타르알데하이드를 사용한 가교결합에 의해서 및 가교결합 없이 실온에서 90분동안 pH 5.6의 아세테이트 완충액중의 새로이 제조된 글루코오스 산화효소 용액(5.0mg.ml-1)중에 프로토테크재료를 현탁시킴으로써 단순 흡착에 의해 프로토테크 재료상에 고정된다. 달리는, 상기 효소 흡착은 편리하게는 전기영동법으로 수행할 수 있으며, 이러한 목적을 위해 전기 기재재료를 60분 동안 양전위에서 효소용액중에 현탁시킨다.
상술한 카보디이미드 처리를 이용하여, 하기 효소를 프로토테크로부터 백금 도금된 카아본지, 즉 예비 백금 도금된 탄소분말로부터 생성된 PTFE-결합된 카아본지(미합중국 특허원 제4,044,193호)상에 고정시킨다 : 락테이트 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 글루코오스 산화효소/베타-갈락토시다제.
선행기술 전극과 비교하여 본 발명의 잇점 및 본 발명의 효소전극 재료의 특성을 더욱 상세히 설명하기 위해, 전술한 실시예에서와 같이 제조된 효소 전극 재료를 첨부도면 및 문헌 [참조 : Analytica ChimicaActa, 183,(1986), 59-66]에 나타낸 변형된 랜크 산소 전극 시스템(Rank oxygen electrode system)(Rank Brothers, Bottisham, Cambridge)을 포함하는 전지 내에서의 전류 감응성에 대해 시험한다. 상기 시스템에서 막은 백금 버튼(button) 전극상에 유지되는 본 발명에 따른 카아본지 효소 전극(직경 5mm)으로 대체된다. 역전극(counter electrode)(백금 포일)은 전지 커버를 통해 삽입한다. 기준전극은 은-염화은 전극이다. 일부시험(보호막, 및 비교반된 용액사용)에 있어서, 2-전극 배열이 사용된다 ; 역/기준 전극은 둘레가 염소화된 은(silver)환이다 통상적으로 pH 7.0 완충액중의 시험용액을 자기적으로 교반하면서, 작동 전극은 일정전위기를 사용하여 기준전극에 대해 600mV의 전위를 유지한다. 2-전극 배열을 이용하는 경우, 325mV의 전위를 사용한다. 백그라운드 전류가 낮은 정도까지 감소되기에 충분한 시간이 지난후, 기질 용액을 주사기로부터 주입한다. 전류 감응을 도포기록계 상에 기록한다.
수득된 결과는 하기에 상세히 논의되며 첨부된 도면에 그래프로 나타내었다.
우선 제15도에 있어서, 명세서에 나타낸 대부분의 데이타는 제15도에 나타낸 전기 화학 전지를 사용하여 수득하였다. 이 전지는 기재(1) 및 수쳄버(water chamber)(h)(이 챔버를 통해 물이 순환하여 전지의 온도를 조절할 수 있다)를 둘러싸는 환상 재킷(jacket)(2)를 가진 2-부분 전지를 포함하며, 상기 두 부분은 고정적으로 끼워진 칼라(collar)(3)에 의해 함께 연결된다. 고정된 효소를 포함하는 종이 전극 재료의 시험원판(a)가 놓이는 백금 접촉물(d)는 기재(1)의 중심에 위치하며, 백금 접촉물은 전지의 두 부분이 함께 결합하는 경우 고무 ○-환 밀봉물(e) 및(f)에 의해 백금 접촉물상에 놓인다.
조절가능한 칼라(g)에 의해 지지된 스토퍼(stopper)(4)는 물론 효소기질 용액을 함유하는 전지의 최상부에 삽입되며, 이 최상부에 백금 역전극(b) 및 Ag/AgCl 기준전극(c)가 설치된다. 지시된 바와 같이 시험은 600mV로 유지된 실험 전극을 사용하여 수행하며, 전류 출력은 기질용액에 노출된 외관상 표면적이 0.14cm2인 전극으로부터 측정된다. 결과는 전류밀도, 즉 기질에 노출된 전극(a)의 단위면적당 전류 출력으로 도면에 나타낸다.
제16도에 있어서, 백금 접촉물(B)는 절연슬리브(sleeve)(G)에 의해 이로부터 분리된 기준/역전극(C)에 의해 둘러싸인다. "○"환 상에 설치된 다공성 폴리카보네이트 막을 사용하여 백금 접촉물상에 시험 원판(E)(고정된 효소를 포함하는 중의 전극 재료)를 지탱한다. 개방 시료 챔버(F)는 시료를 막상에 적하되게 한다. 전극 전지는 일정전위기(A)를 통해 모니터링된 전류 및 325mV에서 분극된다. 325mV로 유지된 2-전극 배열을 사용하면 600mV로 유지된 통상의 3-전극전지에 비해 잇점이 있는데, 즉 사용이 편리하며 더 낮은 백그라운드 전류를 갖는다. 그러나, 다른 시스템에 비해 어느 하나의 시스템을 선택하는 것은 본 발명 전극의 보관 안정성, 사용 안정성, 선형 감응성 또는 산소 의존성과 같은 성능을 특성에 거의 영향을 주지 않는다.
수득된 결과는 하기에 더욱 상세히 논의될 것이다.
[감응의 선형성 및 시간 의존성]
첨부도면의 제1도의 교반조건하에 3-전극 전지를 사용하여, 0 내지 35mM 범위의 최종농도를 제공하는 글루코오스의 연속적인 첨가에 대한 대표적인 전극 감응성을 예시하고 있다. 세 전극 A,B 및 C모두는 상기 방법 A에 의해 그위에 고정된 글루코오스 산화효소를 갖는다. 전극 A는 본 발명에 따른 활성화된 백금 도금된 탄소 지지체, 즉, 상품명 프로토테크로서 시판된, 수지(폴리테트라플루오로에틸렌) 결합된 백금 도금된 탄소분말의 성형시트를 포함한다. 전극 B는 흑연막대의 한 부분으로부터 절단된 전기전도성 지지체를 포함한다. 전극 C는 시판되는 비백금 도금된 카아본지로부터 절단된 전기전도성 지지체를 포함한다. 도면 1에 나타낸 바와 같이, 전극 B 및 C는 문헌에서 통상적으로 제시되는 매개체화된 센서를 사용한 결과를 상기시키는, 보다 작고 비교적 느린 감응성을 갖는다. 전극 A는 감응시간이 약 1초인 더욱 신뢰성있고 안정된 감응성을 제공한다(초기 감응의 결정에서 관찰된 신호중의 "스파이크"(spike)는 부분적으로는 주입방법으로부터 생성된 중요하지 않은 인공물이며 , 글루코오스 의존성 평탄부(plateau)가 주요신호이다), 세 개의 전극 모두가 글루코오스 농도에 대해 거의 선형 감응성을 제공한다(제2도 : A 및 C에 대해서만 결과를 나타냄), 이것은 헐액중의 글루코오스의 직접적인 분석을 위해 필요한 범위를 측정한다(0 내지 30mM). 상기 고정화 방법 B를 이용하여 A형 전극으로 수득된 유사한 결과는 이 방법이 연장된 범위에 걸러 우수한 선형성을 제공함을 제시한다.
제2도에 나타낸 바와 같이, 전극 A의 감응성은 23일후 실제로 변화하지 않았으며, 다른 전극의 감응성은(전극 C에 대해 나타낸 바와 같이)시간에 따라 저하되었다. 이러한 형태의 양상은 상술한 다른 고정화 방법에 대해서도 관찰되었으며, 이들 모든 고정화 방법은 A에 사용된 탄소재료를 사용하여 함께 감응성있고 안정한 전극을 제조하는데 이용될 수 있었으나, 다수의 다른 불활성 탄소재료를 사용하는 경우 불만족스러운 전극이 제공되었다. A의 반응시간은 또한 23일 후에도 변화하지 않은 반면, 다른 전극들은 초기의 감응시간이 약 23 내지 30초이었으나 8일 후 2 내지 3분으로 증가하여 감응시간이 증가함을 보여주었다. 일반적으로 활성 전극(예 : A)은 첫째날 감응성이 다소 감소하는 것으로 나타나지만, 그후 감응성은 시간에 대해 일정해진다. 4℃에서 습윤상태(pH 5.6)로 보관되고 6개월 간격으로 시험한 A형 전극은(처음 며칠 후에)거의 변화가 없었으며, 이 기간후에 다소의 점차적인 저하가 있었을지라도, 12개월에서의 감응성은 최초값의 70%이었다.
제1도 및 제2도는 제15도에 나타낸 3-전극 배열을 사용한, 600mV 작동전위에서 μAcm-2으로 표시한 전극의 전류 출력을 나타낸다.
본 발명의 전극의 연장된 보관 수명 및 안정성은 180일 동안 실온에서 pH 5.6의 아세테이트 완충액중에 보관한 후 5mM 글루코오스에 대한 카보디이미드 고정된 글루코오스 산화효소전극의 감응성을 나타내는 제5도에 의해 추가로 설명된다. 선행 기술의 전극(실시예 1)에 대한 대조용 결과는 제6도에 나타내었다. 제5도의 측정은 3-전극 시스템을 사용하여 600mV에서 수행하였고 제6도 측정은 2-전극 배열을 사용하여 325mV에서 수행 하였다.
상이한 효소 및 상이한 고정화 방법을 이용하여 선행기술(실시예 1)전극 및 본 발명의 전극의 감응성 곡선에 대한 추가의 비교는 제7도 내지 제9도에 나타내었고, 모두 325mV에서 측정하였다.
락테이트, 갈락토오스 및 락토오스(혼합된 글루코오스 산화효소 및 베타-갈락토시다제)에 대한 감응성 곡선은 제10도 내지 제12도에 나타내었다. 이들의 측정은 600mV에서 수행하였다.
적극의 재-사용 : 반복 측정의 적합성
연속 부하시 본 발명의 전극은 이전에 보고된 바 없는 유형의 예외적 수명을 나타낸다. 이는 하기의 엄밀한 시험의 결과로 설명된다.
첫째 글루코오스 산화효소 전극(실시예 2)을 밀폐된 전지내에 설치하고 교반된 글루코오스 용액에 전류로서 감응하게 한다(초기 농도 : 5mM, 초기 전류 : 100μamp) 전류를 18시간 연속적으로 흐르게 하는데, 이 기간동안 신호는 점차 10μamp이하로 떨어진다. 수득된 총 전기는 이론적으로 예상된 양의 약 75%에 상당한다(글루코오스 분자당 수득된 2개 전자를 기준으로 계산), 이 실험은 글루코오즈 용액을 보충하여 가함으로써 동일 전극으로 즉시 반복되는데, 이로부터 초기전류가 재설정되고 연속 부하시 기질의 "하향 흐름"은 동일 결과를 제공한다.
연속 실험에서, 글루코오스의 농도를 5mM로 유지하기 위해 대규모 저장소로부터 순환에 의해 공급된 글루코오스 용액을 공급하면서 동일한 전극을 사용하여 전류를 5.7일간 더 전달한다. 출력은 100시간에 걸쳐 서서히 떨어지나, 이후 45μA에서 안정되며, 이 수치는 추가의 40시간 동안 유지된다. 이 기간동안 몇몇 약하게 결합된 효소는 전극 기재로부터 분리되게 되거나(교반 속도에 대한 전류 출력의 의존성은 없다), 몇몇 다른 조절 효과가 작용할 수 있다.
상기에 기술된 장기간 시험후, 글루코오스 농도범위에 걸친 전극의 감응은 상술된 바와 같이 시험된다. 신호의 폭은 새로 제조되었을 때 보다 작으나, 전극은 0 내지 30mM의 글루코오스 범위에 걸쳐 매우 만족스런 "스텝" 작용을 나타냄 으로서, 부하시 연장사용의 결과로서 어떠한 유해한 영향을 주지 않음을 확인할 수 있다. 이 결론은 저장(4℃) 1주일후, 저장 9주 후 및 추가의 4.7일간 동안 이전과 같이 부하시켜 재차 수행한 후의 추가의 3개의 시험에서 인지할 수 있다 : 글루코오스 농도 범위에 걸쳐 감응은 불변이었다.
이들 시험에서 전극 하나가 250시간 이상(15,000분 초과)의 총 시간동안 작동될 수 있으므로, 전극 재료는 전위적으로 매우 긴 수명을 제공한다. 선행기술의 효소 전극의 작동 수명은 통상적으로 본 발명의 것보다 휠씬 짧은데, 많은 경우 단지 몇시간이다[참조 : Turner,(1985) Proceedings Biotech 85(Euprope) Online Publications, Pinner, U.K., 181-192]. 예를 들어, 퍼로센-커플링 글루코오스 산화효소를 기본으로한 글루코오스 전극의 반감기는 약 25시간이지만(참조 : Turner,상기 참조), 문헌[참조 : Cass et al. (1984) Analyt. Chem. 56, 667-673]에는 동일 전극에 대하여 50시간의 총 안정한 수명을 보고하였다. 전극을 5mM 글루코오스 용액의 50회 연속 측정에 대하여 사용하였을때 표준편차는 1퍼센트 미만이었다.
[연속 모니터링의 적합성]
상기 언급한 재사용 시험(45μamP, 5mM 글루코오스)에서 기록된 최종 감응의 수준은 기포 용액에의 노즐에 의해 영향 받지 않고 남아있으며, 몇 주일의 추가 저장후에도 동일하다. 12시간에 걸친 이 전극으로부터 전류 출력의 안정성은 세균 오염으로부터 글루코오스의 손실을 방지하도록 고안된 조건하에서 멸균된 글루코오스 용액을 사용하는 조절된 시험에서 확인한다. 신호는 총 기간에 걸쳐 일정하며, 이것은 수주일간에 걸쳐 교반되고 순환된 용액중의 전극의 초기 "조절"효과가 완전함을 의미한다. 상기 방법 또는 이외의 적당한 조절/세척 방법에 의하여 적합하게 조절된 이러한 전극들은 글루코오즈의 연속 모니터링이 필요한 곳에 적용된다.
[뱃취 재현성]
적당히 "깨끗한" 제조조건이 유지된다먼, 본 발명에 따른 모든 전극들은 글루코오스에 대한 우수한 감응성을 제공하면서 기술된 바 대로 작동한다. 동일 방법으로 제조된 동일 크기의 전극쌍은 매우 일치되는 결과를 나타낸다(동일 조건하에 시험시 전류는 낮은 비율로 감응한다), 또한, 이렇게 제조된 모든 전극들은, 선행기술의 글루코오스 전극과는 달리 상기에 언급한 바의 긴 수명 및 내구력을 지닌다. 따라서 본 발명의 전극은 신뢰성있게 저장될 수 있으며 수주일동만 사용되는 반면, 선행기술의 전극은 한 배취내에 많은 가변성을 종종 나타낸다. 예를 들어, 터너(Turner)는 한 뱃취내의 몇몇 글루코오스 산화효소 전극은 가끔 예외적으로 긴-수명(600시간의 반감기)을 가지나, 대부분 약 24시간의 반감기를 갖는다고 지적하였다. 그러므로 이들은 24시간보다 훨씬 긴 기간에 대하여는 신뢰성 있게 이용될 수 없다.
[산소 농도에 대한 감응의 의존도]
용해된 산소의 영향을 시험하기 위해 시험 전지를 글루코오스 전극과 함께 산소 전극을 포함하도록 변형시킨다. 실험은 아르곤을 스파징(sparging)하여 용해된 산소를 시스템 밖으로 완전히 몰아낸 상태에서 수행한다. 이러한 조건하에 A형(상기 참조)의 전극이 글루코오스 첨가에 대한 신속한 감응을 나타내는 것은 주변의 산소 농도와는 거의 무관한 메카니즘임을 나타낸다. 이러한 결과는 바람직한 효소 고정과 함께 전극 표면 구조의 특이한 특성에 기인한 것이며, 이전에는 관찰되지 않았다.
추가의 실험에서(제4도), 600mV에서의 A형 전극(상기한 방법 A에 의해 제조)의 출력 신호를 아르곤을 계속 스파징하는 동안 모니터링한다. 동시에 시료중의 산소 압력에 대해 측정한다. 제4도에서 나타낸 결과들은 시료 용액중의 산소압력(하단의 그래프)에 실질적으로 무관한 거의 일정한 전류 신호(상단의 그래프)를 나타낸다. 또, 다른 시험에서 신호는 10분간 거의 영향받지 않으나, 산소 압력은 급격히 떨어진다. 또 다른 전극(방법 B에 의해 제조)은 3분에 걸쳐 5%의 전류 강하를 보여주며, 이 시간동안 산소는 90%까지 소모된다. 전류 감응은 비록 이 현상은 비교적 느리게 성립되지만 산소가 시스템으로 재-도입될때 또한 증가된다. 아르곤을 연속적으로 퍼어징하면, 전극은 단지 제한된 범위의 글루코오스 농도에 대해서만 감응하며, 미량으로 존재하는 산소는 기질로부터 수소를 제거하는 효소 작용의 부분인 "트리거링(triggering)"에 필요하다. 또한 전극에서 흡착된 산소(저농도 및 산소전극에 의해 검출될 수 없는 산소량)는 이의 작용에 얼마간의 역할을 함은 배제될 수 없다.
[효소 부하]
글루코오스 소모율 및 최대 전류 밀도를 각기 측정하면 전극(A형)당 활성적으로 고정된 효소의 양은 전극 표면의 cm2당 활성 효소 약 7μg에 상응한다(얼마간의 정보가 바이오센서에 근거를 둔 유사한 글루코오스 환원효소의 효소 부하에 관한 문헌에 기술되어 있다). 고정화 과정에서, 효소 용액을 10배까지 희석하여도, 매우 활성인 전극이 제조될 수 있음이 밝혀졌다.
[감응의 온도 의존도]
A형의 전극을 10 내지 37℃의 온도에서 0 내지 30mM의 글루코오스 농도범위에 걸쳐 시험하였다. 온도 상수는 2 내지 3%/℃이었다(약 24kJ.mol-1의 아레니우스 활성화 에너지에 상당함), 이것은 페로센 매개된 바이오센서에 대해 인용된 4%/℃의 수치와 비교된다[참조 : Cass et al., 상기 참조].
[pH 의존도]
pH에 대한 감응 의존도는 소규모인 것으로 관찰되었다. 그러나, 매우 높은 글루코오스 농도(>25mM)에서를 제외하면, pH 7.0 내지 8.0사이에서 감응은 실질적으로 pH와 무관하다.
[보호막으로 감싼 전극의 감응]
폴리카보네이트 막은 교반 시스템에서 전극 감응의 형상 및 폭에 있어 작은 변화를 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 교반하지 않은 시스템내에서 감응시간은 약 20초였다.
[전체 혈액시료의 분석을 위한 전극의 용도]
폴리카보네이트 막으로 싸인 전극은 혈액내 글루코오스를 직접 측정하기 위해 만족스럽게 사용된다. 0.2mmol/l에서 아스코르베이트로부터의 간섭은 5mmol/l의 글루코오스 농도에서 총 신호의 약 2.5%였다.
[상이한 구조의 분석용 바이오센서에서의 전극의 용도]
상기에 기술한 바 있는 변형된 클라크(clark) 전극을 사용한 랜크-형 전지내에서 본 발명의 효소 전극의 성공적 사용은 상기에 언급한 결과에 의하여 입증된다. 또한 탐침과 같은 다른 센서 형에서 사용될 때도 전극은 우수한 결과를 제공하는 것으로 입증되었다.
예를 들어, 많은 통상의 전극에서 보통 사용되는 직경이 2mm인 탐침의 경우, 전극을 전선위에 설치하고 유리관내에 봉합되도록 설계되어 있다. 대기중 산소를 제거할 필요없이 글루코오스 농도를 신뢰성있게 측정하기 위해 비이귀 또는 다른 용기에 함유된 교반된 시험 용액속에 이를 삽입한다(부착된 기준 전극 및 역전극과 함께). 이 탐침 및 유사하게 고안된 더욱 소형의 탐침을 사용하여 측정할 경우, 고정된 글루코오스 농도의 용액내에서 전극의 전류 감응은 외관상 면적 또는 전극 중량에 대해 대략적으로 비례하는 것으로 나타났다.
전극이 소형화된(면적 : 약 0.25 내지 0.50mm2, 중량 : 30 내지 60μg) 탐침이 또한 제조된다. 전선 설치물을 플라스틱 슬리브로 감싸고, 슬리브된 탐침을 카테터 바늘(1.5mm 직경)내에 삽입한다. 이 바늘은 고무마개를 통하여 용기(발효조 또는 유사한 장치, 또는 폐기물 저장기로 도입될 수 있는 용기)내로 삽입될 수 있으며 용기내에 함유된 용액의 글루코오스 농도를 측정하기 위한 탐침-센서로서 사용할 수 있다. 이 구조에 있어 감지 전극은 삽입시기에 둘러싸는 바늘에 의해 보호되지만, 삽입시기 후에는 필요한 곳에서 바늘을 밀어 제거시킬 수 있다.
상술한 바와 같은 소형 탐침은 전형적으로 1 내지 10μamp 범위내의 신호를 제공하는 반면, 1 내지 100namp 범위의 정확한 측정은 적합한 기기를 사용하여야 한다. 이 범위에서 신호 전류는 매우 작은 크기의(본 발명의) 효소 전극(면적 : 약 0.005mm2중량 : 1μg)에 의하여 지지되므로, 이러한 전극은 생체내 측정용 카테터 탐침에 적용할 수 있는 바와 같이 미세 침상 마이크로 탐침과 유사하다.
본 발명의 전극의 작동 수행 메카니즘이 완전히 밝혀지지 않았지만, 얻어진 결과에 기초하여 특정 결론을 유도할 수 있다. 즉, 승온에서 표면산화에 의하여 형성된 탄소상의 활성 표면 그룹의 존재는 자체가 효소의 고정에 필수적인 가교결합 반응에 적합하도록 하며, 이러한 표면 그룹의 수 및 다양성은 백금(또는 팔라듐 같은 기타의 백금족 금속)이 박층 표면 촉매로서 존재할 경우 증가될 수 있다[참조 : Kinoshita and Stonehart. (1977), Modern Aspects of Electrochemistry, No. 12, Ed. Bockris and Conway, Plenum Press, New York, 183-266]. 효소 결합의 상이성에 따라 상이한 고정화 방법이 존재함은 명백하다(예를들어, 다수의 보고된 설계들은 효소 부착을 위해 다양한 아미노산 잔기를 사용하는 반면, 염화 시아누르산 활성물질로 결합된 효소는 오로지 이들의 리신 잔기만을 사용한다 ; (참조 Ianiello and Yacynych. (1981) Analyt. Chem. 53, 2090-2095.), 고정에 의해 생성된 효소의 3차 구조의 변이는 모든 고정 과정에서 동일한 것으로 기대되지는 않으며, 이는 이러한 종류의 공정에서 관찰된 효소 활성 및 안정성에 있어서 많은 차이를 설명할 수 있다.
예를 들어 일본국 공개특허공보 제56-163447호에 기술된 층지고, 비-이질성인 구조의 전극 유형과는 달리 본 발명에 사용된 기재 전극 재료의 높은 이질 특성은 통합된 3-차 구조에 있어서 상이한 유형 및 방향의 다양한 가교결합을 수득할 가능성을 극대화한다. 가교결합제의 부재하에, 이는 또한 강력한 표면 흡착을 가능하게 한다. 결합된 탄소질 매트릭스의 공극을 효소에 대하여 매우 큰 표면적으로 존재하는 매트릭스의 성분에 효소 분자가 "들어가고 돌아다닐 수" 있게 하여주며, 안정성 및 활성에 바람직한 구조를 제공한다(이는 문헌의 이전 실험에 의해 나타난 바와 같이, 구조를 조이는 훨씬 작은 표면적의 백금, "유리질" 탄소 및 흑연과 같은 비교적 평평한 표면위에 결합하는 것과는 대조된다), 또한 본 발명 전극의 극히 신속한 감응시간(1 내지 2초)은 높은 효소 활성을 필요로 할 뿐만 아니라 전극 자체상의 전자 수용체 부위의 능력에 의해 보조되어야하는 전극으로 전자를 극히 신속하게 이동함을 나타낸다. 이들은 효소상의 활성 부위에 표면 백금 생성물이 접근할 가능성을 최대로 하는 미세구조내에 매우 큰 면적에 걸쳐 분포된 미세한 백금 도금된 탄소 입자의 고밀도에 의하여 제공된다.
본 발명에 따른 효소 전극의 결합제로서 다른 수지 및 다른 백금족 금속의 적용성을 입증하기 위해, 글루코오스 산화효소 전극을, 결합제로서 폴리비닐 아세테이트 및 백금족 금속으로서 팔라듐을 사용하여 제조하였다.
다른 결합제수지를 사용하는 경우에 있어, 글루코오스 산화효소 전극은 폴리테트라플루오로에틸렌 대신 결합제로서 폴리비닐 아세테이트 50중량%를 사용함을 제외하고는 상기에 설명한 바와 같이(실시예 2) 실질적으로 제조된 백금 도금된 카아본지 전극의 표면상에 상기에 설명된 방법 A에 의해 글루코오스 산화효소를 고정함으로써 제조된다.
325mV에서 동일한 변형 랜크 전극 시스템을 사용하여 시험하였을 때, 제13도에 나타낸 바와 같이 거의 선형 감응을 나타내었다.
다른 백금족 금속을 사용하는 경우에 있어, 탄소 분말(공칭 입자 크기 30nm ; Vulcan XC-72)의 표면상에 콜로이드성 팔라듐을 부착시키고 결합제로서 폴리테트라플루오로에틸렌 50중량%(팔라듐 도금된 탄소 분말을 기준)를 사용하여 전기 전도성 카아본지의 표면상에 박층(0.1mm으로서 팔라듐 도금된 탄소 분말을 결합시켜 제조한 팔라듐 도금된 카아본지 전극의 표면상에 상술한 방법 A에 의해 글루코오스 산화효소를 고정함으로 글루코오스 산화효소 전극을 제조한다.
처리된 팔라듐 도금된 카아본지로부터 절단된 직경이 2mm인 디스크를 제16도에서 도시한 2-전극 전지의 백금 접촉물 상에 설치하고, 325mV에서 글루코오스에 대한 이의 감응에 대하여 시험한다. 결과는 제14도에 제시되어 있으며, 또한 글루코오스 농도에 대한 전류 밀도가 거의 선형 반응을 나타내었다.
미합중국 특허원 제4,293,396호 및 또 다른 문헌에서 교시되는 가스 확산 전극에서의 Pt, Pd, Ru 및 Rh 및 다른 백금족 금속의 표현 등가에 비추어, 다른 백금족 금속(예 : 루테늄 및 로듐)도 본 발명의 효소 전극에서 백금 및 팔라듐에 대한 대체물로서 효과적일 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. (a) 미분된 백금족 금속 입자와 표면 밀착하여 수지와 함께 결합된 탄소 또는 흑연 입자로 구성된 다공성 전기 전도성 층에서 상기의 금속 입자가 전도성 층 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분포된 수지 -결합된 금속-도금 탄소 또는 흑연 입자로 필수적으로 이루어진 실질적으로 이질성인 다공성 기체(substrate) 구조를 갖는 다공성 전기 전도성 층을 함유하는 전기 전도성 지지 부재 ; 및(b) 상기 다공성 기체의 표면에 흡착되거나 고정화된 촉매적 활성량의 효소를 함유하여서 구성되는 효소 전극으로, 효소의 작용을 받는 기질이 포함되어 있는 액체 및 전극 전위의 존재하에서 효소의 촉매 활성이 감응 전류로써 표시되는 효소 전극.
  2. 제1항에 있어서, 백금족 금속이 백금 또는 팔라듐인 효소 전극.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 합성수지 결합제가 플루오로카본 수지 또는 폴리비닐 아세테이트인 효소 전극.
  4. 제3항에 있어서, 합성수지 결합제가 폴리테트라플루오로에틸렌인 효소 전극.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기체 표면상에 고정되거나 흡착된 효소가 산화-환원효소인 효소 전극.
  6. 제5항에 있어서, 산소-환원효소가 글루코오스 산화효소인 효소 전극.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전기전도성 지지 부재가, 미분된 백금족 금속과 혼합된 수지-결합된 탄소 또는 흑연 입자가 표층으로서 결합되거나, 입자의 표면에 미분된 백금족 금속이 흡착 또는 부착된 전기전도성 기재를 포함하는 효소 전극.
  8. 제7항에 있어서, 전기전도성 지지 부재가 전기전도성 카아본지(carbon paper)인 효소 전극.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다공성이 층이, 수지와 결합하기 전의 개개의 입자 표면에 부착되거나 흡착된 백금족 금속을 갖는 수지결합된 탄소 또는 흑연 입자를 포함하는 효소 전극.
  10. 제9항에 있어서, 다공성 층이, 분말의 입자 크기가 5 내지 30nm 범위이고 그 표면에 입자 크기가 1.5 내지 2.5nm 범위인 콜로이드성 백금이 흡착된 수지-결합된 백금 도금된 탄소 분말을 포함하는 효소 전극.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기질이 투과할 수 있는 미세다공성 막으로 표면이 보호된 효소 전극.
  12. 제11항에 있어서, 막이 폴리카보네이트 막인 효소 전극.
  13. 제1항에서 청구된 효소 전극을 도입한 센서(sensor).
  14. 효소와 촉매적으로 반응하여 측정가능한 전류를 생성시킬 수 있는 효소 기질이거나 이러한 효소 기질로 전환가능한 분석물을 필요에 따라 반응성 효소 기질 종류로 전환시킨 후, 시료를 기질과 반응성이 있는 고정된 효소 또는 효소 혼합물을 포함하는 제1항에서 정의한 효소 전극과 접촉시켜 전류를 생성시키고, 생성된 전류를 측정함을 특징으로 하여, 효소와 촉매적으로 반응하여 측정가능한 전류를 생성시킬 수 있는 효소 기질이거나 이러한 효소 기질로 전환가능한 분석물을 시료중에서 정량분석하는 전류 측정방법.
  15. 제14항에 있어서, 시료가 임상적 시료인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 시료가 혈액시료이고, 분석물이 글루코오스이며, 효소가 글루코오스 산화효소인 방법.
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