JP2003505109A - 核酸の捕獲及び検出の為の、シッフ塩基型結合による固体担体へのオリゴヌクレオチドの付着 - Google Patents

核酸の捕獲及び検出の為の、シッフ塩基型結合による固体担体へのオリゴヌクレオチドの付着

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JP2003505109A JP2001513640A JP2001513640A JP2003505109A JP 2003505109 A JP2003505109 A JP 2003505109A JP 2001513640 A JP2001513640 A JP 2001513640A JP 2001513640 A JP2001513640 A JP 2001513640A JP 2003505109 A JP2003505109 A JP 2003505109A
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ルクタノフ，ユージニー，アレクサンダー
ポディミノギン，ミカイル，エイ
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エポック・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 改変オリゴヌクレオチド（ＯＤＮｓ）は、固体担体に改良された収率で結合され、これによって、前記固体担体又は前記ＯＤＮの一方に取り付けられたＮＨ2基と、前記固体担体又は前記ＯＤＮの他方取り付けられた芳香族アルデヒドとの間のシッフ塩基型結合を通じて、前記担体の単位面積当たり高密度の結合オリゴヌクレオチドが達成される。好適な固体担体−ＯＤＮ結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、ガラス表面に取り付けられたセミカルバジド基と、ＯＤＮの３´末端又は５´末端又はＯＤＮの中間ヌクレオチドに取り付けられた芳香族アルデヒドとの間に形成される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、一般に、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの付着の化学作用に
関する。詳しくは、本発明は、一本鎖又は二本鎖のＤＡＮ又はＲＮＡ標的の捕獲
と検出の為の、シッフ塩基型共役結合を通じた、固体担体へのオリゴヌクレオチ
ドの結合に関する。
【０００２】 発明の背景 非常に少量の核酸の検出と定量化は、生物、法廷及び医療科学において重要な
役割を果す。典型的には、サンプル中の核酸は、８以上の連続したヌクレオチド
を含む相補的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出
される。前記標的−オリゴヌクレオチドハイブリッドに比例するシグナルを提供
する為に、通常、前記標的又は前記捕獲用オリゴヌクレオチドのいずれかが、放
射性、蛍光性、化学発光性の機能基（ｍｏｉｅｔｙ）等のシグナル発生標識、又
は、その触媒活性を通じて検出可能な産物を得ることが出来る酵素（ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ等）を含有する。この点に関して従来技術は非常に発
達しており、核酸フィールド内のシグナルの検出と定量化のために多くの方法が
利用可能である。
【０００３】 前記捕獲用の標識化されたオリゴヌクレオチドの標的核酸に対するハイブリダ
イゼーション後、反応しない標的及び標識化オリゴヌクレオチドからシグナル発
生二本鎖を分離することが必要である。これは、通常、前記標的、又より一般的
には、前記捕獲用オリゴヌクレオチドが、固体担体上に固定され、それによって
不純物分子を含まない前記ハイブリッドの単離を可能にすることから達成される
。「サンドイッチアッセイ」変形法においては、オリゴヌクレオチドが固体担体
に固定されて標的を捕獲するために使用される。捕獲された標的は、前記捕獲用
オリゴヌクレオチドと異なる配列を有する第２の標識化オリゴヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーションによって検出される。
【０００４】 従来技術において、オリゴヌクレオチドを固定するのに適した多くのタイプの
固体担体が知られている。これらには、ナイロン、ニトロセルロース、活性化ア
ガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス粒子、プラスチック、ポリスチレン
、ガラス、及びポリマー改変表面が含まれる。これらの固体担体は、膜、マイク
ロタイタープレート、ビーズ、プローブ、ディップスティック、等の多くの形態
で使用される。オリゴヌクレオチドを、これらの固体担体に直接的又はリンカー
を介して共有結合させるための様々な化学的方法が知られている。その中で本発
明の背景として特に注目されるのは、近年記載された（ラメゼイ（Ｒａｍｓａｙ
），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：４０−４（１９９８））ＤＮＡマ
イクロアレイの作成においてガラス及びナイロン表面を使用する方法である。Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌は、マイクロアレイの有用性とその限界を記載
した特集補足を出版している（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１（１）：１−６０（
１９９９））。
【０００５】 通常、なんらかの固体担体を使用するためには、求核性基と反応することが可
能な「反応基」を含有しなければならないオリゴヌクレオチドと反応する求核性
基の存在が必要である。或いは、前記固体担体内に、オリゴヌクレオチド内に存
在する又はそれに付着された求核体と反応する「反応基」が存在しているか、も
しくは、導入される。適当な求核基又は機能基（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は、ヒドロ
キシル、スルフィドリル、アミノ及び活性化カルボキシル基を含み、他方、これ
ら及びその他の求核体（反応基）と反応可能な基は、ジクロロトリアジニル、ア
ルキルエポキシ、マレイミド、ブロモアセチル基及びその他を含む。前記求核又
は反応基を固体担体に導入する化学的方法は公知であり、それらの方法には、ナ
イロン（米国特許第５，５１４，７８５号）、ガラス（ロジャース（Ｒｏｄｇｅ
ｒｓ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３−３０（１９９９））、アガロー
ス（ハイスミス（Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ）等、Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１２：４１８−２３（１９９２）及びポリスチレン（ゴッシュ（Ｇｏｓｈ）等
、Ｎｕｃ．にＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５：５３５３−５３７２（１９８７））を
活性化する方法がある。固体担体上に反応又は求核基が存在する又はオリゴヌク
レオチドが存在するかに応じて、結合は、直接的に又はニ官能性試薬を使用して
行うことができる。ニ官能性及び結合試薬は周知であり、多くの業者から入手可
能である。
【０００６】 本発明の背景として特に注目されるのは、クレムスキ（Ｋｒｅｍｓｋｙ）等（
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５：２８９１−２９０９（１９８７））によっ
て記載されている、５´末端に６炭素カルボキシ酸リンカーを含有する１６量体
オリゴヌクレオチドの作成のための方法である。この生成物は、標準式合成器で
適当なホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｉｅｓ）を使用して
合成された。次に、この酸を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル
カルボジイミドの存在下で３−アミノ−１，２−プロパンジオールと反応させて
安定したジオールを生成した。このジオールをアルデヒド段階に酸化させ、次に
、それをヒドラジドラテックスビーズと反応させて、シアノボロヒドリドナトリ
ウムによって還元されたシッフ塩基結合を形成した。その著者等は、前記オリゴ
ヌクレオチドジオールは安定的な中間物であるが、アルデヒドとオリゴヌクレオ
チド塩基との不要な反応を最小限にするために、アルデヒドは、前記ラテックス
ビーズへの結合の直前に調合すべきである、と教示している。
【０００７】 本発明の背景として注目されるもう一つの記事は、アルキル化によるオリゴヌ
クレオチドの５´の燐酸塩への芳香族アルデヒドの結合を記載しているツァレヴ
（Ｔｓａｒｅｖ）等（Ｂｉｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１６：７６５−７９（１９９０
）によるものである。その生成物は、酵素−Ｔ７Ａ２プロモータ複合体をプロー
ブするために使用された。
【０００８】 通常、ガラス表面は、適当なシロキサン試薬を使用してガラスに対してアミノ
−、スルフィドリル−、カルボキシ−、又はエポキシル−基を導入することによ
って活性化される。具体的には、ガラス担体上のオリゴヌクレオチドアレイの固
定が、１−４−フェニレンジイソチオシアネートを使用したグオ（Ｇｕｏ）等，
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２：５４５６−５４６５（１９９４）、無水コ
ハク酸とカルボジイミド結合を使用したジョーズ（Ｊｏｏｓ）等、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，２４７：９６−１０１（１９９７）、及び３−グリシドキシプ
ロピルトリメトキシシランを使用したベアッティ（Ｂｅａｔｔｉ）等、Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４：２１３−２２５（１９９５）、によって記載されている
。
【０００９】 重亜硫酸塩存在下における一本鎖ＤＮＡ中のシチジンと、セミカルバジド機能
基を含有する試薬との急激な特異的反応も記載されている（ハヤツ（Ｈａｙａｔ
ｓｕ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５：２６７７−２６８２（１９７６）。
【００１０】 ハイブリダイゼーションによる配列決定や遺伝子発現のアレイに基づく分析等
の、固定されたオリゴヌクレオチドのアレイを利用する方法が知られている。こ
れらの方法において、異なる既知の配列を有する複数のオリゴヌクレオチドのオ
ーダーされたアレイを、単数又は複数のテストポリヌクレオチド、核酸、又は核
酸ポピュレーションへのハイブリダイゼーションのプラットフォームとして使用
する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの検出と、それらの既知の配列の
アラインメントによってテストポリヌクレオチドの配列を再構成することが可能
である。例えば、米国特許第５，４９２，８０６号、第５，５２５，４６４号、
第５，５５６，７５２号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／１０５８８，ＷＯ９６／１
７９５７、及びラムゼイ（Ｒａｍｓａｙ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，
１６：４０−４（１９９８）及びリプシュツ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ）等，Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．，２１：２０−２４（１９９９））の科学刊行物を参照。
【００１１】 しかしながら、現在の固定化方法の多くには、単数又は複数の欠点がある。そ
れらの内のいくつかとしては、オリゴヌクレオチド装荷（ｌｏａｄｉｎｇ）収率
が低い複雑で高価な反応スキーム、副反応しやすい反応性で不安定な中間生成物
、固定されたオリゴヌクレオチドの不都合なハイブリダイゼーションカイネティ
クスがある。高スループットモードでガラス表面上でアレイ状に効果的にオリゴ
ヌクレオチドを固定するには、ａ）様々なバッチでの再現可能な装荷を提供する
単純で信頼性の高い反応、ｂ）安定的な反応中間生成物、ｃ）装荷率が高くハイ
ブリダイゼーション速度の速いアレイ、ｄ）高温安定性、ｅ）低コスト、及びｆ
）低バックグランド、が必要である。
【００１２】 本発明は、これらの課題のいくつかを満たす又はそれらと取り組む方向におけ
る大きなステップを提供するものである。
【００１３】 発明の要旨 本発明によれば、シッフ塩基型共役結合が、ＮＨ2機能基を含有する基と、芳
香族アルデヒド又はケトンとの間に形成されて、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）
を固体担体に共有結合する。前記シッフ塩基型結合は、前記固体担体と、前記Ｏ
ＤＮの３´末端又は５´末端との間、或いは前記固体担体と、前記ＯＤＮ中の単
数又は複数の中間ヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ）との間にある。或いは、前記シッフ塩基型結合は、これらの部位の組み
合わせに存在する。この点に関して、前記シッフ塩基型共有結合は、前記固体担
体又は前記ＯＤＮ上に直接的にではなく、それら自身が前記固体担体及び前記Ｏ
ＤＮにそれぞれ共有結合付着された結合基（リンカー）上に配置されてもよいこ
とが理解される。従って、前記固体担体又は前記ＯＤＮのいずれか一方又は両方
は、前記ＯＤＮを前記固体担体に結合させるべく前記シッフ塩基型共有結合を形
成する−ＮＨ2又は芳香族アルデヒド基を含む結合基を含むものであってよい。
【００１４】 本発明の一態様及び好適態様によれば、前記シッフ塩基型共有結合は、式Ｒ´
−ＮＨ−ＣＯ−ＨＮ−ＮＨ2のセミカルバジド基又は機能基と、式Ｒ´´−Ｑ−
ＣＨＯの芳香族アルデヒド機能基、好ましくは、ベンズアルデヒド機能基、との
間に形成され、ここで、前記基Ｒ´は、前記固体担体又はＯＤＮに付着されたリ
ンカー基を含む前記固体担体又は前記ＯＤＮ残基の一方を表わし、前記Ｒ´´は
、それらに付着されたリンカー基を含む前記固体担体又はＯＤＮ残基の他方を表
わす。この式中の符号Ｑは、Ｎ，Ｏ及びＳから独立的に選択される三つ以下のヘ
テロ原子を有することが可能な芳香環又はヘテロ芳香環を表わし、ここで、前記
芳香又はヘテロ芳香環は、それ自身、アルキル又はアルコキシ基が好ましくは１
〜６の炭素を有する、アルキル、アルコキシ又はハロゲン基によって置換可能で
ある。従って、前記固体担体と前記ＯＤＮとの間に形成される前記結合は、式 Ｒ´−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｑ−Ｒ´´ によって表わされ、ここで、これらの符号は上述した意味を有する。
【００１５】 本発明の更に別の態様及び好適態様又は実施例によれば、前記セミカルバジド
機能基は、ガラス表面に取り付けられ、前記ベンズアルデヒド機能基には、前記
ＯＤＮの３´又は５´末端、又は、前記ＯＤＮの内部に位置する単数又は複数の
ヌクレオチドへのリンカーが付着される。前記セミカルバジド改変固体担体表面
及び前記芳香族アルデヒド結合ＯＤＮを作成するための合成方法は、本発明の更
に別の態様を構成する。
【００１６】 上に要約した、芳香族アルデヒド又はケトンを含んでいるシッフ塩基型結合、
特に、セミカルバゾン結合、によって共に結合された前記固体担体ＯＤＮ結合体
の利点としては、（ａ）ｐＨ７以下で形成可能であること、（ｂ）シッフ塩基と
芳香族アルデヒドの結合、特に、芳香族アルデヒドとの結合によって形成された
セミカルバゾンの安定性、（ｃ）前記ＯＤＮが、固体担体を含む前記セミカルバ
ジド機能基に対して、（６０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好まし
くは９５％以上の）高い確率で付着可能であること、そして（ｄ）前記固体担体
の単位表面積当たりの高い結合密度（好ましくは、約１０4オリゴヌクレオチド
／μｍ2、最も好ましくは約１０5オリゴヌクレオチド／μｍ2）が得られること
、が挙げられる。これらの利点は、従来の方法と対照的であり、例えば、ＯＤＮ
に付着された脂肪族アルデヒドが、ヒドラゾン含有固体担体と結合されて、不安
定で、安定した固体担体−ＯＤＮ結合体を提供するためには還元されなければな
らないヒドラゾンを形成するクレムスキ（Ｋｒｅｍｓｋｙ）等、（Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．，１５：２８９１−２９０９（１９８７））を参照。
【００１７】 本発明の別の態様は、アルデヒド標識化プライマが使用されて、アンプリコン
が、セミカルバジド含有固体担体上で固定される方法において一本鎖ＤＮＡを単
離する一般的方法である。前記アンプリコンの変性と単離によって、溶液中と前
記固体担体上に一本鎖ＤＮＡが得られ、これらは、それぞれ、公知の多くの用途
に使用することが可能である。これは、一本鎖ＤＮＡが、ビオチニル化プライマ
を使用したポリメラーゼ連鎖反応後に、「親和生成」され、その後、ストレプト
アビジン−固体担体分離される、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）等、Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７８：２３９−４２（１９８９）に記載の方法の改良で
あり、更なる発展である。
【００１８】 本発明の更に別の態様又は実施例によれば、前記セミカルバゾン結合によって
前記固定表面に結合された前記オリゴヌクレオチドは、更に、単数又は複数の適
当に付着された小溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）機能基、蛍光発生機能基、及
び蛍光クエンチャーを含む。この結合体は、増幅反応中に、完全な相補性標的に
よって、前記クエンチャー分子が、増幅中に、５´−ヌクレアーゼ活性又はポリ
メラーゼによって切開され（米国特許第５，２１０，０１５号、及びウィッター
（Ｗｉｔｔｅｒ）等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８（１
９９７））に記載されているように）、その結果、蛍光固定されたオリゴヌクレ
オチドが作り出されるように構成されている。ミスマッチの標的は増幅されず、
蛍光シグナルは発生しない。米国特許第５，２１０，０１５号の明細書と刊行物
ウィッター（Ｗｉｔｔｅｒ）等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−
１３８（１９９７）とをここに参考文献として合体させる。
【００１９】 本発明の更に別の態様によれば、前記セミカルバゾン又はその他のシッフ塩基
改変ガラス表面に対する負電荷核酸分子の非特異的吸収は、前記無反応ＮＨ2基
（好ましくは、セミカルバジド−Ｒ´−ＮＨ−ＣＯ−ＨＮ−ＮＨ2基）を陰イオ
ンを含有する機能基に変換することによって大幅に除去可能である。これは、前
記固体担体ＯＤＮ結合体を、例えば、この結合体を４−ホルミル−１，３−ベン
ゼンジスルホン酸基と反応させることによって、陰イオン基を導入する試薬と反
応させることによって達成される。更に、前記固体担体、好ましくは、ガラス表
面、上の反応しないシラノール機能が、疎水性シロキサンによって末端キャップ
され、前記固定オリゴヌクレオチドの安定性を増加させる。
【００２０】 これは通常は不要であるが、前記芳香族アルデヒド機能基と形成されたセミカ
ルバゾン結合と前記固体担体とのオリゴヌクレオチドの結合を還元して、更に安
定的な固体−担体−ＯＤＮ結合体を提供することができる。
【００２１】 本発明の更に別の態様によれば、シチジンを含有するＯＤＮが、前記ＯＤＮの
シチジンヌクレオチドを介した重亜硫酸塩触媒共有結合付着によって、セミカル
バジド基を含有する固体担体上に固定される。
【００２２】 本発明は、主として、現時点においては、前記シッフ塩基型（好ましくはセミ
カルバゾン）結合によってガラス表面に付着したオリゴヌクレオチドを使用した
核酸の捕獲と検出、特に、アレイ形状のＰＣＲ生成核酸配列の捕獲と検出とに使
用されるが、本発明の用途は、これに限定されるものではない。一般に、本発明
によって固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオ
チド、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列に対するより優れた直接捕獲能力を示す。
【００２３】 好適実施例の説明 改変担体（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ） 前記要約部に記載したように、本発明によれば、前記固体担体又は前記オリゴ
ヌクレオチド（ＯＤＮ）のいずれか一方が求核アミノ基を含有し、その他方が、
十分に高速かつ効率的な反応で、前記求核アミノ基と反応して、その結果、安定
的な共有結合によってそれに結合された前記固体担体の単位面積当たり高密度の
ＯＤＮを達成する、前記ＯＤＮを前記固体担体に付着させるシッフ塩基型共有結
合を形成することが可能な芳香族又はヘテロ芳香族アルデヒド又はケトンを含有
する。これらの特性を備えるために、前記求核アミノ基は、好ましくはかつ理想
的には、７．０以下のｐＫａを有する。好適実施例において、前記求核アミノ（
ＮＨ2）基は、前記固体担体に共有結合し、前記芳香族アルデヒド又はケトン（
好ましくはアルデヒド）は、前記ＯＤＮに結合される。
【００２４】 従って、本発明の好適実施例に使用される前記固体担体は、第１アミン（Ｒ´
−ＮＨ2）として、又はヒドラジニル、（Ｒ´−ＮＨ−ＮＨ2）、オキシアミノ（
Ｏ−ＮＨ2）、又はセミカルバジド（Ｒ´−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2）基、とし
て前記求核ＨＮ2基を含有する。Ｒ´は、単に、可能な結合基又はリンカーを含
む、前記固体担体の残りを表わす。最も好ましくは、本発明による前記固体担体
は、１つ以上３０以下の原子を含有するリンカーによって前記固体担体のマトリ
クスに付着されたセミカルバジド基を含む。機能基を含有するこれらのアミノ（
ＮＨ2）基は、公知の方法によって前記固体担体又は表面に導入することができ
る。
【００２５】 従来技術において利用可能な複数種の固体担体の内、ガラスが最も好ましい。
本発明のこの好適実施例によれば、前記ガラス表面は、前記求核アミノ（ＮＨ2
）基を含み、これは、前述したように、１つ以上３０以下の原子を含有するリン
カーによって、前記ガラス表面に結合された、第１アミノヒドラジニル、オキシ
アミノ、又はセミカルバジド基とすることができる。最も好ましくは、セミカル
バジド基が、前記リンカーによって前記ガラス表面に結合される。このセミカル
バジド基は、７．０以下のｐＫａを有する。このセミカルバジド基とその他のア
ミノ（ＨＮ2）基とは、適当なトリアルキルオキシシランとの反応を含む、公知
の方法によって前記ガラス表面に導入することができる。本発明の最も好適な実
施例の場合、前記セミカルバジド基は、反応スキーム１に図示された、トリアル
キルオキシシランを含有するセミカルバジドによって前記ガラス表面に導入され
る。
【００２６】
【化１２】 反応スキーム１
【００２７】 反応スキーム１において、Ｒ1は、１〜１０炭素のアルキル基を表わす。但し
、単数又は複数のＲ1基は、フェニルとすることも可能である。現時点において
最も好適な実施例において、Ｒ1は、エチルである。ｎは整数であり、好ましく
は、０〜３０、より好ましくは０〜１０の値を有する。従って、このスキームに
よれば、アルキル鎖によって付着されたイソシアノ基を有するトリアルコキシシ
ロキサン化合物（式１）が、ヒドラジンと反応して、セミカルバジド（式２）を
含むトリアルコキシシランを提供し、これが、その後、前記ガラス表面と反応し
、前記リンカー（ＣＨ2）ｎを通じて付着したセミカルバジド基を有するガラス
表面（固体担体）が提供される（式３）。これらの反応の条件の詳細説明は、こ
の特許出願の実験部分に提供される。
【００２８】 改変オリゴヌクレオチド（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ） 本発明の好適実施例において、芳香族又はヘテロ芳香族アルデヒドは、前記オ
リゴヌクレオチド（ＯＤＮ）と共有結合され、これによって、前記ＯＤＮを、前
記固体担体に結合された前記求核ＮＨ2（好ましくはセミカルバジド）基と反応
を可能にする。
【００２９】 本発明以前においては、オシャネシー（Ｏ´Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ等、Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：１−８（１９９０））に記載されているように、
オリゴヌクレオチドにアルデヒド基を導入する方法は複雑で、ジオール前駆物質
のオリゴ合成後の過ヨウ素酸塩酸化を必要とするものであった。本発明の新規な
態様又は特徴は、保護された芳香族アルデヒドを含み、標準的な自動オリゴヌク
レオチド合成中におけるＯＤＮへのアルデヒド基の導入に利用可能なホスホルア
ミダイト試薬を提供することにある。最も好適な実施例において、前記芳香族ア
ルデヒド基又は機能基は、反応スキーム２中において式４によって示されている
ように、フェニル環に付着された「Ｒx」によって示すリンカーを有する「ベン
ズアルデヒド」機能基である。
【００３０】
【化１３】 反応スキーム２
【００３１】 式４において、Ｒxは、原子鎖を表わし、これは、環を含むものとすることが
でき、又、２〜１５０原子の全長を有するものとすることができる。Ｒxは、Ｃ
，Ｈ，Ｎ，Ｏ及びＳから選択される原子を含むことができ、更に、−ＮＨ−，−
Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ
Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ又は−Ｓ−
Ｓ−基を１つ以上含むことができる。Ｒxを形成する合成方法は公知であり、例
えば、合成用リンカーアームの説明との関連において米国特許第５，８４９，４
８２号に記載されている。この米国特許第５，８４９，４８２号の明細書をここ
に参考文献として合体させる。尚、式４の芳香族アルデヒドの代りに、芳香族ケ
トン（アセトフェノン等）を使用することも可能であろう。但し、アルデヒドの
使用が好ましい。
【００３２】 反応スキーム２によれば、式４の芳香族アルデヒド（又はケトン）は、式５の
ジアセタール、環状アセタール、又はジアルカノエート派生物の形成によって、
前記アルデヒド基中において保護されている。式５において、Ｒ2は、１〜６炭
素のアルキル基、１〜６炭素のアシル基、を表わし、前記二つのＲ2基は、協動
で、２−４炭素の炭素環式化合物を形成する（例えば、エチレングリコールと形
成される環状アセタールにおける環状アセタールのように）。次に、式５の保護
されたアルデヒドを、反応スキームに図示されているように、式６のホスホルア
ミダイト試薬に変換する。この変換の詳細な実験条件は、実験部の例に記載する
。次に、式６のホスホルアミダイト試薬を、後に使用して前記保護アルデヒドを
オリゴヌクレオチド（下記のように）に導入する。
【００３３】
【化１４】 式７
【００３４】 式６のホスホルアミダイト試薬の代りに、前記保護芳香族アルデヒドを、それ
自身がＯＤＮの５´又は３´末端に付着されている第１又は第２アミノ基、又は
、前記ＯＤＮ中の内部ヌクレオチドに付着されている第１又は第２アミノ基に付
着させることも可能である。
【００３５】 アミノ尾端（ｔａｉｌｅｄ）ＯＤＮは、従来技術によって作成することができ
、例えば、その明細書をここに参考文献として合体させる米国特許第５，５１２
，６６７号に記載されている。保護芳香族アルデヒドを前記ＯＤＮのいずれかの
末端、又は単数又は複数の内部ヌクレオチドに付着させるのに適した試薬が式７
に図示されている。式７において、Ｒ2及びＲxは、式５との関連において定義さ
れる。Ｙは反応基（求核性アミンと反応可能）であって、例えば、炭酸塩、イソ
シアネート、イソチオシアナート、モノ又はジ−置換ピリジン、アジリジン、Ｃ
Ｏ−Ｘ，ＳＯ2−Ｘ（Ｘはハロゲン）、モクロロトリアジン、ジクロロトリアジ
ン、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、アゾドニトロフェニル又はアジド基等である。例として、適当に活性化さ
れた３−（α，α−ジメトキシトル−４−イル）プロピオン酸派生物を、内部塩
基として前記ＯＤＮに導入された５−（３−アミノプロピル）ウリジンヌクレオ
チドに結合させることができることが銘記される。
【００３６】
【化１５】 反応スキーム３
【００３７】 反応スキーム３は、３´−芳香−アルデヒド−尾端オリゴヌクレオチドの合成
に適した制御細孔ガラス試薬１２の合成の実際例を開示している。この点に関し
て、本記載において実際の化合物に与えられている番号は、一般式に与えられて
いる番号と区別されるべきものであると理解される。従って、反応スキーム３に
おいて「６」と示されている化合物は、反応スキーム２中の式６と区別されなけ
ればならない。スキーム中に１２で示されている制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）担体に付着された保護アルデヒド機能を提供
する反応条件例の詳細説明は、実験部分に提供される。前記ＣＰＧ担体１２は、
第１ヒドロキシ機能にジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基を有する
。前記ＤＭＴ保護基が除去された後、公知の工程によって、この支持体上に段階
的にＯＤＮを構築し、前記芳香族アルデヒド機能基が３´末端に付着したＯＤＮ
を得ることができる。次に、このまだその３´末端に芳香族アルデヒドを有する
ＯＤＮを、周知に方法によって前記固体担体から取り外す。
【００３８】 反応スキーム３は、更に、アルデヒド機能がジ−アセテートとして保護されて
いるホスホルアミダイト試薬１０を提供するための合成ルート例も開示している
。このホスホルアミダイト試薬１０は、前記芳香族アルデヒド機能がＯＤＮの５
´末端にあるＯＤＮを合成するための従来技術に従って使用することができる。
【００３９】 前記実験部は、本発明に関連して使用されるジアセタール及びジアセテート派
生物の精製と脱保護のために利用される条件を記載している。前記アルデヒド含
有担体及び／又はホスホルアミダイト試薬１０を利用して合成された、前記オリ
ゴヌクレオチド中のアルデヒド基の存在は、２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ンとの反応、その後の、逆相ＨＰＬＣ分析によって確認することができる。この
技術は、アルデヒド−ＯＤＮから出発して得られるヒドラゾン−ＯＤＮと明らか
に区別されるものである。本発明によって作られた前記アルデヒドＯＤＮは、数
ヶ月に渡って−２０℃で保存された時に反応性において顕著な変化を示さなかっ
た。
【００４０】 ＯＤＮの改変固体担体との結合 前記好適実施例について記載したように、固体ガラス表面上の求核アミノ基は
、ＯＤＮの´３又は´５末端又は内部塩基に付着されたアルデヒド基と反応され
る。或いは、前に簡単に説明したように、芳香族アルデヒドが固体担体（ガラス
表面）に付着され、アミノ基（好ましくはセミカルバジド）がＯＤＮに付着され
る。
【００４１】 一般に、結合反応は、２〜７のｐＨ、好ましくはｐＨ６、最も好ましくはｐＨ
５で行われる。ｐＨ以外は、反応条件は前記反応にとって極めて重要ではないこ
とが判った。特に前記好適実施例におけるようにセミカルバジドＮＨ2基が使用
される場合、本発明によってガラス担体の単位表面積当たり高い密度のＯＤＮが
達成可能であることが判った。好ましくは、１０4オリゴヌクレオチド／μｍ2、
より好ましくは１０5オリゴヌクレオチド／μｍ2の密度が本発明によって得られ
る。前記セミカルバゾン結合は、標準ＰＣＲ及び診断アッセイに使用される中性
及び中度塩基性ｐＨにおいて安定的であると判定された。
【００４２】 更に、本発明の別の態様又は特徴として、前記固体担体上の無反応ＮＨ2基を
陰イオン発生試薬によって処理することによって、実質的に無バックグラウンド
の固体担体表面が達成される。
【００４３】 前記アルデヒド改変オリゴヌクレオチドとの、ヌクレオチドアミノ基含有支持
担体の反応から形成されたガラス−オリゴヌクレオチド共役結合体の例が式８に
図示されている。
【００４４】
【化１６】 式８
【００４５】 ここで、ｎは１〜３０；Ｒ3はＨ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアル
キル；Ｘは−Ｎ＝；−ＯＮ＝；−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝；−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ）
−ＮＨ−Ｎ＝又は−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝；Ｑは炭素環とすること
が可能で、ナフタレン、ジヒドロ又はテトラヒドロナフタレン等の縮合環構造と
することが可能な芳香環、又は、５又は６員（例えば、チオフェン又はピリジン
）とすることが可能なヘテロ芳香環又は、キノリン等の縮合環構造の一部である
ヘテロ芳香環、そして、前記環自身は、下位アルキル、下位アルコキシ又はハロ
ゲン等の置換物と置換可能であり、Ｖは、２〜１００原子長をとり得るリンカー
で、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ及びＳから選択される原子を含むことが可能で、更に追加的
に−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−，
−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，ＯＰ（Ｏ
）（Ｏ-）Ｏ−又は−Ｓ−Ｓ−基の内の単数又は複数を含むことが可能である；
Ｒ5は、ヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−３´−オリゴマ又はヌクレ
オチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−５´−オリゴマであって、ここで、Ｕは
Ｏ又はＳである。Ｔは、原子価結合又はリンカー様Ｖである。Ｔは、Ｘに隣接し
た炭素原子を有する。
【００４６】 アルデヒド改変固体担体が、３´−，５´−又は内部塩基に求核アミノ基を含
むＯＤＮに結合された別の好適実施例が式９に図示されている。
【００４７】
【化１７】 式９
【００４８】 ここで、ｍは１〜３０；Ｒ3はＨ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアル
キル；Ｘは−Ｎ＝；−ＯＮ＝；−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝；−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ）
−ＮＨ−Ｎ＝又は−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝；Ｑは炭素環とすること
が可能で、ナフタレン、ジヒドロ又はテトラヒドロナフタレン等の縮合環構造と
することが可能な芳香環、又は、５又は６員（例えば、チオフェン又はピリジン
）とすることが可能なヘテロ芳香環又は、キノリン等の縮合環構造の一部である
ヘテロ芳香環、そして、前記環自身は、下位アルキル、下位アルコキシ又はハロ
ゲン等の置換物と置換可能であり、Ｗは、２〜１００原子長で、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ
及びＳから選択される原子を含むことが可能で、更に追加的に−ＮＨ−，−ＯＨ
，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）
−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−又は
−Ｓ−Ｓ−基の内の単数又は複数を含むことが可能である；Ｒ5は、ヌクレオチ
ドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−３´−オリゴマ又はヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ
＝（Ｏ）（−Ｕ-）−５´−オリゴマであって、ここで、ＵはＯ又はＳである。
Ｔは、原子価結合又はリンカー様Ｗである。ＷとＴは、Ｘに隣接した炭素原子を
有する。従って、式８及び９において、基Ｖ，Ｗ及びＴは、前記シッフ塩基型結
合を前記固体担体へ、更に用途に応じてＯＤＮへ付着する可能なリンカー基を表
わしている。
【００４９】
【化１８】 反応スキーム４
【００５０】 反応スキーム４は、本発明の現時点において最も好適な実施例による、セミカ
ルバゾン結合に結合されたＯＤＮ−ガラス結合体の形成を開示している。
【００５１】 更に別の実施例において、オリゴヌクレオチドは、３´，５´又は内部ヌクレ
オチドに導入された１種類以上の芳香族アルデヒド含有機能基によって固体担体
に付着される。
【００５２】 ここに参考文献として合体させるハヤツ（Ｈａｙａｔｓｕ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，１５：２６７７−２６８２（１９７６）によって開示された反応と同様にし
て、長鎖ＤＮＡを、シチジン残基を介した重亜硫酸塩触媒共有結合によって前述
したようにセミカルバジド機能基を含有する固体担体に固定することも本発明の
範囲に属する。
【００５３】 ＰＣＲアッセイ条件下における前記セミカルバゾン結合の安定性を、下に示す
モデル化合物を使用して測定した：
【００５４】
【化１９】 式１０
【００５５】 前記セミカルバゾン結合体（式１０）を、ＰＣＲバッファ中で９５℃で３０分
間処理し、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィによって分析した。前記処理されたセ
ミカルバゾン結合体を前記開始物質と比較したところ、ほとんど、又は全く分解
されていなかった。
【００５６】 別の実施例において、固体表面結合オリゴヌクレオチドは、更に、好適に保持
された、小溝バインダ、蛍光発生機能基、及び蛍光クエンチャーを含む。この結
合体は、完全な相補性標的による増幅反応中に、増幅中に前記クエンチャー分子
が、米国特許第５，２１０，０１５号、及びウィッター（Ｗｉｔｔｅｒ）等、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８（１９９７））に記載されて
いる反応のように、５´−ヌクレアーゼ活性によって切開され、その結果、蛍光
固定されたオリゴヌクレオチドが作り出されるように構成されている。ミスマッ
チの標的は増幅されず、蛍光シグナルは発生しない。これは図６に略示されてい
る。小溝バインダ（ＭＧＢ）、フルオロホア（Ｆ）及びクエンチャー（Ｑ）をＯ
ＤＮに付着させる化学作用と方法は、米国特許第５，８０１，１５５号、１９９
８年４月３日出願の同時係属出願第０９／０５４，８３２号に記載されており、
これらの明細書をここに参考文献として合体させる。
【００５７】 アレイを構築するための材料としては、非限定的に、ナイロン、ポリプロピレ
ン、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウェハ、光ファイバ、コポリマ、及び
公知のものに類似のアレイ構造に適したその他の材料がある。
【００５８】 固体表面上の無反応基の末端キャッピング 前記セミカルバゾン結合を介した固体担体へのオリゴヌクレオチドの共有結合
付着後、表面上の無反応アミノ基を、非特異的プライマ及びアンプリコンバック
グラウンドを制限するのに役立つ陰イオン発生試薬によって処理する。これは、
前記固体表面の、適当な芳香族アルデヒド（式１１）による処理によって達成さ
れる。同様に、セミカルバジド標識化オリゴヌクレオチドが芳香族アルデヒド含
有固体担体に結合される時、無反応アルデヒド基は、陰イオン発生試薬（式１２
）と反応し、ここでＲ6とＲ7は、それぞれ独立的にＨ−，−ＣＯＯ-、又は−Ｓ
Ｏ3 -である。無反応シラノール基も、反応特性を更に高めるために改変すること
も可能である。適当なシランは、市販されている（ＵＣＴ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｐ
Ａ）。
【００５９】
【化２０】 式１１
【００６０】
【化２１】 式１２
【００６１】 改変固体担体のハイブリダイゼーション特性 固体表面上のオリゴヌクレオチド装荷を、適当な32Ｐ標識化ヌクレオチド三燐
酸基塩及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はＴ４ポリヌクロ
チドキナーゼを使用して反対の末端が32Ｐ標識化された５´−又は３´−アルデ
ヒド改変オリゴヌクレオチドを使用して測定した。前記32Ｐ標識化オリゴヌクレ
オチドを、直径約１．５ｍｍの小スポットとしてのセミカルバジド改変ガラス表
面と直接反応させ、過剰セミカルバジド基は、４−フォルミル−１，３−ベンゼ
ン二スルホン酸との反応によってキャッピングした。共有結合オリゴヌクレオチ
ドを、適当な標準曲線を使用して蛍光体イメージャによって定量化した。最大付
着が約１０5オリゴヌクレオチド分子／μｍ2の表面密度で約１時間以内に達成さ
れた。１５μＭ以上（＞１５μＭ）のオリゴヌクレオチド濃度での反応で、ガラ
ス表面上に最高の固定が得られた。
【００６２】 前記固体担体に対してセミカルバゾンリンカーを介して固定された前記オリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力を、相補的32Ｐ標識化オリゴヌクレ
オチドの直接捕獲によってテストした。約１００ｆｍｏｌｅオリゴヌクレオチド
／スポットの最適捕獲率が、約２７５ｆｍｏｌｅオリゴヌクレオチド／スポット
の濃度を固体表面に塗布した時に達成することができた。更に、蛍光体イメージ
ングによって、ビオチニル化プライマとストレプトアビジンビーズとを使用して
一本鎖に分離され、適当に32Ｐ標識化された２３５ｂｐのアメロギニン遺伝子フ
ラグメントＰＣＲ産物が、本発明によって結合されたプローブによって効率的に
捕獲することが可能であることが示された。別のデモンストレーションにおいて
は、アレイに固定された６種類の捕獲オリゴヌクレオチドが、それらの相補的一
本鎖ＰＣＲ増幅標的を効率的に捕獲した。
【００６３】 発明の好適使用態様 オリゴヌクレオチドアレイ 本発明の別実施例において、固定されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイ
ゼーションによる配列決定や遺伝子発現のアレイに基づく分析等の、オリゴヌク
レオチドのアレイを利用する方法に使用される。ハイブリダイゼーションによる
配列決定において、異なる既知の配列のオリゴヌクレオチドのオーダーされた配
列を、単数又は複数のテストポリヌクレオチド、核酸、又は核酸ポピュレーショ
ンへのハイブリダイゼーションのプラットフォームとして使用する。ハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドの検出と、それらの既知の配列のアラインメントに
よってテストポリヌクレオチドの配列を再構成することが可能である。或いは、
野生型配列を有するオリゴヌクレオチドと、対象遺伝子の所与の領域のすべての
可能な変異配列とをアレイ上に配置することができる。前記アレイをハイブリダ
イゼーション条件下において対象体又は生物標本からのＤＮＡ又はＲＮＡに対し
て露出することによって、前記対象遺伝子の野生型又は変異ステータスを判定す
ることができる。これは、本発明を使用することなく、従来技術、例えば、米国
特許第５，４９２，８０６号、第５，５２５，４６４号、第５，５５６，７５２
号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９６／１７９５７に記載され
ており、これらすべてをここに参考文献として合体させる。上記方法は共に、関
連する配列間、特に、単一ヌクレオチドレベルでの、識別を必要とし、従って、
本発明の固体担体付着オリゴヌクレオチドの単純性、再現性は、これらの技術に
おける改善を提供するものである。アレイを構成するための材料としては、非限
定的に、ナイロン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウェ
ハ、光ファイバ、コポリマ、及び公知のもののようなアレイ構築に適したその他
の材料がある。
【００６４】 アレイ技術に対する本発明の更に別の用途は、特定の細胞又は組織中の遺伝子
発現のパターンの検査である。この場合、異なる遺伝子に対応するオリゴヌクレ
オチド又はポリヌクレオチドを、表面上にアレイ配置し、そして、例えば、特定
の細胞又は組織タイプからの核酸サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下に
おいて前記アレイとインキュベートする。ハイブリダイゼーションが発生する前
記アレイ上の部位を検出することによって、どのオリゴヌクレオチドがハイブリ
ダイズしたか、従って、どの遺伝子がそのサンプルが取り出された前記特定細胞
又は組織中において活性かを判断することができる。
【００６５】 アレイ法は、又、野生型又は変異配列が表面上のオーダーされたアレイとして
配置される突然変異の同定にも使用することが可能である。ストリンジェント条
件下における前記アレイへのポリヌクレオチドサンプルのハイブリダイゼーショ
ンと、前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがそのポリヌクレオチドにハイブ
リダイズするかを判定することによって、そのポリヌクレオチドが野生型配列を
有するものであるのか、それとも変異配列を有するものであるのかを判断するこ
とができる。診断的に関連する遺伝子の多くの変異配列は、それらの野生型対応
配列と、一つ又は少数のヌクレオチド位置においてのみ異なるものであるので、
本発明の改変オリゴヌクレオチドの高い識別力によって、変異検出における改善
が提供される。アレイ法は、更に、核酸ハイブリダイゼーションが、適当な検出
システムとの組み合わせで使用可能なすべての診断法にも使用することができる
。前記核酸には、ＤＮＡ，ＲＮＡ、及び公知の方法によって増幅された配列が含
まれる。
【００６６】 アレイ技術に対する上述したすべての用途において、本発明による固体担体に
対するオリゴヌクレオチド付着の単純性と効率は、アレイの製造及び性能におけ
る大幅な改善を提供する。
【００６７】 一般論 オリゴヌクレオチド合成器から直接にアルデヒドリンカーを含有するオリゴヌ
クレオチドが入手可能であることにより、オリゴヌクレオチドを、すべてのアミ
ン含有固体担体に対して固定することが可能である。従って、本発明によって、
オリゴヌクレオチド親和性クロマトグラフィ材料を容易に合成することができる
。更に、アルデヒドによって３´末端が標識化されたプライマを使用することに
よって、増幅後に、アンプリコンをアミン含有固体表面に固定することが容易と
なり、変性後に一本鎖を単離することが可能となる。
【００６８】 例 以下の例は、例示の目的のみで含まれるものであって、本発明の範囲を限定す
ることを意図したものではない。
【００６９】 一般的実験 すべての空気及び水に影響される反応を、僅かに正圧のアルゴン中で行った。
Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー，ＷＩ）から無水溶媒を入手した。フラッシュ
クロマトグラフィーを、２３０−４００メッシュのシリカゲル上で行った。融点
を、Ｍｅｌ−Ｔｅｍｐ融点装置を開放毛管にして測定し、補正しなかった。元素
分析を、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（バウンドブ
ルック，ＮＪ）によって行った。ＵＶ可視吸収スペクトルを、ＵＶ−２１００（
シマズ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ））又はＬａｍｄａ２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
）分光光度計によって２００−４００ｎｍ帯域で記録した。1Ｈ ＮＭＲスペク
トルを、２０℃でＢｒｕｋｅｒ ＷＰ−２００又はＶａｒｉａｎ ＸＬ−２００
分光光度計でランした。ケミカルシフトをＭｅ4Ｓｉからダウンフィールドへｐ
ｐｍで報告する。薄相クロマトグラフィを、シリカゲル６０Ｆ−２５４（ＥＭ
Ｒｅａｇｅｎｔｓ）アルミニウムバックのプレート上でランした。
【００７０】 例１．（ａ，ａ−ジメトキシトル−４−イル）−オキシエチル１，２−シアノエ
チルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（５）の作成。 ４−ヒドロキシエトキシベンズアルデヒド ジメチルアセタール（３） メタノール（４０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）との混合物中の４−ヒド
ロキシエトキシベンズアルデヒド（バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）等，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７３：９０６−９１２（１９５１）；８．５ｇ
，５１．２ｍｍｏｌ）、２−２−ジメトキシプロパン（３０ｍＬ，２４４ｍｍｏ
ｌ）の溶液に対して、無水Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５（Ａｌｄｉｃｈ）（１．０ｇ
）を添加した。この混合物を、５時間攪拌し、触媒を濾過によって除去し、濾液
を濃縮して前記出発アルデヒドが混在した未精製生成物が得られた。この材料を
、１：１エチルアセテート−ヘキサンでの溶出によってシリカ上にクロマトグラ
フした。この精製生成物フラクションをプールし、濃縮した。真空乾燥によって
、７．６ｇ（７０％）のタイトル化合物が、薄黄色の粘性液体として得られた。 1 Ｈ ＮＭＲ：ｄ７．２８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ，２Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），
３．９８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），３．７１（ｑ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），３．
２０（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ：ｄ １５８．６０，１３０．１９，１２７．
７４，１１３．９０，１０２．４６，６９．４３，５９．５２，５２．２７。
【００７１】 （ａ，ａ−ジメトキシトル−４−イル）−オキシエチル１，２−シアノエチルＮ
，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（５） ５０ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の１（４．７６ｇ，２２．４５ｍｍｏｌ）とエチ
ルジイソプロプロピルアミン（１０ｍＬ）の溶液に、２−シアノエチル ジイソ
プロピルクロロホスホルアミダイト（５．８５ｇ，２４．７ｍｍｏｌ）を添加し
た。１時間の攪拌後、過剰ホスフィチレーティング（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔ
ｉｎｇ）剤をクエンチするために反応物を、メタノール（１ｍＬ）で処理し、Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2で希釈した。溶液を、５％重炭酸ナトリウム、かん水で洗浄し、Ｎａ2
ＳＯ4上で乾燥させた。真空濃縮によって、オイルが得られ、これを、ヘキサン
−エチルアセテート−トリエチルアミン（２：１：０．１）での溶出によってシ
リカ上にクロマトグラフした。溶剤を蒸発させ真空乾燥した後、所望の生成物が
、無色の粘性シロップ（６．３ｇ，６８％）として得られた。
【００７２】 例２．アセチルオキシ［４−（６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメ
トキシ］−５−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］−（２−シアノエトキシ）ホ
スフィノオキシ｝ヘキシルオキシ）フェニル］メチル アセテート（１０）の調
製
【００７３】 ４−［４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）ブトキシ］
ベンズアルデヒド（６） ５０ｍｌの無水ＤＭＦ中の、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（２．８３ｇ，
２３．２２ｍｏｌ）、トルエン−４−スルホン酸 ４−（２，２−ジメチル−＜
１，３＞ジオキソラン−４−イル）−ブチル エステル（レーマン（Ｌｅｈｍａ
ｎｎ）等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１６９：５３−６８（１９８７）；
７．６２ｇ，２３．２２ｍｍｏｌ）と、１，８−ジアザバイシクロ［５，４．０
］ウンデク−７エン（３．６ｍｌ）の溶液を、８５℃で４時間攪拌した。前記Ｄ
ＭＦを真空除去し、その残渣をヘキサン中の２０％エチルアセテートでのシリカ
ゲルクロマトグラフィ溶出によって精製した。精製生成物フラクションを蒸発さ
せて均質オイルを得た。４．９３ｇ（７５％）収量；ＴＬＣ（１：１，エチル
アセテート／ヘキサン）、Ｒf＝０．６８；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ９．８
９（１Ｈ，ｓ，アルデヒド），７．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，芳香族）
、６．９８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，芳香族），（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），４
．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨ2），３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．
１Ｈｚ，ＣＨ），１．８６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
，１．４１及び１．３６（６Ｈ，２ｘｓ，メチル）。分析。Ｃ16Ｈ22Ｏ4０．１
５Ｈ2Ｏ：Ｃ，６８．３８；Ｈ，８．００の計算。結果：Ｃ，６８．３１；Ｈ，
８．０８。
【００７４】 アセチルオキシ｛４−［４−（２，２−ジメチル（１，３−ジオキソラン−４−
イル）ブトキシ］フェニル｝メチル アセテート（７） ６０ｍｌの無水酢酸中の３の溶液（４．７８ｇ，１７．１３ｍｍｏｌ）に、硫
酸（無水酢酸中の１％溶液を１．０ｍｌ）を添加した。この溶液を室温で９０分
間攪拌し、５００ｍｌの氷冷の５％重炭酸ナトリウム溶液に注入した。その生成
物を、エチルアセテート（５００ｍｌ）に抽出し、その抽出物を水（２ｘ５００
ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、蒸発によって７をオイルと
して得た。５．８９ｇ（９０％）収量；ＴＬＣ（１：１，エチル アセテート／
ヘキサン）、Ｒf＝０．７３；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）７．６２（１Ｈ，ｓ，
アセタールＣＨ），７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，芳香族）、６．９０
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，芳香族），４．０８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），３．
９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＣＨ2），３．５２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１
Ｈｚ，ＣＨ），２．１１（６Ｈ，ｓ，アセチル），１．８２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2
），１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），１．４１及び１．３６（６Ｈ，２ｘｓ，メ
チル）。分析。Ｃ20Ｈ28Ｏ7：Ｃ，６３．１４；Ｈ，７．４２の計算。結果：Ｃ
，６３．１９；Ｈ，７．４０。
【００７５】 アセチルオキシ［４−（５，６−ジヒドロキシヘキシルオキシ）フェニル］メチ
ル アセテート（８） ７（５．８ｇ，１５．２６ｍｍｏｌ）の２０％水性メタノール溶液に、トリフ
ルオロ酢酸（１．５ｍｌ）を添加した。その溶液を４０分間室温で攪拌し、４０
０ｍｌのエチルアセテートで希釈し、４００ｍｌの５％重炭酸ナトリウム溶液で
洗浄し、その後４００ｍｌの水で洗浄した。その有機溶液を、硫酸ナトリウムを
用いて乾燥させ蒸発させた。その残渣を、エチルアセテート中５０％ヘキサンか
ら１００％エチルアセテートへ、そしてエチルアセテート中５％のメタノールへ
の勾配でのシリカゲルクロマトグラフィ溶出によって精製した。その精製生成物
フラクションを、蒸発させてオイルを得た。１．１ｇ（２０％）収量；ＴＬＣ（
エチル アセテート中５％のメタノール）、Ｒf＝０．６４；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3）７．６２（１Ｈ，ｓ，アセタールＣＨ），７．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
．７Ｈｚ，芳香族）、６．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，芳香族），３．９
８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＣＨ），３．６８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．４
６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），２．１１（６Ｈ，ｓ．アセチル），１．８２（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ2），１．５５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ2）。分析。Ｃ17Ｈ24Ｏ7：Ｃ，５９．
９９；Ｈ，７．１１の計算。結果：Ｃ，６０．２６；Ｈ，７．０８。
【００７６】 アセチルオキシ（４−｛６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ
］−５−ヒドロキシヘキシルオキシ｝−フェニル）メチル アセテート（９） １７ｍｌの乾燥ピリジン中の８（１．０ｇ，２．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ
メトキシトリチル塩化物（１．２１ｇ，３．５７ｍｍｏｌ）を添加した。この溶
液を室温で２時間攪拌し、その後、２５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウムに注入し
、３００ｍｌのエチルアセテートで抽出した。抽出物を、硫酸ナトリウムを用い
て乾燥させ蒸発させた。その残渣を、エチルアセテート（１％トリエチルアミン
）中５０％ヘキサンによるシリカゲルクロマトグラフィ溶出によって精製した。
その精製生成物フラクションを、プールし蒸発させて気泡（ｆｏａｍ）を得た。
１．６６ｇ（８５％）収量；ＴＬＣ（１：１エチル アセテート／ヘキサン）、
Ｒf＝０．５０；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）７．６２（１Ｈ，ｓ，アセタールＣ
Ｈ），７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，芳香）、７．３３−６．８１（１
７Ｈ，芳香）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ2），３．７８（６
Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3）、３．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３及び９．４Ｈｚ，ＣＨ
），３．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ＣＨ），２．３７（１Ｈ，ｍ，ＣＨ
），２．１０（６Ｈ，ｓ，アセチル）、１．８１−１．３８（６Ｈ，多重項，Ｃ
Ｈ2）。Ｃ38Ｈ42０9：Ｃ，７１．０１；Ｈ，６．５９の計算。結果Ｃ，７０．９
１：Ｈ，６．４２。
【００７７】 アセチルオキシ［４−（６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ
］−５−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］−（２−シアノエトキシ）ホスヒノ
オキシ｝ヘキシルオキシ）フェニル］メチル アセテート（１０） ０．６７ｍｌのＮ，Ｎ−ジイシソプロピルエチルアミンを含有する３２ｍｌの
無水メチレン塩化物に溶解させた９（０．８３ｇ，１．２９ｍｍｏｌ）の溶液に
、２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４９ｍｌ
，２．１９ｍｍｏｌ）を添加した。その反応溶液をアルゴン中で２５℃で１．０
時間攪拌し、その後、１．０ｍｌのメタノールで処理し、３００ｍｌの５％の重
炭酸ナトリウム溶液に注入した。この混合物を、エチルアセテート（３００ｍｌ
）で抽出し、その抽出物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ蒸発させた。その未
精製生成物を、ヘキサン（２％トリエチルアミン）中の２５−５０％エチルアセ
テート勾配でのシリカゲルクロマトグラフィ溶出によって精製した。精製ホスホ
ルアミダイトフラクションを、蒸発させて均質なオイルを得た。０．６１ｇ（５
６％）収量；ＴＬＣ（１：１エチル アセテート／ヘキサン）、Ｒf＝０．６２
；31Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）１４７．８２（一重項）。分析。Ｃ47Ｈ59Ｎ2 Ｏ10Ｐ ０．２Ｈ2Ｏ：Ｃ，６６．６８；Ｈ，７．０７；Ｎ，３．３１の計算。
結果、Ｃ，６６．４６；Ｈ，７．２７；Ｎ，２．９４。
【００７８】 例３．ＣＰＧ（１２）の作成 ３．０ｍｌの乾燥メチレン塩化物中の９（０．８３ｇ，１．２９ｍｍｏｌ），
無水コハク酸（０．１５ｇ，１５０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２ｍｌ
）及びＮ−メチル イミダゾール（１２μｌ）の溶液を、アルゴン中で１４時間
室温で攪拌した。ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテート（０．３９
ｍｌ，２．３２ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を更に３０分間攪拌した。その反
応溶液を、シリカゲルカラムにロードし、ヘキサン（０．５％トリエチルアミン
含有）中の２５％エチルアセテートによって溶出した。精製生成物フラクション
を、プールし、蒸発させてシロップを得た。４６７ｍｇ（４０％）収量；ＴＬＣ
（１：１エチル アセテート／ヘキサン）、Ｒf＝０．５６；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3）７．６２（１Ｈ，ｓ，アセタールＣＨ），７．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
．３Ｈｚ，芳香），７．３３−６．７２（１７Ｈ，芳香），５．１６（１Ｈ，ｔ
，Ｊ＝５．８Ｈｚ，ＣＨ），３．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ2），
３．７７（６Ｈ，ｓ，メトキシ），３．１６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2），３．０１（
２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，サクシニルＣＨ2），２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６
．５Ｈｚ，サクシニルＣＨ2），２．１１（６Ｈ，ｓ，アセチル），１．８２−
１．３２（６Ｈ，多重項，ＣＨ2）。分析。Ｃ48Ｈ45Ｆ5Ｃ12：Ｃ，６３．４３；
Ｈ，４．９９の計算。結果：Ｃ，６３．６５；Ｈ，４．７１。
【００７９】 １１のＣＰＧ（１２）への付着 １３．０ｍｌの無水ＤＭＦ中の細孔制御されたガラス（ＬＣＡＡ５００Ａ，４
．２ｇ；装荷，２８３ｕｍｏｌ／ｇ）の懸濁液に対して、１１（２２６ｍｇ，０
．２５２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．５ｍｌ）を添加した。この混合物
を、アルゴン中で２４時間ゆっくりと振とうさせた。次に、無水ピリジン（８４
ｍｌ）を添加し、その後、無水酢酸（８４ｍｌ）を添加した。この混合物を１．
０時振とうさせた。ビーズを濾過し、ＤＭＦとメタノールで濯ぎ、乾燥させた。
装荷−４１ｕｍｏｌ／ｇ。
【００８０】 例４．３−（４−セミカルバジド）プロピルトリエトキシシランの調製 ３０ｍｌの無水アセトニトリル中に無水ヒドラジン（３．２ｍｌ；Ａｌｄｒｉ
ｃｈ，ミルウォーキー，ＷＩ）を溶解させた。激しく攪拌しながら、２．５ｇの
イソシアネートプロピルトリエトキシシラン（Ｕｎｉｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）を滴下によって添加した
。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その溶媒を真空除去した。油性残渣を、無
水エタノール中で溶解しその溶液を濾過し、その溶媒と無反応ヒドラジンを減圧
下で蒸発させた。最後の工程を濾過を省いて二回繰り返した。その結果得られた
粘性残渣を一晩真空乾燥し、２．７ｇ（９６％の収率）の所望の生成物を透明の
オイルとして得た。1Ｈ ＮＭＲ：ｄ６．８２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３２（
ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ），４．０５（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ2），３
．７２（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ2），２．９６（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２
Ｈ，ＣＨ2），１．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．２６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，
９Ｈ，ＣＨ3），０．４９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）。
【００８１】 例５．オリゴヌクレオチド合成 すべてのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学作用を使用して
ＡＢＩ ３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器によって合成された。これらオリゴヌクレ
オチドを、逆相ＨＰＬＣによって精製し、それらの濃度を２６０ｎｍ（Ｒｅｆ）
でＵＶ分光測光法によって測定した。その収量は、通常のオリゴヌクレオチド合
成において観察されるものと類似していた。
【００８２】 例６．ガラススライドの改変（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）とオリゴヌクレ
オチドアレイの調製 スライドの作成 ガラススライドを、下記の標準シラン化法によって改変した。予め清浄された
顕微鏡スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，
ＮＹ）を、１Ｎ ＨＮＯ3によって１時間室温で処理し、次に、脱イオン流水に
よって濯ぎ、その後、無水エタノールによって洗浄した。次に、これらのスライ
ドを、９５％エタノール／水中の１％３−（４−セミカルバジド）プロピルトリ
エトキシシラン溶液中に３０分間浸漬した。これらのスライドを、９５％エタノ
ールで５分間、アセトニトリルでそれぞれ５分間二回、最後にエーテルで洗浄し
た。その後、これらのスライドを、４５分間１１０℃でキュアリングした。改変
されたスライドは、活性の顕著な損失無く、防塵容器内でベンチトップ上で少な
くとも１ヶ月間保存可能である。
【００８３】 オリゴヌクレオチドの固定 ベンズアルデヒド改変オリゴヌクレオチドを、望ましい濃度で１００ｍＭ酢酸
ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中に溶解させ、スライドの下方の湿った紙テ
ンプレート上のグリッドバターンに沿った０．５１小滴として前記改変スライド
上にマニュアルで直接的にスポットした。スライドを湿った容器内に配置された
ペトリ皿内において１−５時間３７℃でインキュベートした。ガラス表面上のす
べての未反応セミカルバジド基をブロックするために、前記スライドを１００ｍ
Ｍの酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中の１００ｍＭ４−フォルミル−１
，３−ベンゼン二スルホン酸ナトリウム塩の溶液によって１時間３７℃で処理し
た。次に、これらのスライドを水で濯ぎ、３０分間、３７℃で０．５Ｍ燐酸ナト
リウムバッファ（ｐＨ７．０）中の３０％エタノールによって洗浄し、その後、
同じ温度で５´ＳＳＰＥ，０．１％トリトンＸ−１００で３０分間洗浄した。こ
れらのスライドを水で完全に濯ぎ、室温で空気乾燥し、ハイブリダイゼーション
実験に使用可能とした。
【００８４】 図１は、固定効率に対する異なるｐＨとオリゴヌクレオチド濃度の作用を図示
している。ｐＨ５と２０ｍＭのオリゴヌクレオチド濃度とがガラス表面上におい
て最適な固定を示した。
【００８５】 図２は、最適オリゴヌクレオチド固定が約１時間でガラス表面上に達成される
ことを図示している。
【００８６】 例７．オリゴヌクレオチド装荷とハイブリダイゼーション効率の測定 ５´又は´３アルデヒド改変オリゴヌクレオチドを、［ａ−32Ｐ］ｄｄＡＴＰ
（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＤ）と末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又は［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）とＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（ＮＥ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の夫々を使用
して、反対側の末端を放射標識化した。簡単に説明すると、１．２ｎｍｏｌのオ
リゴヌクレオチドと１００ｍＣｉの適当な放射性三燐酸塩とを、製造業者によっ
て指定された条件を使用して標識化反応に導入した。標識化されたオリゴヌクレ
オチドを、ＮＥＮＳＯＲＢa ２０カートリッジ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＤ）
を使用して精製した。標識化されたオリゴヌクレオチドを含む前記カートリッジ
からの溶出液を、乾燥させて、１００ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ
（ｐＨ５．０）中に溶解させ、これに９ｎｍｏｌの未標識化オリゴヌクレオチド
を添加して約１００ｍＭの最終濃度とした。同じバッファを２倍の減少量で使用
してこのストックの系列希釈を作った。様々な濃度のオリゴヌクレオチド溶液０
．５１を、４つ写しで、セミカルバジド改変ガラススライドに塗布し３７℃で３
時間反応させた。ガラス表面は、前述したようにブロックし、洗浄し、結合した
オリゴヌクレオチドをＢｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ−２５０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉ
ｍａｇｅｒを使用した蛍光体イメージングによって定量化した。蛍光体イメージ
ャからのデータを、既知量の、顕微鏡スライド上にスポットされ洗浄無しで乾燥
された同じ標識化オリゴヌクレオチドプローブの系列希釈から得られた標準曲線
と比較することによってｆｍｏｌ／スポットに変換した。
【００８７】 相補的標的とのハイブリダイゼーションのための付着オリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーション効率又は利用度を測定するために、アルデヒド改変した非
放射標識化プローブを、上述したようにスライド上に固定した。０．２ｍｍ厚の
電気テープから作られたスペーサーを使用して２．４´５．０ｃｍのカバースリ
ップを、プローブが配置された領域の上にスポットした。８０−１００ｍｌのハ
イブリダイゼーション混合物（１ｍＭ５´32Ｐ−標識化相補オリゴヌクレオチド
，５´ＳＳＰＥ，０．１％トリトンＸ−１００）を、前記スライドと前記カバー
スリップとの間に毛管作用によって塗布した。前記スライドを、前記ハイブリダ
イゼーション溶液の蒸発を防止するために、湿った容器内の湿ったＷｈａｔｍａ
ｎ３ＭＭ紙上の閉じたペトリ皿中で３７℃で一晩インキュベートした。シェーカ
ー上で、各スライドに対して２５ｍｌのハイブリダイゼーションバッファを用い
て、３０分間の洗浄を二回行った。ハイブリダイゼーションのレベルを上述した
ように定量化した。
【００８８】 図３は、前記ハイブリダイゼーション反応によって前記ガラス表面上に塗布さ
れたオリゴヌクレオチド濃度の共有結合付着とハイブリダイゼーション効率に対
する作用を調べたものである。図示されているように、最適ハイブリダイゼーシ
ョン標的捕獲は、約１０ｍＭの塗布濃度のオリゴヌクレオチドで発生し始め、こ
れによって、＞２００ｆｍｏｌ／２ｍｍスポットの共有結合付着オリゴヌクレオ
チドが得られる。約７５−１００ｆｍｏｌ／２ｍｍスポットの最適オリゴヌクレ
オチド標的捕獲が発生する。
【００８９】 例８．短いオリゴヌクレオチド標的又は一本鎖ＰＣＲ生成物とのオリゴヌクレオ
チドアレイのハイブリダイゼーション 女性及び男性のヒトゲノムＤＮＡサンプルを、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｃａｍｄｅ
ｎ，ＮＪ）から入手した。エクソン３に対応する２３５ｂｐのアメロゲニン遺伝
子フラグメントを、一組のプライマ、５´−ＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣ
ＡＴＣＣＣ−３´（配列識別番号１５）及び５´−ビオチン−ＣＴＧＧＴＧＡＧ
ＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣ−３´（配列識別番号１６）を使用したＰＣＲによ
って増幅した。その増幅反応（１００ｍｌ）は、５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．００１％ゼラチン、
１００ｎｇＤＮＡ，１ｍＭの各プライマ、２００ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ、及び２．５単位のＪｕｍｐｓｔａｒｔa Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）を含んでいた。ＰＣＲを、
３５サイクル（９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間）を使用して
、Ｓｔａｔａｇｅｎｅ ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ４０ Ｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
ＣＡ）で行った。
【００９０】 ＰＣＲ生成物を、４％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し
た。前記非ビオチニル化プライマから生じたＰＣＲ生成物の一つのＤＮＡ鎖を、
［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、５´末端標
識化した。この標識化鎖を、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジン結合
磁気ビーズであるダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ） Ｍ−２８０（Ｄｙｎａ
ｌ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を使用して分離した。簡単に
説明すると、１−２ｍｇのＰＣＲ生成物を含有する５０ｍｌの標識化反応混合物
を、２´Ｂ＆Ｗバッファ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ
ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ）によって二回希釈し、１ｍｇの予め洗浄されたダイ
ナビーズに添加した。懸濁液を、時々混合しながら、室温で１５分間インキュベ
ートした。磁石を使用してビーズを分離し、１００ｍｌのＢ＆Ｗバッファで３回
洗浄し、７５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで処理して前記ＤＮＡ鎖を変性した。混
合物を室温で５分間インキュベートし、上澄みを回収し、変性工程を更にもう一
度繰り返した。これらの上澄みを組み合わせたものを、同じ量の０．１Ｎ ＨＣ
ｌで中和し、エタノール沈殿させた。増幅の特異性を、マクサム（Ｍａｘａｍ）
とギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の方法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．，＆ Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９，５６
０−５６４（１９７７））を使用して前記標識化鎖を配列決定することによって
確認した。
【００９１】 三つの写しでスポットされた６つのオリゴヌクレオチドから成るオリゴヌクレ
オチドマクロアレイと５´標識化３０量体相補的合成オリゴヌクレオチド標的と
のハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション時間を３時間に短縮した
ことを除いて、前の部で記載したのと同じ方法で行った。その後、前記スライド
をハイブリダイゼーションバッファ（５´ＳＳＰＥ，０．１％トリトンＸ−１０
０）中で室温で１５分間洗浄した。次に、これらのスライドを０．５´ＳＳＰＥ
，０．１％トリトンＸ−１００中で２´１５分間４２℃で洗浄した。いくつかの
場合、ミスマッチ識別性を向上させるために１５分間の追加の洗浄が必要であっ
た。最後に、これらのスライドを空気乾燥させ、蛍光体イメージングで分析した
。
【００９２】 一本鎖ＰＣＲ生成物を、同じアレイのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズす
るために、前記標的の濃度は１０−２０ｎＭとした。３７℃での一晩のハイブリ
ダイゼーション後に、ハイブリダイゼーションバッファ中での１５分間の洗浄と
、０．５´ＳＳＰＥ，０．１％トリトンＸ−１００中での３７℃での２´１５分
間洗浄を行った。
【００９３】 使用されたプライマとプローブのオリゴヌクレオチド配列を表１に図示する。
捕獲オリゴヌクレオチドのアレイを使用した捕獲の特異性が、図４及び図５に図
示されている。具体的には、図４は、６つのＯＤＮプローブから成るマクロアレ
イの、８種類の３０量体ＯＤＮ標的に対するハイブリダイゼーションを示し、前
記標的の配列は表１に開示され、ここで各オリゴヌクレオチドは、３つの写しで
スポットされ、３ｘ６スポットのアレイを提供しており、標的配列１と８は前記
アメロギニン遺伝子のＸ及びＹコピーに対応し、その他すべての標的配列は、表
１において太字で示された位置においてヌクレオチド置換を含んでおり、各プロ
ーブと標的との間の塩基対のマッチ又はミスマッチが各ＯＤＮの３つの写しの下
部に示されている。図５は、図４に示した６つのＯＤＮプローブから成る同じマ
クロアレイの、女性及び男性ヒトゲノムＤＮＡから発生した一本鎖２３５量体Ｐ
ＣＲ生成物と、アメロギニン遺伝子の単離された男性コピーを表わす１３２量体
生成物と、に対するハイブリダイゼーションを図示しており、ここで、男性ＤＮ
Ａからの前記ＰＣＲ生成物は前記遺伝子フラグメントの女性及び男性コピーの異
種等モル混合物を表わす。
【００９４】 これらの結果は、前記固定反応の再現性を示している。更に、前記ハイブリダ
イゼーション結果は、図示されたマッチ及びミスマッチに対して予想される結果
を示している。
【００９５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、オリゴヌクレオチドの濃度と媒質のｐＨとの関数としてガラス表面に対
するセミカルバゾン結合を介したオリゴヌクレオチド付着の最適化を三次元的に
示すグラフである
【図２】 図２は、時間の関数として、ｆｍｏｌ／スポット単位で表わされた前記ガラス表
面へのオリゴヌクレオチドの付着を示すグラフである
【図３】 図３は、ハイブリダイゼーションの効率と各スポット上に塗布されたオリゴヌク
レオチド密度の関数としてのオリゴヌクレオチド付着効率とを示すグラフである
【図４】 図４は、その配列を表１に示す、８つの異なる３０量体ＯＤＮ標的に対する６つ
のＯＤＮプローブから成るマクロアレイのハイブリダイゼーションを示しており
、ここで、各オリゴヌクレオチドは、同じ物を３つ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）ス
ポットして、合計３ｘ６スポットのアレイを提供しており、前記標的配列１と８
は、アメロゲニン遺伝子のＸ及びＹコピーに対応し、そして、その他すべての標
的配列は、表１中において太字で示された位置においてヌクレオチド置換を含み
、各プローブと標的との間に形成された塩基対のマッチ又はミスマッチが、各Ｏ
ＤＮの３つの写し（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）の下部に示されている
【図５】 図５は、図４に図示した６つのＯＤＮプローブの同じマクロアレイの、女性又は
男性ヒトゲノムＤＮＡから生成された一本鎖２３５量体ＰＣＲ生成物と、及び、
アメロゲニン遺伝子フラグメントの単離男性コピーを表わす１３２量体生成物と
へのハイブリダイゼーションを図示し、ここで、男性ＤＮＡサンプルから生成さ
れた前記ＰＣＲ生成物は、前記遺伝子フラグメントの女性と男性のコピーの異種
等モル濃度混合物を表わす
【図６】 図６は、固体担体係留５´ヌクレアーゼアッセイの略図である
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルクタノフ，ユージニー，アレクサンダー アメリカ合衆国 ワシントン 98012 ボ セル 205ス・ストリート サウス・イー スト 817 (72)発明者 ポディミノギン，ミカイル，エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 98155 レイク・フォレスト・パーク ワンハン ドレッドナインティサード・ストリート ノース・イースト 4950 (72)発明者 ヘッジペス，ジョエル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94127 サン・フランシスコ ロビンフッド・ド ライブ 33 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA12 4C057 MM01 MM02 MM04

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 固体担体に付着されたオリゴヌクレオチドを有する組成物で
    あって、式（ｉ）及び式（ｉｉ）から成るグループから選択された式を有し、 【化１】 式（ｉ） 【化２】 式（ｉｉ） ここで、固体相の符号は、前記組成物の残りが共有結合によって付着する固体
    マトリクスを表わし、 ｎ＝１〜３０； ｍは１〜３０； Ｒ3は、Ｈ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアルキル； Ｘは、−Ｎ＝；−ＯＮ＝；−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝；−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ）−
    ＮＨ−Ｎ＝又は−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝； Ｑは、炭素環式縮合環又は非縮合環、或いは、縮合又は非縮合ヘテロ芳香環で
    あって、前記炭素環式又はヘテロ芳香環は、オプションとして、下位アルキル、
    下位アルコキシ又はハロゲン基によって置換され、 Ｖは、炭素−炭素結合を有し、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−
    酸素結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）
    −ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−
    ，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−及び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数
    又は複数の機能基とを含むことが可能な、２〜１００原子長のリンカー、 Ｗは、炭素−炭素結合と、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−酸素
    結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−Ｎ
    Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，Ｏ
    Ｐ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−及び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は
    複数の機能基とを含むことが可能な、２〜１００原子長のリンカーであり、前記
    リンカーＷは、Ｘに隣接する炭素原子で終端している、 Ｔは、炭素−炭素結合と、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−酸素
    結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−Ｎ
    Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，及
    び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は複数の機能基とを含むこ
    とが可能な、１〜１００原子長の原子価結合又はリンカーであり、前記リンカー
    Ｔは、Ｘに隣接する炭素原子で終端している、 Ｒ5は、ヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−３´−オリゴマ、又は、
    ヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−５´−オリゴマ であり、ここでＵはＯ又はＳである。
  2. 【請求項２】 式（ｉ）による請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の組成物であって、Ｘは、−Ｎ＝又は−ＮＨ
    −Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝である。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の組成物であって、Ｘは、−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ
    ）−ＮＨ−Ｎ＝である。
  5. 【請求項５】 請求項２に記載の組成物であって、Ｑは、ベンゼン環である
    。
  6. 【請求項６】 請求項４に記載の組成物であって、Ｑは、ベンゼン環である
    。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載の組成物であって、前記固体相はガラス表面
    である。
  8. 【請求項８】 式（ｉｉ）による請求項１に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の組成物であって、Ｘは、−Ｎ＝又は−ＮＨ
    −Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝である。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の組成物であって、Ｘは、−ＮＨ−Ｃ＝（
    Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝である。
  11. 【請求項１１】 請求項８に記載の組成物であって、Ｑは、ベンゼン環であ
    る。
  12. 【請求項１２】 請求項８に記載の組成物であって、前記固体相はガラス表
    面である。
  13. 【請求項１３】 請求項２に記載の組成物であって、前記オリゴヌクレオチ
    ドに付着されていないＮＨ2基は、陰イオンを含む共有結合機能基によって末端
    キャップされている。
  14. 【請求項１４】 ガラス担体に付着されたオリゴヌクレオチドを有する組成
    物であって、下式を有し、 【化３】 ここで、 ガラスは、前記ガラス担体を表わし、 Ｒ1は、１〜１０炭素のアルキル又はフェニル、 ｎは、値１〜３０の整数、 Ｒ3は、Ｈ又は１〜６炭素のアルキル基、 Ｖは、炭素−炭素結合を有し、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−
    酸素結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝０）−，−Ｃ＝（Ｏ）
    −ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−
    ，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−及び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数
    又は複数の機能基とを含むことが可能な、２〜１００原子長のリンカー、そして Ｒ5は、ヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−３´−オリゴマ又は、ヌ
    クレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−５´−オリゴマであり、ここでＵは
    Ｏ又はＳである。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の組成物であって、ｎは３である。
  16. 【請求項１６】 請求項１４に記載の組成物であって、Ｒ3はＨである。
  17. 【請求項１７】 請求項１４に記載の組成物であって、前記フェニル基は、
    リンカーＶを介して前記オリゴヌクレオチドの５´−末端に付着している。
  18. 【請求項１８】 請求項１４に記載の組成物であって、前記フェニル基は、
    リンカーＶを介して前記オリゴヌクレオチドの３´−末端に付着している。
  19. 【請求項１９】 請求項１４に記載の組成物であって、ｎは３であり、Ｒ3
    はＨであり、更に、前記フェニル基は、リンカーＶを介して前記オリゴヌクレオ
    チドの５´−末端に付着している。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の組成物であって、前記リンカーＶは、
    ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−機能基を有する。
  21. 【請求項２１】 固体担体ヌクレオチド結合体を提供するべく、オリゴヌク
    レオチドを固体担体に付着させる方法であって、該方法は以下の工程を有する、 式（ｉｉｉ）の改変固体担体を、式（ｉｖ）の改変オリゴヌクレオチドと、又
    は、式（ｖ）の改変固体担体を式（ｖｉ）の改変オリゴヌクレオチドと、反応さ
    せる工程、 【化４】 式（iii） 【化５】 式（iv） 【化６】 式（v） 【化７】 式（vi） ここで、固体相の符号は、固体マトリクスを表わし、 ｎ＝１〜３０； ｍは１〜３０； Ｒ3は、Ｈ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアルキル； Ｘは、−Ｎ；−ＯＮ；−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ；−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−
    Ｎ又は−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ； Ｑは、炭素環式縮合環又は非縮合環、或いは、縮合又は非縮合ヘテロ芳香環で
    あって、前記炭素環式又はヘテロ芳香環は、オプションとして、下位アルキル、
    下位アルコキシ又はハロゲン基によって置換される、 Ｖは、炭素−炭素結合を有し、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−
    酸素結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）
    −ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−
    ，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−及び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数
    又は複数の機能基とを含むことが可能な、２〜１００原子長のリンカー、 Ｗは、炭素−炭素結合と、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−酸素
    結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−Ｎ
    Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，Ｏ
    Ｐ（Ｏ）（Ｏ-）Ｏ−及び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は
    複数の機能基とを含むことが可能な、２〜１００原子長のリンカーであり、前記
    リンカーＷは、Ｘに隣接する炭素原子で終端している、 Ｔは、炭素−炭素結合と、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−酸素
    結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−Ｎ
    Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，及
    び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は複数の機能基とを含むこ
    とが可能な、１〜１００原子長の原子価結合又はリンカーであり、前記リンカー
    Ｔは、Ｘに隣接する炭素原子で終端している、 Ｒ5は、ヌクレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−３´−オリゴマ又は、ヌ
    クレオチドの−Ｏ−Ｐ＝（Ｏ）（−Ｕ-）−５´−オリゴマ であり、ここでＵはＯ又はＳである。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、式（ｉｉｉ）の改変固
    体担体が、式（ｉｖ）の改変オリゴヌクレオチドと反応する。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法であって、前記反応は、約８以下
    のｐＨを有する水相中で行われる。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前記反応は、約７以下
    のｐＨを有する水相中で行われる。
  25. 【請求項２５】 請求項２２に記載の方法であって、Ｘは、−Ｎ及び−ＮＨ
    −Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎから成るグループから選択される。
  26. 【請求項２６】 請求項２２に記載の方法であって、Ｒ3はＨであり、Ｑは
    、ベンゼン環である。
  27. 【請求項２７】 請求項２１に記載の方法であって、式（ｖ）の改変固体担
    体が、式（ｖｉ）の改変オリゴヌクレオチドと反応する。
  28. 【請求項２８】 式（ｉｉｉ）又は式（ｖ）の改変固体担体であって、 【化８】 式（iii） 【化９】 式（v） ここで、固体相の符号は、固体マトリクスを表わし、 ｎ＝１〜３０； ｍは１〜３０； Ｒ3は、Ｈ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアルキル； Ｘは、−Ｎ；−ＯＮ；−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ；−ＮＨ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−
    Ｎ又は−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ； Ｑは、炭素環式縮合環又は非縮合環、或いは、縮合又は非縮合ヘテロ芳香環で
    あって、前記炭素環式又はヘテロ芳香環は、オプションとして、下位アルキル、
    下位アルコキシ又はハロゲン基によって置換される、そして Ｔは、炭素−炭素結合と、更に、オプションとしてかつ独立して、炭素−酸素
    結合と、−ＮＨ−，−ＯＨ，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−Ｎ
    Ｈ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，及
    び−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は複数の機能基とを含むこ
    とが可能な、１〜１００原子長の原子価結合又はリンカーであり、前記リンカー
    Ｔは、Ｘに隣接する炭素原子で終端している。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の改変固体担体であって、式（ｉｉｉ）
    による。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の改変固体担体であって、Ｘは、−Ｎ及
    び−ＮＨ−Ｏ−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−Ｎから成るグループから選択される。
  31. 【請求項３１】 以下の式により表わされるホスホルアミダイト試薬であっ
    て、 【化１０】 ここで、Ｒ2は、１〜６炭素のアルキル基、１〜６炭素のアシル基、又は、前
    記二つのＲ2基は協動で２〜４炭素の炭素式環を形成する、 Ｒ3は、Ｈ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアルキル、 Ｒxは、全長２〜１５０原子で、オプションとして環を含む原子鎖であって、
    炭素−炭素結合を有し、更に、オプションとしてかつ独立的に、炭素−酸素結合
    と、−ＮＨ−，−Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ＝（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ
    −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−，−Ｓ−，ＯＰ（Ｏ）（Ｏ - ）Ｏ又は−Ｓ−Ｓ−から成るグループから選択される単数又は複数の機能基と
    を含むことが可能である、そして Ｑは、炭素環式縮合環又は非縮合環、或いは、縮合又は非縮合ヘテロ芳香環で
    あり、前記炭素環式又はヘテロ芳香環は、オプションとして、下位アルキル、下
    位アルコキシ又はハロゲン基によって置換される。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載のホスホルアミダイト試薬であって、Ｒ 3 はＨである。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載のホスホルアミダイト試薬であって、Ｑ
    はベンゼン環である。
  34. 【請求項３４】 下記式で表わされる改変制御細孔ガラス担体であって、 【化１１】 ここで、ｎは値１〜３０の整数、Ｒ2は、１〜６炭素のアルキル基、１〜６炭
    素のアシル基、又は、前記二つのＲ2基は協動で２〜４炭素の炭素式環を形成す
    る、 Ｒ3は、Ｈ，Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ6シクロアルキル、そして Ｒ4は、Ｈ又はジメトキシトリフェニルメチルである。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の改変制御細孔ガラス担体であって、Ｒ 3 はＨである。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載の改変制御細孔ガラス担体であって、ｎ
    は４であり、Ｒ2はＣＨ3ＣＯ−である。
  37. 【請求項３７】 オリゴヌクレオチドに固体担体を結合する方法であって、
    前記担体が、マトリクスと、共有結合リンカー基を介してこのマトリクスに共有
    結合付着されたＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＮＨ2基とを有し、前記オリゴヌクレオチ
    ドがシトシンヌクレオチドを含むものにおいて、前記方法は以下の工程を有する
    、 水相中の重亜硫酸塩存在下において、前記固体担体を前記オリゴヌクレオチド
    と反応させる。
  38. 【請求項３８】 核酸又はそのフラグメントを、実質的に相補的なオリゴヌ
    クレオチド鎖に結合させる方法であって、該方法は以下の工程を有する、 異なる配列のオリゴヌクレオチドアレイを、各ＯＤＮがＮＨ2基と芳香族アル
    デヒドとの間に形成されたシッフ塩基を含む共有結合によってその表面に結合さ
    れた固体担体表面上に提供する工程、そして 前記核酸又はそのフラグメントを、前記固体表面に結合された前記オリゴヌク
    レオチドアレイに接触させる工程。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の方法であって、前記シッフ塩基は、前
    記固体表面に付着されたセミカルバジド基と、前記オリゴヌクレオチドのそれぞ
    れに付着された芳香族アルデヒドとの間に形成されている。
  40. 【請求項４０】 請求項３９に記載の方法であって、前記固体表面はガラス
    表面である。
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