JP2007510928A - 高密度アミン機能化表面 - Google Patents
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Abstract
プロテオミクス、ゲノミクス、医薬、薬の発見、及び診断などの研究の分野において興味深い、タンパク質、ペプチド、DNA、細胞、小分子、及び他の化学的又は生物学的分子の結合のための、表面上のアミン官能基を提供するための方法。
Description
本出願は、2003年11月6日に出願されたアメリカ仮出願番号60/517,847に基づく優先権を主張しており、この出願は、図も含めてその全体が参照により本出願に取り込まれる。
本発明は、化学的又は生物学的分子が付着するのに有用な、アミン官能基を持つ表面に関する。本発明はまた、例えば、付着した生体分子を、次の生体分子相互作用検出のために、共有結合的に固定化するような、機能的ポリマーの移植を用いた、高性能な表面化学を生み出す方法に関する。
ヒトゲノムのシークエンスの完了した状態で、分子生物学の次の大きな挑戦の一つは、DNAによってコードされている、多くのタンパク質標的がいかにして他のタンパク質、小分子薬剤候補、そして多数の酵素と阻害剤を相互作用しているかを理解することであろう。例えば、Pandey&Mann,“Proteomics to study genes and genomes,”Nature,405,p.837−846,2000;Leigh Anderson et al.,“Proteomics:applications in basic and applied biology,”Current Opinion in Biotechnology,11,p.408−412,2000;Patterson,“Proteomics:the industrialization of protein chemistry,”Current Opinion in Biotechnology,11,p.413−418,2000;MacBeath & Schreiber,“Printing Proteins as Microarrays for High−Throughput Function Determination,”Science,289,p.1760−1763,2000;De Wildt et al.,“Antibody arrays for high−throughput screening of antibody−antigen interactions,”Nature Biotechnology,18,p.989−994,2000などを参照。この目的を達成するために、多くの異なる生体分子の相互作用を高感度で同時に同定及び/又は定量する能力を持つツールが、医薬の発見、プロテオミクス、そして診断法において応用されるであろう。さらに、広範に使用されるこれらのツールは、使うのに単純で、所有し操作するのに廉価で、そして例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、小さいタンパク質、抗体、そして細胞全体でさえも含む、広範囲な検体に応用可能でなければならない。
担体表面への標的分子の固定化は、生物学的な検定の開発において重要な観点である。一般的に、生物学的検定は、マイクロウェルプレート、顕微鏡のスライド、チューブ、シリコンの基板、または膜の表面で行われる。標的分子は、表面上の官能基と分子の官能基との間の結合反応を用いて、共有結合的に表面に固定化される。ガラス表面上への一般的な表面機能化技術の一つは、機能的シランを用いたシラン化である。Gelest Inc.、チュリータウン、ペンシルバニア州によって出版された、Silane,Silicones,and Metal−Organics,p.88(2000)を参照。Corning Inc.(コーニング、ニューヨーク州)によって生産されるGAPS IIでコートされたスライド、TeleChem International, Inc(サニーヴェイル、カリフォルニア州)によって供給されるArryitTM SuperAmineスライド、Sigma Diagnostics(セントルイス、ミズーリ州)によって供給されるSILANE−PRETMアミン機能化スライド、そしてその他のものが、顕微鏡スライド方式における生物学的検定表面として利用可能な例である。SuperAmineスライドは、平方ミリメートルあたり5x1012のアミン官能基を供給すると主張している。もう一つの例では、ナイロン担体上でアミジンに誘導体化されたアミド基が、特異的なポリヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーション検定のDNAとRNAプローブを固定化するために使われる。U.S.Patent 4,806,546を参照。Nalge Nunc International(ロチェスター、ニューヨーク州)によって供給されるNucleoLinkTMとCovaLinkTMを含む、マイクロウェルプレートやチューブの方式の生産品は、ポリマー様担体表面においてのみ利用可能である。CovaLinkTM生産品は、表面領域の平方ミリメートルあたり、およそ1012で二級アミン官能基表面を与える。二級アミンは、多くの共役反応において、一級アミンより低い反応性を示す。Loudon,G.Marc,Organic Chemistry,3d ed.,The Benjamin/Cummings Publishing,レッドウッドシティ、カリフォルニア州(1995)を参照。
例えば、シリコン、ガラス、又は金といった材料の表面を化学的に機能化するための、数多くの既知の方法が存在する。表面の機能化は、しばしば表面の拡張された応用をもたらすため、大いに興味深く、非化学的に機能化された表面を持つ表面と比べて、結合が向上し、表面に対する様々な分子の分析が可能になる。表面をコートする化学的機能化のタイプ、量、そして質は、共有結合の強さと、特異的な検体に結合する表面の能力を決定づける。コーティング自体が、容易に洗浄されないこと、又は複数回の使用後に分解しないことが、高く望まれる。表面にコートされたアミン官能基は、生体分子を検出するための多目的なプラットフォームを供給することが示される。これらの官能基は、例えば静電的相互作用又は化学的結合といった物理的誘引力を通して、生体分子を捕らえる。そのような化学的結合は、直接又は非直接的(すなわち化学的リンカーを通して)に達成できる。多くの同種二機能性又は異種二機能性リンカーが、この分野においては知られている。アミンで表面をコーティングするための単純な方法は、洗浄した表面をポリリジンに直接さらすことである。一つの例は、マイクロアレイプリントに使うガラススライド表面である。しかしながら、このタイプの表面は、複数回の使用の後には不安定になることが示されている。アミンで表面をコーティングする別の方法は、共によく知られる、ガラス上にシラン又は金上にチオールを結合させた、アミン−コーティング分子を表面に共有結合的に結合させることである。
様々なアミノアルキルシラン試薬が、アミノ基を持つシリコン又はガラスを基板にした表面をコートするのに使われる。そのような表面をコートするのに使われるプロセスは、様々なシラン試薬、溶媒、そして異なった物理的処理方法の使用を含む。さらに、表面上の化学官能基の存在をテストするために、放射線、比色分析、蛍光、XPS、FTIR、AFM、そしてその他のものを含む多くの方法が使われる。感度は、表面テストの適切な方法を選ぶ場合には、重要な問題である。一般的に言って、バイオセンサーの表面を化学的にコートするための標準的な工業的方法も、そのようなバイオセンサー上で特異的な化学部位の存在又は量を検出するための標準的なテスト方法も、存在しない。
過去において、化学的にコートされた不活性なプラスチックを基板にした表面を準備する際に、かなりの困難に突き当たった。あるプラスチック表面を化学的にコートする試みは、しばしば望まない分解をもたらす、すなわちプラスチックが溶解し、食刻され、又は構造的に崩壊される。さらに、多くの場合、不活性なプラスチックを基板とした表面のコーティングは実用的ではなく、化学的なコーティングの層は表面に正確に接着せず、特に親水性ポリマーのコーティングの場合には、複数回の使用の後簡単に洗い流されてしまう。アミン−機能化表面に関しては、表面を準備するプロセスが、試薬の不適合、望まない長い反応時間、又はプラスチックを基板とする表面を変化又は分解するような、必要な硬化温度の上昇などの、様々な望ましくない組成上の、及び/又はプロセス上の限界を有する。
さらに、定性的に及び/又は定量的に、表面上の官能基を特徴づけるのは難しい。アミン基の存在を確認するために、現行の比色分析そして蛍光による方法は、通常溶液中のサンプルを用いており、この方法では、検出は乾燥表面上のサンプルよりはるかに高感度である。乾燥した全体的に平らでない表面上で、10オングストロームより薄い化学官能基の表面の特徴づけを行うことも、難しい作業であることが証明されている。
例えば、オリゴヌクレオチド、抗体−抗原相互作用、ホルモン−受容体相互作用、そして酵素−基板相互作用を含む、様々な生体分子の複合体を検出するためにバイオセンサーが、開発されている。一般的に、バイオセンサーは2つの構成要素から成る:高い特異性を持つ認識要素と、分子認識事象を定量可能なシグナルへと変換する変換器である。シグナル変換は、蛍光、干渉分光法(Jenison et al.,“Interference−based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon,”Nature Biotechnology,19,p.62−65;Lin et al.,“A porous silicon−based optical interferometric biosensor,”Science,278,p.840−843,(1997))、そして重量測定(A.Cunningham,Bioanalytical Sensors,John Wiley&Sons(1998))を含む、多くの方法によって達成されている。
光学活性に基づいた伝達方法の中で、蛍光化合物による検体のラベリングを必要としない直接的な方法は、相対的な検定の簡便さと、容易にラベル化できない小分子とタンパク質の相互作用を研究するための能力のために、興味深い。直接的な光学的方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)(Jordan&Corn,“Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces,”Anal.Chem.,69:1449−1456(1997))、グレーティングカプラ(Morhard et al.,“Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction,”Sensors and Actuators B,70,p.232−242,(2000))、偏光解析法(Jin et al.,“A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions,”Analytical Biochemistry,232,p.69−72,(1995))、エバネッセント光装置(Huber et al.,“Direct optical immunosensing(sensitivity and selectivity),”Sensors and Actuators B,6,p.122−126,(1992))、そして反射計(Brecht&Gauglitz,“Optical probes and transducers,”Biosensors and Bioelectronics,10,p.923−936,(1995))を含む。これらの検出方法の理論上予想される検出限界は、診断上関連性のある濃度範囲に至るまで実現可能であることが実験的に確認され、決定されている。しかしながら、これまでのところ、これらの方法はまだ、ハイスループットの生体分子相互作用解析に最も頻繁に使われる、マイクロタイタープレートに基づいた、又はマイクロアレイに基づいた基盤技術と容易に適合したフォーマットで、いずれのタイプのラベルも必要とせずに高感度検定を行うことが可能な、市販のハイスループット実験器具はない。
生物学的検定に関連するような、化学的及び生物学的分子は、検定培地中で立体構造を持つ。固体表面に固定化された場合には、分子の立体配座は妨げられるかもしれない。高密度の化学的又は生物学的分子が、二次元担体表面に固定化された場合、立体構造の密集が起こる。Southern,E. et al.,Nature Genetics Supp.21:5(1999)参照。立体構造の密集又はアクセシビリティの問題は、化学的又は生物学的分子の相互作用に大きく影響する。これは、多くの大きなサイズの分子にとっては特に真実である。例えば、Grayとその共同研究者は、オリゴヌクレオチド塩基が、アンモニアがオリゴヌクレオチドの脱保護に使われる場合、立体障害を解消するように支持表面から十分に溶け出すようであり、その結果、向上したハイブリダイゼーションシグナルが観測されることを報告している。Gray,DE,et al.,Langmuir,13:2833(1997);Matson,RS,Anal. Biochem.223(1):110(1995)参照。Shchepinovらは、固定化したオリゴヌクレオチドと固体支持体表面の間にスペーサーを加えることが、ハイブリダイゼーションシグナルをかなり向上させたことを示した。Shchepinov,M.S.,et al.,Nucleic Acids Res.,25(6):1155−61(1997)参照。
支持体表面の官能基の密度を増加させるために、そして立体障害を減少させるために、化学的に機能性なポリマーが、支持体表面の先端に三次元マトリクスを与えるように使われた。例えば、パーキンエルマーライフサイエンス(ボストン、マサチューセッツ州)によって供給される、三次元タンパク質マイクロアレイ基板HydroGelTMでコートされたスライドは、タンパク質相互作用のための、高度に膨潤可能なポリマーマトリクスを提供する。このポリマーマトリクスは、乾燥させた時には2μmの厚さを持ち、完全に水和させた時には最大90μmまでの厚さを持つ。Wang,G.B.,et al.,Nucleic Acids Res.(投稿準備中)参照。アマシャムバイオサイエンス(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から供給される、3D−LinkTMもまた、3次元ポリマーマイクロアレイ基板を供給するための試みである。しかしながら、架橋されたポリマーマトリクスの網目状構造は、大きなサイズの生体分子のアクセシビリティを限定する。U.S.Patent 6,413,722(参照によって本願明細書に援用される)。逆相表面ポリマー化を用いて、水性溶液中で、最も不活性なポリマー表面上でさえも、フリーラジカル転移により非架橋“ブラシ”ポリマー構造を成長させることができる。Wang, G.B.,et al.,6th World Biomaterials Congress,Hawaii(2000);U.S.Patent 6,358,557(参照によって本願明細書に援用される)。様々な機能性と化学的官能基密度が、機能的なフリーラジカルポリマー化可能なモノマー又は混合物の添加によって、容易に得られる。しかしながら、それは、有機物のポリマー表面又は無機物の表面上にポリマープライマーを必要とする。“ブラシ”ポリマー表面はまた、イニシエイターを含むシランでシラン処理されたガラス上の表面でのラジカル生成によって開始される、フリーラジカルポリマー化を用いて構築される。E.P.O.Patent 1,176,423参照。シランの合成が、このプロセスにとって決定的である。アミンを含むポリマーは、多段階の反応を通して、塩化シアヌル試薬のカップリングを用いて、アミノ−シラン化ガラス表面上に共有結合的に結合される。しかしながら、塩化シアヌル活性化は、無水の溶液中で行われなければならず(U.S.Patent 6,413,722参照)、プロセス上限定される。それゆえ、この問題に対処するための技術が必要とされている。
一つの態様においては、本発明は、高密度アミン機能化表面を調製するための方法を提供する。この方法は、
(a)エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーの溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより、高密度アミン機能化表面を形成することを含む。さらに表面はプラスチックでありうる。
(a)エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーの溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより、高密度アミン機能化表面を形成することを含む。さらに表面はプラスチックでありうる。
本発明の別の態様において、この方法は、一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程を含む。化学的又は生物的分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞分画物、そして細胞の部分を含むことができる。さらに、タンパク質は、酵素、抗体、アビジン、ストレプトアビジン、又はペプチドでありうる。さらに、化学的又は生物学的分子は、小分子でありうる。小分子は、ビオチンでありうる。
本発明のさらなる態様は、高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーを含む。バイオセンサーは、比色共鳴バイオセンサーのような、光学活性的センサーでありうる。あるいは、バイオセンサーは、音響バイオセンサー又は電気バイオセンサーでありうる。さらに表面はプラスチックでありうる。
高密度アミン機能化表面は、同じ又は異なっている一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含みうる。一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーは、一級アミン、二級アミン、又はその両方を含むことができる。アミン含有ポリマーは、ポリエチレンイミン又はポリビニルアミンであることができる。
本発明のさらなる態様は、高密度のアミン機能化ポリマーマトリクスを含み、これは機能的なエポキシ基を介して表面に共有結合的に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含み、ここで、アミン含有ポリマーは同一又は異なっており、アミン含有ポリマーは二つ又はそれ以上のアミン基を含む。あるいは、アミン含有ポリマーは、三つ又はそれ以上のアミン基を含む。
本発明のさらなる態様は、表面に生体分子を固定化する方法を含み、この方法は、生体分子を以下の工程により作成される高密度アミン機能化表面と接触させることを含む:(a)エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成させ、そして、(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより生体分子を固定化する。
本発明の別の態様は、高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーを含み、ここで、高密度アミン機能化表面は、以下の方法によって調製される:
(a)エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより高密度アミン機能化表面を形成する。さらに、バイオセンサーは光学センサー、比色共鳴バイオセンサー、音響バイオセンサー、電気バイオセンサーでありうる。さらに、表面はプラスチックでありうる。
(a)エポキシシランで表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応するような条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより高密度アミン機能化表面を形成する。さらに、バイオセンサーは光学センサー、比色共鳴バイオセンサー、音響バイオセンサー、電気バイオセンサーでありうる。さらに、表面はプラスチックでありうる。
図面の簡単な説明
図1は、比色共鳴反射バイオセンサーに用いられる光学回折格子構造の様々な態様の模式図である。nsubstrateは、基板材料を表す。n1はカバー層の屈折率を表す。n2は一次元又は二次元回折格子の屈折率を表す。nbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。t1はカバー層の厚さを表す。t2は回折格子の厚さを表す。tbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。
図2は、アミン含有ポリマーがエポキシ表面に結合するグラフト反応を表す。
図3は、異なる表面上における、pmol/mm2で表されるアミン基のアミン密度を示す。
図4は、水性媒体中のエポキシ表面と5つの濃度のポリエチレンイミンのグラフト反応後、遠心分離乾燥又は凍結乾燥されたサンプルの、オングストロームで表された、ポリエチレンイミン(“PEI”)の厚さを表す。
図5は、三つの定義されたグループについて、表面に結合した分子の量の検出応答、すなわち脈波伝播速度(PWV)シフトを表す。
図6は、ストレプトアビジン結合の応答を表す。
図7は、処理した表面上のSA(ストレプトアビジン)の動態曲線と固定化の終点を表す。
図8は、表面上に固定化されたSAに対するビオチンの応答を表す。
図1は、比色共鳴反射バイオセンサーに用いられる光学回折格子構造の様々な態様の模式図である。nsubstrateは、基板材料を表す。n1はカバー層の屈折率を表す。n2は一次元又は二次元回折格子の屈折率を表す。nbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。t1はカバー層の厚さを表す。t2は回折格子の厚さを表す。tbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。
図2は、アミン含有ポリマーがエポキシ表面に結合するグラフト反応を表す。
図3は、異なる表面上における、pmol/mm2で表されるアミン基のアミン密度を示す。
図4は、水性媒体中のエポキシ表面と5つの濃度のポリエチレンイミンのグラフト反応後、遠心分離乾燥又は凍結乾燥されたサンプルの、オングストロームで表された、ポリエチレンイミン(“PEI”)の厚さを表す。
図5は、三つの定義されたグループについて、表面に結合した分子の量の検出応答、すなわち脈波伝播速度(PWV)シフトを表す。
図6は、ストレプトアビジン結合の応答を表す。
図7は、処理した表面上のSA(ストレプトアビジン)の動態曲線と固定化の終点を表す。
図8は、表面上に固定化されたSAに対するビオチンの応答を表す。
アミンでコートされた表面は、例えば、プロテオミクス、ゲノミクス、医薬、創薬、そして診断研究などの分野において興味ある、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞分画物、細胞の一部、そして、他の化学的又は生物学的分子などの、化学的又は生物学的分子の結合に有用である。例えば、バイオセンサーは、興味深い化学的又は生物学的分子を結合するための、アミンでコートされたものでありうる。本発明は、高密度アミン機能化表面と、表面上に高密度のアミン官能基を提供するプロセスに関する。本発明は、可塑性なバイオセンサー構造に使われるような、プラスチック表面を変化させない又は分解させない化学的試薬を用いて、高密度の機能的なアミン結合部位を提供することができる。
本発明の方法は、特に、アミン基とエポキシ基との間のグラフト反応を用いて、エポキシ表面上にアミン含有ポリマーを共有結合的に結合させる方法を提供する。本発明のポリマーは、一つ以上のアミノ基を含む。ポリマーは、一級アミン、二級アミン、又は一級と二級アミンの両方を含みうる。
本願明細書で使われている、アミンとは、直接又は連結分子を通して表面に結合する、−NH2の化学式を有する一級アミンならびに二級アミンの両方を表す。アミンでコートされた表面又はアミン機能化表面とは、化学的又は生物学的分子の直接又は間接的な結合などの、化学修飾が可能なアミン基を与える表面を表す。間接的な結合とは、当該技術分野において知られている、化学的リンカーを通した化学的又は生物学的分子の結合を表す。
プラスチックを基礎とするバイオセンサー又はプラスチックバイオセンサーとは、プラスチックの格子又はセンサー表面、格子のためのプラスチック支持体(基板とも呼ばれる)、及び/又は他のプラスチック構成要素を含むバイオセンサーを表す。そのようなバイオセンサーは、バイオセンサーの表面の機能化に使われる反応条件の結果として分解を受けやすい。光学的特性を有するプラスチックが好ましい。プラスチックは、粒子状のものがなく、きれいで透き通っていて、なめらかで平らな仕上がりを与える能力がある。一つの例として、バイオセンサーは、アクリルポリマー格子層を支持するポリエステル基板を含みうる。他のプラスチックの非限定的な例は、ポリエステルとポリウレタンを含む。しかしながら、バイオセンサーに使われるための光学的特性を与える、いずれのプラスチックも使用することができる。別の例では、格子表面が、基板と格子の両方として機能するプラスチックである。
アミン機能化表面とは、化学的又は生物学的分子が結合されたコーティングを有する表面を表す。例えば、アミン機能化表面は、限定されないが、高屈折率材料のコーティングを有する、プラスチックを基礎とするバイオセンサーのセンサー表面を表すことができる。そのような高屈折率材料は、例えば、シリコン窒化物、硫化亜鉛、二酸化チタン、又は酸化タンタルを含む。任意に、酸化シリコン層が、表面機能化の前に、高屈折率材料上にコートされうる。高屈折率材料または酸化シリコンのいずれかが、化学的又は生物学的分子の結合のために、アミン官能基で機能化されうる。高屈折率材料でコートされた格子表面をアミン機能化するのに使われる試薬は、アクリルポリマーであろうと他のプラスチックであろうと、格子材料と基板材料に適合するものでなければならない。格子は、高屈折率材料でコートされ、これは表面をアミン機能化するのに使われる試薬から格子材料をある程度保護するが、格子の反対側は、機能化プロセスの間じゅうずっと露出されている。同じように、格子が基板に結合している時は、基板の反対側は活性化試薬にさらされている。また、格子表面の高屈折率材料のコーティングの不完全さは、格子表面の上側の領域の露出をもたらすかもしれない。従って、様々な層の材料および層間の接着は、機能化およびその後のいずれの検定手順の間じゅう、無傷のままであるべきである。
バイオセンサーのアミン機能化表面とは、プラスチックを基礎としたバイオセンサーならびにプラスチックに基づかないバイオセンサーを表す。例えば、バイオセンサーは、酸化チタンでコートされたセンサー、又は高い屈折率を有するさらなるセンサー、上層や基本材料構造のためのコート又は低い吸着率のカバーなどを含む。加えて、その様々な物理的形状の全てにおける二酸化シリコン、又は低い吸着率、低い屈折率を有する材料が、検討される。これらのバイオセンサーは、例示を意味し、アミン機能化表面を有するバイオセンサーに限られない。
サブ波長格子表面(SWS)バイオセンサー
本発明の一つの態様では、サブ波長格子表面(SWS)を用いて、特異的に結合する物質又は結合パートナー又はその両方といった、化学的又は生物学的材料の相互作用を高感度で探知するために使うことができる、特定の波長での鋭い光の共鳴反射を作り出す。比色共鳴回折格子表面は、特異的な結合物質のための表面結合プラットフォームとして働く。偏光解析法、表面プラズモン共鳴、そして反射率スペクトルのように、この方法は、化学的に結合する材料が特異的な場所内に存在する場合にこれを決定するために、表面上の屈折率の変化を用いる。
本発明の一つの態様では、サブ波長格子表面(SWS)を用いて、特異的に結合する物質又は結合パートナー又はその両方といった、化学的又は生物学的材料の相互作用を高感度で探知するために使うことができる、特定の波長での鋭い光の共鳴反射を作り出す。比色共鳴回折格子表面は、特異的な結合物質のための表面結合プラットフォームとして働く。偏光解析法、表面プラズモン共鳴、そして反射率スペクトルのように、この方法は、化学的に結合する材料が特異的な場所内に存在する場合にこれを決定するために、表面上の屈折率の変化を用いる。
サブ波長格子表面は、薄膜コーティングの効果を模倣することができる、回折光学の従来にはないタイプである。(Peng&Morris,“Resonant scattering from two−dimensional gratings,”J.Opt.Soc.Am.A,Vol.13,No.5,p.993,May;Magnusson,&Wang,“New principle for optical filters,”Appl.Phys.Lett.,61,No.9,p.1022,August,1992;Peng&Morris,“Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two−dimensional gratings,”Optics Letters,Vol.21,No.8,p.549,April,1996)。SWS構造は、表面レリーフの、一次元又は二次元の格子を含み、ここでは、格子周期が入射光の波長と比較して小さいので、反射し伝達したゼロ次以外のどの回折次数も伝搬ができない。アメリカ特許出願番号10/059,060と10/058,626を参照(その全体が本出願の参照として取り込まれる)。SWS表面ナローバンドフィルターは、格子溝を満たす、基板層とカバー層との間に挟まれた、一次元または二次元の格子を含むことができる。任意に、カバー層は使われない。格子領域の有効屈折率が、基板又はカバー層より大きい時には、導波モード共鳴効果が起こる。フィルターが適切にデザインされている時には、一次元又は二次元格子構造が選択的に、波長の狭周波数帯で光を合わせる。光が散乱を受け、そして前方と後方に伝搬するゼロ次光を合わせる。導波モード共鳴効果は、いずれかのフォトンが構造内に入る点からおよそ3ミクロンの高度に局在化した領域に起こる。横方向の導波モードの伝搬は支持されていないので、導波路は作られない。
この構造の反射した又は伝達した色は、特異的結合物質又は結合パートナー又はその両方などの分子をカバー層の上方の表面又は一次元又は二次元格子表面に加えることにより変調されうる。添加した分子は、構造を通して入射放射の光路長を増加させ、そして従って、最大の反射率又は透過率が起こるであろう波長を加減する。
一つの態様では、バイオセンサーは、白色光を当てた場合、唯一の波長を反射するように設計される。化学的又は生物学的分子といった、特異的結合物質がバイオセンサーの表面に結合した時には、反射した波長(色)は、格子と連動した光の光路の変化のためにシフトする。特異的結合物質をバイオセンサー表面に結合させることによって、相補的な結合パートナー分子が、いずれの種類の蛍光プローブ又は微粒子ラベルの使用もなく、検出されうる。検出技術は、例えば、タンパク質結合の〜0.1nmの厚さの分解の変化まで可能であり、そして、バイオセンサー表面が流体中に浸されていても乾燥していても実行しうる。
例えば、検出システムは、例えば繊維光プローブを通して垂直の入射でバイオセンサーの小さな点を照らす光源及び、例えば第二の繊維光プローブを通して垂直の入射で反射光を集める分光計から構成される。励起/検出システムとバイオセンサー表面との間には物理的接触は起こらないので、特別な結合プリズムは必要とされず、バイオセンサーは、例えばマイクロタイタープレート及びマイクロアレイスライドを含む、いずれの一般的に使われる検定プラットフォームにも容易に適用されうる。単一の分光計読み取りは、数ミリ秒で行われうる、従って、バイオセンサー表面上で並行して起こる多数の分子相互作用をすばやく測定でき、リアルタイムで反応の動態をモニターすることができる。
この技術は、特に分子ラベルが、研究下の分子の機能性を変化させる又は阻害する場合において、多数の生体分子相互作用を並行して測定する点で応用上有用である。タンパク質を標的とした医薬的化合物ライブラリーのハイスループットなスクリーニング、及びプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、本発明の組成及び方法によって与えられる、感度及びスループットを必要とする、応用の例である。
SWS構造の例の概念図は図1に示される。図1において、nsubstrateは基板材料を表し、n1は任意的なカバー層の屈折率を表す。n2は二次元格子の屈折率を表す。Nbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の屈折率を表す。t1は二次元格子構造の上のカバー層の厚さを表す。t2は格子の厚さを表す。tbioは一つ又はそれ以上の特異的結合物質の層の厚さを表す。一つの態様において、n2>n1である(図1参照)。層の厚さ(すなわち、カバー層、一つ又はそれ以上の特異的結合物質、又は格子)は、上面の付加的分子に対する共鳴波長の感度を達成されるように選択される。格子周期は、望みの波長で共鳴が達成されるように選択される。その構造は、ガラス及びシリコン窒化物誘電性材料から組み立てられうる。あるいは、構造は、適切な誘電性カバー層とともに、エンボス加工したプラスチックから形成されることができる。
本発明の一つの態様は、SWSバイオセンサーを提供する。SWSバイオセンサーは、一次元又は二次元格子、格子を支持する基板層、及び基板層と反対の格子の表面に固定化された一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含む。
一次元又は二次元格子は、例えば、硫酸亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、及びシリコン窒化物を含む材料を含むことができる。格子の切断面のプロファイルは、期間的に繰り返している機能、例えば“正方形の波”を含むことができる。格子は、連続的は平行線、正方形、円形、楕円形、三角形、台形、正弦波、卵形、長方形、及び六角形からなる群から選択される、繰り返しのパターンの形から構成されうる。正弦波の切断面プロファイルは、格子の形をプラスチックのような柔らかい材料にエンボス加工すること、又は繰り返しの格子の表面をエポキシのような材料にレプリカすることを必要とする製造的な応用のためには好ましい。本発明の一つの態様では、格子の深さは約0.01ミクロンから約1ミクロンであり、格子の周期は約0.01ミクロンから約1ミクロンである。
SWSバイオセンサーはまた、一次元の線状の格子表面構造、すなわち一連の平行線又は溝を含むことができる。一次元の線状格子は、導波モード共鳴フィルター効果を産み出すために十分である。二次元格子が、両方のサブ波長であるセンサー表面の平面を横切る二つの横方向の特徴を持つのに対し、一次元格子の切断面は、長さが共鳴格子効果の波長より大きい時には、一つの横方向へのサブ波長のみである。一次元の格子バイオセンサーは、一次元格子の表面構造を、より低い屈折率の材料を覆った薄いフィルムとしてコートされた高い屈折率の材料を含むことができる。あるいは、一次元格子バイオセンサーは、低い屈折率の材料基板を含み、その上に高い屈折率の薄いフィルム材料が一次元格子の表面構造の模様でつけられている。低い屈折率の材料は、ガラス、プラスチック、ポリマー又は加硫したエポキシでありうる。高い屈折率の材料は、低い屈折率の材料より大きい屈折率を有さなければならない。高い屈折率の材料は、例えば、硫酸亜鉛、シリコン窒化物、酸化タンタル、二酸化チタン又は酸化インジウム錫などでありうる。
一つの態様において、SWS構造は、例えば、標準的な顕微鏡スライドと同じサイズの格子表面を構築することによって、及び格子構造上の場所のx−yのマス目上に高い親和性の化学的受容体試薬の微小水滴を置くことによって、マイクロアレイプラットフォームとして使われる。あるいは、SWS構造は、標準的なマイクロタイタープレートと同じサイズとして構築されて、プレート全体の底面へと組み込まれる。例えば、マイクロアレイ/マイクロタイタープレートの化学的に機能化された表面が、検体などの分子にさらされる場合、分子は高い親和性を持つ場所へと優先的に引き寄せられるだろう。結果として、ある表面の場所には付加材料が集まり、その他の表面の場所には集まらない。付加材料を引き寄せる表面の場所は、それぞれ個別のマイクロアレイ/マイクロタイター表面の場所といった個別の表面の場所内で、共鳴波長におけるシフトを測定することによって決定されうる。従って、例えば、サンプル中の結合した分子、検体などの量、及び受容体試薬と分子の間の化学的親和性は、共鳴波長のシフトの範囲を測定することによって決定されうる。
本発明の一つの態様において、第一の分子と第二のテスト分子との相互作用が検出されうる。上記のSWSバイオセンサーが使われ;しかしながら、その表面に固定化された特異的結合物質は存在しない。それゆえ、バイオセンサーは、一次元又は二次元格子、一次元又は二次元格子を支持する基板層、及び任意にカバー層を含む。上記の通り、バイオセンサーが照射された時、反射した放射線スペクトル上で共鳴格子効果が産み出され、そして格子の深さと周期は、共鳴格子効果の波長より小さい。
第一の分子と第二のテスト分子の相互作用を検出するために、第一及び第二の分子の混合物がバイオセンサー上の別々の場所にアプライされる。別々の場所とは、バイオセンサー上のある点又はウェル、又はバイオセンサー上の大きな領域でありうる。第一の分子と第三のコントロール分子の混合物もまた、バイオセンサー上の別々の場所にアプライされる。そのバイオセンサーは、上記のバイオセンサーと同じ、又は第二のバイオセンサーでありうる。もしバイオセンサーが同じバイオセンサーであるならば、第二の別々の場所が、第一の分子と第三のコントロール分子の混合物のために使われうる。あるいは、別々のバイオセンサーの同じ場所が、第一及び第二の分子がバイオセンサーから洗浄された後で使われうる。第三のコントロール分子は、第一の分子と相互作用せず、そして第一の分子とおよそ同じサイズである。バイオセンサー又は複数のバイオセンサーの別々の場所からの光の反射波長におけるシフトが測定される。もし第一の分子と第二のテスト分子を有する別々の場所からの光の反射波長におけるシフトが、第一の分子と第三のコントロール分子を有する別々の場所からの反射波長におけるシフトより大きければ、その場合第一の分子と第二のテスト分子は相互作用している。相互作用は、例えば、核酸分子のハイブリダイゼーション、抗体又は抗体断片と抗原の特異的結合、及びポリペプチドの結合でありうる。第一の分子、第二のテスト分子、又は第三のコントロール分子は、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体(scFv)、F(ab)断片、F(ab’)2断片、Fv断片、小さな有機分子、細胞、ウィルス、及び細菌でありうる。
アミン機能化バイオセンサー
シリコン窒化物のような高い屈折率の材料の層が、プラスチック構造のような構造にコートされた後、デバイスは、高い屈折率の材料の表面上でアミン官能基の結合によって、センサーとしての使用のために準備される。プラスチックに基づいたバイオセンサーは、その表面にアミン官能基を与える化学修飾の間に、分解されうる(すなわち、センサー上の構造又は組成が変化する)。そのような分解を避けるため、本発明は、バイオセンサーのプラスチックにも対応できる試薬を用いて、バイオセンサーのアミン表面機能化のためのプロセスを提供する。高い屈折率の材料が、プラスチックバイオセンサーの格子表面上に溶着された後、そのセンサーは保管してもよく、又は機能化のために直接使用してもよい。センサーは、アミン機能化の手順の前に、ウェット(例えば溶媒などの液体を用いた洗浄)又はドライ(例えば、UV、オゾン、プラズマ)法を用いる洗浄工程に供される。一つの態様では、アミン機能化の手順は、(a)プラスチック比色共鳴バイオセンサーを、アルコール性シラン溶液にさらす、それから(b)さらされたプラスチック比色共鳴バイオセンサーをアルコールで洗う、という工程を含む。バイオセンサーが乾燥したら、格子表面はアミン官能基、すなわち、−NH2基を含む。
シリコン窒化物のような高い屈折率の材料の層が、プラスチック構造のような構造にコートされた後、デバイスは、高い屈折率の材料の表面上でアミン官能基の結合によって、センサーとしての使用のために準備される。プラスチックに基づいたバイオセンサーは、その表面にアミン官能基を与える化学修飾の間に、分解されうる(すなわち、センサー上の構造又は組成が変化する)。そのような分解を避けるため、本発明は、バイオセンサーのプラスチックにも対応できる試薬を用いて、バイオセンサーのアミン表面機能化のためのプロセスを提供する。高い屈折率の材料が、プラスチックバイオセンサーの格子表面上に溶着された後、そのセンサーは保管してもよく、又は機能化のために直接使用してもよい。センサーは、アミン機能化の手順の前に、ウェット(例えば溶媒などの液体を用いた洗浄)又はドライ(例えば、UV、オゾン、プラズマ)法を用いる洗浄工程に供される。一つの態様では、アミン機能化の手順は、(a)プラスチック比色共鳴バイオセンサーを、アルコール性シラン溶液にさらす、それから(b)さらされたプラスチック比色共鳴バイオセンサーをアルコールで洗う、という工程を含む。バイオセンサーが乾燥したら、格子表面はアミン官能基、すなわち、−NH2基を含む。
本発明の一つの観点においては、シラン溶液は、3−アミノプロピルトリエトキシシラン、及びエタノール又は他の適切な低分子量アルコールのようなアルコールを含む。同様に、適切な低分子量アルコールを用いて、バイオセンサーを洗浄してもよい。アミンでプラスチックのバイオセンサーをコートする一つの例は、まずセンサーを3−アミノプロピルトリエトキシシランとエタノールを含む溶液にさらし、それからエタノール中でセンサーを簡単に洗い、そして最後にセンサーを乾燥する。エタノール中の3−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度は、3−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度がエタノール中約1から約15%であるように調節されることができる。さらに、エタノールは約90%から100%(体積/体積、水で調節された)であってもよい。乾燥工程は、オーブン中で、例えば約70℃で10分間行われることができる。乾燥は、バイオセンサーの分解が起こらないように選択された温度で、より高い温度で行われることができる。
本発明に基づいて、多数の適切な温度、濃度、反応時間、及び硬化/インキュベーション時間を用いることができる。本発明の検討されるバリエーションは、表面のタイプ、シラン試薬(3−アミノプロピルトリメトキシシランなどの他のシラン)、シランの濃度、コーティングの溶媒又は溶媒の組み合わせ(例えば、エタノールと水)、コーティングの反応時間、洗浄溶媒又は溶媒の組み合わせ(例えば、エタノールと水)、硬化時間、及び硬化温度などを含む。
表面の処理
本発明の一つの態様において、バイオセンサー表面は化学的な処理によって修飾されうる。例えば、表面は、溶液中に表面を浸すことによって、溶液で処理されうる。あるいは、化学的蒸気又は噴霧凝華を含む気相の処理が、表面のコーティングのために使われうる。気相処理は、幾何学的に平らでない表面の等角的なコーティングを確実にするために使われうる。そのようなコーティングは、表面をシラン化する工程において、又は表面に他の有機材料を添加するために、使われうる。表面を処理する他の方法は、当業者によって認識されているだろう。
本発明の一つの態様において、バイオセンサー表面は化学的な処理によって修飾されうる。例えば、表面は、溶液中に表面を浸すことによって、溶液で処理されうる。あるいは、化学的蒸気又は噴霧凝華を含む気相の処理が、表面のコーティングのために使われうる。気相処理は、幾何学的に平らでない表面の等角的なコーティングを確実にするために使われうる。そのようなコーティングは、表面をシラン化する工程において、又は表面に他の有機材料を添加するために、使われうる。表面を処理する他の方法は、当業者によって認識されているだろう。
プラズマによる処理は、気相のコーティングプロセスの前に、一般的に使われうる。プラズマ処理は、表面上のほとんどの汚染を除去し、次に続く気相のコーティングプロセスの吸着を改善するために表面を活性化しうる。
気相のコーティングプロセスは、化学的機能性を付加し、そして吸着する湿気、有機汚染物、及びポリマーフィルム表面上の低分子量材料などを最小化するために使われうる。気相のコーティングは、表面の均一的な処理、ポリマーフィルムが処理される場合の裏側の処理が不要、多穴性の材料を処理する場合に穴が不要であることを含む、ただしそれらに限定されない長所を有する。そのようなコーティングは、シグマ・テクノロジーズ(トゥーソン、アリゾナ州)、4thステート(ベルモント、カリフォルニア州)、イールド・エンジニアリング(サン・ホセ、カリフォルニア州)、エリー・サイエンティフィック(ポーツマス、ニューハンプシャー州)、及びASTプロダクツ(advanced surface technologies)(ビルリカ、マサチューセッツ州)によって提供されているサービスを含む、ただしそれらに限定されない、本発明における有用性を与える。
音響バイオセンサー
本発明の別の態様において、音響バイオセンサーが使われる。音響バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び/又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の共鳴振動周波数の変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。共鳴振動周波数は、例えば、ピエゾ抵抗的なデバイス、微小機械化肘木、膜、又は音叉といった機械的な振動器、又は表面音波発振器などを用いることによって測定されうる。
本発明の別の態様において、音響バイオセンサーが使われる。音響バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び/又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の共鳴振動周波数の変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。共鳴振動周波数は、例えば、ピエゾ抵抗的なデバイス、微小機械化肘木、膜、又は音叉といった機械的な振動器、又は表面音波発振器などを用いることによって測定されうる。
電気バイオセンサー
本発明の別の態様において、電気バイオセンサーが使われる。電気バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び/又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の、抵抗的に、例えば、直流電流又は交流電流、低又は高周波数、電気容量、又はインダクタンスの変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。
本発明の別の態様において、電気バイオセンサーが使われる。電気バイオセンサーは、検体などの分子と、分子及び/又は検体の結合の結果としての溶着物の変化によってもたらされるバイオセンサー表面の、抵抗的に、例えば、直流電流又は交流電流、低又は高周波数、電気容量、又はインダクタンスの変化を検出することによって、表面に共有結合的に結合した化学的又は生物学的分子との、結合を測定する。
特異的な結合物質と結合パートナー
一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、もし存在するならば、例えば物理的吸着によって、又は化学的結合によって、一次元又は二次元格子、又はカバー層上に固定化される。特異的結合物質は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体(scFv)、F(ab)断片、F(ab’)2断片、Fv断片、小さな有機分子、ビオチン、細胞、ウィルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖又は二本鎖DNA溶液、RNA溶液、コンビナトリアルな化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、又は生物学的サンプル、でありうる。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊膜液、脳脊髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、又は前立腺液、などでありうる。
一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、もし存在するならば、例えば物理的吸着によって、又は化学的結合によって、一次元又は二次元格子、又はカバー層上に固定化される。特異的結合物質は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体(scFv)、F(ab)断片、F(ab’)2断片、Fv断片、小さな有機分子、ビオチン、細胞、ウィルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖又は二本鎖DNA溶液、RNA溶液、コンビナトリアルな化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、又は生物学的サンプル、でありうる。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊膜液、脳脊髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、又は前立腺液、などでありうる。
好ましくは、一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、バイオセンサー上の別々の場所のマイクロアレイ中に配置される。特異的結合物質のマイクロアレイは、表面が多くの別々の場所を含み、それぞれ異なった特異的結合物質を持つか又は異なった量の特異的結合物質を持つように、本発明のバイオセンサーの表面上の一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含む。例えば、あるアレイは、1、10、100、1,000、10,000、又は100,000の異なった場所を含む。そのようなバイオセンサー表面は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質が典型的にx−y座標の標準的なマス目パターン中にきれいに配置されているので、マイクロアレイと呼ばれる。しかしながら、本発明のマイクロアレイは、いずれかの標準的な、又は非標準的なパターンに配置された、一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含みうる。例えば、別々の場所は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質の点のマイクロアレイを定義できる。マイクロアレイの点は、直径およそ50からおよそ500ミクロンでありうる。マイクロアレイの点はまた、直径およそ150からおよそ200ミクロンでありうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、その特異的結合パートナーと結合しうる。
本発明のバイオセンサー上のマイクロアレイは、例えば、一次元又は二次元格子、又はカバー層表面上の場所のx−yマス目上に、一つ又はそれ以上の特異的結合物質の微小滴下量を置くことによって作られうる。バイオセンサーが、一つ又はそれ以上の結合パートナーを含むテストサンプルにさらされる場合、結合パートナーは、結合パートナーに対して高い親和性を有する特異的結合物質を含むマイクロアレイ上の特殊な場所に優先的に結合されるだろう。特殊な場所において、その表面上に結合パートナーが集まる場所もあれば、集まらない場所もあるだろう。
特異的結合物質は、本発明のバイオセンサーの表面に加えられた結合パートナーに、特異的に結合する。特異的結合物質は、その結合パートナーに特異的に結合するが、バイオセンサーの表面に加えられた他の結合パートナーには十分に結合しない。例えば、特異的結合物質が抗体であり、そしてその結合パートナーが抗原である場合、抗体は特定の抗原に特異的に結合するが、他の抗原には十分に結合しない。結合パートナーは、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体(scFv)、F(ab)断片、F(ab’)2断片、Fv断片、小さな有機分子、細胞、ウィルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖又は二本鎖DNA溶液、RNA溶液、コンビナトリアルな化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、又は生物学的サンプル、でありうる。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊膜液、脳脊髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、又は前立腺液、などでありうる。
本発明のマイクロアレイの一例は、アレイ内のそれぞれ別々の場所が、異なる核酸分子を含む、核酸のマイクロアレイである。この態様において、核酸マイクロアレイ内の点は、テストサンプル中の核酸の反対の鎖で、相補的な化学結合を検出する。
マイクロタイタープレートが、生化学的検定に使われる最も一般的なフォーマットであるのに対し、マイクロアレイは、貴重な試薬の量を最小化しながら一度で測定できる、生化学的な相互作用の数を最大化する方法として、徐々に見られるようになってきている。本発明のバイオセンサー上に、マイクロアレイスポッターを使って特異的結合物質のアプライを行うことによって、平方インチあたり10,000の特異的結合物質の密度が得られうる。一つのマイクロアレイの場所を調べるために照射ビームを集中させることによって、バイオセンサーは、ラベル不要なマイクロアレイ読み出しシステムとして使われうる。
一つ又はそれ以上の特異的結合物質の固定化
一つ又はそれ以上の結合物質のバイオセンサー上への固定化は、特異的結合物質が洗浄手順によって洗い落とされないように、及びテストサンプル中においてその結合パートナーへの結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように、行われる。表面化学方法のいくつかの異なるタイプが、様々なタイプのマイクロアレイやバイオセンサーの使用のために、例えば、ガラスに対しての特異的結合物質の共有結合のために実行された。これらの同じ方法は、本発明のバイオセンサーに容易に適合させうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質の結合のための正確な官能基を含むようなバイオセンサーの表面の準備は、バイオセンサーの製造プロセスのなくてはならない部分である。
一つ又はそれ以上の結合物質のバイオセンサー上への固定化は、特異的結合物質が洗浄手順によって洗い落とされないように、及びテストサンプル中においてその結合パートナーへの結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように、行われる。表面化学方法のいくつかの異なるタイプが、様々なタイプのマイクロアレイやバイオセンサーの使用のために、例えば、ガラスに対しての特異的結合物質の共有結合のために実行された。これらの同じ方法は、本発明のバイオセンサーに容易に適合させうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質の結合のための正確な官能基を含むようなバイオセンサーの表面の準備は、バイオセンサーの製造プロセスのなくてはならない部分である。
本願明細書で使われる、“化学的又は生物学的分子”という用語は、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに結合しうる、いずれかの化学的又は生物学的分子を表す。化学的又は生物学的分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、及び細胞の部分からなる群から選択されうる。
本願明細書で使われる、タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドという用語は、アミノ酸残基のポリマーを表す。その用語はまた、一つ又はそれ以上のアミノ酸が、翻訳後のプロセス(例えば、グリコシル化やリン酸化)によって修飾されたアミノ酸を含む、天然のアミノ酸に相当する化学的アナログである、アミノ酸ポリマーにも適用される。本願明細書で使われる“タンパク質”という用語は、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、成長因子、など、限定なく含まれ、またそれに限定されないものを意味する。
“ポリペプチド”という用語は、ポリマーの長さを問わないアミノ酸のポリマーを表す;従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、天然のポリペプチド及び合成のポリペプチドの両方を表す。この用語は、ポリペプチドの化学的又は翻訳後修飾を含みうる。それゆえ、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質の官能基、及びその他同類のものの共有結合を含むポリペプチドの修飾は、ポリペプチドという用語によって明白に含まれる。化学的に修飾されたポリペプチドは、同定又はキャプチャータグがポリペプチドに取り込まれたものを含む。天然又は上記の例にリストされているその他の化学修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこにでも起こりうる。同じタイプの修飾が、与えられたポリペプチドのいくつかの部位で同じ又は変化する度合いにおいて存在することは、評価されるだろう。また、与えられたポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として枝分かれしていてもよく、そして枝分かれしている又はしておらず、環状であってもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、フォスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、水素付加、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレニル化、硫酸化、アルギニル化などの転移RNAを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、及びユビキチン化、を含む。(例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993);Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1−12(1983);Seifter et al.,Meth Enzymol 182:626−646(1990);Rattan et al.,Ann NY Acad Sci 663:48−62(1992)を参照)。また、一つ又はそれ以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然のアミノ酸、無関係な生物学的システムにおいて天然にのみ起こるアミノ酸、ほ乳類のシステム由来の修飾アミノ酸などを含む)、置換された結合、ならびに当該技術分野で知られた他の修飾を持つ、天然及び非天然の両方のポリペプチドを含むポリペプチドが定義内に含まれる。ポリペプチドは、天然物又は合成品であることができる。
一つ又はそれ以上の特異的結合物質は、物理的吸着(すなわち化学的リンカーの使用なしで)によって、又は化学的結合(すなわち化学的リンカーを使用して)によってバイオセンサーの表面に結合しうる。化学的結合は、バイオセンサーの表面上で特異的結合物質のより強い結合を産み出すことができ、そして表面に結合した分子の明確な配向及び配座を与えうる。
約0.1ng/mlより低い濃度での結合パートナーの検出のために、バイオセンサーに結合した結合パートナーを、バイオセンサーの表面上のさらなる層へと増幅及び伝達することが望ましい。バイオセンサー上に溶着した質量の増加は、光路長の増加の結果として簡単に検出できる。バイオセンサーの表面上へのより大きい質量の組み入れによって、表面上の結合パートナーの光学密度もまた増加し、従って加わった質量がない場合に起こるだろうよりも大きな共鳴波長のシフトが与えられる。質量の付加は、例えば、酵素的に“サンドイッチ”検定を通して、又は、様々なサイズ及び組成の適切に結合させたビーズ又はポリマーの形でバイオセンサーの表面への質量の直接的な添加によって、達成されうる。この原理は、質量の増幅なしで達した感度限界を1500倍以上も超える感度の増加を示す、他のタイプの光学バイオセンサーに利用された。例えば、Jenison et al.,“Interference−based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon,”Nature Biotechnology,19:62−65,2001を参照。
一つの例として、NH2機能化バイオセンサーは、表面上に固定化された一本鎖DNAキャプチャープローブを含む特異的結合物質を有することができる。キャプチャープローブは、その相補的な標的結合パートナーと選択的に相互作用する。結合パートナーは、順に、“検出器”分子と結合するだろう配列又はタグを含むようにデザインされうる。検出器分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とのリンカーを含むことができ、正確な酵素がさらされた場合、検出器分子が存在する場合のみ、バイオセンサー上に付加材料が選択的に溶着するだろう。そのような手順は、例えば、数分内にバイオセンサーに300オングストロームの検出可能な生体材料を加えることができる。
“サンドイッチ”方法はまた、検出感度を向上させるために使われうる。この方法において、大きな分子量の分子が、低分子量の分子の存在を増幅するのに使われうる。例えば、約0.1kDaから約20kDaの分子量を持つ結合パートナーは、例えば、スクシニミジル−6−[a−メチル−a−(2−ピリジル−ジチオ)トルアミド]ヘキサノエイト(SMPT)、又はジメチルピメリミデイト(DMP)、ヒスチジン、又はビオチン分子でタグを付けることができる。タグがビオチンの場合、ビオチン分子は、60kDaの分子量を持つストレプトアビジンと強く結合するであろう。ビオチン/ストレプトアビジンの相互作用は高度に特異的であるから、ストレプトアビジンは、小さな結合パートナーによってのみ産み出されるだろうシグナルを60倍にまで増幅する。
検出感度は、化学的に誘導化された小さな粒子の使用を通してさらに向上されうる。コロイド状の金、様々なプラスチック、又はガラスで作られた、約3から300nmの直径を持つ“ナノ粒子”が、結合パートナーに選択的に共有的にそれらに結合することができるであろう分子種によってコートされうる。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコートされたナノ粒子は、バイオセンサー表面上でビオチンタグの付加された結合パートナーの視感度を向上させるのに使われうる。ストレプトアビジン分子自身は60kDaの分子量を持つのに対し、誘導化されたビーズは、例えば60kDaを含む、いずれのサイズの分子量を持ちうる。大きなビーズの結合は、バイオセンサー表面上で光学密度の大きな変化及び容易に測定できるシグナルを結果としてもたらすだろう。この方法は、感度分解において、およそ1000倍の結果をもたらすことができる。
バイオセンサーを使用する方法
本発明のバイオセンサーは、一つ又は多数の特異的結合物質/結合パートナーの相互作用を並行して調べるために使われうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質とそのそれぞれの結合パートナーとの結合は、ラベルを使うことなく、その表面に一つ又はそれ以上の特異的結合物質が固定化されたバイオセンサーに対し、一つ又はそれ以上の結合パートナーをアプライすることによって、検出されうる。例えば、SWSバイオセンサーは、光で照らされ、反射波長の最大、又は光の伝達波長の最小が、バイオセンサーから検出される。もし一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、そのそれぞれの結合パートナーに結合した場合、そのとき反射した光の波長が、一つ又はそれ以上の特異的結合物質がそのそれぞれの結合パートナーと結合していない場合を比べて、シフトする。SWSバイオセンサーが、一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含むアレイの別々の場所にコートされている場合、そのとき反射した波長の最大又は光の伝達波長の最小は、バイオセンサーのそれぞれ別の場所から検出される。
本発明のバイオセンサーは、一つ又は多数の特異的結合物質/結合パートナーの相互作用を並行して調べるために使われうる。一つ又はそれ以上の特異的結合物質とそのそれぞれの結合パートナーとの結合は、ラベルを使うことなく、その表面に一つ又はそれ以上の特異的結合物質が固定化されたバイオセンサーに対し、一つ又はそれ以上の結合パートナーをアプライすることによって、検出されうる。例えば、SWSバイオセンサーは、光で照らされ、反射波長の最大、又は光の伝達波長の最小が、バイオセンサーから検出される。もし一つ又はそれ以上の特異的結合物質が、そのそれぞれの結合パートナーに結合した場合、そのとき反射した光の波長が、一つ又はそれ以上の特異的結合物質がそのそれぞれの結合パートナーと結合していない場合を比べて、シフトする。SWSバイオセンサーが、一つ又はそれ以上の特異的結合物質を含むアレイの別々の場所にコートされている場合、そのとき反射した波長の最大又は光の伝達波長の最小は、バイオセンサーのそれぞれ別の場所から検出される。
本発明の一つの態様において、種々の特異的結合物質、例えば抗体は、本発明のバイオセンサー上にアレイフォーマットで固定化されうる。次に、バイオセンサーは、タンパク質のような結合パートナーを含む興味のあるテストサンプルと接触される。バイオセンサー上に固定化された抗体に特異的に結合するタンパク質のみが、バイオセンサーに結合したままになる。そのような方法は、根本的に酵素結合免疫検定法の大スケールの種類である;しかしながら、酵素又は蛍光ラベルの使用は必要ない。
酵素の活性は、一つ又はそれ以上の特異的結合物質が固定化されたバイオセンサーに対して、一つ又はそれ以上の酵素をアプライすることによって検出されうる。例えば、バイオセンサーは洗浄され、光で照らされる。光の反射した波長がバイオセンサーから検出される。一つ又はそれ以上の酵素が、酵素活性によって、バイオセンサーの一つ又はそれ以上の特異的結合物質を変化させた場合、光の反射した波長はシフトする。
加えて、テストサンプル、例えば、結合パートナーを含む細胞溶解物は、本発明のバイオセンサーにアプライされ、続いて結合しなかった材料を除去するために洗浄される。バイオセンサーに結合した結合パートナーは、バイオセンサーから溶出され、例えば、質量分析によって同定されうる。任意に、ファージDNAディスプレイライブラリーは本発明のバイオセンサーにアプライされ、続いて結合しなかった材料を除去するために洗浄される。バイオセンサーに結合した個々のファージ粒子は単離されうる、そしてこれらのファージ粒子の挿入物はそれから結合パートナーの同定を決定するために配列決定されうる。
上記の応用のために、そして特にプロテオミクスへの応用において、本発明のバイオセンサー上に、テストサンプル由来の結合パートナーのような材料を選択的に結合させる能力、それに続いて、さらなる分析のために結合した材料をバイオセンサーの別々の場所から選択的に除去する能力は、有利である。本発明のバイオセンサーはまた、光の反射した波長のシフトを測定することによって、バイオセンサーアレイの別々の場所に結合したサンプル由来の結合パートナーを検出し、その量を定量する能力を持つ。例えば、一つの別個のバイオセンサーの場所での波長のシフトは、バイオセンサーアレイの別々の場所に結合した結合パートナーの量を決定するために、他の別個のバイオセンサーの場所でのポジティヴ及びネガティヴコントロールと比較することができる。
SWSバイオセンサーの組み立て
SWSバイオセンサーの詳細な製造プロセスは以前に述べられている。例えば、Cunningham B.etal.,Sensor and Actuators B 6779,1−6(2002)を参照、本願明細書に引用して援用する。具体的に、光学グレードのポリマーフィルムが、SWSセンサーの支持として使われた。UV硬化型のアクリルベースのポリマーコーティングが、円形がSWS構造を形成する96ウェルマイクロタイタープレートの標準的フォーマットに相当する、96個の円を有するシリコンの覆いを用いて、フィルム上をコートされ、複製された。ゼノン・コーポレーション(ウォバーン、マサチューセッツ州)により提供されたUVランプ RC600が、複製後のコーティングの硬化のために使われた。続いて、二酸化チタンの層及び二酸化シリコンの層が、表面の上面に溶着された。
SWSバイオセンサーの詳細な製造プロセスは以前に述べられている。例えば、Cunningham B.etal.,Sensor and Actuators B 6779,1−6(2002)を参照、本願明細書に引用して援用する。具体的に、光学グレードのポリマーフィルムが、SWSセンサーの支持として使われた。UV硬化型のアクリルベースのポリマーコーティングが、円形がSWS構造を形成する96ウェルマイクロタイタープレートの標準的フォーマットに相当する、96個の円を有するシリコンの覆いを用いて、フィルム上をコートされ、複製された。ゼノン・コーポレーション(ウォバーン、マサチューセッツ州)により提供されたUVランプ RC600が、複製後のコーティングの硬化のために使われた。続いて、二酸化チタンの層及び二酸化シリコンの層が、表面の上面に溶着された。
エポキシシランを用いたシラン化
組み立てられたSWSバイオセンサーシートは、脱イオン水中50ppmの水酸化ナトリウム溶液に20分間浸され、それから大量の脱イオン水で洗われた。シラン溶液は、ダウ・コーニング(ミッドランド、ミシガン州)によって提供された、4mLの3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(Z−6040)と、196mLの95%エタノール、5%の脱イオン水、及び0.1mLの酢酸を含む溶媒混合物を用いて調製された。シラン溶液は、シラン化の前に15分間寝かせた。洗浄したSWSバイオセンサーシートが、シラン溶液中に1分間浸された。それらはその後、200mLのイソプロピルアルコールで3回洗浄された。SWSバイオセンサーは、遠心を用いて乾燥され、65%の相対湿度の部屋で18時間硬化された。
組み立てられたSWSバイオセンサーシートは、脱イオン水中50ppmの水酸化ナトリウム溶液に20分間浸され、それから大量の脱イオン水で洗われた。シラン溶液は、ダウ・コーニング(ミッドランド、ミシガン州)によって提供された、4mLの3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(Z−6040)と、196mLの95%エタノール、5%の脱イオン水、及び0.1mLの酢酸を含む溶媒混合物を用いて調製された。シラン溶液は、シラン化の前に15分間寝かせた。洗浄したSWSバイオセンサーシートが、シラン溶液中に1分間浸された。それらはその後、200mLのイソプロピルアルコールで3回洗浄された。SWSバイオセンサーは、遠心を用いて乾燥され、65%の相対湿度の部屋で18時間硬化された。
ポリエチレンイミンを用いた表面移植
アルドリッチ・ケミカル(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)により50%の水溶液として提供されたポリエチレンイミン(PEI)は、20%、15%、10%、5%、及び1.5%へと希釈され、そして濃塩酸を用いてpH8.0に調節された。実施例2に記載されたシラン化されたSWSバイオセンサーシートは、調製されたPEI溶液に18時間浸され、そしてまず脱イオン水を用いて洗われ、その後3X PBS+0.5%Tween20を用いて洗われ、そして最後に脱イオン水を用いて洗われた。
アルドリッチ・ケミカル(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)により50%の水溶液として提供されたポリエチレンイミン(PEI)は、20%、15%、10%、5%、及び1.5%へと希釈され、そして濃塩酸を用いてpH8.0に調節された。実施例2に記載されたシラン化されたSWSバイオセンサーシートは、調製されたPEI溶液に18時間浸され、そしてまず脱イオン水を用いて洗われ、その後3X PBS+0.5%Tween20を用いて洗われ、そして最後に脱イオン水を用いて洗われた。
表面上のアミン基の密度の測定
実施例3に記載されたSWSバイオセンサーシートは、25x75mmのサイズへと切られた。様々な表面上のアミン基の密度を測定するために、切られたSWSバイオセンサーシート、コーニング(コーニング、ニューヨーク州)製のコーニングGAPS IIアミノ−シランコートスライド、テレケム・インターナショナル(サニーベール、カリフォルニア州)製のArryitスーパーアミンスライド、シグマ(セントルイス、ミズーリ州)製のシグマSilane−Prepアミンスライド、及びコントロールとして洗浄したガラススライド、からなる5つのグループのスライドが、それぞれ5つの四角形の皿に置かれた。測定は三連で行われた。20mLの50mM炭酸水素ナトリウムバッファー、pH8.5中、0.1mMスルフォスクシニジル−4−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−ブチレート(Sulfo−SDTB)が調製され、そしてすぐにそれぞれの皿へと注がれた。皿は30分間振とうされ、サンプルは続いて乾燥された。MJリサーチ(ウォータータウン、マサチューセッツ州)製の19x60mm2の開口ガスケット試験槽が、それぞれのサンプルの上に置かれた。400μLの30%過塩素酸が、それぞれの試験槽に加えられた。サンプルはその後10分間振とう器で振とうされた。200μLの最終溶液が、モレキュラー・デバイス(サニーベール、カリフォルニア州)製のプレート読み取り器SpectraMax Plusを用いて、495nmの吸光度で測定された。生産物の濃度は、70,000M-1cm-1の減衰係数を用いた測定吸光度に基づいて計算された。Gaur,R.K. and Gupt,K.C.,Anal.Biochem.180,253−258(1989)を参照。サンプル上のアミン基の密度は、図3に表される。この実験結果は、接近可能な、そして比較的大きなサイズのSulfo−SDTB(分子量605.59)と反応することができる、表面上のアミン基の密度を反映する。
実施例3に記載されたSWSバイオセンサーシートは、25x75mmのサイズへと切られた。様々な表面上のアミン基の密度を測定するために、切られたSWSバイオセンサーシート、コーニング(コーニング、ニューヨーク州)製のコーニングGAPS IIアミノ−シランコートスライド、テレケム・インターナショナル(サニーベール、カリフォルニア州)製のArryitスーパーアミンスライド、シグマ(セントルイス、ミズーリ州)製のシグマSilane−Prepアミンスライド、及びコントロールとして洗浄したガラススライド、からなる5つのグループのスライドが、それぞれ5つの四角形の皿に置かれた。測定は三連で行われた。20mLの50mM炭酸水素ナトリウムバッファー、pH8.5中、0.1mMスルフォスクシニジル−4−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−ブチレート(Sulfo−SDTB)が調製され、そしてすぐにそれぞれの皿へと注がれた。皿は30分間振とうされ、サンプルは続いて乾燥された。MJリサーチ(ウォータータウン、マサチューセッツ州)製の19x60mm2の開口ガスケット試験槽が、それぞれのサンプルの上に置かれた。400μLの30%過塩素酸が、それぞれの試験槽に加えられた。サンプルはその後10分間振とう器で振とうされた。200μLの最終溶液が、モレキュラー・デバイス(サニーベール、カリフォルニア州)製のプレート読み取り器SpectraMax Plusを用いて、495nmの吸光度で測定された。生産物の濃度は、70,000M-1cm-1の減衰係数を用いた測定吸光度に基づいて計算された。Gaur,R.K. and Gupt,K.C.,Anal.Biochem.180,253−258(1989)を参照。サンプル上のアミン基の密度は、図3に表される。この実験結果は、接近可能な、そして比較的大きなサイズのSulfo−SDTB(分子量605.59)と反応することができる、表面上のアミン基の密度を反映する。
偏光解析器を用いたPEI層の厚さの測定
SI−TECH(ジェニーバ、イリノイ州)より提供されたシリコンウェハースGH503−3が2x3cmの小片に切られた。その2x3cmの小片は、脱イオン水中10%の水酸化ナトリウムに20分間浸し、その後大量の脱イオン水で洗うことによって洗浄された。乾燥の後、そのシリコン小片は、実施例2に記載された手順に従って、エポキシシランZ−6040を用いてシラン化された。5つのグループのシラン化シリコン小片は、三連で、50mLの脱イオン水中20%、15%、10%、5%、及び1.5%PEI、pH8.0に18時間浸され、その後大量の水で洗われた。それぞれのグループのサンプルの5つの小片は、遠心を用いて乾燥された。別のそれぞれのグループ由来のサンプルの5つの小片は、液体窒素で凍結され、それから凍結乾燥機中で乾燥された。2つのセットのサンプルのPEIの厚さは、ガートナー・サイエンティフィック社(スコーキー、イリノイ州)によって製造されたGaertner L116A偏光解析器を用いて測定された。厚さは、より高い濃度のPEIが使われた場合には、より厚いPEI層がエポキシ表面に移植されたことを示す(図4参照)。遠心で乾燥されたサンプルと比較して、同じグループの凍結乾燥されたサンプルは、より大きな厚さを示した。同じ量のPEIが、凍結乾燥と遠心のサンプルの両方の表面上に移植されたが、凍結乾燥されたサンプルのより厚いPEI層が観測された。それは、凍結乾燥されたサンプル上のPEI層は多穴性であることを示し、凍結乾燥が水性媒体中で移植されたPEIのあるポリマー構造を凍らせた。このことは、表面上のPEIポリマー鎖が、乾燥型のPEI層と比べて、水性媒体中ではより伸ばされたということを示した。伸びたPEIポリマー鎖は、少なくとも50オングストロームの厚さを有する、表面上の接触可能な層を形成した。水性媒体中の表面のPEI層の厚さは、二次元表面と比較して立体障害が減少することが期待される、三次元ポリマー基板である構造を確立した。
SI−TECH(ジェニーバ、イリノイ州)より提供されたシリコンウェハースGH503−3が2x3cmの小片に切られた。その2x3cmの小片は、脱イオン水中10%の水酸化ナトリウムに20分間浸し、その後大量の脱イオン水で洗うことによって洗浄された。乾燥の後、そのシリコン小片は、実施例2に記載された手順に従って、エポキシシランZ−6040を用いてシラン化された。5つのグループのシラン化シリコン小片は、三連で、50mLの脱イオン水中20%、15%、10%、5%、及び1.5%PEI、pH8.0に18時間浸され、その後大量の水で洗われた。それぞれのグループのサンプルの5つの小片は、遠心を用いて乾燥された。別のそれぞれのグループ由来のサンプルの5つの小片は、液体窒素で凍結され、それから凍結乾燥機中で乾燥された。2つのセットのサンプルのPEIの厚さは、ガートナー・サイエンティフィック社(スコーキー、イリノイ州)によって製造されたGaertner L116A偏光解析器を用いて測定された。厚さは、より高い濃度のPEIが使われた場合には、より厚いPEI層がエポキシ表面に移植されたことを示す(図4参照)。遠心で乾燥されたサンプルと比較して、同じグループの凍結乾燥されたサンプルは、より大きな厚さを示した。同じ量のPEIが、凍結乾燥と遠心のサンプルの両方の表面上に移植されたが、凍結乾燥されたサンプルのより厚いPEI層が観測された。それは、凍結乾燥されたサンプル上のPEI層は多穴性であることを示し、凍結乾燥が水性媒体中で移植されたPEIのあるポリマー構造を凍らせた。このことは、表面上のPEIポリマー鎖が、乾燥型のPEI層と比べて、水性媒体中ではより伸ばされたということを示した。伸びたPEIポリマー鎖は、少なくとも50オングストロームの厚さを有する、表面上の接触可能な層を形成した。水性媒体中の表面のPEI層の厚さは、二次元表面と比較して立体障害が減少することが期待される、三次元ポリマー基板である構造を確立した。
X線光電子分光法(XPS)を用いた表面の特徴づけ
実施例3で調製されたサンプルの表面成分は、XPSを用いて分析された。55°の発信角度が選択され、そしておよそ5nmの最上表面層が分析された。窒素はPEIによってのみ供給され、そして表面のPEI量を見積もるために用いられた。表1は、グラフト反応に使われたPEIの濃度が高くなるにつれて増加した窒素の含量を示す。
実施例3で調製されたサンプルの表面成分は、XPSを用いて分析された。55°の発信角度が選択され、そしておよそ5nmの最上表面層が分析された。窒素はPEIによってのみ供給され、そして表面のPEI量を見積もるために用いられた。表1は、グラフト反応に使われたPEIの濃度が高くなるにつれて増加した窒素の含量を示す。
PEIセンサー表面へのビオチンの固定化
実施例2のシラン化されたセンサーシートは、底のない96ウェルプレートの底に取り付けられた。200μLの脱イオン水中15%PEI、pH8.0が、3x6のウェルに入れられ、そして18時間後に除去された。そのウェルは、実施例3に記載された手順に従って洗われた。エポキシ表面ウェルの残りは、後の実験でコントロールとして使われた。
実施例2のシラン化されたセンサーシートは、底のない96ウェルプレートの底に取り付けられた。200μLの脱イオン水中15%PEI、pH8.0が、3x6のウェルに入れられ、そして18時間後に除去された。そのウェルは、実施例3に記載された手順に従って洗われた。エポキシ表面ウェルの残りは、後の実験でコントロールとして使われた。
1mg/mLのビオチン−PEG−CO2−NHS(式量3400)及び1mL/mLのmPEG−CM−HBA−NHS(式量3400)が、1xPBSバッファー(pH7.4)(“PBS”)中に調製された。両方の試薬は、ネクター・セラピューティクス、サンカルロス、カリフォルニア州によって提供された。200mLの2つの調製された試薬溶液及びコントロールとしてのPBSは、3つのグループのそれぞれについて6つのウェルに入れられ、そしてPBSで3回洗われ、それから96ウェルプレート読み取り器(SRUバイオシステムズ、ウォバーン、マサチューセッツ州)を用いて測定された。表面に結合した分子の量の検出応答、PWVシフトは、以前に述べた。Cuningham B.,et al.,Sensor and Actuators B 6779:1−6(2002)を参照。3つのグループのPWVは、図5に示される。Biotin−PEG−CO2−NHS及びmPEG−CM−HBA−NHSの両方が、コントロールと比較して、2つの試薬から、PEI上のアミンとNHSエステルの反応を用いて、センサー表面に固定化された。
ビオチン化されたPEI表面へのストレプトアビジンの結合
100μg/mLのストレプトアビジン(SA)が、プロザイム社(サンリアンドロ、カリフォルニア州)によって提供された、SA10を用いてPBS中に調製された。200mLのSA溶液及びPBSコントロールが、実施例6のそれぞれのグループにおける3つのウェル及びエポキシ表面ウェルに、それぞれ加えられた。室温での60分のインキュベーションの後、実験ウェルはPBSを用いて3回洗われた。SA結合の応答は、96ウェルプレート読み取り器を用いて測定され、そして図6に示される。SAは、他の7つのコントロールグループと比較して、はっきりとPEIを用いた表面に固定化されたビオチンと結合した。
100μg/mLのストレプトアビジン(SA)が、プロザイム社(サンリアンドロ、カリフォルニア州)によって提供された、SA10を用いてPBS中に調製された。200mLのSA溶液及びPBSコントロールが、実施例6のそれぞれのグループにおける3つのウェル及びエポキシ表面ウェルに、それぞれ加えられた。室温での60分のインキュベーションの後、実験ウェルはPBSを用いて3回洗われた。SA結合の応答は、96ウェルプレート読み取り器を用いて測定され、そして図6に示される。SAは、他の7つのコントロールグループと比較して、はっきりとPEIを用いた表面に固定化されたビオチンと結合した。
ポリビニルアミンを用いた表面移植
LUPAMINR9095という商標の下、BASF社(マウントオリーヴ、ニュージャージー州)によって水中20%の溶液で供給された、ポリビニルアミン(PVA)は、水を用いて15%に希釈され、濃塩酸を用いてpH7.4にまで調節された。100μLのPVA溶液が、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えられた。96ウェルプレートは、底のない96ウェルプレートに対して、実施例2に記載されたようなシラン化されたSWSバイオセンサーシートを取り付けることによって、組み立てられた。PVA溶液は、ウェルの中で室温にて一晩、エポキシシラン処理された表面と反応され、そして二日目に除去された。そのウェルは、水を用いて3回洗われ、そして空にされた。100μLの25%グルタルアルデヒド水溶液が、それぞれのウェルに加えられ、そして2時間のインキュベーションの後除去された。ウェルは、水で3回、pH7.4のPBSバッファーで3回洗われ、そしてPBS中で保管された。
LUPAMINR9095という商標の下、BASF社(マウントオリーヴ、ニュージャージー州)によって水中20%の溶液で供給された、ポリビニルアミン(PVA)は、水を用いて15%に希釈され、濃塩酸を用いてpH7.4にまで調節された。100μLのPVA溶液が、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えられた。96ウェルプレートは、底のない96ウェルプレートに対して、実施例2に記載されたようなシラン化されたSWSバイオセンサーシートを取り付けることによって、組み立てられた。PVA溶液は、ウェルの中で室温にて一晩、エポキシシラン処理された表面と反応され、そして二日目に除去された。そのウェルは、水を用いて3回洗われ、そして空にされた。100μLの25%グルタルアルデヒド水溶液が、それぞれのウェルに加えられ、そして2時間のインキュベーションの後除去された。ウェルは、水で3回、pH7.4のPBSバッファーで3回洗われ、そしてPBS中で保管された。
ポリビニルアミン機能化SWSバイオセンサー表面上のストレプトアビジンの固定化
プロザイム社(サンリアンドロ、カリフォルニア州)によって提供されたSA10を用いて、5mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4中に調製された、50μLの0.5mg/mLのSA溶液が、実施例9に記載されたプレートのそれぞれの空のウェルに加えられた。そのプレートは、図7左側に見られるような、ストレプトアビジンの固定化の応答を観測するために、96ウェルプレート読み取り器(SRUバイオシステムズ、ウォバーン、マサチューセッツ州)上に置かれた。20時間の固定化の後、SA溶液は除去され、そしてそのウェルはPBSバッファー(pH7.4)を用いて洗われた。PVA及びコントロールを通した機能化ウェル上のSA固定化の終点は、図7右側に示される。
プロザイム社(サンリアンドロ、カリフォルニア州)によって提供されたSA10を用いて、5mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4中に調製された、50μLの0.5mg/mLのSA溶液が、実施例9に記載されたプレートのそれぞれの空のウェルに加えられた。そのプレートは、図7左側に見られるような、ストレプトアビジンの固定化の応答を観測するために、96ウェルプレート読み取り器(SRUバイオシステムズ、ウォバーン、マサチューセッツ州)上に置かれた。20時間の固定化の後、SA溶液は除去され、そしてそのウェルはPBSバッファー(pH7.4)を用いて洗われた。PVA及びコントロールを通した機能化ウェル上のSA固定化の終点は、図7右側に示される。
処理された表面上に固定化されたSAに対するビオチンの応答
シグマ(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)によって提供されたビオチン(カタログ番号B0301)のPBSバッファー(pH7.4)中の0.05mg/mLの溶液が、実施例10に記載されたように調製された、SA結合表面の4つのウェルへと加えられ、ビオチンとSAの相互作用を飽和させるように0.5時間インキュベートされた。そのウェルは、PBSバッファーで3回洗われ、その後空にされた。その4つのビオチン処理されたウェルは、コントロールとして使われた。90μLのPBSバッファーが、4つの異なるSAが結合した空のウェル及び4つのコントロールウェルに入れられた。0.6分のベースラインの読み取りの後、10μLのPBSバッファー中0.5μg/mLのビオチンが、4つのビオチン処理されたウェル及び4つのコントロールウェルへと加えられた。図8に示したビオチンの応答は、固定化されたSAが活性を保持していたことを示す。
シグマ(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)によって提供されたビオチン(カタログ番号B0301)のPBSバッファー(pH7.4)中の0.05mg/mLの溶液が、実施例10に記載されたように調製された、SA結合表面の4つのウェルへと加えられ、ビオチンとSAの相互作用を飽和させるように0.5時間インキュベートされた。そのウェルは、PBSバッファーで3回洗われ、その後空にされた。その4つのビオチン処理されたウェルは、コントロールとして使われた。90μLのPBSバッファーが、4つの異なるSAが結合した空のウェル及び4つのコントロールウェルに入れられた。0.6分のベースラインの読み取りの後、10μLのPBSバッファー中0.5μg/mLのビオチンが、4つのビオチン処理されたウェル及び4つのコントロールウェルへと加えられた。図8に示したビオチンの応答は、固定化されたSAが活性を保持していたことを示す。
本発明、そしてそれを製造及び使用する方法とプロセスは、今、それに関連するいずれの当業者が同じものを作り、使うことができるように、十分な、明白な、簡潔な、及び正確な用語で記載されている。前述の発明の好ましい態様、及び特許請求の範囲に記載された発明の本質又は範囲から逸脱しない範囲で修正をなすことができることが、理解されるだろう。
Claims (43)
- 高密度アミン機能化表面を調製するための方法であって、
(a)エポキシシランを用いて表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し;そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応する条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、このことにより高密度アミン機能化表面を形成する、
の各工程を含む方法。 - 一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサー。
- バイオセンサーが光学センサーである、請求項3記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが比色共鳴バイオセンサーである、請求項4記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが音響バイオセンサーである、請求項3記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが電気バイオセンサーである、請求項3記載のバイオセンサー。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが同一又は異なっている、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが同一である、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが一級アミンを含む、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが二級アミンを含む、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーが一級及び二級アミンを含む、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリエチレンイミンを含む、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリエチレンイミンからなる、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリビニルアミンを含む、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがポリビニルアミンからなる、請求項1記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、及び細胞の部分からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子がタンパク質を含む、請求項17記載の方法。
- タンパク質が酵素である、請求項18記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項18記載の方法。
- タンパク質が、アビジン又はストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項18記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子がペプチドを含む、請求項2記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子がポリヌクレオチドを含む、請求項2記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子が、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、又は細胞の部分を含む、請求項2記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子が小分子を含む、請求項2記載の方法。
- 化学的又は生物学的分子がビオチンを含む、請求項2記載の方法。
- アミン含有ポリマーが同一又は異なっている、及びアミン含有ポリマーが2つ又はそれ以上のアミン基を含む、機能性エポキシを介して表面に共有結合的に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む、高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
- アミン含有ポリマーが3つ又はそれ以上のアミン基を含む、請求項27記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
- アミン含有ポリマーがポリエチレンイミンを含む、請求項27記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
- アミン含有ポリマーがポリビニルアミンを含む、請求項27記載の高密度アミン機能化ポリマーマトリクス。
- 生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項1記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
- 生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項5記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
- 生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項13記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
- 生体分子を表面に固定化する方法であって、生体分子を、請求項14記載の高密度アミン機能化表面と接触させ、このことにより生体分子が固定化される、ことを含む方法。
- 高密度アミン機能化表面を含むバイオセンサーであって、高密度アミン機能化表面が、
(a)エポキシシランを用いて表面を処理してエポキシ機能性表面を形成し、そして
(b)一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーがエポキシ機能性表面と反応する条件下で、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーを含む溶液をエポキシ機能性表面に加えることにより、一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーをエポキシ機能性表面に結合させ、ここのことにより高密度アミン機能化表面を形成することを含む方法により調製される、ことを特徴とするバイオセンサー。 - バイオセンサーが光学センサーである、請求項35記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが比色析共鳴バイオセンサーである、請求項36記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが音響バイオセンサーである、請求項35記載のバイオセンサー。
- バイオセンサーが電気バイオセンサーである、請求項35記載のバイオセンサー。
- 表面がプラスチック表面である、請求項1記載の方法。
- 一つ又はそれ以上の化学的又は生物学的分子を、表面に結合した一つ又はそれ以上のアミン含有ポリマーに共有結合的に結合させる工程をさらに含む、請求項40記載の方法。
- 表面がプラスチック表面である、請求項3記載のバイオセンサー。
- 表面がプラスチック表面である、請求項35記載のバイオセンサー。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010525334A (ja) * | 2007-04-19 | 2010-07-22 | エス アール ユー バイオシステムズ,インコーポレイテッド | 固定化された標的と直接結合する小分子を検出するためにバイオセンサーを使用する方法 |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8111401B2 (en) | 1999-11-05 | 2012-02-07 | Robert Magnusson | Guided-mode resonance sensors employing angular, spectral, modal, and polarization diversity for high-precision sensing in compact formats |
US7167615B1 (en) | 1999-11-05 | 2007-01-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same |
US7371562B2 (en) * | 2000-10-30 | 2008-05-13 | Sru Biosystems, Inc. | Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure |
US7575939B2 (en) | 2000-10-30 | 2009-08-18 | Sru Biosystems, Inc. | Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements |
US7524625B2 (en) * | 2000-10-30 | 2009-04-28 | Sru Biosystems, Inc. | Real time binding analysis of antigens on a biosensor surface |
US7094595B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-08-22 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions |
US7927822B2 (en) | 2002-09-09 | 2011-04-19 | Sru Biosystems, Inc. | Methods for screening cells and antibodies |
US7309614B1 (en) | 2002-12-04 | 2007-12-18 | Sru Biosystems, Inc. | Self-referencing biodetection method and patterned bioassays |
US7434476B2 (en) * | 2003-05-07 | 2008-10-14 | Califronia Institute Of Technology | Metallic thin film piezoresistive transduction in micromechanical and nanomechanical devices and its application in self-sensing SPM probes |
US7552645B2 (en) * | 2003-05-07 | 2009-06-30 | California Institute Of Technology | Detection of resonator motion using piezoresistive signal downmixing |
US7302856B2 (en) * | 2003-05-07 | 2007-12-04 | California Institute Of Technology | Strain sensors based on nanowire piezoresistor wires and arrays |
US8298780B2 (en) | 2003-09-22 | 2012-10-30 | X-Body, Inc. | Methods of detection of changes in cells |
CA2604099C (en) * | 2005-04-12 | 2011-02-15 | Sru Biosystems, Inc. | Proteolipid membrane & lipid membrane biosensor |
WO2007090511A1 (de) * | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh | Polyelektrolyt mono- und multischichten für optische signalwandler |
US8652564B2 (en) * | 2006-05-08 | 2014-02-18 | The Ohio State University Research Foundation | Aminated materials for assays |
US20080083618A1 (en) * | 2006-09-05 | 2008-04-10 | Neel Gary T | System and Methods for Determining an Analyte Concentration Incorporating a Hematocrit Correction |
CA2667119C (en) * | 2006-10-18 | 2016-04-12 | Axela Inc. | Measuring multiple analytes over a broad range of concentrations using optical diffraction |
US20090014030A1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-01-15 | Asml Netherlands B.V. | Substrates and methods of using those substrates |
US9134307B2 (en) | 2007-07-11 | 2015-09-15 | X-Body, Inc. | Method for determining ion channel modulating properties of a test reagent |
CA2693700A1 (en) | 2007-07-11 | 2009-01-15 | Sru Biosystems, Inc. | Methods for identifying modulators of ion channels |
DE102007049013A1 (de) * | 2007-10-11 | 2009-04-16 | Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG | Sensor mit Langzeitstabilität für Bio-Prozesse |
US8257936B2 (en) | 2008-04-09 | 2012-09-04 | X-Body Inc. | High resolution label free analysis of cellular properties |
FR2943544B1 (fr) * | 2009-03-31 | 2012-04-20 | Univ Angers | Procede de preparation de capsules lipidiques fonctionnalisees. |
WO2012057185A1 (ja) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | 東レ株式会社 | 血液成分吸着用担体及び血液成分吸着カラム |
EP2661317B1 (en) | 2011-01-04 | 2021-11-17 | The Research Foundation for The State University of New York | Functionalization of nanofibrous microfiltration membranes for water purification |
KR102592368B1 (ko) | 2014-07-02 | 2023-10-25 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 반도체 센서의 표면 처리 |
US20170234874A1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-08-17 | Clearbridge Biophotonics Pte Ltd. | Integrated visual morphology and cell protein expression using resonance-light scattering |
SG11201804001RA (en) * | 2015-11-30 | 2018-06-28 | Agency Science Tech & Res | A cell culture substrate and method of making thereof |
US11420941B2 (en) * | 2017-06-29 | 2022-08-23 | Cowper Sciences Inc. | Methods and systems for mask alignment in manufacturing process of arrays |
US11709156B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-07-25 | Waters Technologies Corporation | Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis |
US11709155B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-07-25 | Waters Technologies Corporation | Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes |
US11918936B2 (en) | 2020-01-17 | 2024-03-05 | Waters Technologies Corporation | Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020068157A1 (en) * | 2000-10-26 | 2002-06-06 | Glaucus Proteomics B.V. | Products with biofunctional coating |
JP2003028872A (ja) * | 2001-06-05 | 2003-01-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | 反応性固相担体及びdna断片検出用具 |
WO2003064995A2 (en) * | 2002-01-28 | 2003-08-07 | Sru Biosystems, Llc | A guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure |
JP2003528301A (ja) * | 2000-03-22 | 2003-09-24 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | マイクロアレイ応用のためのポリマー被膜表層 |
Family Cites Families (96)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4009933A (en) * | 1975-05-07 | 1977-03-01 | Rca Corporation | Polarization-selective laser mirror |
US4050895A (en) * | 1975-09-26 | 1977-09-27 | Monsanto Research Corporation | Optical analytical device, waveguide and method |
US4576850A (en) * | 1978-07-20 | 1986-03-18 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Shaped plastic articles having replicated microstructure surfaces |
US4668558A (en) * | 1978-07-20 | 1987-05-26 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Shaped plastic articles having replicated microstructure surfaces |
US4344438A (en) * | 1978-08-02 | 1982-08-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Optical sensor of plasma constituents |
US4289371A (en) * | 1979-05-31 | 1981-09-15 | Xerox Corporation | Optical scanner using plane linear diffraction gratings on a rotating spinner |
EP0075353B1 (en) * | 1981-09-18 | 1987-08-19 | Battelle Memorial Institute | Method and apparatus for the determination of species in solution with an optical wave-guide |
USRE33064E (en) * | 1981-09-18 | 1989-09-19 | Prutec Limited | Method for the determination of species in solution with an optical wave-guide |
EP0112721B1 (en) * | 1982-12-21 | 1988-05-18 | Ares-Serono N.V. | Assay technique |
US4536608A (en) * | 1983-04-25 | 1985-08-20 | Exxon Research And Engineering Co. | Solar cell with two-dimensional hexagonal reflecting diffraction grating |
US4652290A (en) * | 1983-07-05 | 1987-03-24 | Motorola, Inc. | Method for making optical channel waveguides and product manufactured thereby |
AU583040B2 (en) * | 1984-06-13 | 1989-04-20 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Devices for use in chemical test procedures |
US4701008A (en) * | 1984-08-10 | 1987-10-20 | Motorola, Inc. | Optical waveguide including superstrate of niobium or silicon oxynitride and method of making same |
GB8423204D0 (en) * | 1984-09-14 | 1984-10-17 | Comtech Res Unit | Assay technique and equipment |
US4735906A (en) * | 1984-11-28 | 1988-04-05 | Texas A&M University | Sensor having piezoelectric crystal for microgravimetric immunoassays |
US4650329A (en) * | 1984-11-29 | 1987-03-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Optical 3-d signature device for detecting chemical agents |
EP0184600B1 (en) * | 1984-12-10 | 1990-03-14 | Prutec Limited | Method for optically ascertaining parameters of species in a liquid analyte |
GB8509491D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Plessey Co Plc | Optic waveguide biosensors |
EP0226604B1 (de) * | 1985-05-29 | 1991-08-21 | Artificial Sensing Instruments ASI AG | Optischer sensor zum selektiven nachweis von substanzen und zum nachweis von brechzahländerungen in messubstanzen |
US4806546A (en) * | 1985-09-30 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Immobilization of nucleic acids on derivatized nylon supports |
GB8612861D0 (en) * | 1986-05-27 | 1986-07-02 | Cambridge Life Sciences | Immobilised enzyme biosensors |
GB8618133D0 (en) * | 1986-07-24 | 1986-09-03 | Pa Consulting Services | Biosensors |
US4876208A (en) * | 1987-01-30 | 1989-10-24 | Yellowstone Diagnostics Corporation | Diffraction immunoassay apparatus and method |
GB8705649D0 (en) * | 1987-03-10 | 1987-04-15 | Pa Consulting Services | Assay sensor |
US4999234A (en) * | 1987-08-10 | 1991-03-12 | Polaroid Corporation | Holographic optical data storage medium |
US4952056A (en) * | 1988-05-17 | 1990-08-28 | Entwicklungsgemeinschaft Asi | Method of determining the autocollimation angle of a grating coupler |
GB2220080A (en) * | 1988-06-24 | 1989-12-28 | Marconi Gec Ltd | Improvements in optical waveguides |
US6235488B1 (en) * | 1988-09-29 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Surface preparation for chemical-specific binding |
SE8804074D0 (sv) * | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Pharmacia Ab | Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem |
SE462454B (sv) * | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
GB8916764D0 (en) * | 1989-07-21 | 1989-09-06 | Sambles John R | Surface plasmon optical sensor |
US5156785A (en) * | 1991-07-10 | 1992-10-20 | Cordis Corporation | Extruded tubing and catheters having increased rotational stiffness |
US5541057A (en) * | 1989-09-18 | 1996-07-30 | Biostar, Inc. | Methods for detection of an analyte |
EP0455067B1 (de) * | 1990-05-03 | 2003-02-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mikrooptischer Sensor |
US5337183A (en) * | 1991-02-01 | 1994-08-09 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Distributed resonant cavity light beam modulator |
SE468188B (sv) * | 1991-04-08 | 1992-11-16 | Stiftelsen Inst Foer Mikroelek | Metod foer inkoppling av straalning i en infraroeddetektor, jaemte anordning |
CA2086338C (en) * | 1991-04-26 | 2002-03-26 | Rino E. Kunz | Process and device for determining measured quantities by means of an integrated optical sensor module |
US5155785A (en) * | 1991-05-01 | 1992-10-13 | At&T Bell Laboratories | Optical fiber interconnection apparatus and method |
GB9111912D0 (en) * | 1991-06-04 | 1991-07-24 | Fisons Plc | Analytical methods |
GB2256477B (en) * | 1991-06-07 | 1995-03-08 | Marconi Gec Ltd | An optical sensor |
US5494829A (en) * | 1992-07-31 | 1996-02-27 | Biostar, Inc. | Devices and methods for detection of an analyte based upon light interference |
US5413884A (en) * | 1992-12-14 | 1995-05-09 | American Telephone And Telegraph Company | Grating fabrication using electron beam lithography |
US5615052A (en) * | 1993-04-16 | 1997-03-25 | Bruce W. McCaul | Laser diode/lens assembly |
CN1125410A (zh) * | 1993-06-11 | 1996-06-26 | 明尼苏达矿产制造公司 | 激光加工复制工具 |
US5395587A (en) * | 1993-07-06 | 1995-03-07 | Smithkline Beecham Corporation | Surface plasmon resonance detector having collector for eluted ligate |
GB9314991D0 (en) * | 1993-07-20 | 1993-09-01 | Sandoz Ltd | Mechanical device |
SG64333A1 (en) * | 1993-09-13 | 1999-04-27 | Minnesota Mining & Mfg | Abrasive article method of manufacture of same method of using same for finishing and a production tool |
US5691846A (en) * | 1993-10-20 | 1997-11-25 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Ultra-flexible retroreflective cube corner composite sheetings and methods of manufacture |
US5559338A (en) * | 1994-10-04 | 1996-09-24 | Excimer Laser Systems, Inc. | Deep ultraviolet optical imaging system for microlithography and/or microfabrication |
US5955335A (en) * | 1994-10-08 | 1999-09-21 | Foschungszentrum Julich GmbH | Biomaterial immobilization on an Si3 N4 surface containing Si-NH2 groups with a heterobifunctional cross-linking agent |
TW323341B (ja) * | 1995-01-09 | 1997-12-21 | Minnesota Mining & Mfg | |
US5606170A (en) * | 1995-02-03 | 1997-02-25 | Research International, Inc. | Multifunctional sensor system |
EP0813667B1 (en) * | 1995-03-03 | 1999-05-26 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Light directing film having variable height structured surface and light directing article constructed therefrom |
US5690894A (en) * | 1995-05-23 | 1997-11-25 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
US5598300A (en) * | 1995-06-05 | 1997-01-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Efficient bandpass reflection and transmission filters with low sidebands based on guided-mode resonance effects |
US6200737B1 (en) * | 1995-08-24 | 2001-03-13 | Trustees Of Tufts College | Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure |
US5991480A (en) * | 1995-09-01 | 1999-11-23 | Paul Scherrer Institut | Process and device for measuring light beams |
US5822486A (en) * | 1995-11-02 | 1998-10-13 | General Scanning, Inc. | Scanned remote imaging method and system and method of determining optimum design characteristics of a filter for use therein |
US5814524A (en) * | 1995-12-14 | 1998-09-29 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations |
GB9602542D0 (en) * | 1996-02-08 | 1996-04-10 | Fisons Plc | Analytical device |
US5804453A (en) * | 1996-02-09 | 1998-09-08 | Duan-Jun Chen | Fiber optic direct-sensing bioprobe using a phase-tracking approach |
US5801390A (en) * | 1996-02-09 | 1998-09-01 | Nikon Corporation | Position-detection method and apparatus with a grating mark |
AU2038897A (en) * | 1996-03-27 | 1997-10-17 | British Telecommunications Public Limited Company | Optical diffraction grating |
US5821343A (en) * | 1996-04-25 | 1998-10-13 | Medtronic Inc | Oxidative method for attachment of biomolecules to surfaces of medical devices |
IL118209A0 (en) * | 1996-05-09 | 1998-02-08 | Yeda Res & Dev | Active electro-optical wavelength-selective mirrors and active electro-optic wavelength-selective filters |
KR20000016498A (ko) * | 1996-06-10 | 2000-03-25 | 다니엘 제이. 설리반 | 생산환경을 위한 홀로그래픽 패터닝방법 및 공구 |
US5864641A (en) * | 1997-04-11 | 1999-01-26 | F&S, Inc. | Optical fiber long period sensor having a reactive coating |
US6035089A (en) * | 1997-06-11 | 2000-03-07 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Integrated narrowband optical filter based on embedded subwavelength resonant grating structures |
NZ516848A (en) * | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
US5955378A (en) * | 1997-08-20 | 1999-09-21 | Challener; William A. | Near normal incidence optical assaying method and system having wavelength and angle sensitivity |
US5925878A (en) * | 1997-08-20 | 1999-07-20 | Imation Corp. | Diffraction anomaly sensor having grating coated with protective dielectric layer |
US6902703B2 (en) * | 1999-05-03 | 2005-06-07 | Ljl Biosystems, Inc. | Integrated sample-processing system |
US6128431A (en) * | 1997-10-08 | 2000-10-03 | The Regents Of The University Of California | High efficiency source coupler for optical waveguide illumination system |
US5994150A (en) * | 1997-11-19 | 1999-11-30 | Imation Corp. | Optical assaying method and system having rotatable sensor disk with multiple sensing regions |
TW460758B (en) * | 1998-05-14 | 2001-10-21 | Holographic Lithography System | A holographic lithography system for generating an interference pattern suitable for selectively exposing a photosensitive material |
US5986762A (en) * | 1998-06-15 | 1999-11-16 | Imation Corp. | Optical sensor having optimized surface profile |
US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
US6303179B1 (en) * | 1999-02-08 | 2001-10-16 | Medtronic, Inc | Method for attachment of biomolecules to surfaces through amine-functional groups |
MXPA02003934A (es) * | 1999-10-19 | 2002-12-13 | Commw Scient Ind Res Org | Preparacion de una superficie polimerica funcional. |
EP1287360A2 (de) * | 2000-06-02 | 2003-03-05 | Zeptosens AG | Kit und verfahren zur multianalytbestimmung |
US7142296B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-11-28 | Sru Biosystems, Inc. | Method and apparatus for detecting biomolecular interactions |
US7101660B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-09-05 | Sru Biosystems, Inc. | Method for producing a colorimetric resonant reflection biosensor on rigid surfaces |
US7153702B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-12-26 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor |
US7264973B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-09-04 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant optical biosensor |
US7217574B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-05-15 | Sru Biosystems, Inc. | Method and apparatus for biosensor spectral shift detection |
US7175980B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-02-13 | Sru Biosystems, Inc. | Method of making a plastic colorimetric resonant biosensor device with liquid handling capabilities |
US7094595B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-08-22 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions |
US7202076B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-04-10 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions |
US20030113766A1 (en) * | 2000-10-30 | 2003-06-19 | Sru Biosystems, Llc | Amine activated colorimetric resonant biosensor |
US7023544B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-04-04 | Sru Biosystems, Inc. | Method and instrument for detecting biomolecular interactions |
US7306827B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-12-11 | Sru Biosystems, Inc. | Method and machine for replicating holographic gratings on a substrate |
US20030092075A1 (en) * | 2000-10-30 | 2003-05-15 | Sru Biosystems, Llc | Aldehyde chemical surface activation processes and test methods for colorimetric resonant sensors |
US6916541B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-12 | Penn State Research Foundation | Modified substrates for the attachment of biomolecules |
WO2003022769A1 (en) * | 2001-09-07 | 2003-03-20 | The Penn State Research Foundation | Modified substrates for the attachment of biomolecules |
US7195872B2 (en) * | 2001-11-09 | 2007-03-27 | 3D Biosurfaces, Inc. | High surface area substrates for microarrays and methods to make same |
US20040076961A1 (en) * | 2002-10-21 | 2004-04-22 | Lewis Mark A. | Biomolecule retaining material and methods for attaching biomolecules to a surface |
-
2004
- 2004-11-08 US US10/983,511 patent/US20050214803A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-08 AU AU2004290375A patent/AU2004290375A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-08 WO PCT/US2004/037012 patent/WO2005047904A2/en active Application Filing
- 2004-11-08 CA CA002544836A patent/CA2544836A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-08 JP JP2006539682A patent/JP2007510928A/ja active Pending
- 2004-11-08 EP EP04810438A patent/EP1680679A2/en not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003528301A (ja) * | 2000-03-22 | 2003-09-24 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | マイクロアレイ応用のためのポリマー被膜表層 |
US20020068157A1 (en) * | 2000-10-26 | 2002-06-06 | Glaucus Proteomics B.V. | Products with biofunctional coating |
JP2003028872A (ja) * | 2001-06-05 | 2003-01-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | 反応性固相担体及びdna断片検出用具 |
WO2003064995A2 (en) * | 2002-01-28 | 2003-08-07 | Sru Biosystems, Llc | A guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010525334A (ja) * | 2007-04-19 | 2010-07-22 | エス アール ユー バイオシステムズ,インコーポレイテッド | 固定化された標的と直接結合する小分子を検出するためにバイオセンサーを使用する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005047904A3 (en) | 2005-07-21 |
EP1680679A2 (en) | 2006-07-19 |
CA2544836A1 (en) | 2005-05-26 |
AU2004290375A1 (en) | 2005-05-26 |
WO2005047904A2 (en) | 2005-05-26 |
US20050214803A1 (en) | 2005-09-29 |
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