NO176920B - Enzymelektrode - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler enzym-elektroder som er istand til å reagere amperometrisk på den katalyserende aktivitet av et enzym i nærvær av dets respektive substrat, og omfattende et oksido-reduktase-enzym immobilisert eller adsorbert på overflaten av et elektrisk ledende støtte-materiale bestående av eller omfattende et platinisert lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler. Spesielt, men ikke eksklusivt, omhandler oppfinnelsen enzymelektroder som kan bli brukt for å påvise glukosenivået, og som omfatter et elektrisk ledende støttemateriale hvorpå det er immobilisert en oksidoreduktase, f .eks. en glukoseoksydase, hvor elektroden reagerer amperometrisk på den katalytiske aktivitet av det immobiliserte enzym når den introduseres i en glukoseinneholdende prøve.

Fordelene ved amperometriske biosensorer som innbefatter et enzym som biokatalysator, er blitt omtalt i detalj av Aston og Turner, (1984) Biotech, Genet. Eng. Rev. (ed. G.Russe-ll) / 1/ 89-120, Intercept, Newcastle-upon-Tyne, og av Davis G., (1985) Biosensors, 1, 161-178. De er forskjellige ved signaltransduksjons-måten, og forskjellige måter kan løst klassifiseres som (a) de hvor den elektriske impuls oppstår fra oksydering av et produkt av enzymreaksjonen ved en elektrode; (b) "mediatorhjulpet" hvori elektroner transpor-teres fra enzymet til elektroden ved hjelp av en oksydasjon-reduksjon ("redoks") reagens, eller (c) "direkte elektronoverføring" (DET), hvor ingen slik hjelpeoverføring er nødvendig.

Kategori ( a )

Denne kategori kan illustreres under referanse til virkningen av visse oksydaser (f.eks. glukoseoksydase, alkohol-oksydase) hvilke enzymer danner hydrogenperoksyd i henhold til reaksjonen:

I denne metoden oksyderes peroksydet ved en elektrode anbrakt ved et fast potensiale:

Et elektrisk signal dannes etter overføringen av elektroner fra peroksydet til elektroden, og under passende betingelser er den enzymkatalyserte strøm proposjonal til analytt-konsentrasj onen.

Mange anordninger for bestemmelse av glukose har blitt beskrevet, men de fleste av dem har begrensninger med hensyn til reproduserbarheten og reaksjonshastigheten og området av den tilgjengelige glukosekonsentrasjon. Enkelte av de moderat fremgangsrike kommersielle metoder avhenger av anvendelsen av peroksyd som skissert ovenfor, hvor glukose er substratet og det oksyderte produkt er glukono-1,5-lakton. Andre metoder avhenger av sekundære reaksjoner av peroksyd (f.eks. kolorimetrisk assay) eller en fysio-kjemisk måling, såsom konduktans. Imidlertid er disse generelt langsomme i reaksjon og har den ulempe at de er relativt følsomme overfor oksygenspenningen i prøvene, som kan variere vesentlig; ved lave oksygenspenninger kan den øvre grense for linearitet av strømreaksjon være lavere enn ønsket for enkle, nøyaktige forsøk. Lignende betraktninger gjelder indirekte assaymetoder for substrater forskjellige fra glukose.

Kategori ( b) - Mediatorhiulpede biosensorer

I disse anordninger holdes enzymet i en redusert ("elek-tronrik") tilstand som et resultat av dets reaksjon med substratet som er analytten hvis konsentrasjon skal måles. Et krav for en virksom sensor er dannelseen av elektrisk kobling mellom kilden for elektroner (et eller annet elektronrikt "aktivt sete" inne i enzymet) og elektroden selv. Siden aktive seter imidlertid har en tendens til å ligge i kløfter eller folder inne i den makromolekylære enzymstruktur, er tilgang til disse fullstendig eller delvis blokkert, og det er følgelig et problem å etablere en elektrisk forbindelse som er tilstrekkelig effektiv for pålitelig og følsom signaltransduksjon. Overføring av elektroner mellom enzym og elektrode kan imidlertid lettes ved innbefattelse av en elektronbærer eller "overfører" som i oksydert form tar opp elektroner fra enzymet og så i redusert form transporterer dem tilbake til elektroden, hvor den blir reoksydert.

Anvendelsen av overførere kan illustreres ved nylig be-skrevne biosensorer som bruker glukoseoksydase immobilisert på en karbonelektrode. En form anvender kovalent bundet enzym immobilisert ved cyanogenklorid-metoden (Johnson and Gorton, 1985, Biosensors, 1, 355-369) som, hevdes det, gir god stabilitet (flere måneder). Imidlertid har sensoren alvorlige ulemper ved at den brukte overfører, N-metyl-fenaziniumion (fenazin metosulfat), er ustabil og blir også lett vasket ut og krever daglig erstatning ved bruk. Elektroden er også sensitiv overfor oksygenkonsentrasjon, selvom det ble vist at den elektrokjemiske trans-duksjon via overføreren konkurrerer godt med oksygenreduk-sjonsreaksjonen. En annen biosensor som også innbefatter immobilisert glukseoksydase bruker ferrocen eller en av dets derivater som overfører: Cass et el., (1984) Analyt. Chem. 56, 667-673 og EP-A-0 078 636. Overføringen av elektroner til elektroden via overføreren forløper som følger:

Mekanistiske detaljer ved virkningen av denne elektrode er ikke klare: spesielt er ikke forklart hvordan den meget uløselige reduserte form av ferrocen bærer ladning til elektroden for å opprettholde cyklisk overfører-aktivitet (selv om denne innvending ikke behøver å gjelde for ioniske ferrocen-derivater) . Dessuten er dets respons relativt sen i betraktning av den potensielt meget raske respons som kunne ha blitt ventet ut fra de kjente hastighetene for de involverte enzymatiske reaksjoner, og elektroden har en begrenset levetid grunnet den begrensede stabilitet av enzymet.

Bruken av en overfører i signaltransduksjon har flere med-følgende ulemper: muligheten for at den lekker ut fra området som inneholder biokatalysatoren, begrensninger vedrørende diffusjonen av oksyderte/reduserte former og iboende instabilitet av overføreren i seg selv.

Kategori ( c) - Direkte elektronoverføring ( DET) biosensorer

Muligheten for å konstruere en biosensor uten å innbefatte en overfører har blitt antydet i en ny oversikt over bio-elektrokatalyse: Tarasevich, (1985) Bioelectrochemistry 10, 231-295. Slike anordninger kan refereres til som "reagens-løse" eller "overførerløse". Eksempler på overførerløse enzymelektroder er angitt i Tarasevich's oversikt, men de omfatter ledende organiske polymerer, f.eks. inneholdende strukturelle enheter lignende de til metyl-viologen og/eller ledende organiske salter såsom NMP+TCNQ-(N-metyl-fenazinium-tetracyåno-4-quinodimetan), som modifiserer egenskapene til elektroden og utfører rollen som overfø-rere. Mange av metodene ved elektrontransduksjon fra redoks-proteiner via modifiserte elektroder faller også innenfor denne kategori.

Den iboende instabilitet av mange ledende organiske poly-mere og salter bemerkes. Således har aktiviteten til den NMP/TCNQ-modifiserte elektrode som blir brukt i en alkohol-biosensor en halveringstid på ca. 15 dager. Slike elektroder er også oksygensensitive.

I henhold til de publiserte beviser synes det som om få rene overførerfri enzymelektroder har blitt laget hittil, selv om mange mislykkede forsøk har blitt foretatt, hvor de fleste bruker karbonbaserte elektroder. Nyere litteratur angående bruken av glukoseoksydase (Johnson og Gordon loe.eit.) antyder at hovedproblemet ligger i immobiliseringen av et enzym, noe som har en tendens til å hemme dens elektronoverføringsegenskaper på grunn av steriske eller andre begrensninger og nødvendiggjør således inklusjonen av en overfører.

Det finnes enkelte sjeldne eksempler på meget aktive oksydaser immobilisert på karbon eller platina. For eksempel beskriver Ianiello et al. (1982) Analyt. Chem. 54, 1098-1101, overførerfri sensorer hvori glukose-oksydase og L-aminosyre-oksydase er kovalent bundet til en grafittelek-trode ved cyanogenklorid-metoden. Imidlertid har enzymelektrodene en begrenset levetid på 20 til 30 dager: Ianiello og Yacynych. (1981) Analyt.Chem. 53, 2090-2095. Ingen informasjon angående oksygenfølsomheten for elektrodene er angitt.

Flere biosensorer som opererer i henhold til de ovenfor angitte prinsipper, spesielt glukosesensorer, har blitt beskrevet i tidligere teknikk, og et representativt utvalg har allerede blitt omtalt, men for foreliggende formål må en beskrivelse betraktes som spesielt relevant, dvs. Matsu-shita Electric Appliance Industry Company, japansk ikke-gransket patentpublikasjon nr. 56-163447. Denne beskriver en indirekte glukoseelektrode, dvs. hvori hydrogenperoksyd dannet ved oksydasjonene av glukose i nærvær av glukose-oksydase: oksyderes ved overflaten av en platinaelektrode

for å danne en oksydasjonsstrøm som er proporsjonal med substrat(glukose)konsentrasjonen til prøven. Elektroden omfatter en elektrisk ledende karbonbase som støtter et lag av immobilisert enzym, f.eks. en immobilisert glukose-oksydase. Den elektrisk ledende base i seg selv er av støpt grafitt inneholdende opptil 10 vektdeler av et fluorkarbonresin som bindemiddel og hvorpå det er anbragt f.eks. elektrolytisk eller ved dampavleiring, et tynt (mindre enn 1 jim) lag av platina. Oppfinnelsen, hevdes det, unngår problemene i forbindelse med immobiliseringen av enzymet direkte på platinaoverflaten og danner en enzym-elektrode som det hevdes er karakterisert ved rask reaksjonstid (5 sekunder), høy følsomhet og varighet. Imidlertid har nylig eksperimentelt arbeide med slike elektroder ikke bekreftet slike fordeler.

Følgelig eksisterer det fremdeles et beholv for en enzymelektrode, spesielt, men ikke eksklusivt, for bruk i glukosebiosensorer, som er pålitelig og reproduserbar og som viser en rask reaksjon og høy følgsomhet og som har god langtidsstabilitet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse, hvis særtrekk er angitt i krav l's karakteriserende del, blir et nytt karbonsubstrat brukt for en enzymelektrode som tillater enzymet, f.eks. glukoseoksydase, å bli festet til elektroden på en mer fordelaktig måte, noe som tillater konstruk-sjonen av en amperometersensor med sterkt forbedret reaksjon og stabilitet. Denne forbedrede enzymelektrode krever ikke bruk av et overf ør ingsreagens, (selv om et slikt kan tilsettes om ønsket) og er funnet å virke i nærvær av meget lave nivåer av oppløst oksygen. Den gir sterk reaksjon, dvs. strømtetthet på flere hundre mikroampere pr. kvadrat-centimenter (tilgjengelig elektrodeoverflate) i en 10 mM glukoseoppløsning, og dette er antatt å være meget større enn noen tidligere amperometrisk enzymbiosensor og kan bli brukt fordelaktig ved fremstilling av mikroprøve-biosensorer på mindre enn 1 mm<2> elektrodeområde, som danner 0 til 100 nanoampere. Elektroden kan også konstrueres ved å bruke meget små mengder immobilisert enzym. Den reagerer på glukose meget raskere enn enhver kjent glukosesensor, typisk 1 til 2 sekunder i fravær av en beskyttende membran, og 10 til 30 sekunder med en membran. Den har bemerkelsesverdig stabilitet når den lagres vått, selv ved romtemperatur. Elektroder viser god respons, selv etter mange måneder. De har et utvidet arbeidsområde, krever et vesentlig lavere arbeidspotensial enn normalt (325 mV mot det mer vanlige 650 mV) og oppviser bemerkelsesverdig lav bakgrunn ved arbeidspotensialet.

Basis for foreliggende oppfinnelse er en enzymelektrode eller biosensor som omfatter et enzym immobilisert på overflaten av et elektrisk ledende bæremateriale, som består av eller omfatter et porøst lag av resin-bundne karbon- eller grafittpartikler, hvor nevnte partikler har nært blandet med seg eller anbrakt eller adsorbert på overflaten av de enkelte partikler før binding for å danne nevnte lag, et findelt platinagruppe-metall, for derved å danne et porøst substratlag hvorpå nevnte enzym adsorberes eller immobili-seres og som omfatter et i hovedsak heterogent lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler med nevnte platinagruppe-metall dispergert, i hovedsak uniformt, gjennom nevnte lag. Således, i spesiell kontrast til det lagdelte, ikke-heterogene platiniserte karbonstøttemateriale beskrevet i japansk publisert søknad nr. 56-163447, består av eller omfatter elektroden i henhold til foreliggende oppfinnelse av et i hovedsak heterogent lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler med nevnte platinagruppe-metall dispergert i hovedsak uniformt gjennom dette lag. Foretrukket blir det resin-bundne karbonpulverlag dannet ved å resinbinde karbonpulverpartikler hvorpå kollodialt platina eller palladium har blitt anbragt eller adsorbert før støping for å danne substratet. Foretrukne resinbin-demidler brukt i støping av de platiniserte karbonpartikler for å danne elektrodesubstratet brukt i foreliggende oppfinnelse, er fluorkarbonresiner, spesielt polytetrafluoretylen.

Under referanse til dannelsen av enzymelektroden ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter den foretrukne elektrode som antydet, en elektrisk ledende base bestående av eller omfattende et lag av resinbundet karbonpulver, inneholdende et platinagruppe-metall, f.eks. platina eller palladium adsorbert på overflaten av de forpulvrede partikler før binding.

Som karbonpulver kan brukes ethvert passende karbon- eller grafittpulver som lett tillater den påfølgende immobilisering av enzymet, og for dette formål bør karbonpulver brukes som har en høy tetthet av funksjonelle grupper, såsom karboksylat-, amino- og svovelinneholdende grupper, på overflaten, i motsetning til de mer vitrøse og glass-aktige karbonmaterialer som binder enzymer meget dårlig. Partikkelstørrelse kan ligge i området fra 3-50 nm, mer vanlig 5-3 0 nm.

Platina (eller palladium) kan anbringes på karbonpartiklene på enhver passende måte, f .eks. dampf aseavleiring, elektrokjemisk avleiring eller enkel adsobsjon fra kollodial suspensjon (som er foretrukket) for å gi platinagruppe-metallmengder på fra 1 til 20 vekt%, basert på vekten av karbon, fortrinnsvis fra 5 til 15%. Disse begrensinger er imidlertid mer praktiske enn kritiske. Under ca. 1% platinagruppe-metall faller utgangssignalet til et nivå som i praksis er for lavt til å måles, bortsett fra med meget følsom apparatur. Over ca. 20% blir tilføringen av platina-gruppe-metall uøkonomisk med liten ytterligere gevinst i betraktning av reaksjonstid, følsomhet osv. Faktisk begynner følsomheten å falle ved meget høye metallavleir-inger. I den foretrukne teknikk blir karbonpulveret platinisert eller palladisert ved oksydativ rekomponering av en platina- eller palladiumforbindelse, såsom klorpla-tinasyre eller enda mer foretrukket, et kompleks av platina eller palladium med en oksyderbar ligand i nærvær av karbonpulveret, for derved å avleire kollodialstørrelse platina eller palladium direkte på overflaten av karbonpartiklene på den måten som f.eks. er angitt i GB patent 1.347.494, US patent 4.044.193 og US patent 4.166.143.

Etter platinisering eller palladisering blir det platiniserte eller palladiserte karbonpulver støpt ved å bruke et passende vannavstøtende bindingsharpiks, fortrinnsvis et fluorkarbonharpiks, såsom polytetrafluoretylen, for å danne enten en fullstendig selvstøttende porøs støpt struktur omfattende i hovedsak nevnte resin-bundne platiniserte eller palladiserte karbonpulverpartikler eller, mer vanlig, et porøst støpt overflatelag av slike resinbundne partikler, bundet til et elektrisk ledende substrat, f.eks. av metall, karbon eller grafitt. Et spesielt foretrukket substratmateriale for det støpte resin-bundne platiniserte karbonlag er karbonpapir, som angitt i US patent 4.229.490 eller en åpenporet karbonduk eller -bane, som angitt i US patent 4.293.396. For å oppnå maksimal porøsitet bør mengden resin som brukes som bindemiddel være det nødvendi-ge minimum for å fremskaffe mekanisk integritet og stabilitet til elektrodelaget hvor slike lag vanligvis har en tykkelse som ikke er større énn ca. 0,1 - 0,5 mm, selv om større tykkelse kan bli brukt. Avhengig av kravene for strukturell integritet, mekanisk styrke og porøsitet, er mengdene av bindingsharpiks ikke kritisk og kan være fra så lite som 5-10 vekt% basert på mengden av platinisert eller pallidisert karbonpulver opp til så meget som 80%, men hvor mengden vanligvis ligger i området 30 - 70 vekt%. Et antall resiner kan bli brukt, innbefattende harpikser som er ledende eller semi-ledende, men foretrukket er syntetiske fluorkarbonharpikser, spesielt polytetrafluoretylen. I betraktning av det lille, men essensielle krav for oksygen i oksydasjonsprosessen, er det vesentlig at bindemidlet er permeabelt for oksygen. For dette formål bør bindemidlet ha en minimum oppløsningsgrad overfor oksygen ved atmosfærisk trykk på minst 2 x IO<3> cm3 02 (målt ved standard temperatur og trykk) pr. m<3> polymer.

Passende bindemidler og deres kjente oksygenoppløsnings-grader tatt fra The Polymer Handbook (Ed. J.Brandrup og E.H. Immergut) Ist Ed. (1967), Interscience, innbefatter:

De foretrukne enzym-elektrode-substrater brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse er faktisk kommersielt tilgjengelige materialer solgt under varemerket Prototech av Prototech Company of Newton Highlands, Massachusetts, og tidligere brukt som elektrokatalytiske gassdiffusjonselektroder i brennceller. Fremstillingen av slike materialer er beskrevet i detalj i US patent 4.044.193, US patent 4.166.143, US patent 4.293.396 og US patent 4.478.696, til hvilke referanse bør foretas for utfyllende detaljer. Grovt sett blir imidlertid kollodialt platina med en par-tikkelstørrelse i området 15 - 25 Ångstrom (1,5 - 2,5 nm) adsorbert på overflaten av forpulvret karbon (partikkel-størrelse 50 - 300 Ångstrom; 5-30 nm), f.eks. ved dannel-se av en platinasol in situ i nærvær av forpulvret karbon, som virker som et kjernedannende middel for solen. De platiniserte karbonpartikler blir så støpt på en elektrisk ledende støttestruktur, f.eks. et ark av karbonpapir, ved å bruke et syntetisk harpiksbindemiddel, fortrinnsvis en fluorinert hydrokarbonharpiks, og spesielt polytetrafluoretylen.

Alternativt, beskrevet i US patent 4.293.396, blir de platiniserte karbonpartikler impregnert i et på forhånd dannet porøst karbonklede og bundet deri ved å bruke fluor-karbonharpiksen, fortrinnsvis polytetrafluoretylen. Det er imidlertid underforsått at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til bruken av Prototech-materialene, men omfatter andre lignede substratmaterialer omfattende resinbundne og støpte, platinisete eller palladiserte karbonpulvere. Spesielt er det påtenkt at det også kan bli brukt materialer av typen beskrevet som brenselcelle-elektroder i US patent 4.229.490, dvs. karbonpapirelektroder av typen bestående av et karbonpapirstøttemateriale, fortrinnsvis impregnert med vannavstøtende harpiks, såsom polytetrafluoretylen, og hvorpå det er anbragt, f.eks. ved skjerm-trykking ("screen printing") , et resinbundet katalysatorlag omfattende en uniform blanding av platinasort og karbon eller grafittpartikler bundet med et vannavstøtende resin, igjen fortrinnsvis polytetrafluoretylen.

Immobiliseringen av enzymet på overflaten av det resin-bundne platiniserte eller palladiserte karbonsubstrat kan utføres ved å bruke et antall veletablerte immobiliserings-teknikker, f .eks. kovalent binding med et karbodiimid eller en karbonyldiimidazolreagens som kovalent bindes med 1,6-dinitro-3,4-difuorbenzen (DFDNB), eller kryssbinding med glutaraldehyd.

Typiske eksempelmessige fremgangsmåter for immobiliseringen av enzymet, glukoseoksydase, er som følger:

Andre typer koplingsmidler kan brukes for immobiliserings-prosessen, innbefattende bifunksjonelle midler av variabel kjedelengde, f.eks. diimidater såsom dimetylmalonimidat eller dimetylsuberimidat.

Alternativt har det blitt funnet at enkel adsorpsjon av enzymet på den resinbundne platiniserte eller palladiserte karbonpulverstøtte, dvs. uten kryssbinding, er effektiv med enkelte enzymer og spesielt med glukose-oksydase.

Vanligvis, men ikke nødvendigvis, vil ikke overflatelaget av immobilisert enzym være fysisk beskyttet ved påføringen av en passende porøs, f.eks. polykarbonatfilm eller membran som selvfølgelig må være permeabel for enzymsubstratet (glukosen) som skal bestemmes. Slike membraner er noe ufor-delaktige ved at de øker sensorens reaksjonstid, men ikke desto mindre er foreliggende sensorer selv med en slik membran i stand til reaksjonstider som kan sammenlignes med og i mange tilfeller er vesentlig bedre enn vanlige enzym-elektroder.

Som allerede antydet, omhandler oppfinnelsen spesielt glukose-okydaseelektroder, dvs. hvor det immobiliserte enzym er en glukose-oksydase, men det vil være tydelig at andre oksidoreduktaser kan bli brukt, selv om ikke alltid med tilsvarende effekt. Dette er ikke nødvendigvis på grunn av noen iboende ineffektivitet hos enzymet, men grunnet andre faktorer. F.eks. ved bestemmelse av oksal-syre ved å bruke oksalat-okydase undergår oksalsyresub-stratet i seg selv elektrokjemisk oksydasjon ved base-elektroden, for således i stor grad å maskere enhver effekt av enzymet. Imidlertid innbefatter andre passende oksidoreduktaser laktatoksydase, galaktoseoksydase, kolesterol-oksydase og andre peroksyddannende enzymer, såvel som kombinasjoner av immobiliserte enzymer innbefattende kombinasjoner av en ikkeoksydase og en oksydase hvor førstnevnte virker på et substrat av interesse for å danne et oksyderbart substrat for oksydasen, og sistnevnte virker på det oksyderbare produkt for å danne en målbar strøm som er proposjonal til konsentrasjonen av substratet av interesse. En slik kombinasjon er kombinasjonen av beta-galaktosidase og glukose oksydase (for kvantitativ bestemmelse av laktose) eller kombinasjonen av beta-glukan depolymeriserende enzym, beta-glukosidase og glukose oksydase (for bestemmel-sen av beta-glukaner).

Andre typer sensorutnyttelse innbefatter bruken av enzymbaserte eller ikke enzymbaserte reagenser eller prosesser som innvirker med et primært substrat av interesse i en precursor-reaksjon hvor det resulterende produkt innbefatter et stoff som i sin tur virker som et substrat for en enzymelektrode i henhold til foreliggende oppfinnelse. Mange eksempler på slike precursortrinn finnes på området immunokjemiske reaksjoner og metoder for å bruke slike reaksjoner ved dannelsen av sensorer innbefattende immuno-sensorer, som bruker enzymelektroden i henhold til foreliggende oppfinnelse, og vil være nærliggende for fagmannen.

Imidlertid vil den primære bruk at elektrodene i henhold til foreliggende oppfinnelse være som biosensorer for påvisning og/eller kvantitativ måling av et oksyderbart substrat, spesielt glukose, i en prøve, spesielt en klinisk prøve såsom blod, serum, plasma, urin, svette tårer og spytt.

Andre mulige ikke-kliniske anvendelsesområder innbefatter:

a) fermenteringsovervåkning,

b) industriell prosesskontroll,

c) miljømessig overvåkning, f.eks. utslipp og foru-rensningskontroll av væsker og gasser,

d) matvareundersøkelse

e) veterinære bruksområder, spesielt bruksområder nærliggende de kliniske anvendelsesområder antydet ovenfor.

I og med at bio- og andre sensorer innbefattende et enzym-elektrode-materiale i henhold til foreliggende oppfinnelse kan omfatte andre strukturelle elementer, elektriske føringer, elektrisk ikke-ledende (isolerende) støttemate-riale eller sonder osv., er slike elementer i fremstillingen vanlige og behøver ikke å beskrives i detalj. La det være tilstrekkelig å si at når elektrodematerialet, som vanligvis vil være tilfelle, er et papirtynt ark eller strimmel, vil biosensoren vanligvis innbefatte en isolerende støttedel eller sonde hvorpå elektrodematerialet er montert, og ved hjelp av hvilket elektrodematerialet kan innføres i prøven. I slike tilfeller kan den faktiske størrelse av delen som utgjør elektrodematerialet være ganske liten, ikke mer enn et par mm<2> eller mindre. Elektrisk kontakt med elektrodematerialet kan foretas på mange måter, f.eks. ved å montere elektrodematerialet i flate mot flate-kontakt med en elektrisk ledende kontakt eller terminal, f.eks. av platina, sølv eller annen passende leder. Hvor elektrodematrialet er av passende størrelse og styrke for å være fullstendig selvstøttende, kan isolerende støtter eller bærere for elektrodematerialet fjernes, og elektriske ledninger tilkobles direkte til overflaten av elektrodematerialet. Støttedeler andre enn karbonpapir kan bli brukt, såsom en elektrisk semiledende overflate, f.eks. overflaten av en felt-effekt-transistor (FET), eller en elektrisk ikke-ledende overflate. I sistnevnte tilfelle kan elektrisk kontakt fremskaffes direkte til det platinagruppe-metall resinbundne karbon- eller grafittlag.

Fremstillingen av enzym-elektrodematerialer i henhold til foreliggende oppfinnelse og deres egenskaper er illustrert ved de følgende eksempler.

Eksempel 1 (Sammenlignende) (Tidligere teknikk)

En enzymelektrode i henhold til tidligere teknikk ble fremstilt ved elektrolytisk avleiring av et tynt lag (mindre enn 1 |im) platina på overflaten av en elektrisk ledende base bestående av et porøst resinbundet karbonpapir omfattende ledende karbonsort-granuler (Vulcan XC-72) med en nominell partikkelstørrelse på 30 nm og støpt på et ark av kommersielt tilgjengelig grafittert karbonapapir og med 10 vekt% polytetrafluoretylen som bindemiddel.

Glukose-oksydase fra As<p>eraillus niger ble immoblilisert på overflaten av forskjellige prøver av det platiniserte karbonpapir ved karbodiimidbehandling tidligere beskrevet og ved kryssbinding med glutaraldehyd ved behandling av platinisert overflate av elektroden med vandig glukose-oksydaseoppløsning, tørking og påfølgende kryssbinding av det avleirede enzym ved eksponering til glutaraldehyd ved 15°C.

For påfølgende undersøkelse av elektrodematerialet ble det deretter skåret i skiver med 2 mm i diameter.

Eksempel 2. Glukoseelektrode

Glukose-oksydase fra Aspergillus niger ble immobilisert på platinisert karbonpapir solgt under varemerket "Prototech" fra Prototech Co., Massachusetts, U.S.A. og bestående av platinisert-karbonpulver-partikler (Vulcan XC-72) fremstilt i henhold til eksempel 1 fra US patent 4.044.193 ved avleiring av kollodialt platina (partikkelstørrelse 1,5 - 2,5 nm) på overflaten av karbonpulveret (nominell partikkel-størrelse 30 nm) ved oksydativ nedbrytning av kompleks platina-sulfittsyre (II) ved å bruke H202, og etterfølgende støping og binding av det platiniserte karbonpulver på overflaten av et kommersielt grafittisert karbonpapir ved å bruke ca. 50 vekt% polytetrafluoretylen. Platinamengden av det endelige produkt er 0,24 mg/cm<2>.

Glukoseoksydase ble immobilisert på forskjellige prøver av Prototech-materialet ved behandlingene beskrevet tidligere, dvs. ved behandling med karbodiimid, ved karbonyldiimida-zol-behandling og ved DFDNB-behandling.

I separate forsøk ble glukose-oksydase immobilisert på Pro-totechmaterialet ved kryssbinding med glutaraldehyd og ved enkel adsorbsjon, dvs. uten kryssbinding, ved suspendering av Prototech-materialet i ferskt fremstilt glukoseoksydase-oppløsning (5,0 mg/ml) i pH 5,6 acetatbuffer i 90 minutter ved romtemperatur. Alternativt kan adsorbsjon av enzymene passende utføres ved en elektroforeseprosess, for hvilket formål elektrodebasematerialet suspenderes ved en positiv spenning i enzymoppløsningen i 60 minutter.

Eksempel 3

Ved å bruke karbodiimid-behandlingen tidligere beskrevet, ble de følgende enzymer immobilisert på platinisert karbonpapir fra Prototech, dvs. et PTFE-bundet karbonpapir dannet fra pre-platinisert karbonpulver (US pat. 4.044.193):

laktat oksydase

galaktose oksydase

glukose oksydase/beta-galaktosidase.

For ytterligere å illustrere fordelene ved oppfinnelsen og egenskapene til enzym-elektrodematerialene ifølge foreliggende oppfinnelse sammenlignet med elektroder ifølge tidligere teknikk, ble enzym-elektrodematerialene fremstilt i de tidligere eksempler testet for amperometrisk reaksjon i en celle omfattende et modifisert Rank oksygen-elektrodesystem (Rank brothers, Bottisham, Cambridge) vist i de medfølgende tegninger og også i Analytica Chimica Acta, 183, (1986), 59-66. I dette system erstattes membranen med en karbonpapir-enzymelektrode (5 mm i diam.) i henhold til foreliggende oppfinnelse som ble plassert på platina-knapp-elektroden. Motelektroden (platinafolie) ble satt inn gjennom celledekslet. Referansen var en sølv-sølvklorid-elektrode. I enkelte forsøk (med den beskyttende membran og urørte oppløsninger) ble en 2-elektrode konfigurasjon brukt, hvor mot/referanseelektroden var en omgivende kloridert sølvring. Vanligvis ble forsøksoppløsningene i pH 7,0 buffer omrørt magnetisk mens den arbeidende elektrode ble holdt ved et potensial på 660 mV med hensyn til referansen ved hjelp av en potensiostat. Når 2-elektrode-konfigurasjonen ble brukt, ble det anvendt et potensiale på 325 mV. Etter å tillate tilstrekkelig tid for bakgrunns-strømmen til å falle til et lavt nivå, ble substratoppløs-ningen injisert fra en sprøyte. Strømreaksjonen ble nedtegnet på en striper.

De erholdte resultater er omtalt i detalj nedenfor og er

illustrert grafisk i de medfølgende tegninger, hvor:

fig. 1 illustrerer reaksjonen av en glukose-oksydase elektrode i henhold til oppfinnelsen sammenlignet med glukoseoksydase immobilisert på andre typer karbonelektrode; fig. 2 er en første kurve som illustrerer stabiliteten av glukose-oksydase elektroden; fig. 3 er en andre kurve som illustrerer reaksjonen til glukose-oksydase elektroden i et område av konsentrasjoner; fig. 4 er en kurve som illustrerer reaksjonen av glukose-oksydase elektroden under betingelser med skiftende omliggende oksygenspenning; fig. 5 er en kurve som illustrerer lagringseffekten på glukose-oksydase elektroden ved romtemperatur; fig. 6 er en sammenlignende kurve som illustrerer lag-rings-effekten på elektroder ifølge tidligere teknikk ved romtemperatur; fig. 7 viser sammenligningen mellom reaksjonen mellom en glutaraldehyd immobilisert glukose-oksydase elektrode ifølge foreliggede oppfinnelse og en glutaraldehyd immobilisert glukose-oksydase elektrode ifølge tidligere teknikk; fig. 8 tilsvarer fig. 7, men ved å bruke karbodiimid-immobilisering; fig. 9 viser sammenligningen mellom reaksjonen av den karbodiimid-immobiliserte laktat-oksydase elektrode ifølge foreliggende oppfinnelse og en karbodiimid-immobilisert laktat-oksydase elektrode ifølge tidligere teknikk; figurene 10 og 11 viser henholdsvis responsprofil til galaktose-oksydase og laktatoksydase-elektroder ifølge foreliggende oppfinnelse, og fig. 12 viser responsprofilen til en kombinert glukose-oksydase/beta-galaktosidase elektrode i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fig. 13 viser responsprofilen til en glukose-oksydase-elektrode i henhold til oppfinnelsen som bruker polyvinylacetat som bindemiddel for det platiniserte karbonpulver i stedet for polytetrafluoretylen. Fig. 14 viser responsprofilen til en glukose-oksydase elektrode i henhold til foreliggende oppfinnelse hvor glukose-oksydasen er immobilisert på en karbonpapirelektrode omfattende et overflatelag av resinbundet (polytetrafluoretylen) palladisert karbonpulver,

fig. 15 viser den modifiserte Rank elektrokjemiske celle brukt ved bestemmelse av arbeidsbetingelsene for elektrodene i henhold til foreliggende oppfinnelse,

fig. 16 viser 2-elektrode-konfigurasjonen brukt for enkelte av målingene.

Ved først å referere til fig. 15, ble mange av dataene fremsatt heri erholdt ved å bruke en elektrokjemisk celle vist i fig. 15. Denne omfatter en todelt celle, en base (1) og en ringformet kappe (2) innesluttende et vannkammer (h) hvorigjennom vann kan sirkuleres for å kontrollere temperaturen til cellen, og hvor de to deler er forbundet ved hjelp av den festende gjengede krave (3) . Sentralt plassert i basen (1) er en platinakontakt (d) hvorpå er plassert forsøksskiven (a) av papirelektrodematerialet, omfattende det immobiliserte enzym, og som holdes på plass på platinakontakten ved hjelp av gummi 0-ringforseglinger (e) og (f) når de to deler av cellen er koblet sammen.

Innstukket i toppen av cellen, som selvfølgelig vil inne-holde enzymsubstratoppløsningen, er en kork (4) støttet med en justerbar krave (g) og i hvilken det er montert en platina-motelektrode (b) og en Ag/AgCl referanseelektrode (c) . Som angitt ble forsøk utført med den arbeidende elektrode justert til 600 mV, hvor strømuttaket ble målt fra en elektrode med et tilgjengelig overflateområde på 0,14 cm<2> eksponert til substratoppløsningen. Resultatene er uttrykt i figurene i form av strømtetthet, dvs. strøm-utførsel pr. enhetsoverflate av elektrode (a) eksponert til substratet.

Under referanse til fig. 16 er platinakontakten (B) omgitt av referanse/motelektroden (C) og er skilt fra denne med en isolerende krave (G) . En porøs polykarbonatmembran montert på en 0-ring er brukt for å holde forsøksskiven (E) (papir-elektrodemateriale omfattende det immobiliserte enzym) på platinakontakten. Et åpent prøvekammmer (F) gjør det mulig å plassere prøver dråpevis på membranen. Elektrodecellen polariseres ved 325 mV og strømmen overvåkes via en potensiostat (A) . Anvendelsen av en 2-elektrodekonsstellasjon anbrakt ved 325 mV har fordeler i forhold til den vanlige 3-elektrodecelle anbrakt ved 600 mV, nemlig letthet ved bruk av en lavere bakgrunnsstrøm. Imidlertid påvirker valget av ett system i forhold til det andre ikke virkning-trekkene vesentlig, såsom lagringsstabilitet, stabilitet ved bruk, linearitet ved respons eller oksygenavhengighet til elektrodene ifølge oppfinnelsen.

De erholdte resultater vil bli diskutert mer i detalj nedenfor.

Linearitet og tidsavhengighet til reaksjonene

I de medfølgende tegninger er det vist typiske eksempler på elektroderespons til suksessive tilsetninger av glukose som gir endelige konsentrasjoner i området 0-35 mM, ved å bruke en 3-elektrodecelle under omrørte betingelser. Alle 3 elektroder A, B og C hadde glukose-oksydase immobilisert derpå ved metode A. Elektrode A omfattet en aktivisert platinisert karbonstøtte i henhold til oppfinnelsen, dvs. et støpt ark av harpiks (polytetrafluoretylen)-bundet platinisert

karbonpapir solgt under varemerket Prototech; elektrode B omfattet en elektrisk ledende støtte skåret fra endel av en grafittstav; elektrode C omfatter en elektrisk ledende støtte skåret fra et kommersielt tilgjengelig ikkeplatini-sert karbonpapir. Som vist, ga elektrodene B og C mindre, relativt sene responser og minnet om resultater med medi-erte sensorer vanligvis presentert i litteraturen. Elektrode A ga mer pålitelige responser med en reaksjonstid på ca. 1 sekund. ("Spissen" i signalet observert ved toppen av den opprinnelige respons er delvis en uviktig artefakt som kommer fra injeksjonsmetoden; det glukoseavhengige platå er signalet av interesse). Alle tre elektroder ga en i hovedsak lineær respons med hensyn til glukosekonsentrasjonen (fig. 2, resultater vist kun for A, C) . Dette omfatter området krevet for direkte analyse av glukose i blodet

(0-30 mM). Lignende resultater erholdt med type A elekto-der som bruker immmobiliseringsprosedyre B ovenfor, antyder at denne metode gir enda bedre linearitet over et større område.

Som vist fig. 2 var responsen til elektrode A nesten uforandret etter 23 dager, men responsen til de andre ble nedbrutt med tiden (som vist for elektrode C). Denne opp-førsel ble også observert for andre metoder ved immobilisering beskrevet ovenfor, hvorav alle kunne bli brukt for å danne reagerende og stabile elektroder med karbonmateriale brukt for A, men ga utilfredsstillende elektroder med mange andre inaktive karbonmaterialer. Responstiden til A var

også uforandret etter 23 dager, men andre elektroder viste en økning i responstid med opprinnelige responstider på fra

ca. 25 - 30 sekunder, og som øker etter 8 dager til 2-3 minutter. Aktive elektroder (såsom A) viser generelt et visst fall i respons i løpet av første dag, men responsen nådde så et platå med hensyn til tiden. Elektroder av

gruppe A lagret vått (pH 5,6) ved 4°C og undersøkt ved intervaller over en seksmåneders-periode, viste liten forandring (etter de førse par dager) og selv om det var en viss nedbrytning etter denne periode, var responsen ved 12 måneder fremdeles 70% av den opprinnelige verdi.

Figurene 1 og 2 viser utføringsstrømmen av elektroden i jia/cm<2> ved et operasjonspotensial på 600 mV, ved å bruke 3-elektrode konfigurasjonen vist i fig. 15.

Den utvidede lagringstid og stabilitet av foreliggende elektroder er ytterligere illustrert i fig. 5, som viser responsen av den karbodiimid-immobiliserte glukose-oksydase-elektrode til 5 mM glukose etter lagring i pH 5,6 acetatbuffer ved romtemperatur i en periode på 180 dager. Sammenligningsresutater for elektroder ifølge tidligere teknikk (eksempel 1) er vist i fig. 6. Målingene i fig. 5 ble foretatt ved 600 mV med 3-elektrodesystemet og fig. 6 ved 325 mV med 2-elektrodekonfigurasjonen.

Ytterligere sammenligninger mellom responskurvene for elektrodene ifølge tidligere teknikk (eksempel 1) og foreliggende elektroder ved å bruke forskjellige enzymer og forskjellige immobiliseringsmetoder, er vist i figurene

7-9, hvor alle målinger er foretatt ved 326 mV.

Responskurvene for laktat, galaktose og laktose (kombinert glukose-oksydase og beta-galaktosidase) er vist i figurene 10-12. Disse målinger ble foretatt ved 600 mV.

Gjenbruk av elektroden:

Anvendelighet for gjentatte målinger

Under kontinuerlig belastning viste elektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse eksepsjonell langlivethet av en type som tidigere ikke har blitt vist. Dette ble illustrert ved følgende sekvens av nøyaktige forsøk. Først ble en glukose-oksydase-elektrode (eks. 2) satt opp i en lukket celle og tillatt å reagere amperometrisk til en omrørt glukoseoppløsning (opprinnelig konsentrasjon 5 mM, opprinnelig strøm 100 tiamp) . Dette forløp kontinuerlig i 18 timer under hvilken tid signalet gradvis falt til under 10 jiamp. Den totale elektrisitet som ble dannet, tilsvarte ca. 75% av den ventede teoretiske verdi (på basis av to elektroner gitt pr. molekyl glukose). Dette eksperiment ble umiddel-bart gjentatt med samme elektrode ved fornyelse av glukose-oppløsningen, hvorpå den opprinnelige strøm ble reetablert og "nedkjøringen" av substratet under kontinuerlig belastning ga identiske resultater.

I et påfølgende eksperiment ble tilførsel av strøm ved å bruke samme elektrode fortsatt i ytterligere 5,7 dager, men med tilførselen av glukoseoppløsning fremskaffet ved sirku-lering fra et stort reservoar for å opprettholde 5,5 mM konsentrasjon. Utgangen falt langsomt over en periode på 100 timer, men stabiliserte seg så ved 45 jiA, hvilken verdi ble opprettholdt i ytterligere 40 timer. Det er mulig at enkelte løst bundne enzymer løsnet fra elektrodebasen i løpet av denne periode (selv om det ikke var noen avhengighet av strømutførsel i forhold til omrøringsgraden) eller at en eller annen begrensende effekt virker.

Etter langtidsforsøkene beskrevet ovenfor ble reaksjonen av elektroden over et glukose-konsentrasjonsområde undersøkt som tidligere antydet. Selv om signalamplituden var mindre enn for nylig fremstilt, ga elektroden en meget tilfreds-stillende "trinn" funksjon over området 0-30 mM glukose, noe som bekreftet at den ikke hadde opplevd noen ugunstig effekt som et resultat av den forlengede bruk under belastning. Denne konklusjon ble det kommet frem til i løpet av tre ytterligere forsøk etter én ukes lagring (4°C), etter 8 ukers lagring og etter igjen å kjøre under belastning som tidligere i ytterligere 4,7 dager. Responsen over et glu-kosekonsentrasjonsområde var uforandret.

Disse forsøk antyder at en elektrode kunne drives i en total tid på minst 250 timer (over 15.000 minutter) for således potensielt å gi elektrodematerialet en ekstremt lang arbeidslevetid. Arbeidslevetiden for enzymelektroder ifølge tidligere teknikk er vanligvis meget kortere enn de ifølge foreliggende oppfinnelse, i mange tilfeller kun et par timer: Turner, (1985) Proceedings Biotech 85 (Europe) Online Publications, Pinner, UK, 181-192. For eksempel har glukoseelektroder basert på f errosenkoblet glukose-oksydase generelt halveringstider på ca. 14 timer (Turner, loe.eit.) mens Cass et al. (1984) Analyt. Chem. 56, 667-673 angir en total stabil levetid på 50 timer for samme elektroder. Når en elektrode ble brukt i 50 påfølgende målinger av 5 mM glukoseoppløsningen, var standardavviket mindre enn 1%.

Anvendelighet for kontinuerlig overvåkning

Nivået for endelig respons funnet i ovenfor nevnte gjen-bruksforsøk (45 \ iamp i 5 mM glukose) forble upåvirket ved eksponering til aererte oppløsninger, og var den samme etter flere uker med ytterligere lagring. Stabiliteten av strømuttaket fra denne elektrode over 12 timer ble under-søkt i et kontrollert forsøk ved å bruke sterilisert glukoseoppløsning under betingelser beregnet for å eliminere ethvert tap av glukose fra bakteriell forurensning. Signalet var konstant over hele perioden og antydet at enhver effekt av den opprinnelige "kondisjonering" av elektroden i en omrørt og sirkulert oppløsning over flere dager var fullstendig. Slike elektroder passende kondi-sjonert ved hjelp av denne eller enhver annen passende kondisjonering/vaskeprosedyre, ville kunne brukes når kontinuerlig overvåkning av glukose er krevet.

Porsi onsreproduserbarhet

Forutsatt at tilstrekkelig "rene" preparative betingelser opprettholdes, virker alle elektroder i henhold til foreliggende oppfinnelse som beskrevet og gir god respons for glukose. Elektrodepar av identisk størrelse fremstilt ifølge samme prosedyre ga nært samsvarende resultater (strømrespons innenfor et par prosent når de undersøkes under identiske betingelser) . Videre hadde alle elektroder således fremstilt meget lange levetider og varighet som antydet ovenfor, i motsetning til glukoseelektroder ifølge tidligere teknikk. Således kan elektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse lagret sikkert og brukes i mange uker, mens elektroder ifølge tidligere teknikk viste stor varia-bilitet innenfor ett parti. For eksempel bemerket Turner, loe. eit. , at selv om et par glukose-oksydase-elektroder innenfor ett parti av og til var spesielt langlivede (600 timers halveringstid), hadde hoveddelen halveringstider på ca. 24 timer. Følgelig kunne de ikke bli brukt pålitelig over perioder som var særlig lengre enn 24 timer.

Responsens avhen<g>i<g>het av oksygenkonsentrasion

For å undersøke effekten av oppløst oksygen ble en forsøks-celle modifisert til å innbefatte en oksygenelektrode i tillegg til glukoseelektroden. Eksperimenter ble utført hvori oppløst oksygen ble trukket ut av systemet ved til-førsel av argon. Under disse betingelser ga elektroden av type A (ovenfor) en rask respons for tilsetninger av glukose, noe som antydet en mekanisme som i stor grad var uavhengig av den omliggende oksygenkonsentrasjon. Et slikt resultat som kan tillegges de spesielle særtrekk av elek-trodeoverflatestrukturen i kombinasjon med gunstig enzym-immobilisering, har ikke blitt observert tiligere.

I et ytterligere forsøk (fig. 4) ble utgangssignalet fra en type A elektrode (fremstilt ved metode A ovenfor) overvåket ved 600 mV under kontinuerlig tilførsel med argon. Samtidig ble målinger foretatt av oksygenspenningen i prøven. Resultatene fremsatt i fig. 4 viser et i hovedsak konstant strømsignal (øvre kurve) som i hovedsak var uavhengig av oksygenspenningen i prøveoppløsningen (nedre kurve). I et annet forsøk var signalet nesten upåvirket over en 10 min periode, mens oksygenspenningen falt raskt. En annen elektrode (fremstilt ifølge metode B) viste et fall i strøm på under 5 % over tre minutter, i løpet av hvilken tid oksygenet hadde blitt fjernet med 90%. En økning i strøm-respons er også observert når oksygen gjeninnføres i systemet, selv om dette tillegg etableres relativt langsomt. Ved forlenget vasking med argon reagerte elektrodene på kun et begrenset område av glukosekonsentrasjonen, og det er mulig at tilstedeværelsen av spor av oksygen kan være nødvendig for å "sette i gang" den del av enzymfunk-sjonen som er ansvarlig for uttagning av hydrogen fra substratet. I tillegg kan det ikke utelukkes at oksygen adsorbert ved elektroden (ved lav konsentrasjon og ikke påviselig av oksygen-elektroden) spiller en viss rolle i denne oppførsel.

Enzymtilførsel

Uavhengige målinger av graden av glukosefjerning og maksi-male strømtettheter viser at mengden av enzym aktivt immobilisert pr. elektrode (type A) var ekvivalent til ca. 7 \ ig av aktivt enzym pr. cm2 elektrodeoverflate. (Lite informasjon er gitt i litteraturen angående enzymtilførsler ved lignende glukose-oksydasebaserte biosensorer).

I immobiliseringsprosedyrene ble det funnet at selv når enzymoppløsingen var fortynnet så meget som 10 ganger, kunne meget aktive elektroder likevel fremstilles.

Reaksj onens temperaturavhengjghet

Type A elektroder ble undersøkt over konsentrasjonsområdet 0-30 mM glukose ved temperaturer mellom 10 og 37°C. Tempe-ra turkoef f isienten var 2-3 % pr. grad (tilsvarende en Arrhenius aktiveringsenergi på ca. 24 kJ/raol'1) . Dette stemmer med verdien 4% pr. °C angitt for den ferrosen-medierte biosensor (Cass et al, loe.eit.).

pH- avhengjghet

En liten avhengighet av responsen i forhold til pH ble observert. Mellom pH 7,0 og 8,0 er imidlertid responsen nesten pH-uavhengig, bortsett fra ved meget høye glukosenivå (> 25 mM).

Respons av elektrode dekket med beskyttende membran

En polykarbonatmembran ble funnet å forårsake liten forandring i form og størrelse av elektroderesponsen i et omrørt system. Reaksjonstiden i et urørt system var ca. 20 sek.

Anvendelse av elektrode for analyse av fullblodprøver

Elektroden med polykarbonatmembranen ble brukt tilfreds-stillende for direkte måling av glukose i blod. Interferens fra ascorbat ved 0,2 mmol/liter var ca. 2,5 % av det totale signal ved et glukosenivå på 5 mmol/liter.

Anvendelse av elektrode i forskjellige konstellasjoner av analytisk biosensor

Den passende bruk av enzymelektroden ifølge foreliggende oppfinnelse i en celle av Rank-type som bruker en modifisert Clarkelektrode som beskrevet ovenfor, er vist ved resultatene beskrevet ovenfor. Det har også blitt vist at elektroden gir utmerkede resultater når den brukes i andre sensortyper, såsom en sonde.

For eksempel ble det konstruert en sonde, 2 mm i diameter, av typen som vanligvis blir brukt i mange vanlige elektroder, hvor elektroden var montert på en wire og forseglet i et glassrør. Dette kunne bli satt inn (med referanse og motelektroder festet) i omrørte forsøksoppløsninger inneholdt i et beger eller annen beholder for å foreta pålitelige målinger av glukosekonsentrasjonen uten behov for å eliminere atmosfærisk oksygen. Fra målingen med denne og mindre sonder av lignende utforming ble det etablert at strømresponsen av elektrodene i en oppløsnig med fast glukosekonsentrasjon er omtrent proposjonal med det tilgjengelige areal eller vekten av elektroden.

Sonder ble også konstruert hvori elektroden ble forminsket (ca. 0,25 - 0,50 mm<2> flate, 30 - 60 ug vekt). Wiremon-teringen ble dekket av en plasthylse og denne hylse-sonde ble satt inn i en kateternål (1,5 mm i diameter). Nålen kan stikkes inn i et kammer gjennom en gummiforsegling (som kan være innsatt i en fermenter eller lignende anordning eller et avfallsreservoar) og brukt som en sondesensor for å måle glukosekonsentrasjonen i en oppløsning inneholdt i kamme-ret. I denne konfigurasjon er måleelektroden beskyttet av den omliggende nål ved innsetningstiden, men kan også bli skjøvet klar fra nålen når det er nødvendig etter innset-ningstrinnet.

Mens miniatyrsonder som beskrevet ovenfor gir signaler, typisk i området 1-10 namp, er nøyaktige målinger i området 1 - 100 namp mulige med passende instrumentering. Siden signalstrømmer i dette området er støttet ved enzymelektroder (ifølge foreliggende oppfinnelse) av meget liten størrelse (ca. 0,005 mm<2> område, 1 jig vekt) , kan slike elektroder bli innbefattet i meget fine nål-mikrosonder, slike som ville finne anvendelse i katetersonder for in vivo målinger.

Selv om mekanismen som ligger til grunn for virkningen av elektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke er fullstendig forstått, kan det trekkes visse slutninger, basert på de erholdte resultater. Således er det kjent at tilstedeværelsen av aktive overflategrupper på karbon dannet ved overflateoksydering ved økede temperaturer står for kryssbindingsreaksjoner som krevet for immobilisering av enzymer, blir antall og mengde av slike overflategrupper sannsynligvis øket når platina (eller annet platinagruppe-metall såsom palladium) er tilstede som en tynnsjikt overflatekatalysator (Kinoshita og Stonehart, (1977), Modem Aspects of Electrochemistry, No. 12, red. Bockris og Conway, Plenum Press, New York, 183-266). Det er klart at forskjeller i enzymbinding inntreffer med forskjellige immobiliseringsmetoder. (F.eks. bruker mange av de rappor-terte metoder forskjellige aminosyreresiduer til enzymbinding, mens enzymer bundet med cyanogenkloridaktiverte materialer gjør dette utelukkende via sine lysinresiduer, se Ianiello og Yacynych, (1981) Analyt. Chem 53., 2090-2095). Variasjoner i de tertiære strukturer av enzymer dannet ved immoblisering ville ikke være ventet å være identiske for alle immobiliseringsprosedyrer, noe som kan svare for de store variasjoner i enzymaktivitet og stabilitet som finnes i denne form for arbeid.

Den ekstremt heterogene natur av baseelektrodematerialet brukt i foreliggende oppfinnelse, i motsetning til den lagdelte ikke-heterogene struktur av elektrodetypen beskrevet f.eks. i japansk publ. søkn. nr. 56-163447, maksimaliserer sannsynligheten for å erholde et antall kryssbin-dinger av forskjellig type og orientering i en integrert tredimensjonal struktur. Ved fravær av kryssbindingsrea-genser gir den også sterk overflateadsorbsjon. Porene i den bundne karbonholdige matrise tillater enzymmolekylene å komme "i og rundt" matrisens komponenter, noe som gir et meget stort overflateområde til enzymet og tillater konformasjoner som er gunstige for dets stabilitet og aktivitet. (I motsetning til binding p_å relativt plane overflater som platina, "glassaktig" karbon eller grafitt med meget mindre overflateområde, noe som begrenser konfor-mas j onen, som antydet ved tidligere arbeid i litteraturen.) Videre indikerer de ekstremt raske responstider for elektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse (1-2 sekunder) ekstremt rask overføring av elektroner til elektroden, noe som krever ikke bare høy enzymaktivitet, men er hjulpet ved tilstrekkelig mange elektronreseptorseter og elektroden i seg selv. Disse fremskaffes ved den høye tetthet av fine platiniserte karbongranuler, fordelt over et meget stort område inne i mikrostrukturen, noe som maksimaliserer sannsynligheten for tilgang av overflateplatinatilvekster til aktive seter på enzymet.

For å vise anvendeligheten av andre harpikser som bindemidler i enzymelektroder i henhold til foreliggende oppfinnelse, og av andre platinagruppemetaller, har glukose-oksydase-elektroder blitt konstruert under anvendelse av polyvinylacetat som bindemiddel og palladium som platina-gruppemetall.

I førstnevnte tilfelle ble en glukose-oksydase-elektrode dannet ved immobilisering av glukose-oksydase ved hjelp av metode A tidligere fremstilt på overflaten av en platinisert karbonpapirelektrode som var konstruert i hovedsak som tidligere beskrevet (eksempel 2), men ved å bruke 50 vekt% polyvinylacetat som bindemiddel i stedet for polytetrafluoretylen.

Når den ble undersøkt ved å bruke samme modifiserte Rank elektrodesystem ved 325 mV, ble en i hovedsak lineær respons erholdt, som vist i figur 13.

I sistnevnte tilfelle ble en glukose-oksydase-elektrode konstruert ved å immobilisere glukose-oksydase ved metode A tidligere beskrevet på overflaten av en palladisert karbonpapirelektrode, fremstilt ved avleiring av kollodialt palladium på overflaten av karbonpulver (normal partikkel-størrelse 30 nm: Vulcan XC-72) og deretter å binde det palladiserte karbonpulver som et tynt lag (0,1 mm) på overflaten av et elektrisk ledende karbonpapir under anvendelse av 50 vekt% basert på vekten av det palladiserte karbonpulver av polytetrafluoretylen som bindemiddel.

En skive, 2 mm i diameter, skåret fra det behandlede palladiserte karbonpapir, ble montert på platinakontakten av 2-elektrodecellen beskrevet i figur 16 og undersøkt for sin respons for glukose ved 325 mV. Resultatene er presentert i fig. 14, og viser igjen en i hovedsak lineær respons i forhold til strømtetthet mot glukosekonsentrasjon.

I lys av den store ekvivalens mellom Pt, Pd, Ru og Rh og andre platinagruppe-metaller i gassdiffusjonselektroder, beskrevet i US patent 4.293.396 og andre steder, er det å vente at platinagruppe-metaller såsom ruthenium og rhodium vil være effektive som alternativer til platina og palladium i enzymelektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Claims (11)

1. Enzymelektrode som er i stand til å reagere amperometrisk på den katalytiske aktvitet av et enzym i nærvær av dets respektive substrat og som omfatter et oksido-reduktase-enzym immobilisert eller absorbert på overflaten av et elektrisk ledende støttemateriale bestående av eller omfattende et platinisert porøst lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler, karakterisert ved at det porøse lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler omfatter partikler av metall fra platinagruppen intimt blandet med, eller deponert eller adsorbert på overflaten av karbon- eller grafittpartiklene, for derved å fremskaffe, som det elektrisk ledende støttemateriale, et i hovedsak heterogent lag av resinbunne karbon- eller grafittpartikler, hvor metallet fra platinagruppen er dispergert i hovedsak uniformt gjennom laget.

2. Enzymelektrode ifølge krav 1, karakterisert ved at metallet fra platinagruppen er platina eller palladium.

3. Enzymelektrode ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det syntetiske resin-bindemiddel er et fluorkarbon-resin eller polyvinylacetat.

4. Enzymelektrode ifølge krav 3, karakterisert ved at det syntetiske resin-bindemiddel er polytetrafluoretylen.

5. Enzymelektrode ifølge krav 1, karakterisert ved at oksido-reduktasen er glukose-oksydase.

6. Enzymelektrode ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at det elektrisk ledende støttemateriale omfatter et elektrisk ledende basallag med et overflatelag av de resinbundne karbon- eller grafittpartikler med finfordelte metallpartikler av platinagruppen blandet med eller adsorbert eller avleiret bundet til seg.

7. Enzymelektrode ifølge krav 6, karakterisert ved at det elektrisk ledende støttemateriale er et elektrisk ledende karbonpapir.

8. Enzymelektrode ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at det porøse lag omfatter resinbundne karbon- eller grafittpartikler hvor metallet fra platinagruppen er avleiret eller adsorbert på overflaten av de enkelte partikler før binding til resinet.

9. Enzymelektrode ifølge krav 8, karakterisert ved at det porøse lag omfatter et resinbundet, platinisert karbonpulver, hvor dette pulver har en partikkelstørrelse i området 5 - 30 nm og har kolloidalt platina med en partikkelstørrelse i området 1,5 - 2,5 nm adsorbert på sin overflate.

10. Enzymelektrode ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at overflaten er beskyttet av en mikroporøs membran som er permeabel for det aktu-elle substrat.

11. Enzymelektrode ifølge krav 10, karakterisert ved at membranen er en polykarbonat-membran.