DK173722B1 - Immobiliserede enzymelektroder - Google Patents

Description

DK 173722 B1

Den foreliggende opfindelse angår enzymelektroder, som omfatter et enzym immobi1 i seret på et elektrisk ledende substrat, og som reagerer amperometrisk på den katalytiske aktivitet af enzymet i nærvær af dets respektive substrat. Navnlig, men ikke udelukkende angår opfindelsen en-5 zymelektroder, der kan anvendes til påvisning af glucoseniveauer både in vitro og vn vivo, og som omfatter et elektrisk ledende substrat, hvorpå der er immobiliseret en oxidoreduktase, for eksempel en glucoseoxidase, idet elektroden reagerer amperometrisk på den katalystiske aktivitet af det immobil i serede enzym ved indføring i en glucoseholdig prøve.

10 En forholdsvis detaljeret oversigt over fordelene ved amperometri' ske biosensorer, der omfatter et enzym som biokatalysator, er givet af Aston og Turner (1984) Biotech. Genet. Eng. Rev. (ed. G. Russell), I, 89-120, Intercept, Newcastle-upon-Tyne og af Davis G., (1985) Biosensors, i, 161-178. De varierer med hensyn til signal overføringsmåden, og 15 forskellige typer kan løst klassificeres som (a) sådanne, hvor den elektriske reaktion skyldes oxidation af et produkt af enzymreaktionen ved en elektrode, (b) "formidlerassisterede", hvor elektroner transporteres fra enzymet til elektroden ved hjælp af et oxidations-reduk-tions("redox")reagens eller (c) "direkte elektrontransport" (DET), hvor 20 en sådan formidlerassistance ikke er påkrævet,

Kategori fal

Denne kategori kan illustreres under henvisning til virkningen af visse oxidaser (for eksempel glucoseoxidase, al kohol oxidase), hvilke en-25 zymer producerer hydrogenperoxid i overensstemmelse med reaktionen: substrat + 0^-----[oxidase]---^ oxideret produkt + Η202

Ved denne metode oxideres peroxidet ved en elektrode bragt i lige-30 vægt ved et fast potential: H202 ...................-.....> 02 + 2H+ + 2e

Et elektrisk signal frembringes efter overførsel af elektroner fra 35 peroxidet til elektroden, og under passende betingelser er styrken af den enzymkatalyserede strøm proportional med analytkoncentrationen.

Talrige indretninger til bestemmelse af glucose er beskrevet, men DK 173722 B1 2 de fleste af dem har begrænsninger med hensyn til reproducerbarheden og hastigheden af reaktionen og det tilgængelige glucosekoncentrationsin-terval. Nogle af de moderat vellykkede kommercielle metoder hviler på anvendelse af peroxid som ovenfor skitseret, hvor glucose er substratet, 5 og det oxiderede produkt er giucono-1,5-1 acton. Andre metoder afhænger af sekundære reaktioner af peroxid (for eksempel kolorimetriske analyser) eller en fysisk-kemisk måling, såsom konduktans. Imidlertid reagerer de i almindelighed langsomt og har den ulempe at være forholdsvis følsomme over for oxygenspændingen i prøverne, som kan variere betragte-10 ligt. Ved lave oxygenspændinger kan den øvre grænse for linearitet af strømreaktionen være lavere end ønsket for simple nøjagtige analyser.

Lignende overvejelser gælder for indirekte analysemetoder for andre substrater end glucose.

15 Kategori (bl - formidlerassisterede biofølere I disse indretninger holdes enzymet i reduceret ("elektronrig") tilstand som resultat af dets reaktion med substratet, som er den ana-1yt, hvis koncentration skal måles. Et krav til en praktisk anvendelig føler er etableringen af en elektrisk kobling mellem elektronkilden (en 20 eller anden elektronrig "aktiv position" i enzymet) og selve elektroden.

Hen da aktive positioner er tilbøjelige til at befinde sig i kløfter eller folder i den makromolekylære enzymstruktur, er adgangen til dem blokeret helt eller delvis, og det er derfor noget vanskeligt at etablere en elektrisk forbindelse, som er tilstrækkelig effektiv til pålidelig og 25 følsom signal overførsel. Overførsel af elektroner mellem et enzym og en elektrode kan imidlertid lettes ved inkludering af en elektronbærer eller "formidler", som i den oxiderede form optager elektroner fra enzymet, og derefter i den reducerede tilstand transporterer dem til elektroden, hvor den bliver genoxideret.

30 Anvendelsen af formidlere kan illustreres ved biofølere, som er be skrevet for nylig, hvilke anvender glucoseoxldase immobiliseret på en carbonelektrode. En udformning benytter kovalent bundet enzym immobil i-seret ved cyanurchloridmetoden (Jonsson og Gorton, 1985, Biosensors, I, 355-369), som, hævdes det, giver god stabilitet (flere måneder). Føleren 35 lider imidlertid af alvorlige mangler, idet den anvendte formidler N-methylphenaziniumion (phenazinmethosulfat) er ustabil og også let vaskes ud, hvilket nødvendiggør daglig udskiftning under brug. Elektroden er DK 173722 B1 3 også følsom over for oxygenkoncentrationen, selv om det blev vist, at den elektrokemi ske overførsel via formidleren står sig godt i konkurrencen med oxygenreduktionsreaktionen. En anden bioføler, som også indbefatter immobil i seret glucoseoxidase, anvender ferrocen eller et af dets 5 derivater som formidler: Cass et, al., (1984) Analyt. Chem. 56* 667-673 og EP-A-0 078 636. Overførslen af elektroner til elektroden via formidleren forløber som følger: glucose + enzym [oxideret] --^ glucono-1,5-lacton + enzym [reduceret] 10 enzym [red] + ferrocen [ox] enzym [ox] + ferrocen [red] (ferriciniumion) ferrocen [red] ......(elektron til elektrode) ferriciniumion 15

Detaljer vedrørende den mekaniske funktion af denne elektrode fremgår ikke klart. Specielt forklares det ikke, hvorledes den meget uopløselige reducerede form af ferrocen fører ladning til elektroden til opretholdelse af cyklisk formidleraktivitet (omend denne indvending mulig-20 vis ikke gælder for ioniske ferrocenderivater). Endvidere er dens reaktion temmelig træg i betragtning af den potentielt meget hurtige reaktion, som kunne forventes ud fra de kendte hastigheder af de involverede enzymatiske reaktioner, og elektroden har en begrænset levetid, som kan tilskrives enzymets begrænsede stabilitet.

25 Anvendelsen af en formidler ved signal overførsel er forbundet med flere ulemper: muligheden for, at den siver ud fra det område, der indeholder biokatalysatoren, begrænsninger med hensyn til diffusion af oxiderede og/eller reducerede former og iboende mangel på stabilitet hos selve formidleren.

30

Kategori fc) - direkte elektrontransport [DET1.b i ofølere

Muligheden af at konstruere en bioføler uden tilsætning af en formidler er blevet foreslået i en forholdsvis ny redegørelse for bioelek-trokatalyse: Tarasevich, (1985) Bioelectrochemistry 10, 231-295. Sådanne 35 indretninger kan omtales som "reagensfrie" eller "formidlerfrie". Eksempler på formidlerfrie enzymelektroder nævnes i Tarasevich's redegørelse, men de indbefatter ledende organiske polymerer, for eksempel DK 173722 B1 4 indeholdende strukturelle enheder i lighed med methylviologen og/eller ledende organiske salte såsom NMP+TCNQ’(N-methylphenaziniumtetracyano-4-quinodimethan), som modificerer elektrodens egenskaber og udfører formidlerrollen. Mange af metoderne til elektronoverførsel fra redoxprote-5 iner via modificerede elektroder hører også til den kategori.

Den iboende mangel på stabilitet hos mange ledende organiske polymerer og salte bemærkes. Således har aktiviteten af den NMP/TCNQ-modifi-cerede elektrode en halveringstid på ca. 15 dage ved anvendelse i en alkohol bi oføl er. Sådanne elektroder er også oxygenfølsomme.

10 Af det publicerede bevismateriale fremgår det, at der hidtil kun er blevet anvist få virkligt formidlerfrie enzymelektroder, selv om mange ikke vellykkede forsøg er blevet registreret, de fleste under anvendelse af carbonbasiselektroder. Nyere litteratur om anvendelsen af glucoseoxi-dase (Jonsson og Gorton, Ioc. cit.) foreslår, at hovedproblemet ligger i 15 immobiliseringen af et enzym, som er tilbøjelig til at inhibere dets elektronoverførselsevne på grund af steriske eller andre begrænsninger, som nødvendiggør tilsætning af en formidler.

Der findes nogle sjældne eksempler på meget aktive oxidaser immobi-liseret på carbon eller platin. For eksempel beskriver Ianiello e£ il.

20 (1982) Analyt. Chem. 54. 1098-1101 formidlerfrie følere, hvori glucose-oxidase og L-aminosyreoxidase er bundet kovalent til en grafitelektrode ved cyanurchloridmetoden. Enzymelektroderne har imidlertid en begrænset arbejdslevetid på 20 til 30 dage: Ianiello og Yacynych, (1981) Analyt.

Chem. 53, 2090-2095. Der gives ingen information om elektrodernes oxy-25 genfølsomhed.

Talrige biofølere, som fungerer i henhold til ovennævnte principper, navnlig glucosefølere, er beskrevet i den kendte teknik, og et re præsentativt udvalg er allerede blevet omtalt, men for de foreliggende formål er der en beskrivelse, som må anses for særlig relevant, nemlig 30 Matsushita Electric Appliance Industry Company, japansk offentliggørelsesskrift nr. 56-163447. Dette beskriver en indirekte glucoseelektrode, det vil sige en elektrode, hvori hydrogenperoxid produceret ved oxidation af glucose i nærvær af glucoseoxidase: 35 glucose + 0? ^ giuconolacton + H«0? c enzym c ά oxideres ved overfladen af en platinelektrode DK 173722 B1 5 H202 -----------> 2H+ + 2e" + 02 til frembringelse af en oxidationsstrøm, som er proportional med kon-5 centrationen af substrat (glucose) i prøven. Elektroden omfatter en elektrisk ledende carbonbasis, som bærer et lag af immobil i seret enzym, for eksempel en immobiliseret glucoseoxidase. Selve den elektrisk ledende basis er af formet grafit indeholdende op til 10 vægtdele af en fluorcarbonharpiks som bindemiddel, og på hvilken der for eksempel 10 elektrolytisk eller ved dampaflejring er aflejret en tynd (mindre end 1 μηι) film af platin. Opfindelsen hævdes at undgå de med immobiliseringen af enzymet direkte på platinoverfladen forbundne problemer og frembringer en enzymelektrode, som hævdes at være karakterisetet ved hurtige reaktionstider (5 sekunder), høj følsomhed og stor holdbarhed. Imidler-15 tid har forsøg, som for nylig er udført med sådanne elektroder, ikke været i stand til at fremkalde sådanne fordele.

Der er følgelig stadig behov for en enzymelektrode, navnlig men ikke udelukkende til anvendelse i glucosebiofølere, hvilken er pålidelig og reproducerbar, udviser en hurtig reaktion og høj følsomhed og har god 20 langtidsstabilitet.

I overensstemmelse med opfindelsen anvendes der til en enzymelektrode et særligt carbonsubstrat, som tillader fæstning af enzymet, for eksempel glucoseoxidase til elektroden på en mere fordelagtig måde, som muliggør konstruktion af en amperometrisk føler med stærkt forbedret re-25 aktion og stabilitet. Denne forbedrede enzymelektrode kræver ikke anvendelse af et formidlerreagens (selv om et sådant kan tilsættes om ønsket) og findes at arbejde i nærvær af meget lave niveauer af opløst oxygen. Den giver kraftige reaktioner, f.eks. strømdensiteter på hundreder af mikroampere pr. kvadratcentimeter (tilsyneladende elektrodeareal) 30 i en 10 mM glucoseopløsning. Dette menes at være meget højere end nogen tidligere amperometrisk enzymbioføler og kan med fordel anvendes til fremstilling af mi krosondebi ofølere med et elektrodeareal på mindre end 1 mm , som frembringer 0 til 100 nanoampere. Elektroden kan også konstrueres under anvendelse af meget små mængder immobiliseret enzym. Den 35 reagerer meget hurtigere på glucose end nogen kendt glucoseføler, typisk på 1 til 2 sekunder i fravær af en beskyttende membran og 10 til 30 sekunder med membran. Den har en bemærkelsesværdig stabilitet, når den op- DK 173722 B1 6 bevares i våd tilstand selv ved stuetemperatur: elektroder udviser god reaktion selv efter mange måneder. De har et udstrakt arbejdsområde, kræver betydeligt lavere driftspotential end normalt (325 mV over for det mere almindelige 650 mV) og udviser bemærkelsesværdig lav baggrund 5 ved driftspotentialet.

Grundlag for opfindelsen er en enzymelektrode, der er i stand til at reagere amperométrisk på den katalytiske aktivitet af enzymet i nærvær af dets respektive substrat, og omfattende enzymet immobil i seret eller adsorberet på overfladen af et elektrisk ledende understøtningsorgan 10 bestående af eller omfattende et piatini seret porøst lag af harpiksbund-ne carbon- eller grafitpartikler, hvilken enzymelektrode er ejendommelig ved, at det porøse lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler omfatter partikler af fi ndelt platingruppemetal intimt sammenblandet med eller aflej ret på eller adsorberet til overfladen af carbon- eller gra-15 fitpartiklerne for derved som det elektrisk ledende understøtningsorgan at tilvejebringe et i det væsentlige heterogent lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler med platingruppemetallet fordelt i det væsentlige ensartet over laget. I specifik modsætning til den i offentliggjort japansk patentansøgning nr. 56-163447 beskrevne lagdelte ikke-he-20 terogene platiniserede carbonbærer består elektroden ifølge opfindelsen af eller omfatter et i det væsentlige heterogent lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler med piatingruppemetallet fordelt i det væsentlige ensartet gennem dette lag. Det harpiksbundne carbonpulverlag er fortrinsvis dannet ved harpiksbinding af carbonpulverparti kl er, på hvil -25 ke kolloidalt platin eller palladium er aflejret eller adsorberet forud for formning til dannelse af substratet. Foretrukne harpiksbindemidler anvendt ved formning af de platiniserede carbonpartikler til dannelse af det ifølge opfindelsen anvendte elektrodesubstrat er fluorcarbonharpik-ser, navnlig polytetrafluorethylen.

30 Idet konstruktionen af enzymelektroden ifølge opfindelsen nu be skrives mere detaljeret, omfatter den foretrukne elektrode som angivet en elektrisk ledende basis bestående af eller omfattende et lag af harpiksbundet carbonpulver med et platingruppemetal, for eksempel platin eller palladium, adsorberet på overfladen af de pul verformige partikler 35 forud for sammenbinding.

Som carbonpulver kan anvendes et hvilket som helst passende carbon-eller grafitpulver, som let tillader den efterfølgende immobilisering af DK 173722 B1 7 enzymet, og til dette formål skal der anvendes carbonpulver med en høj densitet af funktionelle grupper såsom carboxyl at-, amino- og svovlholdige grupper på overfladen i modsætning til de mere vitrøse og glas-agtige carbontyper, som kun dårligt binder enzymer. Partikelstørrelsen 5 kan ligge fra 3 til 50 nm, mere almindeligt 5 til 30 nm.

Platin (eller palladium) kan aflejres på carbonpartiklerne på en hvilken som helst bekvem måde, for eksempel ved dampfaseaflejring, elektrokemisk aflejring eller simpel adsorption fra en kolloidal suspension (hvilket foretrækkes) til frembringelse af piatingruppemetalindhold 10 fra 1 til 20 vægt% og fortrinsvis fra 5 til 15 vægt% baseret på vægten af carbon. Disse grænser er imidlertid snarere praktiske end kritiske.

Under ca. 1% piatingruppemetal falder udgangssignalet til et niveau, som fra en praktisk betragtning er for lavt til at kunne måles med andet end meget følsomt apparatur. Over ca. 20% bliver tilsætningen af platingrup-15 pemetal uøkonomisk, og der opnås kun ringe yderligere nytte i form af reaktionstid, følsomhed etc. Med ekstremt høje metal til sætninger begynder følsomheden faktisk at falde. Ved den foretrukne teknik platiniseres eller palladiseres carbonpulveret ved oxidativ dekomponering af en platin- eller palladiumforbindelse såsom chlorplatinsyre eller mere fore-20 trukket fortsat et kompleks af platin eller palladium med en oxiderbar ligand i nærvær af carbonpulveret for derved at aflejre platin eller palladium af kolloidal dimension direkte på overfladen af carbonpartiklerne på den måde, der for eksempel er beskrevet i GB-A-1.357.494, US-A-4.044.193 og US-A-4.166.143.

25 Efter piatinisering eller palladisering formes det platiniserede eller palladiserede carbonpulver under anvendelse af en passende vandafvisende bindingsharpiks, fortrinsvis en fluorcarbonharpiks såsom polyte-trafluorethylen, til dannelse enten af en fuldstændigt selvbærende porøs formet struktur i det væsentlige bestående af de harpiksbundne platinl-30 serede eller palladiserede carbonpulverpartikler, eller hvad der er mere almindeligt af et porøst formet overfladelag af sådanne harpiksbundne partikler bundet til et elektrisk ledende substrat, for eksempel af metal, carbon eller grafit. Et specielt foretrukket substratmateriale til det formede, harpiksbundne, platiniserede carbonlag er carbonpapir som 35 beskrevet i US-A-4.229.490 eller et åbenporet carbonstof som beskrevet i US-A-4.293.395. For at bibeholde maksimal porøsitet bør mængden af den som bindingsmiddel anvendte harpiks være det minimum, som kræves for at DK 173722 B1 8 give elektrodelaget mekanisk integritet og stabilitet, idet sådanne lag sædvanligvis har en tykkelse på højst ca. 0,1 til 0,5 mm, selv om større tykkelser kan anvendes. Underlagt kravene om strukturel integritet, mekanisk styrke og porøsitet er mængderne af bindingsharpiks ikke kritiske 5 og kan variere fra så lidt som 5 eller 10 vægt% baseret på mængden af piatini seret eller palladi seret carbonpulver og op til så meget som 80 vægt%, men med en mere almindelig mængde i intervallet fra 30 til 70 vægt%. Mange forskellige harpikser kan anvendes indbefattende harpikser, som er ledende eller halv-ledende, men syntetiske fluorcarbonharpikser 10 og navnlig polytetrafluorethylen foretrækkes. I betragtning af det lille, men essentielle behov for oxygen ved oxidationsprocessen er det essentielt, at bindemidlet er permeabelt for oxygen. Af hensyn hertil bør bindemidlet have en minimum opløselighed for oxygen ved atmosfærisk tryk -3 3 3 på mindst 2 x 10 cm (målt ved standardtemperatur og -tryk) pr. cm 15 polymer.

Blandt egnede bindemidler og deres kendte oxygenopløseligheder taget fra The Polymer Handbook (Ed. J. Brandrup og E.H. Immergut) 1. udgave (1967), Interscience, er: 20 S x 102 (cm3)

Polytetrafluorethylen (PTFE) 0,276

Andre fluorcarbonpolymerer end PTFE Variabel, 0,2 og opefter 25 Polyethylmethacrylat 8,6

Polystyren 18,2 (beregnet)

Polyvinylacetat 6,3

Polyvinylchlorid 2,92

Polycarbonat 0,51 30 Poly(4-methylpenten-l) 24,3

Polyisopren 10,3

Polychloropren 7,5

Poly-1,3-butadien 9,7

Silikonegummi 31,1

De enzymelektrodesubstrater, som foretrækkes til anvendelse ifølge opfindelsen, er i realiteten kommercielt tilgængelige materialer, som 35 DK 173722 B1 9 sælges under varemærket Prototech af Prototech Company, Newton Highlands, Massachussets, og som hidtil er blevet anvendt som elektrokataly-tiske gasdiffusionselektroder i brændselsceller. Fremstillingen af sådanne materialer beskrives detaljeret i US-A-4.044.193, US-A-4.166.143, 5 US-A-4.293.396 og US-A-4.478-696, hvortil der henvises for fuldstændige detaljer. I store træk adsorberes kolloidal platin med en partikelstørrelse i intervallet fra 15 til 25 Ångstrøm (1,5 til 2,5 nm) imidlertid på overfladen af pulverformigt carbon (partikelstørrelse 50 til 300 Ångstrøm; 5 til 30 nm), for eksempel ved dannelse af en platinsol In sii 10 tu i nærvær af pulverformigt carbon, der virker som et kimdannelsesmiddel for solen. De platiniserede carbonpartikler formes derefter på en elektrisk ledende understøtningsstruktur, for eksempel et lag carbonpa-pir under anvendelse af et syntetisk harpiksbindemiddel, fortrinsvis en fluoreret carbonhydridharpiks og navnlig polytetrafluorethylen.

15 Ifølge en alternativ metode beskrevet i US-A-4.293.396 imprægneres de platiniserede carbonpartikler 1 et på forhånd dannet porøst carbon-stof og bindes deri ved hjælp af fluorcarbonharpiksen, fortrinsvis polytetrafluorethylen. Det må imidlertid forstås, at opfindelsen ikke er begrænset til anvendelse af Prototech-materialerne, men omfatter andre 20 lignende substratmaterialer omfattende harpiksbundet og formet pi at i ni -seret eller pal 1 adi seret carbonpulver. Specielt er det hensigten, at der også kan anvendes materialer af den type, der beskrives som brændselscel leelektroder i US-A-4.229.490, det vil sige carbonpapirelektroder af den type, der omfatter et carbonpapirunderstøtningsorgan, fortrinsvis 25 imprægneret med en vandafvisende harpiks såsom polytetrafluorethylen, og på hvilken der for eksempel ved skabelontrykning er aflejret et harpiksbundet katalysatorlag omfattende en ensartet blanding af platin-sort og carbon- eller grafitpartikler sammenbundet med en vandafvisende harpiks, igen fortrinsvis polytetrafluorethylen.

30 Immobiliseringen af enzymet på overfladen af det harpiksbundne pla tiniserede eller palladiserede carbonsubstrat kan udføres ved hjælp af forskellige veletablerede immobiliseringsteknikker, for eksempel kovalent binding med et carbodiimid- eller et carbonyldiimidazolreagens, kovalent binding med 1,6-dinitro-3,4-difluorbenzen (DFDNB) eller tvær-35 binding med glutaraldehyd.

Typiske eksempler på forskrifter for immobiliseringen af enzymet glucoseoxidase, er som følger: DK 173722 B1 10 A. Carbodiimidbehandlinq 1. Udskær elektrodestykker af passende størrelse fra laget af Proto-5 tech-elektrodemateriale.

2. Nedsænk elektroderne i ethanol i ca. 5 minutter for at sikre omhyggelig befugtntng af det PTFE-belagte bindemiddel og bagning.

10 3. Fjern elektroderne fra ethanolen og vask dem grundigt med destilleret vand for at fjerne alle spor af ethanol.

4. Fremstil 5 ml (eller mindre) af en 0,15 H opløsning af 1-cyclo-hexyl-3-(2-morpho1ino)carbodiimid-g-methyltoluensulphonat i 0,1 M ace- 15 tatpuffer, pH 4,5, og anbring elektroderne deri i 90 minutter ved stuetemperatur. Forsigtig omrøring med en mekanisk rysteanordning kan anven des. Hvis elektroderne skulle flyde på overfladen af opløsningen, er de ikke blevet befugtet tilstrækkeligt, og behandlingen bør gentages fra trin 2.

20 5. Fjern elektroderne og vask dem grundigt med destilleret vand. Anbring dem i en frisk fremstillet opløsning af glucoseoxidase (5,0 mg/ml) i acetatpuffer, pH 5,6, i 90 minutter ved stuetemperatur under forsigtig mekanisk rystning.

25 6. Fjern elektroderne fra enzymopløsningen og skyl dem grundigt med 0. 1 M acetatpuffer. Elektroderne er nu klar til brug.

7. Opbevar elektroderne ved 4"C i 0,1 M acetatpuffer, pH 5,6.

30 B. Carbonvldi imi dazolbehandl irtg: 1. Udfør trin 1 ovenfor og udelad trin 2 og 3.

35 2. Fremstil en opløsning af N^N'-carbonyldiimidazol i vandfrit dimethyl formamid (40 mg/ml).

DK 173722 B1 11 3. Anbring elektroderne i denne opløsning i 90 minutter ved stuetemperatur om ønsket under forsigtig mekanisk rystning.

> 4. Fjern elektroderne fra opløsningen og aftør overskydende carbonyl - 5 diimidazolopløsning før de anbringes i en frisk fremstillet opløsning af glucoseoxidase i yderligere 90 minutter.

5. Udfør trin 6 og 7 ovenfor.

10 C. DFDNB-behandlinq: 1. Udfør trin 1-3 under A ovenfor.

2. Vask elektroderne grundigt i natriumboratpuffer (0,1 M, pH 8,5).

15 3. Fremstil en opløsning af l,6-dinitro-3,4-difluorbenzen i methanol (0,1021 g/5 ml), og anbring elektroderne deri i 10 minutter ved stuetemperatur.

20 4. Fjern elektroderne og vask dem grundigt med boratpuffer, før de anbringes i en opløsning af glucoseoxidase i yderligere 90 minutter ved stuetemperatur.

5. Udfør trin 6 og 7 under A ovenfor.

25

Andre typer koblingsmiddel kan anvendes til immobiliseringsprocessen herunder bi funktionelle midler af variabel kædelængde, for eksempel diimidater såsom dimethylmalonimidat eller dimethylsuberimidat.

Som alternativ har det vist sig, at simpel adsorption af enzymet på 30 den harpiksbundne platiniserede eller pal1 adi serede carbonpulverbærer, det vil sige uden tværbinding, er effektiv ved visse enzymer og navnlig for glucoseoxidases vedkommende.

Sædvanligvis, men ikke nødvendigvis, vil overfladelaget af immobi-liseret enzym blive beskyttet fysisk ved anbringelse af en passende po-35 røs film eller membran, for eksempel af polycarbonat, som naturligvis må være permeabel for enzymsubstratet (glucose), som skal bestemmes. Sådanne membraner er noget ufordelagtige ved, at de forøger følerens reak- DK 173722 B1 12 tionstid, men ikke desto mindre er de foreliggende følere i stand til selv med en sådan membran at give reaktionstider, som er sammenlignelige med og i mange tilfælde betydeligt bedre end de reaktionstider, der opnås med konventionelle enzymelektroder.

5 Som allerede anført angår opfindelsen navnlig glucoseoxidaseelek- troder, det vil sige elektroder, hvor det immobil i serede enzym er en glucoseoxidase, men det er klart, at andre oxidoreduktaser kan anvendes omend ikke altid med samme virkning. Dette skyldes ikke nødvendigvis nogen iboende ineffektivitet af enzymet, men andre faktorer. For eksempel 10 undergår ved bestemmelse af oxalsyre under anvendelse af oxalatoxidase selve oxalsyresubstratet elektrokemisk oxidation ved basiselektroden, således at en eventuel fra enzymet hidrørende virkning maskeres stærkt. Imidlertid indbefatter andre egnede oxidoreduktaser lactatoxidase, ga-lactoseoxidase, cholesteroloxidase og andre peroxidproducerende enzymer 15 samt kombinationer af immobi1 i serede enzymer indbefattende kombinationer af en ikke-oxidase og en oxidase, hvor den første virker på et substrat af interesse til frembringelse af et oxiderbart substrat for oxidasen, og sidstnævnte virker på det oxiderbare produkt til frembringelse af en målelig strøm, som er proportional med koncentrationen af det af inter-20 esse værende substrat. En sådan kombination er kombinationen af beta-ga-lactosidase og glucoseoxidase (til kvantitativ bestemmelse af lactose) eller kombinationen af et beta-glucandepolymeriserende enzym, beta-glu-cosidase og glucoseoxidase (til bestemmelse af beta-glucaner).

Andre typer føleranvendelse indbefatter anvendelse af enzymatiske 25 eller ikke-enzymatiske reagenser eller processer, som vekselvirker med et primært substrat af interesse ved en prækursorreaktion, hvor det resulterende produkt indbefatter en substans, som på sin side virker som substrat for en enzymelektrode ifølge opfindelsen. Mange eksempler på sådanne prækursortrin vil kunne findes inden for området af immunokemi-30 ske reaktioner, og metoder, som gør brug af sådanne reaktioner ved konstruktionen af følere, indbefattende immunofølere, under anvendelse af enzymelektroder ifølge opfindelsen, vil være indlysende for fagmanden.

Den primære anvendelse af elektroderne ifølge opfindelsen vil imidlertid være som biofølere til påvisning og/eller kvantitativ bestemmelse 35 af et oxiderbart substrat, navnlig glucose, i en prøve, navnlig en klinisk prøve såsom blod, serum, plasma, urin, sved, tårer og saliva.

Blandt andre mulige ikke-kliniske anvendelser er: DK 173722 B1 13 (a) fermenteringsovervågning, (b) industriel processtyring, (c) miljømæssig overvågning, for eksempel af afgangs strømme og 5 forureningskontrol af væsker og gasser, (d) fødevareundersøgelse, (e) veterinære anvendelser, navnlig anvendelser beslægtet med de ovenfor foreslåede kliniske anvendelser.

10 For såvidt som bio- og andre følere indbefattende et enzymelektro- demateriale ifølge opfindelsen kan omfatte andre strukturelle elementer, elektriske ledere, ikke-elektrisk ledende (isolerende) bærere eller sonder etc. er sådanne elementer i konstruktionen konventionelle og behøver ikke blive beskrevet nærmere. Det er tilstrækkeligt at sige, at det, når 15 elektrodematerialet, som det sædvanligvis vil være tilfældet, er et papirtyndt lag eller en papirtynd oblat, vil bioføleren sædvanligvis indbefatte et isolerende understøtningsorgan eller en sonde, hvorpå elektrodematerialet er monteret, og ved hjælp af hvilket eller hvilken elektrodematerialet kan indføres i prøven. I sådanne tilfælde kan den 20 aktuelle størrelse af stykket af elektrodemateriale være ganske lille, ikke mere end nogle få kvadratmi 11imeter eller endog mindre. Elektrisk kontakt med elektrodematerialet kan foretages på mange måder, for eksempel ved montering af elektrodematerialet i flade mod flade kontakt med en elektrisk ledende kontakt eller terminal, for eksempel af platin, 25 sølv eller en anden passende leder. Når elektrodematerialet har tilstrækkelig tykkelse og styrke til at være fuldstændigt selvbærende, kan der ses bort fra isolerende understøtninger eller bærere for elektrodematerialet, og elektriske ledere kan forbindes direkte med elektrodematerialets overflade.

30 Andre understøtningsorganer end carbonpapir kan anvendes såsom en elektrisk halv-ledende overflade, for eksempel overfladen af en Field Effect Transistor (FET) eller en ikke-elektrisk ledende overflade. I sidstnævnte tilfælde kan elektrisk kontakt etableres direkte til det med platingruppemetal forsynede harpiksbundne carbon- eller grafitlag.

35 Fremstillingen af enzymelektrodematerial er ifølge opfindelsen og deres egenskaber illustreres i de følgende eksempler.

DK 173722 B1 14

Eksempel 1 (Sammenligning) (kendt teknik)

En enzymelektrode ifølge den kendte teknik fremstilledes ved elek-trolytisk aflejring af et tyndt lag (< 1/Jm) platin på overfladen af en elektrisk ledende basis bestående af et porøst harpiksbundet carbonpapir 5 omfattende ledende carbonblackgranulat (Vulcan XC-72) med en nominel partikelstørrelse på 30 nm og formedes på et lag af kommercielt tilgængeligt grafitiseret carbonpapir under anvendelse af 10 vægt% polyte-trafluorethylen som bindemiddel.

Glucoseoxidase fra Aspergillus niger immobil i seredes på overfladen 10 af forskellige prøver af det platiniserede carbonpapir ved den tidligere beskrevne carbodiimidbehandling og ved tværbinding med glutaraldehyd ved behandling af elektrodens platiniserede overflade med vandig glucoseoxi-daseopløsning, tørring og efterfølgende tværbinding af det aflejrede enzym ved udsættelse for glutaraldehyd ved 25'C.

15 Til efterfølgende afprøvning udskares elektrodematerialet derefter i skiver på 2 mm i diameter.

Eksempel 2. Glucoseelektrode

Glucoseoxidase fra Aspergillus niger immobil i seredes på platinise-20 ret carbonpapir solgt under varemærket "Prototech" af Prototech Co., Massachussetts, U.S.A. og omfattende platiniserede carbonpulverpartikler (Vulcan XC-72) fremstillet i henhold til eksempel 1 i US-A-4.044.193 ved aflejring af kolloidalt platin (partikelstørrelse 1,5 til 2,5 nm) på overfladen af carbonpulveret (nominel partikelstørrelse 30 nm) ved oxi-25 dativ dekomponering af kompleks platinsulfitsyre (II) ved hjælp af H202 og efterfølgende formning og binding af det platiniserede carbonpulver på overfladen af et kommercielt grafitiseret carbonpapir under anvendelse af ca. 50 vægt% polytetrafluorethylen. Platinindholdet i det færdige . 9 produkt er 0,24 mg x cm .

30 Glucoseoxidase immobil i seredes på forskellige prøver af Prototech materialet ved de tidligere beskrevne behandlinger, det vil sige ved behandling med carbonyldiimid, ved carbonyl di i midazolbehandling og ved DFDNB behandling.

I separate forsøg immobiliseredes glucoseoxidase på Prototech mate-35 rialet ved tværbinding med glutaraldehyd og ved simpel adsorption, det vil sige uden tværbinding, ved ophængning af Prototech materialet i frisk fremstillet glucoseoxidaseopløsning (5,0 mg x ml’1) i acetatpuf- DK 173722 B1 15 fer, pH 5,6, i 90 minutter ved stuetemperatur. Som alternativ kan adsorption af enzymet bekvemt udvirkes ved en elektroforeseproces, til hvilket formål elektrodebasismaterialet ophænges med positivt potential i enzymopløsningen i 60 minutter.

5

Eksempel 3

Under anvendelse af den tidligere beskrevne carbodiimidbehandling immobil i seredes følgende enzymer på piatini seret carbonpapir fra Proto-tech, det vil sige et PTFE bundet carbonpapir fremstillet ud fra præ-10 piatiniseret carbonpulver (US-A-4.044.193): lactatoxidase galactoseoxidase glucoseoxidase/beta-galactosidase

For yderligere at illustrere opfindelsens fordele og egenskaberne 15 ved enzymelektrodematerial erne ifølge opfindelsen i sammenligning med kendte elektroder testedes enzymelektrodematerial er fremstillet som i de foregående eksempler for amperometrisk reaktion i en celle omfattende et modificeret Rank oxygenelektrodesystem (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge) vist på tegningen og også i Analytica Chimica Acta, 183» (1986),

20 59-66. I dette system var membranen erstattet med en carbonpapirenzym-elektrode (5 mm i diameter) ifølge opfindelsen, som fastholdtes på pla-tinknapelektroden. Modelektroden (platinfolie) indsattes gennem celledækslet. Referencen var en sølv-sølvchloridelektrode. Ved nogle forsøg (med beskyttelsesmembran og uomrørte opløsninger) anvendtes en 2-elek-25 trodekonfiguration; mod/reference-elektroden var en omgivende chloridi-seret sølvring. Sædvanligvis omrørtes testopløsningerne magnetisk i pH

7,0 puffer, mens arbejdselektroden ved hjælp af en potentiostat holdtes på et potential på 600 mV i forhold til referencen. Ved anvendelse af 2-elektrodekonfi gurationen benyttedes et potential på 325 mV. Efter at 30 tilstrækkelig tid var forløbet til, at baggrundsstrømmen var faldet til et lavt niveau, injiceredes substratopløsning fra en sprøjte. Strømreaktionen registreredes på en kurveskriver.

De opnåede resultater diskuteres nærmere nedenfor og illustreres grafisk på tegningen, hvor 35 fig. 1 illustrerer reaktionen af en glucoseoxidaseelektrode ifølge opfindelsen i sammenligning med glucoseoxidase immobiliseret på andre typer carbonelektroder, DK 173722 B1 16 fig. 2 er en første kurve, der illustrerer glucoseoxidaseelektro-dens stabilitet, fig. 3 er en anden kurve, der illustrerer glucoseoxidaseelektrodens reaktion på et interval af glucosekoncentrationer, 5 fig. 4 er en kurve, der illustrerer glucoseoxidaseelektrodens reak tion under betingelser med varierende omgivende oxygenspænding, fig. 5 er en kurve, der illustrerer virkningen af opbevaring ved stuetemperatur på glucoseoxidaseelektroden, fig. 6 er en sammenligningskurve, der illustrerer virkningen af op-10 bevaring ved stuetemperatur på elektroden ifølge den kendte teknik, fig. 7 viser sammenligningen mellem reaktionen af en glutaraldehyd-immobiliseret glucoseoxidaseelektrode ifølge opfindelsen og en glutaral-dehydimmobiliseret glucoseoxidaseelektrode ifølge den kendte teknik, fig. 8 svarer til fig. 7, men der anvendes carbodiimidimmobilise- 15 ring, fig. 9 viser sammenligningen mellem reaktionen af en carbodiimidimmobil i seret lactatoxidaseelektrode ifølge opfindelsen og en carbodiimidimmobil i seret lactatoxidaseelektrode ifølge den kendte teknik, fig. 10 og 11 viser henholdsvis reaktionsprofilet for galactoseoxi-20 dase- og lactatoxidaseelektroder ifølge opfindelsen, fig. 12 viser reaktionsprofilet for en kombineret glucoseoxidase/-beta-galactosidaseelektrode ifølge opfindelsen, fig. 13 viser reaktionsprofilet for en glucoseoxidaseelektrode ifølge opfindelsen, hvortil der anvendes polyvinyl acetat som bindemiddel 25 for det platiniserede carbonpulver i stedet for polytetrafluorethylen, fig. 14 viser reaktionsprofilet for en glucoseoxidaseelektrode ifølge opfindelsen, hvori glucoseoxidasen er immobiliseret på en carbon-papirelektrode omfattende et overfladelag af harpiksbundet (polytetrafluorethylen) pal ladi seret carbonpulver, 30 fig. 15 illustrerer den til bestemmelse af driftskarakteristika for elektroderne ifølge opfindelsen anvendte modificerede elektrokemi ske Rank-celle, og fig. 16 illustrerer den til nogle af målingerne anvendte 2-elek-trodekonfiguration.

35 Idet der indledningsvis henvises til fig. 15 opnåedes mange af de her præsenterede data ved anvendelse af en elektrokemisk celle vist i fig. 15. Denne omfatter en todelt celle med en basis 1 med en ringformet DK 173722 B1 17 kappe 2, som omgiver et vandkammer h, gennem hvilket vand kan cirkuleres til styring af cellens temperatur, idet de to dele er forbundet med hinanden ved den fastholdte med gevind forsynede muffe 3. Centralt placeret i basen 1 er en platinkontakt d, hvorpå testskiven a af papirelektrode-5 materialet omfattende det immobil i serede enzym er anbragt, og som holdes på plads på platinkontakten af gummi O-ringpakninger e og f, når cellens to dele er sammenkoblet.

I toppen af cellen, som naturligvis vil indeholde enzymsubstratop-løsningen, er der indsat en af en justerbar krave g understøttet prop 4, 10 i hvilken der er monteret en platinmodelektrode b og en Ag/AgCl referenceelektrode c. Som vist udførtes tests med arbejdselektroden bragt i ligevægt ved 600 mV, idet strømydelsen måles fra en elektrode med et tilsyneladende overfladeareal på 0,14 cm i kontakt med substratopløsningen. Resultaterne udtrykkes i figurerne ved strømdensitet, det 15 vil sige strømydelse pr. enhedsareal af elektroden a i kontakt med substratet.

I fig. 16 ses en platinkontakt B omgivet af en reference/mod-elek-trode C, som er adskilt derfra af en isolerende manchet G. En porøs po-lycarbonatmembran monteret på en "0"-ring anvendes til at holde test-20 skiven E (papirelektrodemateriale omfattende det immobiliserede enzym) på platinkontakten. Et åbent prøvekammer F tillader dråbevis anbringelse af prøver på membranen. Elektrodecellen polariseres ved 325 mV, og strømmen overvåges via en potenti ostat A. Anvendelsen af en 2-elektrode-konfiguration bragt i ligevægt ved 325 mV har fordele i forhold til den 25 sædvanlige 3-elektrodecelle bragt i ligevægt ved 600 mV nemlig bekvemmelighed under brug og lavere baggrundsstrøm. Valget af det ene system frem for det andet påvirker imidlertid ikke væsentligt ydelsesegenskaberne såsom lagringsstabilitet, stabilitet under brug, linearitet af reaktion eller oxygenafhængighed af elektroderne ifølge opfindelsen.

30 De opnåede resultater diskuteres nærmere nedenfor.

Linearitet og tidsafhænoighed af reaktioner I fig. 1 på tegningen vises typiske eksempler på elektrodereaktion på successive tilsætninger af glucose til slutkoncentrationer i inter-35 vallet 0 til 35 mM ved anvendelse af en 3-elektrodecelle under omrøring.

Alle tre elektroder A, B og C var forsynet med giucoseoxidase immobil i -seret derpå ved fremgangsmåde A ovenfor. Elektrode A omfattede en akti- DK 173722 B1 18 veret platiniseret carbonbærer ifølge opfindelsen, det vil sige en formet plade af harpiksbundet (polytetrafluorethylen) platiniseret carbon-pulver solgt under varemærket Prototech, elektrode B omfattede en elektrisk ledende bærer udskåret af et stykke grafitstang, og elektrode C 5 omfattede en elektrisk ledende bærer udskåret fra et i handelen tilgængeligt ikke-platiniseret carbonpapir. Som vist gav elektroderne B og C mindre, forholdsvis sløve reaktioner, en reminiscens af resultater med formidlede følere, der er almindeligt forekommende i litteraturen..

Elektrode A gav mere pålidelige og stabile reaktioner med en reaktions-10 tid på ca. 1 sekund. ("Spidsen" i signalet, som iagttages i toppen af den indledende reaktion, er delvis en artefakt, som skyldes injektionsmetoden; det glucoseafhængige plateau er det interessante signal). Alle tre elektroder gav en i det væsentlige lineær reaktion med hensyn til glucosekoncentrationen (fig. 2, resultater kun vist for A og C). Denne 15 strækker sig over det interval, der kræves til direkte analyse af glucose i blod (0 til 30 mM). Lignende resultater opnået med elektroder af type A under anvendelse af immobiliseringsprocedure B ovenfor antyder, at denne metode giver endnu bedre linearitet over et udstrakt område.

Som vist i fig. 2 var elektrode A's reaktion praktisk taget uændret 20 efter 23 dage, mens de andres reaktion forringedes med tiden (som vist for elektrode C). Denne type opførsel iagttoges også for andre ovenfor beskrevne immobiliseringsmetoder, som alle kunne anvendes til fremstilling af reagerende og stabile elektroder med carbonmateriale anvendt til A, men gav utilfredsstillende elektroder med talrige andre inaktive car-25 bonmaterialer. A's reaktionstid var også uændret efter 23 dage, mens andre elektroder udviste en forøgelse i reaktionstid med indledende reaktionstider fra ca. 23 til 30 sekunder stigende til 2 til 3 minutter efter 8 dage. Aktive elektroder (såsom A) udviste i almindelighed et vist fald i reaktion i løbet af den første dag, men reaktionen nåede 30 derefter et plateau i forhold til tiden. Elektroder af typen A opbevaret vådt (pH 5,6) ved 4’C og testet med mellemrum over en 6 måneders periode udviste ringe ændring (efter de første få dage), og selv om der skete en vis gradvis forringelse efter dette tidsrum, var reaktionen fortsat 70% af den oprindelige værdi efter 12 måneders forløb.

_2 35 Fig. 1 og 2 viser strømydelsen for elektroden i μΑ cm ved en driftspotential på 600 mV under anvendelse af den i fig. 15 viste 3-elektrodekonfi gurat i on.

DK 173722 B1 19

Den udvidede lagerholdbarhed og stabilitet af de foreliggende elektroder illustreres yderligere af fig. 5, som viser reaktionen af den carbodiimidimmobili serede glucoseoxidaseelektrode på 5 mM glucose efter opbevaring i acetatpuffer, pH 5,6, ved stuetemperatur i et tidsrum på 5 180 dage. Sammenligningsresultater for elektroden ifølge den kendte tek nik (eksempel 1) vises i fig. 6. Målingerne i fig. 5 foretoges ved 600 mV med 3-elektrodesystemet og i fig. 6 ved 325 mV med 2-elektrodekonfi-gurationen.

Yderligere sammenligninger mellem reaktionskurverne for elektroder 10 ifølge den kendte teknik (eksempel 1) og de foreliggende elektroder under anvendelse af forskellige enzymer og forskellige immobiliseringsmetoder vises i fig. 7 til 9, hvor alle målinger foretoges ved 325 mV.

Reaktionskurverne for lactat, galactose og lactose (kombineret glu-coseoxidase og beta-galactosidase) vises i fig. 10 til 12. Disse måling-15 er foretoges ved 600 mV.

Genanvendelse af elektroden: egnethed til gentagne målinger

Under kontinuert belastning udviste elektroderne ifølge opfindelsen fremragende lang levetid af en type, som ikke tidligere er blevet regi-20 streret. Dette illustreredes ved følgende sekvens af strenge tests.

Først opsattes en glucoseoxidaseelektrode (eksempel 2) i en lukket celle og fik lov til at reagere amperometrisk på en omrørt glucoseopløs-ning (begyndelseskoncentration 5 mM, begyndelsesstrøm 100 /xamp). Den kørte kontinuert i 18 timer, hvorunder signalet gradvist faldt til under 25 10 ^amp. Den samlede frembragte elektricitet svarede til ca. 75% af den teoretisk forventede (på basis af 2 elektroner pr. molekyle glucose).

Dette forsøg gentoges straks med samme elektrode ved fornyelse af glu-coseopløsningen, hvorefter begyndelsesstrømmen reetableredes, og "opbrydningen" af substrat under kontinuert belastning gav identiske resul-30 tater.

Ved sideløbende forsøg fortsattes afgivelse af strøm under anvendelse af samme elektrode i yderligere 5,7 dage, men tilførslen af glu-coseopløsning etableredes ved cirkulation fra et stort reservoir til opretholdelse af en koncentration på 5 mM. Ydelsen faldt langsomt over et 35 tidsrum på 100 timer, men stabiliseredes derefter ved 45 μΑ, hvilken værdi opretholdtes i yderligere 40 timer. Det er muligt, at noget løst bundet enzym blev frigjort fra elektrodebasen over dette tidsrum (selv DK 173722 B1 20 om strømydelsen ikke afhang af omrøringshastigheden), eller at en anden konditioneringseffekt gør sig gældende.

Efter de ovenfor beskrevne langtidstests testedes elektrodens reaktion over et glucosekoncentrationsinterval som tidligere anført. Selv om 5 signalamplituden var mindre end i frisk fremstillet tilstand, gav elektroden en meget tilfredsstillende "trin"-funktion over intervallet 0 til 30 mM glucose, hvilket bekræftede, at den ikke havde lidt nogen skade som resultat af den forlængede anvendelse under belastning. Denne konklusion underbyggedes ved tre yderligere tests efter 1 uges opbevaring 10 (4'C), efter 8 ugers opbevaring og efter igen at have kørt under belastning som før i yderligere 4,7 dage. Reaktionerne over et interval af glucosekoncentrationer var uændrede.

Disse tests viser, at en elektrode kunne drives i et samlet tidsrum på mindst 250 timer (over 15.000 minutter) og således muliggøre en eks-15 tremt lang arbejdslevetid. Arbejdslevetiden for enzymelektroder ifølge den kendte teknik er sædvanligvis meget kortere end for elektroder ifølge opfindelsen, i mange tilfælde kun nogle få timer: Turner, (1985) Proceedings Biotech 85 (Europe) Online Publications, Pinner, U.K., 181-192.

For eksempel har glucoseelektroder baseret på ferrocen-koblet glucose-20 oxidase i almindelighed halveringstider på ca. 24 timer (Turner, loc. cit.), mens Cass et al. (1984) Analyt. Chem. 56, 667-673 anfører en samlet stabil levetid på 50 timer for samme elektroder. Når en elektrode anvendtes til 50 på hinanden følgende målinger af 5 mM glucoseopløsning var standardafvigelsen mindre end 1%.

25

Egnethed til kontinuert overvågning

Niveauet af den endelige reaktion registreret ved ovennævnte genanvendelighedstests (45 /jamp i 5 mM glucose) forblev upåvirket af eksponering for luftede opløsninger og var den samme efter adskillige ugers 30 yderligere opbevaring. Stabiliteten af strømafgivelsen fra elektroden i løbet af 12 timer checkedes ved en kontrolleret test under anvendelse af steriliseret glucoseopløsning under betingelser udformet med henblik på at eliminere eventuelt tab af glucose på grund af bakteriel kontaminering. Signalet var konstant over hele perioden, hvilket indikerede, at 35 eventuelle virkninger af den indledende "konditionering" af elektroden i en omrørt og cirkuleret opløsning over flere dage var komplet. Sådanne elektroder konditioneret på passende vis ved hjælp af en eller anden DK 173722 B1 21 passende konditionerings-/vaskeprocedure vil finde anvendelse, hvor kontinuert overvågning af glucose er påkrævet.

Batchreproducerbarhed 5 Forudsat at passende "rene" præparative betingelser opretholdes, virker alle elektroder fremstillet ifølge opfindelsen som beskrevet, idet de giver gode reaktioner på glucose. Elektrodepar af identisk størrelse fremstillet ved samme procedure gav nøje overensstemmende resultater (strømreaktioner inden for nogle få procent ved testning under iden-10 tiske betingelser). Endvidere havde alle således fremstillede elektroder meget lange levetider og stor holdbarhed som ovenfor anført i modsætning til glucoseelektroder ifølge den kendte teknik. Elektroderne ifølge opfindelsen kan således opbevares og anvendes pålideligt i mange uger, mens elektroder ifølge den kendte teknik ofte udviser stor variabilitet 15 inden for en batch. For eksempel bemærkede Turner, loc. cit., at selv om nogle få glucoseoxidaseelektroder i en batch lejlighedsvis havde exceptionelt lang levetid (600 timers halveringstid), havde størsteparten halveringstider på ca. 24 timer. De kunne derfor ikke anvendes pålideligt over meget længere tidsrum end 24 timer.

20

Afhængighed af reaktion på oxyqenkoncentration

For at teste virkningen af opløst oxygen modificeredes en testcelle til at inkludere en oxygenelektrode udover glucoseelektroden. Forsøg udførtes, hvorved opløst oxygen fejedes ud af systemet ved gennemledning 25 af argon. Under disse betingelser gav elektroden af type A (ovenfor) en hurtig reaktion på glucosetilsætninger, hvilket antyder en mekanisme, som i vid udstrækning er uafhængig af den omgivende oxygenkoncentration.

Et sådant resultat, som kan tilskrives elektrodeoverfladestrukturens særlige karakteristika i kombination med gunstig enzymimmobilisering, er 30 ikke iagttaget tidligere.

Ved et yderligere forsøg (fi g - 4) overvågedes udgangssignalet for en type A elektrode (fremstillet ved metode A ovenfor) ved 600 mV under en kontinuert argongennemledning. Samtidig foretoges målinger af oxygenspænding i prøven. De i fig. 4 anførte resultater viser et i det væ-35 sentlige konstant strømsignal (den øvre kurve), som i det væsentlige er uafhængigt af oxygenspændingen i prøveopløsningen (den nedre kurve). Ved en anden test var signalet praktisk taget upåvirket over et tidsrum på 22 DK 173722 B1 10 minutter, mens oxygenspændingen faldt hurtigt. En anden elektrode (fremstillet ved metode B) viste et fald i strøm på under 5% over 3 minutter, 1 hvilket tidsrum oxygenet var blevet opbrugt 90%. En forøgelse i strømreaktion ses også, når oxygen genindføres i systemet, selv om 5 dette bidrag etableres forholdsvis langsomt. Ved forlænget gennemskylning med argon reagerede elektroderne kun på et begrænset område af glu-cosekoncentration, og det er muligt, at tilstedeværelsen af spor af oxygen kan være påkrævet for at "udløse" den del af enzymfunktionen, som er ansvarlig for uddrageisen af hydrogen fra substratet. Det kan desuden 10 ikke udelukkes, at oxygen adsorberet ved elektroden (til en lav koncentration og ikke påviseligt med oxygenelektroden) spiller en vis rolle for denne opførsel.

Enzymbelastning 15 Uafhængige målinger af giucoseopbrugningshastighed og maksimale strømtætheder viser, at mængden af aktivt immobil i seret enzym pr. elektrode (type A) var ækvivalent med ca. 7 μς aktivt enzym pr. kvadratcentimeter elektrodeoverflade. (I litteraturen gives ringe information om enzymbelastninger af lignende giucoseoxidasebaserede biofølerer). Ved 20 immobiliseringsprocedurerne fandtes det, at der, selv når enzymopløsningen fortyndedes så meget som 10 gange, fortsat kunne fremstilles meget aktive elektroder.

Temperaturafhænqiqhed af reaktion 25 Type A elektroder testedes over koncentrationsintervallet 0 til 30 mM glucose ved temperaturer mellem 10 og 37'C. Temperaturkoefficienten var 2 til 3% pr. grad (svarende til en Arrhenius-aktiveringsenergi på ca. 24 kJ mol’1). Dette står mål med værdien på 4% pr. “C, som er noteret for den ferrocenformidiede bioføler (Cass et al, loc. cit.).

30 pH-afhængighed

En lille afhængighed af reaktionen på pH iagttoges. Men mellem pH

7,0 og 8,0 er reaktionen praktisk taget pH-uafhængig bortset fra ved meget høje glucoseniveauer (> 25 mM).

Reaktion af elektrode dækket med beskyttende membran

En polycarbonatmembran fandtes at bevirke ringe ændring af formen 35 DK 173722 B1 23 og størrelsesordenen af elektrodereaktionen 1 et omrørt system. Reaktionstiden i et ikke-omrørt system var ca. 20 sekunder.

*

Anvendelse af elektrode til analyse af fuldbiodprøver 5 Elektroden med polycarbonatmembran anvendtes tilfredsstillende til direkte måling af glucose i blod. Interferens fra ascorbat ved 0,2 mmol/liter var ca. 2,5% af det totale signal ved et glucoseniveau på 5 mmol/1i ter.

10 Anvendelse af elektrode 1 analytiske bi ofølere af andre konfigurationer

Den vellykkede anvendelse af enzymelektroden ifølge opfindelsen i en celle af Rank-type under anvendelse af en modificeret Cl ark-elektrode som ovenfor beskrevet vises af de ovenfor omtalte resultater. Det er også blevet vist, at elektroden giver fremragende resultater, når den an-15 vendes i andre følerformer såsom en sonde.

For eksempel konstrueredes en sonde med en diameter på 2 mm og af den type, som er almindeligt anvendt i mange konventionelle elektroder, hvor elektroden monteredes på en tråd og forsegledes i et glasrør. Denne kunne indføres (med tilhørende reference- og modelektroder) i omrørte 20 testopløsninger indeholdt i et bæger eller en anden beholder til frem- ♦ bringelse af pålidelige målinger af glucosekoncentration uden behov for at eliminere atmosfærisk oxygen. Ud fra målinger med denne og mindre sonder af lignende udformning blev det fastslået, at elektrodernes strømreaktion i en opløsning af fast glucosekoncentration ca. er propor-25 tional med elektrodens tilsyneladende areal eller vægt.

Der konstrueredes også sonder med elektroder af miniatureudformning (areal ca. 0,25 til 0,50 mm , vægt 30 til 60 μ$). Trådindfatningen dæk-kedes i en formstofmanchet, og den med manchet forsynede sonde indførtes i en kateternål (1,5 mm i diameter). Nålen kan indføres gennem en gummi-30 tætning i en beholder (som for eksempel kan være inkorporeret i en fer-mentator eller et lignende apparat eller et spildreservoir) og anvendes som sondeføler til måling af glucosekoncentrationen i en opløsning indeholdt i beholderen. I denne konfiguration er føleelektroden beskyttet af den omgivende nål på indføringstidspunktet, men kan også skubbes fri af 35 nålen efter indføringstrinnet, hvor dette er nødvendigt.

Da miniaturesonder som ovenfor beskrevet typisk gav signaler i intervallet 1 til 10 μβΓηρ, er nøjagtige målinger i intervallet 1 til 100 DK 173722 B1 24 namp mulige med passende instrumentering. Da signal strømme i dette område understøttes af enzymelektroder (ifølge opfindelsen) af meget lille størrelse (areal ca. 0,005 mm , vægt 1 jig), kan sådanne elektroder inkorporeres i fine nålemikrosonder, som for eksempel vil kunne anvendelse 5 i katetersonder til in vivo målinger.

Selv om den mekanisme, som ligger til grund for funktionen af elektroderne ifølge opfindelsen ikke forstås fuldt ud, kan visse konklusioner drages på grundlag af de opnåede resultater. Det er således kendt, at tilstedeværelsen af aktive overfladegrupper på carbon egner 10 sig til tværbindingsreaktioner, som kræves til immobilisering af enzymer, og antallet og varieteten af sådanne overfladegrupper øges muligvis, når platin (eller et andet piatingruppemetal såsom palladium) forefindes som en tyndtlagsoverfladekatalysator (Kinoshita og Stonehart, (1977), Modern Aspects of Electrochemistry, nr. 12, Ed. Bockris og Con-15 way, Plenum Press, New York, 183-266). Det er klart, at der kan optræde forskelle i enzymbinding ved forskellige immobil i seringsmetoder. (For eksempel anvender mange af de rapporterede skemaer forskellige aminosy-rerester til enzymtilknytning, mens enzymer bundet med cyanurchloridak-tiverede materialer udelukkende gør dette via deres lysinrester; se 20 Ianiello og Yacynych, (1981) Analyt. Chem. 53, 2090-2095). Variationer i de tertiære strukturer af enzymer fremstillet ved immobilisering vil ikke forventes at være identiske for alle immobiliseringsprocedurer, som kan stå for de store variationer i enzymaktivitet og stabilitet, som iagttages ved denne type arbejde.

25 Den ekstremt heterogene natur af det ifølge opfindelsen anvendte basiselektrodemateriale i modsætning til den lagdelte ikke-heterogene struktur i den type elektrode, der for eksempel er beskrevet i offentliggjort japansk patentansøgning nr. 56-163447, maksimerer sandsynligheden for at opnå en mangfoldighed af tværbindinger af forskellige typer 30 og orienteringer i en integreret tredimensionel struktur. I fravær af tværbindingsreagenser giver den også stærk overfladeadsorption. Porerne i den bundne carbonholdige matriks tillader enzymmolekylerne at nå "i og omkring" komponenter i matriksen, som frembyder et meget stort overfladeareal for enzymet og tillader konformationer, som er gunstige for 35 dens stabilitet og aktivitet. (Dette står i modsætning til bindingen på forholdsvis plane overflader såsom platin, "glasagtig” carbon eller grafit med meget mindre overfladeareal, som lægger begrænsninger på konfor- DK 173722 B1 25 mationen som vist ved tidligere arbejde i litteraturen). Endvidere indikerer de ekstremt hurtige reaktionstider for elektroderne ifølge opfindelsen (1 til 2 sekunder) en ekstremt hurtig overførsel af elektroner til elektroden, som ikke kun kræver høj enzymaktivitet, men hjælpes af 5 en tilstrækkelighed af elektronreceptorpositioner på selve elektroden.

Disse tilvejebringes ved den høje densitet af fine piatiniserede car-bongranuler fordelt over et meget stort areal i mikrostrukturen, som maksimerer sandsynligheden for adgang af overfladepiatinvækst til aktive positioner på enzymet.

10 For at vise anvendeligheden af andre harpikser som bindemidler i enzymelektroder ifølge opfindelsen og af andre platingruppemetaller, er der konstrueret glucoseoxidaseelektroder under anvendelse af polyvinyl-acetat som bindemiddel og palladium som platingruppemetal.

I førstnævnte tilfælde konstrueredes en glucoseoxidaseelektrode ved 15 immobilisering af glucoseoxidase ved den tidligere beskrevne metode A på overfladen af en platiniseret carbonpapirelektrode konstrueret i det væsentlige som tidligere beskrevet (eksempel 2), men under anvendelse af 50 vægt% polyvinyl acetat som bindemiddel i stedet for polytetrafluor-ethylen.

20 Ved testning under anvendelse af samme modificerede Rank-elektrode-system ved 325 mV opnåedes der en i det væsentlige lineær reaktion som vist i fig. 13.

I sidstnævnte tilfælde konstrueredes en glucoseoxidaseelektrode ved immobilisering af glucoseoxidase ved den tidligere beskrevne metode A på 25 overfladen af en palladiseret carbonpapirelektrode fremstillet ved aflejring af kolloidalt palladium på overfladen af et carbonpulver (nominel partikelstørrelse 30 nm: Vulcan XC-72) og efterfølgende binding af det palladi serede carbonpulver som et tyndt lag (0,1 mm) på overfladen af et elektrisk ledende carbonpapir under anvendelse af 50 vægt%, base-30 ret på vægten af det palladiserede carbonpulver, polytetrafluorethylen som bindemiddel.

En skive med en diameter på 2 mm udskåret af det behandlede palladiserede carbonpapir monteredes på platinkontakten i den i fig. 15 beskrevne 2-elektrodecelle og testedes for reaktion på glucose ved 325 mV.

35 Resultaterne anføres i fig. 14 og viser igen en i det væsentlige liniær reaktion udtrykt ved strømtæthed over for glucosekoncentration.

I betragtning af den udtrykte ækvivalens af Pt, Pd, Ru og Rh og DK 173722 B1 26 andre platingruppemetaller i gasdiffusionselektroder, som beskrives i US-A-4.293.396 og andetsteds, må det forventes, at andre piatingruppe-metaller, for eksempel ruthenium og rhodium, vil være virksomme som alternativ til platin og palladium i enzymelektroderne ifølge opfindelsen.

5

Claims (16)

1. Enzymelektrode, der er i stand til at reagere amperometrisk på > den katalytiske aktivitet af enzymet i nærvær af dets respektive sub-5 strat, og omfattende enzymet immobiliseret eller adsorberet på overfladen af et elektrisk ledende understøtningsorgan bestående af eller omfattende et platiniseret porøst lag af harpiksbundne carbon- eller gra-fitparti kl er, KENDETEGNET ved, AT det porøse lag af harpiksbundne carbon- eller grafi tpart i kier omfatter partikler af findelt platingruppeme-10 tal intimt sammenblandet med eller aflejret på eller adsorberet til overfladen af carbon- eller grafitpartiklerne for derved som det elektrisk ledende understøtningsorgan at tilvejebringe et i det væsentlige heterogent lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler med pla-tingruppemetallet fordelt i det væsentlige ensartet over laget. 15

2. Enzymelektrode ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT platingrup-pemetallet er platin eller palladium.

3. Enzymelektrode ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT det 20 syntetiske harpiksbindemiddel er en fluorcarbonharpiks eller polyvinyl- acetat.

4. Enzymelektrode ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, AT det syntetiske harpiksbindemiddel er polytetrafluorethylen. 25

5. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, KENDETEGNET ved, AT det på overfladen af substratet immobil i serede eller adsorberede enzym er en oxidoreduktase.

6. Enzymelektrode ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, AT oxidoreduk- tasen er glucoseoxidase.

7. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, KENDETEGNET ved, AT det elektrisk ledende understøtningsorgan omfatter 35 en elektrisk ledende basis, hvortil der som et overfladelag er bundet de harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler sammenblandet med det findelte platingruppemetal eller med det findelte platingruppemetal adsor- DK 173722 B1 28 beret til eller aflejret på overfladen deraf.

8. Enzymelektrode ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, AT det elektrisk ledende understøtningsorgan er et elektrisk ledende carbonpapir. 5

9. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, KENDETEGNET ved, AT det porøse lag omfatter harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler med platingruppemetallet aflejret på eller adsorberet til overfladen af de individuelle partikler forud for sammenbinding med 10 harpiksen.

10. Enzymelektrode ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, AT det porøse lag omfatter et harpiksbundet platiniseret carbonpulver, hvilket pulver har en partikelstørrelse i intervallet 5 til 30 nm og på overfladen der- 15 af har adsorberet kolloidal platin med en parti kel større!se i intervallet 1,5 til 2,5 nm.

11. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, KENDETEGNET ved, AT dens overflade er beskyttet med en mi kroporøs mem- 20 bran, som er permeabel for substratet.

12. Enzymelektrode ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, AT membranen er en polycarbonatmembran. 25

13. Føler omfattende en enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12.

14. Amperometrisk fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af en analyt i en prøve, hvilken analyt selv er eller kan omdannes til et en- 30 zymsubstrat, som er i stand til at reagere katalytisk med enzymet til frembringelse af en målelig strøm, ved hvilken man om nødvendigt efter omdannelse af analytten til den reaktive enzymsubstrattype bringer prøven i kontakt med en enzymelektrode omfattende et immobil i seret enzym eller en blanding af enzymer, som kan reagere med substratet til frem- 35 bringelse af nævnte strøm og måler den frembragte strøm, KENDETEGNET ved, AT enzymelektroden er en enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12. DK 173722 B1 29

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, KENDETEGNET ved, AT prøven er en klinisk prøve.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, AT prøven er en blodprøve, AT analytten er glucose, og AT enzymet er glucoseoxidase.