JP2003528301A - マイクロアレイ応用のためのポリマー被膜表層 - Google Patents

マイクロアレイ応用のためのポリマー被膜表層

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Abstract

(57)【要約】 支持体を、ｎが１から１０の間、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩから単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有する薬剤でシリル化し、次いで架橋剤で活性化した後に、アミン含有ポリマーと反応させることによって、ガラススライドなどの固体支持体を修飾する方法が提供されている。この支持体は、選択的に架橋剤によって処理することができる。従って、修飾された支持体は、多くの標的が安定に支持体と結合し、定まった様式で整列している、アレイ及びマイクロアレイを作成するために使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、概してアレイ及びマイクロアレイの分野、より特異的には、アレイ
及びマイクロアレイの組成物及び固体支持体を修飾する方法に関する。
【０００２】 (発明の背景) 固体支持体の表層に空間的に分布し、安定に結合している多数の重合体分子を
有するマイクロアレイは、生物分析及び関連する分野において益々重要な技術に
なっている。ポリペプチド及びポリヌクレオチドの双方のマイクロアレイが開発
され、例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現のモニタリング、遺伝子マッピング、
細菌の同定、薬の発見、そしてコンビナトリアル・ケミストリーなどの種々の応
用において用途が見出されている。特にマイクロアレイの用途が見出されている
一つの分野としては、遺伝子発現分析がある。
【０００３】 アレイ及びマイクロアレイを製造する現在の方法は、望ましい位置でポリヌク
レオチド合成することによって、或いはポリヌクレオチドをプレ合成し、次いで
それらを固体支持体へ結合させることによる何れかによって固体支持体の特定の
位置へポリヌクレオチドを固定化する。米国特許第５，４４５，９３４号は、オ
ンチップ合成の方法を開示している。この方法では、光切断可能保護基を含有す
る化学種で基質を誘導体化する。選択部位は、マスクを通した照射によって脱保
護する。次いで、この脱保護部位を光保護基を含有するＤＮＡ単体と反応させる
。アレイの部位特異的配列が完成するまで各接着した単量体に対してマスキング
、脱保護、そして反応の工程が繰り返された。
【０００４】 固体支持体上へのプレ合成ポリヌクレオチドを固定化する方法には、単純な吸
着、紫外線結合、及び共有結合が含まれる。一般的に、未修飾ポリヌクレオチド
の未修飾固体支持体への結合は、非効率的である。従って、ポリヌクレオチド又
は固体支持体は、結合が可能となるように修飾しなければならない。従って、ウ
シ血清アルブミンで修飾したポリヌクレオチドは、不活性にマイクロタイタープ
レート（Southern, E. M. PCT 89/00460）へ吸着し、ビオチン化ポリヌクレオチ
ドは、アビジン又はストレプトアビジンで被膜したプレート又はビーズにしっか
りと結合する。その他の方法では、Carricoら., 米国特許第４，８０６，５４６
号は、ナイロン支持体をアルキル化剤で処理してナイロンの表層上にアミジン基
を導入することを記載している。誘導ナイロンの表層は、一本鎖核酸と非共有結
合的に結合する能力を有する。非共有結合的に結合している核酸は、次いで溶液
中の特異的な標的核酸を検出するために使用される。
【０００５】 異なる方法では、固体支持体は、適切な官能基及び／又はリンカーで修飾され
る。従って、固体支持体は、固体支持体上にあって、オリゴヌクレオチドが共有
又は非共有結合的に結合できる、例えばヒドロキシル、カルボキシル、アミン、
アルデヒド、ヒドラジン、エポキシド、臭化アセチル、マレイミド、及びチオー
ル基（Lundら., 米国特許第５，４７４，８９５号）のような活性基を有するよ
うに修飾される。例えば、Nessらに対する米国特許第５，５１４，７８５号は、
ナイロン支持体へのオリゴヌクレオチドの共有結合の方法を開示している。この
ナイロン支持体は、最初にアミン含有ポリマーで処理し、それによってナイロン
支持体の表層上に反応性の模倣エステルを形成する。次いで、表層上のこの模倣
エステルを、第一級又は第二級アミンを含有するポリマーと反応させて、その後
に活性ポリヌクレオチドと結合するアミジン残基を形成させた。その他の方法と
しては、Rampalに対する米国特許第６，０１３，７８９号に、ポリプロピレンフ
ィルムを最初にアンモニアガスの存在下でのプラズマ放出によってアミノ化し、
次いで末端リン酸イミダゾリドを有するオリゴヌクレオチドと接触させ、すると
すぐにオリゴヌクレオチドはホスホロアミダイト結合を通してポリプロピレンと
共有結合することが開示されている。
【０００６】 固定化ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイのためのアレイ
及びマイクロアレイを構築するために使用できる。マイクロアレイを使用する典
型的な方法には、ハイブリダイゼーションの条件下で、流体に含まれているヌク
レオチド配列をマイクロアレイ上に固定化した配列と接触させ、次いでハイブリ
ダイゼーション複合体を検出することが含まれる。ハイブリダイズした核酸の結
果として生じたパターンは、被験試料中のヌクレオチド構成分の性質に関する情
報を示す。広く使われているマイクロアレイのハイブリダイゼーション複合体を
検出する方法は、蛍光発光による。一つの方法では、生物試料から誘導されたプ
ローブを、標識プローブが作成されるように蛍光標識（レポーター）分子とカッ
プリングさせたヌクレオチドの存在下で増幅させ、次いで、プローブ配列がマイ
クロアレイ上に固定化した相補性配列とハイブリダイズするように、標識プロー
ブをマイクロアレイでインキュベートする。次いで、蛍光発光のレベル及びパタ
ーンを測定するために、スキャナーを使用する。
【０００７】 固体支持体上にポリヌクレオチドを固定化する当該分野の方法は、通常は、低
いカップリング量となる。加えて、ポリヌクレオチドは、基板の平らな二次元表
層上に結合し、三次元構造のポリマーマトリックス内にポリヌクレオチドを結合
させることは、より効率的なハイブリダイゼーションを可能にする。従って、ア
レイ及びマイクロアレイを組み立てるために、固体支持体へポリヌクレオチドを
固定化する方法及び手法の必要性が存在している。
【０００８】 （発明の概要） 支持体を、ｎが１から１０の間で、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯＰｒ、Ｃｌ、Ｂｒ
、又はＩから単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有する薬剤でシ
リル化し、次いで架橋剤で活性化した後に、アミン含有ポリマーと反応させるこ
とによって固体支持体を修飾する方法が提供されている。この支持体は、さらに
架橋剤で処理することができる。標的の多くが支持体と安定に結合し、定まった
様式で整列し得る。 また、提供されているのは、固体支持体へ標的を結合させる方法である。この
支持体は、ｎが１から１０の間で、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩか
ら単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有する薬剤でシリル化し、
次いで架橋剤で活性化した後にアミン含有ポリマーと反応させる。この支持体は
、さらに架橋剤で処理することができる。この支持体は、次いで、標的の５'-末
端又は３'-末端にスぺーサーアームを選択的に有することができる。
【０００９】 また、提供されているのは、ｎが１から１０の間で、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ、又はＩから単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有する
薬剤でシリル化し、次いで架橋剤で活性化した後に、アミン含有ポリマーと反応
させることによってガラススライドを修飾することでポリヌクレオチドのアレイ
を作製する方法である。この支持体は、選択的に架橋剤で処理することができる
。ポリヌクレオチドの多くが、定まった様式で支持体と安定に結合する。 下記により十分に記載されている本発明の詳細を読むことによって、本発明の
これら及び他の目的，利点、そして特徴が当該分野の熟練者にとって明らかなも
のとなる。
【００１０】 （詳細な説明） 本発明、アレイ及びマイクロアレイを記載する前に、本発明が記載される特定
の方法及びアレイに限定されるものではなく、当然のことながら変わり得るもの
であることは理解されなければならない。本発明の範囲は添付された請求項によ
ってのみ限定されるので、ここにおいて用いられる専門用語も特定の実施態様の
みを記述する目的のためであり、意図的に限定されるものではないことは理解さ
れなければならない。 特に定義されなければ、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、
本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
ここに記載されているのと類似又は同等の何れの方法及び材料を本発明の実践又
は試験へ用いることが可能であるが、好ましい方法及び材料を今回は記載する。
引用されている公開物と関連のある方法及び／材料を開示及び記述するために、
ここで言及するすべての公開物を取り入れている。
【００１１】 （定義） 特に文脈において明確な指示がない限り、本明細書及び添付請求項に用いられ
ているような、単数形「a」、「an」及び「the」は複数対象物を含むことに特に
留意すべきである。従って、例えば、「a probe」については、そのようなプロ
ーブの一つ以上が組成物に存在することが可能であることを意味する。同じよう
に、「a microarray element」又は「the microarray element」については、一
つ又は複数のマイクロアレイの可能性などを含む。 「固体支持体」という用語は、アッセイ及び反応をおこなうために、例えば核
酸などの標的が固定され得る任意の表層を指す。
【００１２】 「標的」、「ＤＮＡエレメント」又は「マイクロアレイエレメント」という用
語は、所定の試料に対して親和性を有する分子を指す。標的は天然発生又は合成
分子でもよく、直接に或いは特異的な結合基質を介するかの何れかによって表層
と共有又は非共有的に結合し得る。本発明によって用いられることが可能なエレ
メントの例には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオ
チド、オリゴ糖、多糖、糖、タンパク質、ペプチド、ＰＮＡｓ、モノクローナル
抗体、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモンレセプター、酵素、
酵素基質、補酵素、及び細胞表層レセプターに対するアゴニスト及びアンタゴニ
ストを含んでなる薬剤などが含まれる。
【００１３】 「マイクロアレイ」という用語は、高密度で、例えば紙、ナイロン又は他のタ
イプの膜、フィルター、チップ、ガラススライド、ビーズ、或いは他の任意の適
切な固体支持体上において合成、又は結合、或いは配した標的のアレイを指す。 一実施態様では、ポリヌクレオチド及び活性化ポリヌクレオチドは、例えばガ
ラススライドのようなアミン処理された固体支持体に結合している。この結合は
、共有、非共有、又はその組み合わせで可能である。従って、製造されたアレイ
又はマイクロアレイは、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリヌクレオチド標
的に対して相補的である標識核酸プローブを含む液体試料と接触させてもよい。
このプローブのハイブリダイゼーションパターンは、標識核酸試料の遺伝的特徴
に関する情報を得るために検出され得る。
【００１４】 一般的に、本発明は、アミノアルキルシリル化固体支持体を与えるために、固
体支持体をシリル化剤で処理する段階を含む；処理した固体支持体を架橋剤、好
ましくは多官能剤、塩化シアヌル（すなわち２，４，６-トリクロロトリアジン
）と反応させ、続いてアミン含有ポリマー、好ましくはポリエチレンイミン（Ｐ
ＥＩ）で処理する；選択的に、ＰＥＩ-修飾表層を架橋剤で活性化する；次いで
、固体支持体をリンカー基を含むように選択的に修飾してもよいポリヌクレオチ
ドのような標的と接触させる。
【００１５】 本発明では、固体支持体は、最初にシリル化剤で処理される。固体支持体は、
例えばガラス、ゲル、シリコン、融合シリカ、プラスチック、セラミック、紙、
金属、又はナイロンのような他のポリマー等と表層が接触する流体と適合する任
意の物質で構成され得る。基板は、硬くても柔軟なものでもよく、円、楕円、正
方形、長方形、三角形の形の実質的に平面、或いは任意のその他の簡便な実質的
に平面的な形を規定し得る。好ましい実施態様では、長方形のガラススライドは
基板として使用される。シリル化剤は、基板の表層に存在する反応性基と反応し
て第一級アミンを形成するように選択される。例えば、Ｒ’を単独で水素、メチ
ル、エチル、又はプロピルから選択し、Ｒが（ＣＨ２）ｎ で、ｎが１から１０
、そしてＸを単独で水素、アルキル、Ｏアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩから
選択し、その中のアルキルは、好ましくは１から６炭素原子の低アルキルであっ
て、全ての３つのＸ基はともにアルキルであることはなく、ガラススライドの表
層又は近くに存在するＳｉ-ＯＨ基との反応がアミノアルキルシリル化ガラスス
ライドを産するシリル化剤ＮＲ'２ -Ｒ-ＳｉＸ３。好ましい実施態様では、長方
形のガラススライドは、３-アミノプロピル-トリメトキシシランと反応してアミ
ノプロピルシラン化ガラススライドを産する。
【００１６】 アミノアルキルシラン化ガラススライドを、多官能架橋剤で処理してもよい。
一実施態様では、架橋剤は、アミン基の窒素原子と反応して窒素-炭素結合を形
成することができる一つの末端に反応性基を含む。そのような反応性基には、当
該分野で良く知られており、ハロゲン化合物、エステル、エポキシド等が含まれ
る。架橋剤は、さらに、脱保護され、アミン含有ポリマーとのさらなる反応を受
けることができる反対側の末端に保護反応性基を含む。限定されるものではない
が、架橋剤には、Ｎ-スクシニミジル-４-（ヨードアセトアミド）-安息香酸（Ｓ
ＩＡＢ）、ジスクシニミジルスベリン酸、１-エチル-３-（ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド、及び２，４，６-トリクロロトリアジン（塩化シアヌル
）が含まれる。架橋剤は、好ましくは塩化シアヌルである。
【００１７】 架橋剤で処理したアミノアルキルシラン化基板を、次にアミン含有ポリマーと
反応させる。任意の第一級、二級、又は三級アミン含有ポリマーを用いてもよい
。このアミン含有ポリマーは、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビ
ニルアミン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリリジン、及びポリアルギニ
ンであってよい。好ましい実施態様では、シリル化及び架橋剤で活性化された固
体支持体を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で被膜して修飾する。固体支持体の
表層の結果として生じたＰＥＩ-修飾表層を、選択的に塩化シアヌルのような架
橋剤で再び処理してよい。
【００１８】 ＰＥＩ-被膜ガラススライドは、アレイ及びマイクロアレイの製造に使用する
ことができる。好ましい実施態様では、標的はＰＥＩ-被膜ガラススライド上に
固定化する。標的には、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ハプテン、サ
イトカイン、タンパク質、ペプチド、糖類等が含まれる。ポリヌクレオチドには
、ホスホジエステル結合が、例えばホスホロチオネート、メチルイミノ、メチル
ホスホネート、ホスホルミダイト、グアニジン等の代替結合で置換された核酸；
リボースサブユニットが、例えばヘキソースホスホジエステルで置換された核酸
；ペプチド核酸等が含まれる。ポリヌクレオチドは、一本又は二重鎖であっても
よく、ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片であってもよい。ポリヌクレオチドは
、既知の５’又は３’ヌクレオチド配列を包含してもよく、完全長配列であって
もよく、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選択した独特のポリヌクレオ
チドであってもよい。使用されるポリヌクレオチドは、少なくとも配列の断片が
知られている遺伝子又は遺伝子群に対して特異的、或いは特定の細胞型、発生又
は疾患状態に共通の一つ又は複数の未同定ｃＤＮＡに対して特異的なポリヌクレ
オチドであり得る。本発明で使用されるポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオ
チド又はＰＣＲ断片であって、約２から約５０，０００連続した塩基、好ましく
は約５から約５００連続した塩基、より好ましくは約４０−７０塩基長、最も好
ましくは約５０から６５塩基長であり得る。スぺーサー（リンカー）腕、すなわ
ち他の化学基を伸張又は結合させる化学成分は、好ましくは約２から１２の炭素
原子、より好ましくは約６の炭素原子であり、常套的な化学的手法を使用して、
含有するブロックされたアミン基をポリヌクレオチドの５'-ヒドロキシル基と結
合させることができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、当該分野で良く知られ
ている方法によって、ブロックされたアミン基を含有するスぺーサー腕で３'末
端を修飾することができる。
【００１９】 好ましくは、 のような５'-リンカー腕又は３'-リンカー腕を有するポリヌクレオチドを用い、
スペーサー腕としてｎは２−１２までを含み、好ましくは６である；Ｙはアミン
又はチオールであり、好ましくは第一級アミンであり；そしてＡはポリヌクレオ
チドであって、約２−５００００の連続した塩基の範囲にあり、好ましくは約５
から５００の連続したヌクレオチドで、結合のために５'-ヒドロキシル又は３'-
ヒドロキシル基のみでの修飾を必要としている。
【００２０】 次いで、アレイ及びマイクロアレイを製造するために、選択したポリヌクレオ
チドを、ポリマーで被膜したガラススライドと結合させた。アレイは、任意の常
套的な方法論によって生産することが可能であり、多くの異なるアレイの構造及
びそれらの生産のための方法が当該分野に熟練した者に知られており、米国特許
第５，４４５，９３４号、５，５３２，１２８号、５，３８４，２６１号、及び
５，７００，６３７号に開示されていて、その開示は参考文献としてそれら全て
がここで取り入れられている。例えば、基板のポジティブに荷電している表層と
相互作用させることによって、ポリヌクレオチドを非共有結合を介して基板と安
定に結合させることができる。あるいは、例えばアルキルアミノ-リンカー基を
介する共有結合法によって、５'-又は３'-末端リンカー腕を有するポリヌクレオ
チドを基板と結合させてもよい。本発明のその他の実施態様では、非共有及び共
有結合法の双方を介して、ポリヌクレオチドを基板と結合させてもよい。
【００２１】 本発明のアレイ及びマイクロアレイを使用する試料分析をおこなうために、当
該分野で良く知られているように、生物学的試料のＲＮＡ又はＤＮＡからハイブ
リダイゼーションプローブを作製する。次いで、ハイブリダイゼーションの条件
下で、このハイブリダイゼーションプローブを本発明のアレイ及びマイクロアレ
イと接触させてハイブリダイゼーションパターンを生成させる。適切なハイブリ
ダイゼーションの条件は、当該分野に熟練している者に良く知られており、Mani
atisらに対するＷＯ ９５／２１９４４で概説されている。インキュベーション
の条件は、正確な相補性の適合、或いは種々の程度のより低い相補性でハイブリ
ダイゼーションが生じるように調節する。ハイブリッドしていないプローブの除
去の後、蛍光のレベルとパターンを測定するための検出又は視覚化のために、ス
キャナー使用する。検出システムを、全ての異なる配列に関するハイブリダイゼ
ーションの欠如、存在、そして量を同時に測定するために使用してもよい。
【００２２】 ハイブリダイゼーションパターンは、標識した試料核酸が得られた生理学的ソ
ースだけでなく、ハイブリダイゼーションパターンを生じせしめるためにアレイ
と接触させた試料中の核酸の遺伝的性質に関する定量的情報を決定するために使
用できる。データは、各遺伝子の発現レベル、特に定量的表現だけでなく、生理
学的ソースである組織又は細胞で発現している遺伝子の型のように、試料の核酸
が得られた生理学的ソースに関する情報を提供する。
【００２３】 実施例 下記の実施例は、本発明の作製と利用方法に関する完全なる開示及び説明を当
業者へ提供するために提案されており、本発明に関して発明者が考慮する範囲を
限定することを意図しているものではなく、また、下記の実験が全て、或いは唯
一の実行された実験であることを示すことを意図しているものではない。用いら
れている数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確かなものにする努力
が成されているが、幾つかの実験的誤り及び逸脱は釈明されるべきである。特に
示さない限り、部分は重量で、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度、
そして圧力は大気圧又はその付近である。 ｃＤＮＡマイクロアレイは、Brownら.,に対する米国特許第５，８０７，５２
２号に従って作製された。ポリヌクレオチドは、Operon Technologiesによって
合成及び精製され、更なる精製をすることなしに用いられた。化学試薬はAldric
h Chemical Companyから得られ、更なる精製をすることなしに使用された。有機
溶媒はＨＰＬＣグレードであった。
【００２４】 実施例１ この実施例は，ガラススライドをシリル化する方法を示す。擦り傷のないこと
が視覚的な検査で確かめられた１０のガラススライドを選択した。この選択した
ガラススライドを０．１％ＳＤＳの蒸留水の１Ｌ溶液（ｗ／ｖ）に浸し、およそ
３０分の超音波処理に曝した。次に、このガラススライドを乾燥させ、およそ３
０分のアセトン中での超音波処理をし、空気乾燥した。 ２．０％（ｗ／ｖ）シラン溶液を、３-アミノプロピルトリメトキシシランを
脱イオン水に溶解して緩やかに撹拌することで調製した。乾燥ガラススライドを
２分間シラン溶液に浸した。約２分の蒸留水での超音波処理によって、過度のシ
ラン溶液をガラススライドから洗い流し、蒸留水で洗浄した。この洗浄したスラ
イドを、約３０分にわたり１２０℃で保存に適した状態に加工し、使用するまで
ほこりのない環境で貯蔵した。
【００２５】 実施例２ この実施例は、６０ＰＥＩで被膜したガラススライドを製造する方法を示す。
別に示さない限り、すべての反応を約４℃でおこなった。塩化シアヌル（１２．
７ｇ）を、１Ｌのｎ-ヘキサン及び炭酸ナトリウム（２５．０ｇ）に溶解させた
。これとは別に、ポリエチレンイミン（１．０ｇ、分子量２５，０００Ｄａ）を
室温で１Ｌの蒸留水に溶解させた。溶液、実施例１のガラススライド、２Ｌのｎ
-ヘキサン、そしてさらなる１Ｌの蒸留水を、約４℃よりも低い温度にコントロ
ールが可能な冷蔵庫に少なくとも２時間別々に貯蔵した。ガラススライドを２つ
のスライドラックに置き、このラックを塩化シアヌル溶液中に置いて、その溶液
を激しく撹拌した。約１時間後、ガラススライドを超音波クリナーで約１０分間
、１Ｌのｎ-ヘキサンで洗浄し、空気乾燥した。次に、このスライドを約１時間
、ポリエチレンイミン溶液中に置いた。このスライドを、次いで超音波クリナー
で約１０分間、１Ｌの蒸留水で洗浄し、空気乾燥させ、１０００ｒｐｍで遠心分
離し、超音波クリナーで約１０分間、１Ｌのｎ-ヘキサンで洗浄し、約１時間塩
化シアヌル溶液に置き戻し、超音波クリナーで約１０分間、１Ｌのｎ-ヘキサン
で洗浄し、空気乾燥した。次いで、このスライドを、室温で２回、超音波クリナ
ーで約２０分間、１Ｌのアセトンで洗浄し、空気乾燥した。スライドは、次いで
、約２から２５℃で貯蔵して乾燥させた。
【００２６】 実施例３ この実施例は、６０のポリリジン被膜ガラススライドを製造する方法を示す。
１ｇのポリリジン（Sigma）を使用したことを除いて、実施例２の方法を繰り返
した。
【００２７】 実施例４ この実施例は、６０のポリヒスチジン被膜ガラススライドを製造する方法を示
す。１ｇのポリヒスチジン（Sigma）を使用したことを除いて、実施例２の方法
を繰り返した。
【００２８】 実施例５ 下記の実施例は、実施例２で調製されたＰＥＩ-修飾ガラススライド上へのポ
リヌクレオチドの応用を記載する。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（５９塩基長で３'-アミノアルキルリン
カー修飾を有する）をOperon Technologies（アラメダ、カリフォルニア）から
購入した。それぞれが酵母コントロール断片（ＹＣＦ２３）標的配列を標的とし
ているＦｉｇ１に示した配列番号：１−５をこの実験で使用した。これらオリゴ
デオキシリボヌクレオチド（６．２５−１００マイクロモル）の希釈を２ｘＳＳ
Ｃバッファー（ｐＨ７．４）で調製し、９６-ウェルマイクロタイタープレート
に移した。このようにして生じた試料を、インサイトマイクロアレイシステム製
造設備のポリエチレンイミン-修飾ガラススライド上にスポットした。配列させ
た後、スライドを０．２％ＳＤＳ溶液で２分間洗浄した。次に、スライドを脱イ
オン水で１分間洗浄し、６０℃の２％カゼイン溶液のリン酸緩衝生理食塩水に３
０分間浸した。次いで、スライドを０．２％ＳＤＳで５分間洗い流し、脱イオン
水で１分間洗い流し、そして回転させて乾燥した。
【００２９】 実施例６ 以下の実施例は、ハイブリダイゼーション実験である実施例５によって生成さ
れたアレイの使用を記載している。酵母コントロール断片（ＹＣＦ３）標的配列
に相当する合成ＲＮＡ転写物を下記のようにして調製した。ＹＣＦ３標的配列を
含有するクローンは、インサイトマイクロアレイシステム製造設備によって供給
された。クローンをベクター特異的プライマーで増幅して対応するＰＣＲ単位複
製配列を生成した。この物質を、標的配列の３'-及び５'-末端に特異的なＰＣＲ
プライマーで更に増幅した。前方向プライマーは、その３'-末端（ＮＮＮＮＮＮ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ）にＴ７プロモーターを含み、
逆方向プライマーは、その５'-末端に３０-塩基ポリ（ｄＴ）配列を含んだ。Ｐ
ＣＲ産物は、ゲル濾過を使用して精製された。精製されたＴ７産物は、Ambion's
MEGA scribeaキット（オースチン、テキサス）を使用するインビトロ転写を介
してＲＮＡを生成するためのテンプレートとして使用された。このＲＮＡは、Ｕ
Ｖ分光法によって定量化した。
【００３０】 Ｃｙ５-標識ｃＤＮＡプローブは、５'Ｃｙ５標識ランダム９-ｍｅｒｓ（Opero
n Technologies）を使用した逆転写によって１ｎｇのＲＮＡから転写した。反応
は、製造者によって提供されたバッファー中の２００ユニットのＭＭＬＶ逆転写
酵素（Life Technologies, ゲーサーズバーグ、メリーランド）４ｍＭ ＤＴＴ、
１ユニット ＲＮａｓｅインヒビター（Ambion、オースチン、テキサス）、０．
５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、そして２ｍｇのＣｙ５-標識ランダム９-ｍｅｒで、２時間
、３７℃でインキュベーションした。この反応は、５分間の８５℃でのインキュ
ベーションによって停止させた。次いで、この反応をＴＥ-３０カラム（Clontec
h, パロ・アルト、カリフォルニア）で精製し、脱イオン水で９０ｍＬの容量に
し、２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ グリコーゲン、６０ｍＬの ５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、そ
して３００ｍＬエタノールで沈殿させた。ペレットを２４ｍＬのハイブリダイゼ
ーション溶液：５ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ，１ｍＭ ＤＴＴに再懸濁させた。
【００３１】 Ｃｙ５-標識ｃＤＮＡプローブをアレイへ付け、２２-ｍｍ２ガラスカバースリ
ップで被膜し、蒸発を防ぐために密閉したチャンバーに置き、そして６時間にわ
たって６０℃でインキュベートした。ハイブリダイゼーションの後、このアレイ
を１０分間、４５℃で１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次いで３分間、２５℃で０
．１ＸＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した。このアレイは、１０ｍｍの解像度で
GenePix（商品名）スキャナー（フォスターシティー、カリフォルニア）を使用
して、共焦点レーザースキャンニングによってイメージ化した。シグナルを１６
-ビットパーピクセル解像度へ変換し、６５，５３６カウントダイナミック・レ
ンジを得た。インサイトGEMtools（商品名）ソフトウェア（インサイトファーマ
シューティカルズ，インク., パロアルト、カリフォルニア）を、イメージ分析
に使用した。シグナルは、ローカル・バックグラウンドのために修正した。この
実施例が、固定化ポリヌクレオチドを使用したマイクロアレイフォーマットでの
標的配列の検出のためのこの発明の用途を示す。
【００３２】 実施例７ 下記の実施例は、ポリエチレンイミン、ポリリジン、そしてポリヒスチジンで
被膜したガラススライドの性能を比較する。 それらのポリヌクレオチドと結合する能力を比較し、対応するアレイのハイブ
リダイゼーション能力を調べるために、下記の実験がおこなわれた。ポリヌクレ
オチド配列（配列番号：６−１０、Ｆｉｇ１に示す）をイントロン性酵母コント
ロール断片配列、ＹＣＦ４４に対して設計した。ポリヌクレオチドは、Operon t
echnologiesから購入した。各配列は、４つの異なる誘導体として合成された：
（１）未修飾；（２）３'-アミノリンカー修飾（非標識）；５'-色素-標識（シ
アニン３、アミノリンカー無し）；及び５'-色素標識（シアニン３）と３'-アミ
ノリンカー修飾。３'-アミノリンカーを加えた同じ配列のポリヌクレオチドを，
１０：９０モル比（色素標識：非標識）で混合する。３'-アミノリンカーを有し
ないポリヌクレオチドを、同じように１０：９０モル比（色素標識：非標識）で
混合した。各混合物を２ｘＳＳＣバッファー中で再構築し、１ｍＭ、１０ｍＭ及
び１００ｍＭの濃度で９６-ウェルプレート中に配する。次いで、各生じた試料
を修飾ガラス基板上に４回プリントし、シグナルの平均化を可能にした。次に、
このスライドを洗浄し、ブロックし、そして実施例６に記載のように乾燥させた
。そして、各スポットに沈着しているＣｙ３染色の量の相対測定を得るために、
二色レーザースキャンニング装置（Axon Instruments）を使用して、このスライ
ドをスキャンした。代表的なデータがＦｉｇ２に示されている。各ケースでは、
アミノリンカーのない対応する配列に比較して、アミノリンカー修飾ポリヌクレ
オチドがより多く結合する。にもかかわらず、このデータは、ポリヌクレオチド
が共有及び非共有相互作用の組み合わせを介して結合することを示している。
【００３３】 この実施例に従って、コーティング上に結合したポリヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション活性を測定するために、前出の実施例に記載したように、合成Ｒ
ＮＡ転写物をＹＣＦ４４から調製した。Ｃｙ５-標識ｃＤＮＡプローブの生成、
ハイブリダイゼーション及びデータ分析を、前出の実施例に記載のようにおこな
った。次いで、ハイブリダイゼーションプローブの相対測定を示すために、結果
として生じたハイブリダイゼーションアレイを、Ｃｙ５チャネルの中でスキャン
した。代表的なデータは，Ｆｉｇ３に示されている。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 ＹＣＦ２３に対する配列番号：１−５の５つの相補的５９ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチド、及びＹＣＦ４４に対する配列番号：６−１０の５つの相
補的オリゴヌクレオチドの模式図を示す。
【Ｆｉｇ２】 ＹＣＦ４４ポリヌクレオチドの誘導体化ガラススライド：ポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン又はポリヒスチジン上への結合に対応す
る相対Ｃｙ３シグナル強度を例示する。この分析では、所定の濃度での各型のポ
リヌクレオチド（アミノリンカーを有する又は有しない）に対応するシグナルを
平均化した。
【Ｆｉｇ３】 ポリヌクレオチドの誘導体化ガラススライド：ポリエチレンイ
ミン（ＰＥＩ）、ポリリジン又はポリヒスチジン上への結合に対応する相対Ｃｙ
５シグナル強度を例示する。この分析では、所定の濃度での各型のポリヌクレオ
チド（アミノリンカーを有する又は有しない）に対応するシグナルを平均化した
。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サワン，サミュエル，ピー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01879 チングスバーロウ， ビヴァリー ロード 37 (72)発明者 リー，ポール，エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94588 プレザントン，ナーサリー ウェ イ 1782 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）支持体を、ｎが１から１０の間で、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ
    、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩから単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有
    する薬剤でシリル化し、 ｂ）最初の架橋剤で活性化し、 ｃ）修飾固体支持体を形成させるためにアミン含有ポリマーと反応させ、及び ｄ）修飾固体支持体上に定まった様式で配列している標的分子を、修飾固体支持
    体と結合させる段階を含んでなる、標的分子を固体支持体へ結合させる方法。
  2. 【請求項２】 反応後に、固体支持体が更に二番目の架橋剤で修飾される、
    請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 固体支持体が、ガラス、シリカ、プラスチック、セラミック
    、ビーズ、及びナイロン、及びそれらの組み合わせから成る群から選択された、
    請求項１又は２の方法。
  4. 【請求項４】 固体支持体がガラスである、請求項１，２又は３の方法。
  5. 【請求項５】 架橋剤が塩化シアヌルである、請求項１，２，３又は４の方
    法。
  6. 【請求項６】 アミン含有ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリヒスチジ
    ン、ポリリジン、及びポリアルギニン、及びそれらの組み合わせから成る群から
    選択される、請求項１，２，３，４又は５の方法。
  7. 【請求項７】 アミン含有ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１
    ，２，３，４又は５の方法。
  8. 【請求項８】 標的分子が共有結合的に修飾固体支持体と結合している、請
    求項１，２，３，４，５，６，又は７の方法。
  9. 【請求項９】 標的分子が非共有結合的に修飾固体支持体と結合している、
    請求項１，２，３，４，５，６又は７の方法。
  10. 【請求項１０】 標的分子が共有結合的及び非共有結合的に修飾固体支持体
    と結合している、請求項１，２，３，４，５，６又は７の方法。
  11. 【請求項１１】 標的分子が、標的ポリヌクレオチド、標的ポリペプチド、
    及び標的多糖から成る群から選択されている、請求項１，２，３，４，５，６，
    ７，８，９又は１０の方法。
  12. 【請求項１２】 標的分子が標的ポリヌクレオチドである、請求項１，２，
    ３，４，５，６，７，８，９又は１０の方法。
  13. 【請求項１３】 標的分子が、少なくとも約５０から６５ヌクレオチド長を
    独立して含んでなる標的ポリヌクレオチドである、請求項１，２，３，４，５，
    ６，７，８，９又は１０の方法。
  14. 【請求項１４】 標的分子が、５'-末端及び３'-末端、そして５'-末端又は
    ３'-末端にスペーサー腕を含んでなる標的ポリヌクレオチドである、請求項１，
    ２，３，４，５，６，７，８，９又は１０の方法。
  15. 【請求項１５】 標的分子が標的ポリペプチドである、請求項１，２，３，
    ４，５，６，７，８，９又は１０の方法。
  16. 【請求項１６】 標的分子が標的抗体である、請求項１，２，３，４，５，
    ６，７，８，９又は１０の方法。
  17. 【請求項１７】 標的分子が標的モノクローナル抗体である、請求項１，２
    ，３，４，５，６，７，８，９又は１０の方法。
  18. 【請求項１８】 標的分子のアレイであって、 ａ）支持体を、ｎが１から１０の間で、ＸをＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｃｌ、Ｂｒ、又は
    Ｉから単独で選択した式Ｈ２Ｎ-（ＣＨ２）ｎ-ＳｉＸ３を有する薬剤でシリル化
    し、 ｂ）最初の架橋剤で活性化し、 ｃ）アミン含有ポリマーと反応させる段階を含んでなる方法によって修飾した固
    体支持体、及び定まった様式で配列し、支持体と結合している多数の標的分子を
    含んでなるアレイ。
  19. 【請求項１９】 反応後に、固体支持体が更に二番目の架橋剤で修飾されて
    いる請求項１８のアレイ。
  20. 【請求項２０】 固体支持体が、ガラス、シリカ、プラスチック、セラミッ
    ク、ビーズ、及びナイロン、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択され
    ている、請求項１８又は１９のアレイ。
  21. 【請求項２１】 固体支持体がガラスである、請求項１８、１９、２０又は
    ２１のアレイ。
  22. 【請求項２２】 架橋剤が塩化シアヌルである、請求項１８、１９又は２０
    のアレイ。
  23. 【請求項２３】 アミン含有ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、及びポリアルギニン並びにそれらの組み合わせから成る群か
    ら選択されている、請求項１８，１９、２０、２１又は２２のアレイ。
  24. 【請求項２４】 アミン含有ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項
    １８、１９、２０、２１又は２２のアレイ。
  25. 【請求項２５】 標的分子が共有結合的に修飾固体支持体と結合している、
    請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４のアレイ。
  26. 【請求項２６】 標的分子が非共有結合的に修飾固体支持体と結合している
    、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４のアレイ。
  27. 【請求項２７】 標的分子が共有的及び非共有的の双方で修飾固体支持体と
    結合している、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４のアレイ。
  28. 【請求項２８】 標的分子が、標的ポリヌクレオチド、標的ポリペプチド及
    び標的多糖から成る群から選択されている、請求項１８，１９、２０、２１、２
    ２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
  29. 【請求項２９】 標的分子が、少なくとも約５０から６５ヌクレオチド長を
    単独で含んでなる標的ポリヌクレオチドである、請求項１８、１９、２０、２１
    、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
  30. 【請求項３０】 標的分子が、５'-末端及び３'-末端、及び５'-末端又は３
    '-末端のスペーサー腕を含んでなる標的ポリヌクレオチドである、請求項１８、
    １９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
  31. 【請求項３１】 標的分子が標的ポリペプチドである、請求項１８、１９、
    ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
  32. 【請求項３２】 標的分子が標的抗体である、請求項１８、１９、２０、２
    １、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
  33. 【請求項３３】 標的分子が標的モノクローナル抗体である、請求項１８、
    １９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のアレイ。
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