JP2006081534A

JP2006081534A - オリゴヌクレオチドプローブ

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Publication number: JP2006081534A
Application number: JP2004336414A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Komatsu; 康雄小松; Sunao Kojima; 直小島; Ken Nonaka; 謙野中; Yumi Fujinawa; 由美藤縄; Junya Hashida; 順也橋田; Isamu Muto; 勇武藤
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; DNA Chip Research Inc
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; DNA Chip Research Inc
Priority date: 2004-04-20
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2024-11-19
Also published as: WO2005103247A1; JP5083788B2

Abstract

【課題】担体上に強固に固定化され、かつ相補的な標的核酸を効率よく保持するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【解決手段】一般式１：
Ｂ−Ｄ−Ａ（１）
（式中、Ａはオリゴヌクレオチドを表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表す）
で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。
【選択図】図１

Description

本発明は、芳香族基を有するリンカーとオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブ、該オリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体及び該オリゴヌクレオチドプローブを合成するための化合物に関する。

ＤＮＡチップ又はビーズ等を用いた遺伝子解析においては、合成オリゴヌクレオチド又はＰＣＲ産物などをプローブとして担体上に固定化する必要がある。当該担体上に固定化されたプローブと、蛍光などで標識された標的核酸とが相補的に結合することによって、標的核酸が担体上に保持され、標識に由来する蛍光強度を測定することによって、標的核酸量を検出することができる。ＤＮＡチップは、平板状の担体上に数千〜数十万種類のプローブが、あらかじめ決まった場所に固定化されているため、他種類の遺伝子の発現量を一度に定量することができ、遺伝子間の複雑なネットワークの解明に極めて有用である。そのため、遺伝子診断のための有力な手法の一つとして期待されている。

合成オリゴヌクレオチドプローブを担体上に固定化するには、担体上でオリゴヌクレオチドを直接合成する方法（非特許文献１及び非特許文献２）、及び合成したオリゴヌクレオチドを精製後、担体上に固定化する方法とがある。後者の方法においては、オリゴヌクレオチドプローブの合成中に、アミノ基などの官能基を導入し、スポット後にこれらの官能基が担体上にコーティングされた官能基と共有結合を形成させることによって、不可逆的にプローブを固定化する方法が知られている。また、プラス電荷を有するポリＬリジンなどをコーティングした担体上にオリゴヌクレオチドプローブを静電的に結合させる方法なども報告されている。静電的な結合は、オリゴヌクレオチドのマイナス電荷に依存するため、オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が短くなるはど、固定化効率が低下してしまう。そのため、共有結合を介して担体上にオリゴヌクレオチドを固定化する方法が広く用いられている。

アミノ基などの官能基は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入することが知られている（非特許文献３及び非特許文献４）。アミノ基が結合したリンカーとして、現在、最も頻繁に用いられるものは、炭素数６のリンカーである。このリンカーを介してアミノ基が結合したオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡチップのプローブライブラリーとしても市販されている（例えば、ＭＷＧ社、シグマジェノシス社など）。

オリゴヌクレオチドプローブをチップなどの担体上に固定化する場合、アミノ基又はメルカプト基などの官能基をオリゴヌクレオチド合成時に導入する。現在用いられているオリゴヌクレオチドへのアミノ基導入のための試薬には、アミノ基をトリフルオロアセチル基又はモノメトキシトリチル基で保護したアミダイト化合物がある。しかし、上記のような試薬は、オリゴヌクレオチドへのアミノ基の導入効率が低いという問題を有する。また、Ｎ−トリフルオロアセチル−６−アミノヘキシルアミダイト化合物を用いる場合、アミノ基の導入されたオリゴヌクレオチド（アミノ基導入オリゴヌクレオチド）と未導入オリゴヌクレオチドを分離精製することが困難であり、これらが混在することが問題となっていた。一方、Ｎ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルアミダイト化合物を用いる場合、分離精製は可能なものの、分離後の酸性条件下におけるモノメトキシトリチル基の除去に時間を要し、高純度にオリゴヌクレオチドを精製することが困難であった。遺伝子診断では、多数のオリゴヌクレオチドプローブが必要なため、より容易かつ高純度に精製することが望まれていた。

さらに、上記で得られる精製アミノ基導入オリゴヌクレオチドを担体上に固定化する場合、アミノ基と担体表面上のコーティング剤との反応性が低く、十分なオリゴヌクレオチドを担体上に固定化するには、高濃度のオリゴヌクレオチドをスポットする必要があった。結果として多くのオリゴヌクレオチドを必要とし、チップの価格を上げる原因となっていた。従って、オリゴヌクレオチドプローブを担体上に効果的に固定化することが望まれていた。

また、ＤＮＡチップ等において高い感度を得るためには、検出すべき標的核酸をオリゴヌクレオチドプローブ上に効率よく保持することが重要である。オリゴヌクレオチドと標的核酸との結合の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さに依存するため、結合安定性を高めるためには長鎖のオリゴヌクレオチドを合成する必要があった。しかし、ＤＮＡチップのように多数のオリゴヌクレオチドプローブを必要とするような場合には、長鎖オリゴヌクレオチドプローブを合成することはコストの観点から適当でないという問題があった。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｖｏｌ.２０，１６７５−１６７８（１９９２）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１２，１９−２６（１９９４）Ｃｏｕｌｌｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．２７，３９９１−３９９４（１９８６）Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｖｏｌ．１５，３１３１−３１３９（１９８７）

本発明の課題は、担体上に強固に固定化され、合成後の精製が容易であり、かつ相補的な標的核酸を効率よく保持するオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、担体への固定化に必要な反応性官能基を芳香族基と連結した新規化合物を合成し、これをオリゴヌクレオチドに導入することによって上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）一般式１：
Ｂ−Ｄ−Ａ（１）
（式中、Ａはオリゴヌクレオチドを表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表す）
で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。

（２）芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（３）芳香族基が置換又は無置換のフェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環又はピレン環を含むものである（２）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（４）Ｄが複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価の炭化水素基であって、少なくとも１つの芳香族基を有する（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（５）Ｄが主鎖に二価の芳香族基を含む（１）〜（４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（６）Ｄが側鎖に芳香族基を有する（１）〜（４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（７）Ｄが一般式２で表される（６）記載のオリゴヌクレオチドプローブ：

（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_２、Ｒ_２’及びＲ_３はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）。

（８）Ｒ_２が一般式３：
−Ｒ_４−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_５−（ＣＨ_２）_ｎ− （３）
で表され、
Ｒ_３が一般式４：
−（ＣＨ_２）_ｔ−Ｒ_６−（ＣＨ_２）_ｗ− （４）
で表され、
Ｒ_４は、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｉ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−であり、
Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

を表し、
ｍ、ｔは、それぞれ独立して０〜２０の整数を表し、
ｎ、ｗ、i、ｑはそれぞれ独立して１〜２０の整数を表し、
Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す、
（７）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（９）Ｌが置換又は無置換のフェニル基、フェナントリル基、フルオレニル基、ナフチル基、アントリル基又はピレニル基である（７）又は（８）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（１０）Ｄが側鎖にさらなるオリゴヌクレオチドを有する、（１）〜（６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（１１）Ｄが一般式２’で表される（５）記載のオリゴヌクレオチドプローブ：

（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ａ’は水酸基又はオリゴヌクレオチドを表す）。

（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体。

（１３）一般式５：

（式中、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表し、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｒ_８はリン酸保護基を表し、Ｒ_９及びＲ_１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）
で表される化合物。

（１４）芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である（１３）記載の化合物。
（１５）芳香族基が置換又は無置換のフェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環又はピレン環を含むものである（１４）記載の化合物。

（１６）Ｄ’が複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価の炭化水素基であって、少なくとも１つの芳香族基を有する（１３）〜（１５）のいずれかに記載の化合物。

（１７）Ｄ’が主鎖に二価の芳香族基を含む（１３）〜（１６）のいずれかに記載の化合物。
（１８）Ｄ’が側鎖に芳香族基を有する（１３）〜（１６）のいずれかに記載の化合物。

（１９）Ｄ’が一般式２で表される（１８）記載の化合物：

（２０）Ｒ_２が一般式３：
−Ｒ_４−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_５−（ＣＨ_２）_ｎ− （３）
で表され、
Ｒ_３が一般式４：
−（ＣＨ_２）_ｔ−Ｒ_６−（ＣＨ_２）_ｗ− （４）
で表され、
Ｒ_４は、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｉ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−であり、
Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

を表し、
ｍ、ｔは、それぞれ独立して０〜２０の整数を表し、
ｎ、ｗ、i、ｑはそれぞれ独立して１〜２０の整数を表し、
Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す、
（１９）記載の化合物。

（２１）Ｌが置換又は無置換のフェナントリル基、フルオレニル基、ナフチル基、アントリル基又はピレニル基である（１９）又は（２０）記載の化合物。

（２２）Ｄ’が一般式６で表される請求項（１７）記載の化合物：

（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ｒ_１５は水酸基保護基を表す）。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、担体への反応効率が高いために、固定化に要するオリゴヌクレオチド量を低減することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸との結合効率が高いために、従来と同じ鎖長のものでも高い感度で検出することが可能である。また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、合成後の精製が容易であり、複数種のプローブを作製した場合でも、自動化によって精製可能である。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、反応性官能基及び芳香族基を有するリンカーとオリゴヌクレオチドが結合した構造を有する。すなわち、以下の一般式１で表される。
Ｂ−Ｄ−Ａ（１）
式中、Ａはオリゴヌクレオチドを表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表す。

本発明においてオリゴヌクレオチドは、天然のものでも合成のものでもよく、ポリヌクレオチドをも包含する。また、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸、二本鎖オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体を包含する。ＰＣＲ産物も包含される。オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−メトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、及びオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。

本発明においてオリゴヌクレオチドの塩基数は、通常１〜５００、より好ましくは５〜２００、より好ましくは１０〜１００である。

一般式１においてＢは、反応性官能基又はその保護された形態を表す。反応性官能基とは、オリゴヌクレオチドプローブを固定化しようとする担体上に存在する官能基と共有結合を形成しうる基を意味し、例えば、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基と共有結合しうる基（例えば、アミノ基など）、あるいはマレイミド基又はジスルフィド基と反応しうる基（例えば、メルカプト基など）等が挙げられる。本発明においては、メルカプト基及びアミノ基が好ましい。アミノ基としては、１級アミノ基が好ましい。

Ｂは反応性官能基の保護された形態でもよい。保護された形態とは、官能基の水素原子が保護基で置換された形態を意味する。アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、及びモノ又はジ置換トリチル基が挙げられる。モノ置換トリチル基としては、例えば、モノアルコキシトリチル基、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１のアルコキシ基を有するモノアルコキシトリチル基、具体的には、モノメトキシトリチル基、モノエトキシトリチル基、モノプロポキシトリチル基、モノイソプロポキシトリチル基及びモノブトキシトリチル基が挙げられる。トリチル基又はモノ若しくはジ置換トリチル基は疎水性が強いため、合成したオリゴヌクレオチドプローブを逆相カラムによって容易に精製できるという点で有利である。通常、アミノ基をトリチル基又はモノ若しくはジ置換トリチル基で保護した場合、脱保護するためには強い酸性条件下で長時間反応させる必要がある。このような条件は、核酸に損傷を与えることも考えられ、また時間を要するという点でも好ましくない。しかし、本発明のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、アミノ基をトリチル基又はモノ若しくはジ置換トリチル基で保護した場合は、緩和な酸性条件下、短時間で脱保護可能なため、核酸を傷つけることもなく、また、脱保護時間を短縮することもできる。例えば、ｐＨ２〜６、あるいは５〜８０体積％の酢酸存在下、５〜２０分処理することにより脱保護することができる。

メルカプト基の保護基としては、特に制限されないが、ｔ−ブチル基、アラルキル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基及びアシル基等が挙げられる。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、オリゴヌクレオチドは、一般式１においてＤとして表されるリンカー部分を介して、反応性官能基と連結されている。Ｄは、少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表す。

二価の有機基としては、オリゴヌクレオチドプローブの担体との結合性及び標的オリゴヌクレオチドとの相補的結合を阻害するものでなければ特に制限されないが、好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の二価の炭化水素基である。二価の炭化水素基としては、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員１〜５のアルキル基、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員１〜５のアルキレン基、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員１〜５のアルケニレン基、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員１〜１０の二価の脂環式炭化水素基等が挙げられる。上記炭化水素基においては、炭素の一部が複素原子で置換されていてもよい。複素原子としては、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ケイ素原子、リン原子が挙げられる。

置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、置換又は無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルケニル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルコキシ基、置換又は無置換のアルコキシカルボニル基又はカルボキシル基等を挙げることができる。

本発明の一態様において、リンカー部分Ｄは、好ましくは以下の一般式２で表される基である。

式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_２、Ｒ_２’及びＲ_３はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す。ここで置換基は、上記と同様である。また、二価の炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。一般式２において、Ｒ_２が反応性官能基Ｂと結合し、Ｒ_２’がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。Ｒ_２’が直接結合の場合は、一般式２における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。

Ｒ_２は、好ましくは一般式３：
−Ｒ_４−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_５−（ＣＨ_２）_ｎ− （３）
で表される。Ｒ_３は好ましくは一般式４：
−（ＣＨ_２）_ｔ−Ｒ_６−（ＣＨ_２）_ｗ− （４）
で表される。Ｒ_２’は好ましくは直接結合又は−Ｒ_２’’−（ＣＨ_２）_ｊ−である。

Ｒ_２において、Ｒ_４が反応性官能基Ｂと結合し、Ｒ_３において、−（ＣＨ_２）_ｗ−が芳香族基Ｌと結合し、Ｒ_２’において−（ＣＨ_２）_ｊ−がオリゴヌクレオチドと結合する。
Ｒ_４は、好ましくは直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｉ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−である。

Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_２’’は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

から選択される。

ｍ、ｔは、それぞれ独立して０〜２０の整数を表し、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜６、さらに好ましくは０〜３の整数を表し、ｎ、ｗ、i、ｑ及びｊはそれぞれ独立して１〜２０の整数を表し、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜３の整数を表す。

ここで、ｍ＋ｎは通常１〜４０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜５であり、ｔ＋ｗは、通常１〜４０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜５であり、ｉ＋ｑは通常２〜４０、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５であり、Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、特に限定されないが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。
Ｒ_４は、好ましくは直接結合である。

Ｒ_５は好ましくは

であり、Ｒ_６は好ましくは−Ｏ−である。

本発明においては、芳香族基としては、置換又は無置換の芳香族炭化水素基、置換又は無置換の芳香族複素環基、置換又は無置換の多環性芳香族基が挙げられる。本発明においては、疎水性の高い芳香族基が好ましい。また、本発明において芳香族基には核酸塩基は含まれない。

芳香族基の置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、置換又は無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルケニル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルコキシ基、置換又は無置換のアルコキシカルボニル基及びカルボキシル基等を挙げることができる。

置換又は無置換の芳香族炭化水素基としては、置換又は無置換の単環性芳香族炭化水素基、具体的には、フェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、２，３−ジフルオロフェニル基、２，５−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２−エチルフェニル基、３−エチルフェニル基、４−エチルフェニル基などが挙げられる。

芳香族複素環基としては、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基等が挙げられる。

置換又は無置換の芳香族複素環基の具体例としては、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３−ピリダジニル基、４−ピリダジニル基、２−ピリミジニル基、４−ピリミジニル基、５−ピリミジニル基、ピラジニル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−ピロリル基、３−ピロリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、２−メチル−３−ピリジル基、６−メチル−３−ピリジル基、２−クロロ−３−ピリジル基、６−クロロ−３−ピリジル基、２−メトキシ−３−ピリジル基、６−メトキシ−３−ピリジル基、２，６−ジクロロ−３−ピリジル基、２，６−ジメトキシ−３−ピリジル基、などを挙げることができる。好ましい置換又は無置換の芳香族複素環基としては、フリル基、ピロリル基、オキサゾリル基が挙げられる。

多環性芳香族基としては、ナフチル基、フェナントリル基、フルオレニル基、アントリル基、ピレニル基、インダニル基、テトラヒドロナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基が挙げられる。

置換又は無置換の多環性芳香族基の具体例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、４−インダニル基、５−インダニル基、５−テトラヒドロナフチル基、６−テトラヒドロナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基、２，３−メチレンジオキシフェニル基、３，４−メチレンジオキシフェニル基、２，３−エチレンジオキシフェニル基、３，４−エチレンジオキシフェニル基、４−フルオロ−１−ナフチル基、４−クロロ−１−ナフチル基、２−メチル−１−ナフチル基、４−メチル−１−ナフチル基、２−メトキシ−１−ナフチル基、５−メトキシ−１−ナフチル基、６−メトキシ−１−ナフチル基、７−メトキシ−１−ナフチル基、２−エトキシ−１−ナフチル基、５−エトキシ−１−ナフチル基、６−エトキシ−１−ナフチル基、７−エトキシ−１−ナフチル基、１−メトキシ−２−ナフチル基、３−メトキシ−２−ナフチル基、５−メトキシ−２−ナフチル基、６−メトキシ−２−ナフチル基、１−エトキシ−２−ナフチル基、３−エトキシ−２−ナフチル基、５−エトキシ−２−ナフチル基、６−エトキシ−２−ナフチル基、２−クロロ−５−キノリル基などを挙げることができる。好ましい置換又は無置換の多環性芳香族基としては、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。

芳香族基がＤの主鎖部分に存在する場合、上記芳香族基の二価の形態となる。例えば、フェニレン基、ピリジレン基、ピリダジニル基、ピリミジニレン基、ピラジニレン基、フリレン基、チエニレン基、ピロリレン基、イミダゾリレン基、チアゾリレン基、オキサゾリレン基、ナフチレン基、アントリレン基、ピレニレン基、インダニレン基、テトラヒドロナフチレン基、キノリレン基、イソキノリレン基、シンノリニレン基、キナゾリニレン基、キノキサリニレン基、ナフチリジニレン基、フタラジニレン基、インドリレン基、イソインドリレン基、ベンゾフリレン基、ベンゾチエニレン基、インダゾリレン基、ベンゾイミダゾリレン基、ベンゾチアゾリレン基が挙げられ、好ましくはナフチレン基、アントリレン基又はピレニレン基である。上記二価の芳香族基は置換でも無置換でもよい。

本発明において、芳香族基は、１〜５環性芳香族炭化水素基が好ましい。特に、好ましくは２〜４環性芳香族炭化水素基、より具体的には置換又は無置換のナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フルオレニル基及びピレニル基、特に１−ナフチル基及び９−アントリル基である。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブには、リンカー部分Ｄの側鎖に、さらなるオリゴヌクレオチドを有するものも包含される。さらなるオリゴヌクレオチドはもう一方のオリゴヌクレオチドと同一でも異なっていてもよい。

本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドプローブとして、一般式１においてＤが以下の一般式２’で表されるものが挙げられる。

式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ａ’は水酸基又はオリゴヌクレオチドを表す。

ここで置換基は、上記と同様である。また、複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。一般式２’において、Ｒ_１１が反応性官能基Ｂと結合し、Ｒ_１４がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。Ｒ_１４が直接結合の場合は、一般式２’における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。Ａ’がオリゴヌクレオチドの場合も同様に、Ｒ_１３がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合し、Ｒ_１３が直接結合の場合は、一般式２’における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。

Ｒ_１１は、好ましくは、一般式３’：
−（ＣＨ_２）_ａ−Ｒ_５’−（ＣＨ_２）_ｂ− （３’）
で表される。Ｒ_１２は好ましくは一般式４’：
−（ＣＨ_２）_ｃ−Ｒ_６’−（ＣＨ_２）_ｄ− （４’）
で表される。Ｒ_１３は好ましくは、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｅ−であり、Ｒ_１４は好ましくは、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｆ−である。

Ｒ_１１において、−（ＣＨ_２）_ａ−が反応性官能基Ｂと結合し、Ｒ_１２において、−（ＣＨ_２）_ｃ−が芳香族基Ｌと結合する。

Ｒ_５’及びＲ_６’は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

から選択される。

ｅ及びｆは、それぞれ独立して１〜２０の整数を表し、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の整数を表し、ａ〜ｄはそれぞれ独立して０〜２０の整数を表し、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜５、さらに好ましくは０〜３の整数を表す。

ここで、ａ＋ｂは通常１〜４０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜５であり、ｃ＋ｄは、通常１〜４０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜５である。Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、特に限定されないが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。

Ｒ_１３及びＲ_１４は、好ましくは直接結合である。
Ｒ_５’は好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−であり、Ｒ_６’は好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−である。

二価の芳香族基Ｌとしては、特に限定されないが、疎水性の高い二価の芳香族基、好ましくは、置換又は無置換のフェナントリレン基、フルオレニレン基、ナフチレン基、アントリレン基又はピレニレン基、特にナフチレン基及びアントリレン基が挙げられる。より具体的には、置換又は無置換の２，６−ナフチレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基、２，７−ナフチレン基、２，６−アントリレン基、１，８−アントリレン基、９，１０−アントリレン基、１，５−アントリレン基、２，７−フェナントリレン基、２，８−フェナントリレン基、１，５−フェナントリレン基、１，６−フェナントリレン基、１，７−フェナントリレン基、１，８−フェナントリレン基、１，７−９Ｈ−フルオレニレン基、１，６−９Ｈ−フルオレニレン基、２，７−ピレニレン基、２，６−ピレニレン基、又は１，８−ピレニレン基などが挙げられる。

上記のような芳香族基を採用することにより、環数の増加に伴ってこれら芳香族基に結合したオリゴヌクレオチドの水への溶解性が低下するのを抑制することができる。また、担体上に固定化されたプローブ間の疎水的相互作用によってプローブ同士が絡み合うこともなく、標的遺伝子の検出を容易に実施できる。

本発明はまた、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための中間体化合物に関する。一実施形態において本発明の中間体は、上記オリゴヌクレオチドプローブにおいて、オリゴヌクレオチド部分がホスホロアミダイトになった構造を有する化合物である。従って、一実施形態において本発明の中間体化合物は、以下の一般式５で表される。

式中、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｒ_８はリン酸保護基を表し、Ｒ_９及びＲ_１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい。

Ｒ_９及びＲ_１０は、特に制限されないが、好ましくは炭化水素基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基が挙げられる。

あるいは、Ｒ_９及びＲ_１０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって環基を形成していてもよい。該環はＲ_９及びＲ_１０が結合している窒素原子の他にさらに複素原子を含んでいてもよい。そのような環は、好ましくは環員５〜８、好ましくは６の環であり、例えば、モルホリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、チオモルホリン環等が挙げられ、好ましくはモルホリン環である。

ここでリン酸保護基は、ホスホロアミダイト法に使用されるものであればどのようなものでもよいが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。

一実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、一般式５においてＤ’が上記Ｄと等しい中間体化合物を使用して作成することができる。例えば、Ｄが一般式２で表される一般式１のオリゴヌクレオチドプローブは、一般式５においてＤ’がＤと等しい中間体化合物を使用して作成することができる。また、Ｄが一般式２’で表される一般式１のオリゴヌクレオチドプローブは、一般式５においてＤ’が以下の一般式６で表される中間体化合物を使用して作成することができる。

式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４は上記と同義であり、Ｒ_１５は水酸基保護基を表す。水酸基保護基としては、ＤＮＡ合成においてリボースの５’位の保護に使用される保護基を使用することができ、例えば、アセチル基、５’−Ｏ−４，４’，４’’−トリス（４−ベンゾイルオキシ）トリチル基及びジメトキシトリチル基が挙げられ、ジメトキシトリチル基が好ましい。一般式６においては、Ｒ_１１がＢと結合し、Ｒ_１４が酸素原子に結合する。好ましい中間体化合物の具体例を図１１に示す。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、上記中間体化合物をオリゴヌクレオチドと連結させることにより合成することができる。オリゴヌクレオチドへの中間体化合物の導入は、ＤＮＡ自動合成機上でオリゴヌクレオチド合成と同時に実施することができる。

Ｄ’が一般式６で表される一般式５の中間体化合物をオリゴヌクレオチドに導入した後、さらに、オリゴヌクレオチド合成を行うことにより、Ｒ_１３及びＲ_１４にオリゴヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドプローブを製造することができる。また、Ｄ’が一般式６で表される一般式５の中間体化合物のオリゴヌクレオチドへの導入と、オリゴヌクレオチドの合成を繰り返し行うことにより、中間体化合物を複数含むオリゴヌクレオチドプローブ、すなわち複数の芳香族基を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成することもできる。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及び上記中間体化合物は、Ｄ体及びＬ体のいずれも合成及び使用することができ、またそれらの混合物でもよい。

本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体に関する。該担体は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが有する反応性官能基と共有結合しうる官能基をその表面に有するものであれば特に制限されない。

担体の基材としては、例えば、石英ガラス、ホウ珪酸ガラス及びソーダライムガラスなどのガラス、シリコン、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。本発明においては、ガラス、シリコン、セラミックス、プラスチックを使用するのが好ましい。上記基材の表面に官能基を導入したものを担体として用い、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを固定化する。オリゴヌクレオチドプローブの反応性官能基が保護されているときは、保護基を除去してから固定化することが好ましい。

オリゴヌクレオチドプローブが有する反応性官能基と共有結合しうる官能基としては、例えば、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、クロロ基、ジスルフィド基、アルデヒド基、マレイイミド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基等が挙げられる。

アミノ基又はその保護された形態を有するオリゴヌクレオチドプローブを固定化する場合は活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基が導入された担体を用いるのが好ましく、メルカプト基又はその保護された形態を有するオリゴヌクレオチドプローブを固定化する場合は、マレイミド基、ジスルフィド基が導入された担体を用いるのが好ましい。

担体の形状は、特に制限されず、基盤状、糸状、球状、ビーズ状、多角形状、粉末状、多孔質状などが挙げられ、本発明においては基盤状が好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ビオチン及び蛍光色素などの標識に結合させることができる。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、医薬に結合させることもできる。

本発明においては、オリゴヌクレオチドなどの核酸を担体上に固定化する場合、固定化する核酸と、担体への結合に必要な反応性官能基との間に芳香族基を導入することで核酸を担体上に効率よく固定化することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは従来のプローブよりも標的核酸との結合効率が高い。また第三に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、その合成と精製が容易である。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを合成するための中間体化合物（以下、アミダイト化合物と称する）を合成し、それをオリゴヌクレオチドに導入し、得られたオリゴヌクレオチドプローブの能力を評価した。

オリゴヌクレオチドへ芳香族基を導入するためのユニット（アミダイト化合物：Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１）を、図２〜７及び１３に示す方法により合成した。

Ｙ２は、アミノ基をもたず芳香族基のみを有するアミダイト化合物であり、ＤＮＡ自動合成機によりＹ２をオリゴヌクレオチドに導入後、続けて市販品のＮ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト化合物又はトリフルオロアセチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト化合物（グレンリサーチ社）を用いてアミノ基を導入し、オリゴヌクレオチドの末端に、アミノ基と芳香族基を有する５０塩基からなるオリゴヌクレオチドプローブ（Ｘ２−Ｓｐ；図８）を合成した。

Ｙ３、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１のアミダイト化合物は、分子内にアミノ基を有している。従って、合成アミダイト化合物をオリゴヌクレオチドに導入後に、別途市販のアミノ基結合ホスホロアミダイト化合物を用いてアミノ基を導入する必要がなく、オリゴヌクレオチドプローブの合成が従来よりも一工程短くなるという利点を有している。Ｙ３とＹ５は、アミノ基と芳香族基の連結部位の構造が異なるものであり、Ｙ６はＹ５よりもアミノ基と芳香族基の間に、より長い直鎖リンカーを導入したものであり、オリゴヌクレオチドプローブの担体表面からの距離を保つことができる。Ｙ７は、Ｙ６の芳香族基がナフチル基ではなくアントリル基であるアミダイト化合物である。Ｙ８はＹ５の直鎖リンカーの導入部位が異なるアミダイト化合物であり、アミノ基と芳香族基が近接している。これらを５’末端に有するオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれＤＮＡ自動合成機により合成した（Ｘ３−Ｓｐ、Ｘ５−Ｓｐ、Ｘ６−Ｓｐ、Ｘ７−Ｓｐ、Ｘ８−Ｓｐ、Ｘ９−Ｓｐ；図８）。

芳香族基を有しないオリゴヌクレオチドプローブとして、市販の上記アミノ基結合ホスホロアミダイト化合物を用い、オリゴヌクレオチドの末端にアミノ基を導入したもの（Ｘ１−Ｓｐ；図８）、オリゴヌクレオチドとアミノ基の間に芳香族基を有しないオリゴヌクレオチドプローブ（Ｘ４−Ｓｐ；図８）を用い、比較例とした。

合成したオリゴヌクレオチドは、逆相カラムを用いて高純度に精製後、オリゴチップ作製のためのスポット溶液に一定濃度に溶解し、ガラス基盤上にスポットし、固定化した。

基盤への固定化後、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を蛍光標識し、その蛍光強度を測定することで各オリゴヌクレオチドプローブの基盤上での固定化量を定量した。実験の結果から、従来のプローブであるＸ１−Ｓｐよりも芳香族基を有するオリゴプローブ（Ｘ２−Ｓｐ、Ｘ３−Ｓｐ、Ｘ５−Ｓｐ、Ｘ６−Ｓｐ、Ｘ８−Ｓｐ）は、固定化量の多いことが明らかとなった（図９ａ）。

次に各オリゴヌクレオチドプローブの溶液中での活性エステル基との反応効率を調べるため、フルオレセインイソチオシアナート及びＣｙ３スクシンイミジルエステルとの反応を行った。その結果、本発明の芳香族基を有するオリゴヌクレオチドプローブは、いずれの蛍光色素とも、従来のオリゴヌクレオチドプローブと比べて高い反応性を示し、溶液中においても化学物質との反応性が向上することが明らかとなった（図９ｂ、ｃ）。

Ｙ９アミダイト化合物は、オリゴヌクレオチドの末端でも、又は鎖内にも導入可能な誘導体である（図７）。Ｙ９アミダイト化合物を、末端（Ｘ９−Ｓｐ２５）と鎖内（Ｘ９−Ｓｐ３５）それぞれに導入したオリゴヌクレオチドを合成した。それらについて、他のアミダイトと同様に蛍光色素との反応性（図９ｃ）及びガラス基盤上への固定化効率（図１２）について調べた。

以下に各アミダイト化合物及びオリゴヌクレオチドプローブの合成方法及び試験方法を具体的に示す。

（実施例１）アミダイト化合物の合成
薄層クロマトグラフィーは、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行った。カラムクロマトグラフィーにはＷａｋｏｇｅｌＣ−２００（和光純薬工業）を用いた。紫外可視スペクトルは島津ＵＶ-２５００ＰＣ分光光度計を用いて測定した。

^１Ｈ−ＮＭＲはテトラメチルシランを内部標準とし、ＪＥＯＬＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて測定した。^３１Ｐ−ＮＭＲは無機リン酸を内部標準とし、ＪＥＯＬＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて測定した。

（１）アミダイト化合物（Ｙ２）の合成（図２）
（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｃ）
アルゴン雰囲気下、１−（クロロメチル）ナフタレン（化合物ａ）２.４０ｍｌ（１６.０ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物ｂ）１.８５ｍｌ（１５.０ｍｍｏｌ）をトルエンとジオキサンの混合溶液（２：１）９０ｍｌに溶解し、粉末状に砕いた水酸化カリウム４.５ｇを加えて１２０℃で２.５時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル３００ｍｌを加えて、水１００ｍｌで４回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、得られた黄色オイル状物質に８０％酢酸水溶液１００ｍｌを加えて溶解し、室温で１５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｃ）３.２４ｇ（収率９３％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.12-8.09 (m, 1 H), 7.95-7.86 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 4.93 (s, 2 H), 4.67 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.48 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 3.66 (ddddd, 1 H, J = 3.5, 4.8, 5.2, 5.3, 5.9 Hz), 3.56 (dd, 1 H, J = 4.8, 9.7 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 3.5, 9.7 Hz), 3.39 (ddd, 1 H, J = 5.2, 5.5, 10.9 Hz), 3.34 (ddd, 1 H, J = 5.5, 5.9, 10.9 Hz).

（Ｓ）−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｄ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｃ）２.２０ｇ（９.５０ｍｍｏｌ）をピリジン８０ｍｌに溶解し、塩化ジメトキシトリチル３.９０ｇ（１.２当量）を加え、室温で１時間撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル３００ｍｌに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで２回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｄ）４.５９ｇ（収率９０％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.03-7.86 (m, 3 H), 7.55-7.19 (m, 13 H), 6.85-6.81 (m, 4 H), 4.94 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.91 (s, 2 H), 3.82 (dddt, 1 H, J = 4.9, 5.3, 5.6, 5.9 Hz), 3.71 and 3.71 (each s, each 3 H), 3.59 (dd, 1 H, J = 4.9, 9.9 Hz), 3.54 (dd, 1 H, J = 5.9, 9.9 Hz), 2.98 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.9, 9.2 Hz).

（Ｓ）−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール２−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ２）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｄ）２７０ｍｇ（０.５０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.２６ｍｌ（３当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０.２２ｍｌ（２当量）を加え、室温で３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌで１回、水２５ｍｌで１回、飽和食塩水２５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ２）２７１ｍｇ（収率７４％）を白色泡状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 149.06, 148.64.

（２）アミダイト化合物（Ｙ３）の合成（図３）
（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｅ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｃ）１.９０ｇ（８.１８ｍｍｏｌ）をピリジン８０ｍｌに溶解し、塩化トシル２.３２ｇ（１.５当量）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液にエタノール１０ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル３００ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド８０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム１.６０ｇ（３当量）及び塩化アンモニウム１.７５ｇ（４当量）を加えて８０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル３００ｍｌを加えて、水１００ｍｌで５回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｅ）１.３０ｇ（収率６２％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.11-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 5.29 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.4 Hz), 3.51 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.46 (dd, 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.29 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.6 Hz), 3.21 (ddd, J = 6.4, 12.6 Hz).

（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｆ）
（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｅ）１.３０ｇ（５.０５ｍｍｏｌ）をエタノール６０ｍｌに溶解し、パラジウム−炭素（１０％）３３０ｍｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で１５時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物（化合物ｆ）１.１７ｇ（収率１００％）を得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。

（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノイル］アミノプロパン−２−オール（化合物ｇ）
アルゴン雰囲気下、Ｎ−トリフルオロアセチル−６−アミノカプロン酸（化合物ｆ）３６０ｍｇ（１.３当量）と１，１’−カルボニルジイミダゾール２３５ｍｇ（１.２当量）をジメチルホルムアミド、１０ｍｌに溶解し、室温で２時間撹拌した。この反応液に（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｆ）２８０ｍｇ（１.２１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（５ｍｌ）を加え、室温でさらに１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル７０ｍｌを加えて、水２５ｍｌで４回、飽和食塩水２５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｇ）４１７ｍｇ（収率７９％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.39 (br t, 1 H, J = 4.6 Hz), 8.12-8.08 (m, 1 H), 7.96-7.86 (m, 2 H), 7.73 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 7.59-7.44 (m, 4 H), 4.94 (br s, 1 H), 4.93 (s, 2 H), 3.69 (m, 1 H), 3.45-3.42 (m, 2 H), 3.21 (dt, 1 H, J = 5.6, 13.3 Hz), 3.17 (dt, 2 H, J = 4.6, 7.0 Hz), 3.00 (ddd, 1 H, J = 5.6, 6.6, 13.3 Hz), 2.06 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 1.52-1.41 (m, 4 H), 1.22 (m, 2 H).

（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノイル］アミノプロパン−２−オール２−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ３）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノイル］アミノプロパン−２−オール（化合物ｇ）８８１ｍｇ（２.００ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト１.２７ｍｌ（２.０当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液４.９ｍｌ（０.４５Ｍ、１.１当量）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にクロロホルム１００ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４０ｍｌで１回、飽和食塩水４０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ３）８３１ｍｇ（収率６５％）を無色オイル状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 148.79.

（３）アミダイト化合物（Ｙ５）の合成（図４）
（Ｒ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｈ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｃ）１.１６ｇ（５.００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３５ｍｌに溶解し、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルクロロシラン２.２６ｇ（３当量）、イミダゾール２.０４ｇ（６当量）を加えて室温で２１時間撹拌した。反応液にエタノール５ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した後、酢酸エチル２００ｍｌを加えて、水７０ｍｌで４回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質を塩化メチレン７５ｍｌに溶解して０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸２.１ｍｌ（９０％水溶液）を加えて、０℃で１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８０ｍｌを加えて室温に戻した後、更にクロロホルム１５０ｍｌを加えて分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８０ｍｌで１回、飽和食塩水８０ｍｌで１回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｈ）１.７０ｇ（収率９８％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.10-8.07 (m, 1 H), 7.95-7.85 (m, 2 H), 7.54-7.43 (m, 4 H), 4.95 (d, 1 H, J = 12.3 Hz), 4.90 (d, 1 H, J = 12.3 Hz), 4.60 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.79 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.6, 6.0, 6.3 Hz), 3.58 (dd, 1 H, J = 4.0, 9.9 Hz), 3.44 (dd, 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.36 (ddd, 1 H, J = 5.6, 6.0, 11.1 Hz), 3.31 (dt, 1 H, J = 5.6, 11.1 Hz), 0.83 (s, 9 H), 0.02 and 0.00 (each s, each 3 H).

（Ｓ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｉ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｈ）６９５ｍｇ（２.００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ５０ｍｇ（０.２当量）をジメチルホルムアミド３５ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール１９５ｍｇ（０.６当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール１９５ｍｇ（０.６当量）を追加してさらに２時間撹拌した。この反応液に１，６−ヘキサンジアミン１.１６ｇ（５当量）を加えて室温で１５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えて、水６０ｍｌで４回、飽和食塩水６０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られた残渣をメタノール３５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル１.１９ｍｌ（５当量）及びトリエチルアミン１.３９ｍｌ（５当量）を加えて、室温で１４時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｉ）１.０７ｇ（収率９２％）を淡黄色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.37 (br s, 1 H), 8.09-8.05 (m, 1 H), 7.95-7.86 (m, 2 H), 7.55-7.43 (m, 4 H), 7.06 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.96 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.03-3.87 (m, 3 H), 3.56-3.46 (m, 2 H), 3.15 (t, 2 H, J = 6.9 Hz), 2.93 (q, 2 H, J = 6.5 Hz), 1.47-1.34 (m, 4 H), 1.23 (m, 4 H), 0.81 (s, 9 H), 0.15 and -0.01 (each s, each 3 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｊ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｉ）１.００ｇ（１.７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３５ｍｌに溶解して氷冷し、フッ化テトラブチルアンモニウム溶液２.５７ｍｌ（１.０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１.５当量）を加えた。反応液を室温に戻した後、１時間撹拌した。酢酸０.１５ｍｌ（１.５当量）を加えて中和した後、反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｊ）７３４ｍｇ（収率９１％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.38 (br s, 1 H), 8.10-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.84 (m, 2 H), 7.58-7.44 (m, 4 H), 7.10 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.00 (br s, 1 H), 4.93 (s, 2 H), 3.96 (dd, 1 H, J = 4.6, 10.6 Hz), 3.85 (dd, 1 H, J = 5.9, 10.6 Hz), 3.83 (m, 1 H), 3.50 (m, 2 H), 3.15 (dt, 2 H, J = 5.6, 7.0 Hz), 2.94 (q, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.48-1.35 (m, 4 H), 1.24 (m, 4 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルバモイル］グリセロール２−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ５）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｊ）１３４ｍｇ（０.２８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン６.０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０.１２ｍｌ（１.３当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液０.７６ｍｌ（０.４５Ｍ、１.２当量）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌで１回、飽和食塩水１０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ５）１５３ｍｇ（収率８２％）を無色オイル状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 149.53.

（４）アミダイト化合物（Ｙ６）の合成（図４）
（Ｓ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｋ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｈ）７９０ｍｇ（２.２８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ５６ｍｇ（０.２当量）をジメチルホルムアミド３５ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール２２２ｍｇ（０.６当量）を加えて室温で撹拌した。１.５時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール２２２ｍｇ（０.６当量）を追加してさらに２.５時間撹拌した。この反応液に４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン２.５０ｍｌ（５当量）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加えて、水７０ｍｌで４回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られた残渣をメタノール４０ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル１.３６ｍｌ（５当量）及びトリエチルアミン１.５９ｍｌ（５当量）を加えて、室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｋ）１.４４ｇ（収率９２％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.36 (br s, 1 H), 8.09-8.05 (m, 1 H), 7.96-7.84 (m, 2 H), 7.55-7.43 (m, 4 H), 7.05 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.96 and 4.90 (each d, each 1 H, J = 12.2 Hz), 4.06-3.86 (m, 3 H), 3.50-3.34 (m, 14 H), 3.22 (t, 2 H, J = 7.1 Hz), 3.00 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 1.69 (m, 2 H), 1.59 (m, 2 H), 0.81 (s, 9 H), 0.12 and -0.01 (each s, each 3 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｌ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｋ）１.３２ｇ（１.９２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３５ｍｌに溶解して氷冷し、フッ化テトラブチルアンモニウム溶液２.９０ｍｌ（１.０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１.５当量）を加えた。反応液を室温に戻した後、２時間撹拌した。酢酸０.１７ｍｌ（１.５当量）を加えて中和した後、反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｌ）１.０７ｇ（収率９７％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.36 (br s, 1 H), 8.10-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.58-7.44 (m, 4 H), 7.09 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 4.99 (d, 1 H, J = 4.9 Hz), 4.94 (s, 2 H), 4.00-3.77 (m, 3 H), 3.51-3.35 (m, 14 H), 3.23 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 3.01 (q, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.70 (m, 2 H), 1.61 (m, 2 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール２−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ６）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−Ｏ−（１−ナフチルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｌ）２６０ｍｇ（０.４５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０.１９ｍｌ（１.３当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液１.２０ｍｌ（０.４５Ｍ、１.２当量）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌで１回、飽和食塩水１０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ６）２２６ｍｇ（収率６４％）を無色オイル状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 149.54.

（５）アミダイト化合物（Ｙ７）の合成（図５）
（Ｒ）−１−Ｏ−（９−アントリルメチル）グリセロール（化合物ｎ）
アルゴン雰囲気下、９−（クロロメチル）アントラセン（化合物ｍ）１.３６ｇ（６.０ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物ｂ）０.８２ｍｌ（０.６６ｍｍｏｌ）をトルエンとジオキサンの混合溶液（２：１）６０ｍｌに溶解し、粉末状に砕いた水酸化カリウム２.０ｇを加えて１２０℃で１.５時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル２００ｍｌを加えて、水７０ｍｌで３回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、得られた黄色オイル状物質に８０％酢酸水溶液６０ｍｌを加えて溶解し、室温で１８時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｎ）１.４１ｇ（収率８３％）を淡黄色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.62 (s, 1 H), 8.45-8.42 (m, 2 H), 8.12-8.09 (m, 2 H), 7.62-7.50 (m, 4 H), 5.46 (s, 2 H), 4.70 (d, 1 H, J = 5.0 Hz), 4.50 (t, 1 H, J = 5.7 Hz), 3.69-3.54 (m, 3 H), 3.36 (ddd, 1 H, J = 4.9, 5.7, 11.2 Hz), 3.31 (ddd, 1 H, J = 5.3, 5.7, 11.2 Hz).

（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）グリセロール（化合物ｏ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（９−アントリルメチル）グリセロール（化合物ｎ）１.２５ｇ（４.４３ｍｍｏｌ）をピリジン３５ｍｌに溶解し、塩化ジメトキシトリチル１.８０ｇ（１.２当量）を加え、室温で１.５時間撹拌した。エタノール５ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液７０ｍｌで１回、水７０ｍｌで２回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｏ）２.４７ｇ（収率９５％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.63 (s, 1 H), 8.39-8.36 (m, 2 H), 8.12-8.08 (m, 2 H), 7.54-7.46 (m, 4 H), 7.34-7.15 (m, 9 H), 6.78-6.73 (m, 4 H), 5.45 (s, 2 H), 4.92 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.79 (m, 1 H), 3.72-3.66 (m, 2 H), 3.69 and 3.68 (each s, each 3 H), 2.93 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.3 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 5.6, 9.3 Hz).

（Ｒ）−１−Ｏ−（９−アントリルメチル）−２−Ｏ−（トリイソプロピルシリル）グリセロール（化合物ｐ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）グリセロール（化合物ｏ）７６０ｍｇ（１.３０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、トリイソプロピルシリルクロリド０.７１ｍｌ（２.５当量）、イミダゾール４５０ｍｇ（５当量）を加えて室温で２日間撹拌した。反応液にエタノール５ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した後、酢酸エチル２００ｍｌを加えて、水７０ｍｌで４回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をクロロホルム１０ｍｌに溶解し、８０％酢酸水溶液２０ｍｌを加えて、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｐ）５２３ｍｇ（収率９２％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.62 (s, 1 H), 8.44-8.41 (m, 2 H), 8.12-8.06 (m, 2 H), 7.59-7.49 (m, 4 H), 5.49 and 5.44 (each d, each 1 H, J = 11.5 Hz), 4.59 (t, 1 H, J = 5.4 Hz), 3.81-3.71 (m, 2 H), 3.61 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.7 Hz), 3.37 (dd, 2 H, J = 5.4, 5.6 Hz), 0.91-0.84 (m, 21 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］−２−Ｏ−（トリイソプロピルシリル）グリセロール（化合物ｑ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（９−アントリルメチル）−２−Ｏ−（トリイソプロピルシリル）グリセロール（化合物ｐ）５２０ｍｇ（１.１８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ３０ｍｇ（０.２当量）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール１２０ｍｇ（０.６当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール１２０ｍｇ（０.６当量）を追加してさらに２時間撹拌した。この反応液に４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン１.３０ｍｌ（５当量）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１３０ｍｌを加えて、水５０ｍｌで４回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られた残渣をメタノール２０ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル０.７１ｍｌ（５当量）及びトリエチルアミン０.８４ｍｌ（５当量）を加えて、室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｑ）７７３ｍｇ（収率８４％）を淡黄色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.36 (br s, 1 H), 8.63 (s, 1 H), 8.43-8.40 (m, 2 H), 8.12-8.08 (m, 2 H), 7.59-7.50 (m, 4 H), 7.01 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.48 (s, 2 H), 3.99-3.88 (m, 3 H), 3.69 (dd, 1 H, J = 4.9, 9.9 Hz), 3.64 (dd, 1 H, J = 4.6, 9.9 Hz), 3.51-3.35 (m, 12 H), 3.23 (t, 2 H, J = 6.9 Hz), 3.00 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 1.70 (m, 2 H), 1.60 (m, 2 H), 0.90-0.83 (m, 21 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｒ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］−２−Ｏ−（トリイソプロピルシリル）グリセロール（化合物ｑ）５００ｍｇ（０.６４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１２ｍｌに溶解して氷冷し、フッ化テトラブチルアンモニウム溶液０.９６ｍｌ（１.０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１.５当量）を加えた。反応液を室温に戻した後、１時間撹拌した。酢酸５５μｌ（１.５当量）を加えて中和した後、反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物ｒ）３８３ｍｇ（収率９５％）を淡黄色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.37 (br s, 1 H), 8.63 (s, 1 H), 8.44-8.41 (m, 2 H), 8.12-8.09 (m, 2 H), 7.61-7.50 (m, 4 H), 7.09 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.47 (s, 2 H), 5.00 (d, 1 H, J = 4.6 Hz), 3.95 (m, 1 H), 3.89-3.79 (m, 2 H), 3.64 (m, 2 H), 3.50-3.36 (m, 12 H), 3.23 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 3.01 (q, 2 H, J = 6.5 Hz), 1.70 (m, 2 H), 1.61 (m, 2 H).

（Ｓ）−３−Ｏ−（９-アントリルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール２−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ７）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−Ｏ−（９−アントリルメチル）−１−Ｏ−［Ｎ−［１３−トリフルオロアセトアミド−４，７，１０−トリオキサトリデカニル］カルバモイル］グリセロール（化合物ｒ）３５０ｍｇ（０.５６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０.２１ｍｌ（１.２当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液１.３８ｍｌ（０.４５Ｍ、１.１当量）を加え、室温で１.５時間撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌで１回、水２５ｍｌで１回、飽和食塩水２５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ７）２９３ｍｇ（収率６４％）を淡黄色オイル状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 149.51, 149.43.

（６）アミダイト化合物（Ｙ８）の合成（図６）
（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン−２−オール（化合物ｓ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｆ）９００ｍｇ（３.８９ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル０.９３ｍｌ（２当量）及びトリエチルアミン１.０９ｍｌ（２当量）を加えて、室温で３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｓ）８６０ｍｇ（収率６８％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.34 (br t, 1 H, J = 5.7 Hz), 8.12-8.08 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.45 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 4.6, 5.3, 5.6, 7.7 Hz), 3.50 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 5.6, 9.9 Hz), 3.32 (ddd, 1 H, J = 4.6, 5.7, 13.2 Hz), 3.17 (ddd, 1 H, J = 6.1, 7.7, 13.2 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン（化合物ｔ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン−２−オール（化合物ｓ）５１０ｍｇ（１.５６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ３８ｍｇ（０.２当量）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール１９０ｇ（０.７５当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール１９０ｍｇ（０.７５当量）を追加してさらに２時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール５５０ｍｇ（３当量）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えて、水５０ｍｌで４回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｔ）４８７ｍｇ（収率６７％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.48 (br s, 1 H), 8.09-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.88 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 7.17 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.01 (m, 1 H), 4.97 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.33 (t, 1 H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.57 (m, 2 H), 3.42-3.34 (m, 4 H), 2.93 (dt, 2 H, J = 5.6, 6.9 Hz), 1.42-1.33 (m, 4 H), 1.27-1.20 (m, 4H).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ８）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン（化合物ｔ）１８８ｍｇ（０.４０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０.１５ｍｌ（１.２当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液０.９８ｍｌ（０.４５Ｍ、１.１当量）を加え、室温で２０分撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌで１回、水１０ｍｌで１回、飽和食塩水１０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ８）１７０ｍｇ（収率６３％）を白色固体状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.21.

（７）アミダイト化合物（Ｙ９）の合成（図７）
（Ｒ）−１−Ｏ−トシル−３−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール（化合物ｕ）
アルゴン雰囲気下、(Ｓ) −(＋) −２,２−ジメチル１,３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物ｂ）１.２４ｍｌ（１０.０ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍｌに溶解し、塩化トシル３.８１ｇ（２.０当量）を加えて室温で１７時間撹拌した。反応液に水１５ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル３５０ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質に８０％酢酸水溶液７０ｍｌを加えて溶解し、室温で２０時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、さらにピリジンと共沸した。アルゴン雰囲気下、この残渣をピリジン６０ｍｌに溶解し、塩化ジメトキシトリチル４.０７ｇ（１.２当量）を加え、室温で２時間撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル３５０ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｕ）４.５１ｇ（収率８２％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.74 (m, 2 H), 7.45 (m, 2 H), 7.29-7.13 (m, 9 H), 6.88-6.84 (m, 4 H), 5.28 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.04 (dd, 1 H, J = 3.6, 9.6 Hz), 3.96 (dd, 1 H, J = 5.4, 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 3.74 (s, 6 H), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.9, 9.2 Hz), 2.39 (s, 3 H).

（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アジドプロパン−２−オール（化合物ｖ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−トシル−３−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール（化合物ｕ）９３０ｍｇ（１.７０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム４４０ｍｇ（４当量）及び塩化アンモニウム４５５ｍｇ（５当量）を加えて８０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル１５０ｍｌを加えて、水５０ｍｌで４回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｖ）６９０ｍｇ（収率９６％）を黄色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.41-7.18 (m, 9 H), 6.91-6.86 (m, 4 H), 5.31 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.81 (dtdd, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.6 Hz), 3.73 (s, 6 H), 3.36 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.5 Hz), 3.28 (dd, 1 H, J = 6.3, 12.5 Hz), 3.00 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 6.6, 9.2 Hz).

（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アミノプロパン−２−オール（化合物ｗ）
（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アジドプロパン−２−オール（化合物ｖ）６２０ｍｇ（１.４８ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、パラジウム−炭素（１０％）１２０ｍｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で６時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物（化合物ｗ）５４８ｍｇ（収率９４％）を白色泡状物質として得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.42-7.21 (m, 9 H), 6.90-6.86 (m, 4 H), 4.71 (br s, 1 H), 3.73 (s, 6 H), 3.55 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.3, 6.0, 6.9 Hz), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 8.9 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.0, 8.9 Hz), 2.68 (dd, 1 H, J = 4.0, 12.8 Hz), 2.46 (dd, 1 H, J = 6.9, 12.8 Hz).

６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝ナフタレン−２−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル（化合物ｘ）
アルゴン雰囲気下、２，６−ナフタレンジカルボン酸ジペンタフルオロフェニルエステル８２２ｍｇ（１.５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.７０ｍｌ（４.０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン７０ｍｌに溶解し、この溶液に（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アミノプロパン−２−オール（化合物ｗ）５２０ｍｇ（１.３２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）を１０分かけて滴下した。室温でさらに１時間撹拌した後、溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｘ）６６４ｍｇ（収率６７％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 9.01 (m, 1 H), 8.65 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.51 (m, 1 H), 8.32 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.19 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 8.02 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 7.45-7.42 (m, 2 H), 7.31-7.17 (m, 7 H), 6.87-6.83 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.94 (m, 1 H), 3.69 (s, 3 H), 3.68 (s, 3 H), 3.56 (m, 1 H), 3.29 (m, 1 H), 3.05-2.96 (m, 2 H).

６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン（化合物ｙ）
アルゴン雰囲気下、６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝ナフタレン−２−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル（化合物ｘ）６４０ｍｇ（０.８４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、１，３−プロパンジアミン０.７０ｍｌ（１０当量）を加えて室温で３０分撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えて水５０ｍｌで５回洗浄し、有機層を減圧下濃縮した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下メタノール１５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル０.５０ｍｌ（５当量）及びトリエチルアミン０.５９ｍｌ（５当量）を加えて、室温で１４時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｙ）４４０ｍｇ（収率７０％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 9.46 (br s, 1 H), 8.72 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.55 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.47 (m, 1 H), 8.41 (m, 1 H), 8.09-8.05 (m, 2 H), 7.99-7.91 (m, 2 H), 7.44-7.41 (m, 2 H), 7.31-7.16 (m, 7 H), 6.86-6.82 (m, 4 H), 5.10 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.93 (m, 1 H), 3.68 (s, 3 H), 3.67 (s, 3 H), 3.53 (m, 1 H), 3.41-3.23 (m, 5 H), 2.99 (m, 2 H), 1.81 (m, 2 H).

６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ９）
アルゴン雰囲気下、６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン（化合物ｙ）２９８ｍｇ（０.４０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０.１５ｍｌ（１.２当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液０.９８ｍｌ（０.４５Ｍ、１.１当量）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍｌで２回、飽和食塩水１５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ９）２５５ｍｇ（収率６８％）を白色泡状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆)δ: 149.20, 148,95.

（８）アミダイト化合物（Ｙ１０及びＹ１１）の合成（図１３）
（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物α）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｆ）１.８２ｇ（７.８５ｍｍｏｌ）をピリジン７５ｍｌに溶解し、塩化モノメトキシトリチル３.１５ｇ（１.３当量）を加え室温で７時間撹拌した。エタノール１５ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、水７０ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液７０ｍｌで１回、水７０ｍｌで１回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物α）２.８０ｇ（収率７１％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.03-8.00 (m, 1 H), 7.94-7.85 (m, 2 H), 7.54-7.34 (m, 8 H), 7.28-7.12 (m, 8 H), 6.82-6.77 (m, 2 H), 4.94 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.88 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.80 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.82 (m, 1 H), 3.70 (s, 3 H), 3.51 (m, 2 H), 2.39 (br dd, 1 H, J = 7.0, 8.6 Hz), 2.17 (ddd, 1 H, J = 4.6, 8.6, 11.5 Hz), 1.97 (ddd, 1 H, J = 6.6, 7.0, 11.5 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン（化合物β）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物α）２.６２ｇ（５.２０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１３０ｍｇ（０.２当量）をジメチルホルムアミド５５ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール６３０ｍｇ（０.７５当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール６３０ｍｇ（０.７５当量）を追加してさらに３時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール１.８３ｇ（３当量）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル３００ｍｌを加えて、水１００ｍｌで４回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物β）３.０７ｇ（収率９１％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.00-7.85 (m, 3 H), 7.53-7.33 (m, 8 H), 7.28-7.12 (m, 9 H), 6.81-6.77 (m, 2 H), 4.95 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.95 (m, 1 H), 4.88 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.30 (t, 1 H, J = 5.1 Hz), 3.72-3.68 (m, 5 H), 3.36 (m, 2 H), 2.96 (m, 2 H), 2.38 (t, 1 H, J= 8.1 Hz), 2.18 (m, 2 H), 1.41-1.33 (m, 4 H), 1.26-1.22 (m, 4 H).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ１０）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン（化合物β）３２３ｍｇ（０.５０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.５２ｍｌ（６当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０.１３ｍｌ（１.２当量）を加え、室温で３０分撹拌した。反応液にクロロホルム５０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌで１回、水２０ｍｌで１回、飽和食塩水２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ１０）３１０ｍｇ（収率７３％）を無色飴状物質として得た。
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.27.

（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリチルアミノプロパン−２−オール（化合物γ）
（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｆ）を出発原料とし、塩化モノメトキシトリチルの代りに塩化トリチルを用いて、（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物α）の合成と同様に処理して、標記化合物（化合物γ）を得た。

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリチルアミノプロパン（化合物δ）
（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリチルアミノプロパン−２−オール（化合物γ）を出発原料とし、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン（化合物β）の合成と同様に処理して、標記化合物（化合物δ）を得た。

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリチルアミノプロパン６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ１１）
（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリチルアミノプロパン（化合物δ）を出発原料とし、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ１０）の合成と同様に処理して、標記化合物（化合物Ｙ１１）を得た。

（実施例２）オリゴヌクレオチドプローブの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行った。

ＨＰＬＣにはＧｉｌｓｏｎの装置を用い、分析はＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。逆相分析用カラムとしてＷａｔｅｒｓ μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８、３００Å（内径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）、逆相分取用カラムとしてＧＬＳｃｉｅｎｃｅＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３Ｃ１８（内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）、陰イオン交換分析用として東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＤＥＡＥ−２ＳＷ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用した。移動相として、逆相の場合には０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）中アセトニトリル、陰イオン交換の場合には２０％アセトニトリル水中ギ酸アンモニウムの濃度勾配を用いた。

オリゴヌクレオチドプローブの合成
下記の各オリゴヌクレオチドプローブを、デオキシヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（日本テクノサービス社より購入）を原料として、ＤＮＡ自動合成機（モデル３９４Ａ；（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）で、０．２又は１μｍｏｌスケールで合成した。
Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝１〜８）：５’−Ｘｎ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１）
Ｃｙ５−ＡＳ−Ｓｐ：５’−Ｃｙ５−ＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号２）

Ｘ１−Ｓｐ及びＸ４−Ｓｐのオリゴヌクレオチドの５’末端に導入するアミノ基にはＮ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いた。Ｘ２−Ｓｐ、Ｘ３−Ｓｐ、Ｘ５−Ｓｐ、Ｘ６−Ｓｐ、Ｘ７−Ｓｐ、Ｘ８−Ｓｐのアミノ基の導入は、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８のホスホロアミダイト化合物を用いて行った。合成したオリゴヌクレオチドプローブＸ１−Ｓｐ〜Ｘ８−Ｓｐの構造を図８に示す。

合成終了後、オリゴヌクレオチドプローブは以下のように処理し精製した。濃アンモニア水でＣＰＧ（ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＰｏｒｅＧｌａｓｓ）よりオリゴヌクレオチドプローブを切り出し、５０℃で１２時間加温した。溶媒を留去し、脱イオン水に溶解した後、Ｃ１８（ウォーターズ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを行なった（カラムサイズ０．８ｘ１８ｃｍ：５−５０％アセトニトリル、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（以下「ＴＥＡＡ」という）水溶液の溶媒を用いた直線濃度勾配により溶出）。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出されたフラクションを集め、２ｍｌの８０％酢酸水溶液を加え、６０分間攪拌した。酢酸を減圧下留去し、水層を酢酸エチルで洗浄した。溶媒を留去後、滅菌水１ｍｌに溶解した。

Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝１〜８）は、逆相ＨＰＬＣで分取し精製した。逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：
Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝１〜６）ではカラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３（Ｃ−１８）カラムΦ８．０ｘ３００ｍｍ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅ社製）を使用。
Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝７、８）ではカラム：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）を使用。

溶液１
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
カラム温度：５０度
溶液２
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
Ｂ溶液２５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
カラム温度：５０度

（実施例３）オリゴヌクレオチドプローブと蛍光色素との反応
Ｃｙ５−Ｘ１−ＡＳ−Ｓｐの合成
Ｘ１−ＡＳ−Ｓｐ：５’−Ｘ１−ＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣ−３’
Ｘ１−ＡＳ−Ｓｐは、Ｘ１−Ｓｐと相補的なオリゴヌクレオチドであり、まず上記Ｘ１−Ｓｐと同様のアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドフプローブとして合成し、続いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３（Ｃ−１８）カラムΦ８．０ｘ３００ｍｍ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅ社製）

Ｘ１−ＡＳ−ＳｐのＣｙ５−スクシンイミジルエステルとの反応
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘ１−ＡＳ−Ｓｐ）（１ｎｍｏｌ）とＣｙ５−スクシンイミジルエステル（ファルマシア社製）（５００ｎｍｏｌ）を１０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ炭酸緩衝溶液に溶解し（全量１００μＬ）、遮光し３５℃で反応を行った。反応開始１６時間後に、ＮＡＰ１０（ファルマシア社）で脱塩した。その後逆相ＨＰＬＣで分取した。
カラム：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）

溶液１
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
カラム温度：５０度

フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）との反応
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ：ｎ＝１〜８）（１ｎｍｏｌ）とＦＩＴＣ（５００ｎｍｏｌ）を１０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ炭酸緩衝溶液に溶解し（全量１００μＬ）、遮光し４０℃で反応を開始した。反応開始後３０分〜４時間までの任意な時間に１５μＬはかりとり、ＮＡＰ５（ファルマシア社）で脱塩した。その後逆相ＨＰＬＣで分析した。フルオレセインと結合した各オリゴヌクレオチドプローブの逆相ＨＰＬＣによる分析条件及び結果を表３に示した。

溶媒１
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
カラム温度：５０度
結果を図９ｂに示す。

（実施例４）オリゴヌクレオチドプローブのスライドガラスへのスポットと結合反応
スライドガラス（２０枚）を１０％水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に１５分間浸した後、水（２００ｍＬで２回）、１％塩酸水溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬで２回）の順で洗浄した。メタノール（２００ｍＬ）に浸し５分間の超音波洗浄を行い、遠心によって乾燥させ、さらに１８０度で３時間乾燥した。

続いて乾燥させたスライドガラスを３−アミノトリメトキシシラン（１３ｍＬ）、水（８ｍＬ）、メタノール（３８０ｍＬ）中に浸し、室温で少なくとも５時間攪拌下させた。その後スライドガラスを取り出し、メタノール（２００ｍＬ）で３回洗浄して遠心後、１８０度で３時間乾燥させた。あらかじめ１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１４００ｍｇ）を１０％ピリジン・ジメチルホルムアミド溶液（２２０ｍＬ）に溶解させ、これに上記アミノシラン化を行ったスライドガラスを入れ、室温下１６時間攪拌させた。スライドガラスを取り出し、ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）で２回、ジクロロメタン（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍｌ）、メタノール（２００ｍＬ）の順で洗浄し、減圧下室温で乾燥させ、イソチオシアネート化されたスライドガラスを得た。

続いてイソチオシアネート化されたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０又は３０％トリス（３−アミノプロピル）アミン・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄した。減圧下室温で１時間乾燥させた後、あらかじめ１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１４００ｍｇ）を１０％ピリジン・ジメチルホルムアミド溶液（２２０ｍＬ）に溶解させた溶液中にそのスライドガラスを入れ、室温下１６時間攪拌させた。スライドガラスを取り出し、ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）で２回、ジクロロメタン（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍｌ）、メタノール（２００ｍＬ）の順で洗浄し、減圧下室温で乾燥させ、２層目のイソチオシアネート化されたスライドガラスを得、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。

５０塩基オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ）（５０〜３００ｐｍｏｌ）を滅菌水（５μｌ）に溶解し、スポット溶液（５μｌ;１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０））と混合させ、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社製）によって１，４−フェニレンジイソチオシアネートをコーティングしたコーティング済みスライドガラス上にスポットした。スポット後タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないようにスポット済みのスライドガラスを入れ、密閉後室温で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出し、スライドガラスを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０２％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。

続いて１Ｍエタノールアミン水溶液（２００ｍＬ）にガラスを浸し、室温で１時間攪拌しブロッキングを行った。滅菌水で３回洗浄後、ドラフト内で乾燥させて冷蔵保存した。

（実施例５）オリゴヌクレオチドプローブのスライドガラス上への固定化の確認
４０μＭＴｅｘａｓＲｅｄ−ｄｄＡＴＰ（２μＬ）、ジメチルスルホキシド（１０μＬ）、２５ｍＭ塩化コバルト溶液（１０μＬ）、反応緩衝溶液（ｘ５、１Ｍカコジル酸カリウム、１２５ｍＭトリス−塩酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ６．６；２０μＬ）、ターミナルトランスフェレース（１μＬ；４００ｕｎｉｔｓ）に滅菌水を加えて全量８０μｌとした反応溶液を調製後、直ちに実施例４のスライドガラスに全量滴下した。カバーガラスを反応液上にのせ、３７度で放置した。１５分後１ＸＳＳＣ緩衝液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸二水和物）、０．１％ＳＤＳ溶液で６０℃、１０分間、ミリ給水洗浄、エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機（スキャンアレイ）で測定した（図９ａ）。

（実施例６）担体上でのハイブリダイゼーション
Ｃｙ５−Ｘ１−ＡＳ−Ｓｐ（４．８ｐｍｏｌ）に２０ＸＳＳＣ（０．６μｌ）、１０％ＳＤＳ（１．２μｌ）、及び滅菌水を加え全量２４μｌのプローブ溶液を作製した。そのプローブＤＮＡ溶液を静かに実施例４で作製したＤＮＡチップ上にのせた後、カバーグラスを溶液上にのせ、４ＸＳＳＣ溶液で湿らせたキムタオルを敷いたタイトボックス内に入れ、４０度又は６０度で１６時間放置した。

ハイブリダイゼーション後、チップを０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ）に５分間、０．０５ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ）に１０分間、続いて０．０５ｘＳＳＣ（２００ｍＬ）でそれぞれ室温で洗浄した。乾燥させた後、チップスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ、ＡＰａｃｋａｒｄＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＣｏｍｐａｎｙの商品名）で検出した。結果を図１０に示す。

ハイブリダイゼーションの結果から、Ｘ１−ＳｐやＸ４−Ｓｐと比べて、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ用いた場合は、より好感度に検出できることが明らかとなった。

（実施例７）２５塩基オリゴヌクレオチドの合成
Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝１〜８）と同様の方法でＸｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１、３〜９）及びＸ９−Ｓｐ３５を合成し、精製した。
それぞれの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：

溶液１
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
カラム温度：５０度
溶液２
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
Ｂ溶液２５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）
カラム温度：５０度
カラムＡ：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）
カラムＢ：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３（Ｃ−１８）カラムΦ８．０ｘ３００ｍｍ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅ社製）
Ｘｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１、３〜９）：
５’−Ｘｎ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）
Ｘ９−Ｓｐ３５：
５’−ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＣ−Ｘｎ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号４）

（実施例８）２５塩基オリゴヌクレオチドプローブと蛍光色素との反応
フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）との反応
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ２５：ｎ＝１、３〜９；Ｘ９−Ｓｐ３５）（１ｎｍｏｌ）とＦＩＴＣ（５００ｎｍｏｌ）を１０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ炭酸緩衝溶液に溶解し（全量１００μＬ）、遮光し４０℃で反応を開始した。反応開始後３０分〜４時間までの任意な時間に１５μＬはかりとり、ＮＡＰ５（ファルマシア社）で脱塩した。その後逆相ＨＰＬＣで分析した。各オリゴヌクレオチドプローブの逆相ＨＰＬＣによる分析条件を下記に示した。またＦＩＴＣの生成率の結果を図９ｃに示した。

ＨＰＬＣ条件
溶媒
Ａ溶液５％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０.１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
カラム温度：５０度
カラム：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）

（実施例９）
実施例４と同様に表面をコーティングしたスライドガラスに対し、２５塩基オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ２５；n＝１、５、９）（５０又は１００ｐｍｏｌ）を滅菌水（５μｌ）に溶解し、スポット溶液（５μｌ;１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０））と混合させ、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社製）によって１，４−フェニレンジイソチオシアネートをコーティングしたコーティング済みスライドガラス上にスポットした。スポット後タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないようにスポット済みのスライドガラスを入れ、密閉後室温で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出し、スライドガラスを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０２％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。

（実施例１０）オリゴヌクレオチドプローブのスライドガラス上への固定化の確認
４０μＭＴｅｘａｓＲｅｄ−ｄｄＡＴＰ（２μＬ）、ジメチルスルホキシド（１０μＬ）、２５ｍＭ塩化コバルト溶液（１０μＬ）、反応緩衝溶液（ｘ５、１Ｍカコジル酸カリウム、１２５ｍＭトリス−塩酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ６．６；２０μＬ）、ターミナルトランスフェレース（１μＬ；４００ｕｎｉｔｓ）に滅菌水を加えて全量８０μｌとした反応溶液を調製後、直ちに実施例９のスライドガラスに全量滴下した。カバーガラスを反応液上にのせ、３７℃で放置した。１５分後１ＸＳＳＣ緩衝液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸二水和物）、０．１％ＳＤＳ溶液で６０℃、１０分間、ミリ給水洗浄、エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機（スキャンアレイ）で測定した（図１２）。

（実施例１１）オリゴヌクレオチド（Ｘ１０−Ｓｐ２５）の合成と、緩和な条件での脱保護実験
実施例１で合成したアミダイト化合物（Ｙ１０）を用い、Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝１〜８）と同様の方法で、Ｘ１０−Ｓｐ２５を合成し、精製した。
Ｘｎ−Ｓｐ（ｎ＝８、１０）
５’−Ｘｎ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）
それぞれの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：

溶液１
Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液５０％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０度
カラムＡ：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）

Ｘ１０−Ｓｐ２５はモノメトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）によってアミノ基が保護されている。このオリゴヌクレオチドに１０％酢酸水溶液（１ｍＬ）を加え、室温で５分間処理した。反応液を減圧下濃縮し、さらに水を加えて減圧下共沸した。共沸を３度繰り返し行った後、残渣を滅菌水１ｍＬに溶解し、逆相ＨＰＬＣによって分析した（図１４ｂ、ｃ）。以上から、Ｘ１０−Ｓｐ２５が緩和な酸性条件によって脱保護され、Ｘ８−Ｓｐ２５と同じ構造になったことがわかる（図１４ａ）。

本発明により、ＤＮＡチップの低価格化が可能になり、広く遺伝子診断技術の手段としてのＤＮＡチップの普及に寄与することが期待される。

従来のオリゴヌクレオチドプローブと本発明のオリゴヌクレオチドプローブの構造を示す。アミダイト化合物（Ｙ２）の合成方法を示す。アミダイト化合物（Ｙ３）の合成方法を示す。アミダイト化合物（Ｙ５、６）の合成方法を示す。アミダイト化合物（Ｙ７）の合成方法を示す。アミダイト化合物（Ｙ８）の合成方法を示す。アミダイト化合物（Ｙ９）の合成方法を示す。オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ）の構造を示す。オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ）のガラス基盤への固定化量（ａ）とＦＩＴＣとの反応性（ｂ：５０塩基オリゴヌクレオチド、ｃ：２５塩基オリゴヌクレオチド）を示す。実施例６におけるハイブリダイゼーションの結果を示す。中間体化合物の具体例を表す。２５塩基オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘｎ−Ｓｐ２５；ｎ＝１、５、９）と両側にオリゴヌクレオチドをもつプローブ（Ｘ９−Ｓｐ３５）のガラス基盤への固定化量の測定結果を示す。アミダイト化合物（Ｙ１０、Ｙ１１）の合成方法を示す。Ｘ１０−Ｓｐ２５の配列とＸ１０−Ｓｐ２５の脱保護反応のスキーム（ａ）、Ｘ１０−Ｓｐ２５を逆相ＨＰＬＣ分析した結果（ｂ）、及びＸ１０−Ｓｐ２５を酸処理した後、逆相ＨＰＬＣ分析した結果（ｃ）を示す。

配列番号１〜４合成オリゴヌクレオチド

Claims

一般式１：
Ｂ−Ｄ−Ａ（１）
（式中、Ａはオリゴヌクレオチドを表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表す）
で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。
芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
芳香族基が置換又は無置換のフェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環又はピレン環を含むものである請求項２記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価の炭化水素基であって、少なくとも１つの芳香族基を有する請求項１〜３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが主鎖に二価の芳香族基を含む請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが側鎖に芳香族基を有する請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが一般式２で表される請求項６記載のオリゴヌクレオチドプローブ：

（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_２、Ｒ_２’及びＲ_３はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）。
Ｒ_２が一般式３：
−Ｒ_４−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_５−（ＣＨ_２）_ｎ− （３）
で表され、
Ｒ_３が一般式４：
−（ＣＨ_２）_ｔ−Ｒ_６−（ＣＨ_２）_ｗ− （４）
で表され、
Ｒ_４は、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｉ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−であり、
Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

を表し、
ｍ、ｔは、それぞれ独立して０〜２０の整数を表し、
ｎ、ｗ、i、ｑはそれぞれ独立して１〜２０の整数を表し、
Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す、
請求項７記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｌが置換又は無置換のフェナントリル基、フルオレニル基、ナフチル基、アントリル基又はピレニル基である請求項７又は８記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが側鎖にさらなるオリゴヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
Ｄが一般式２’で表される請求項５記載のオリゴヌクレオチドプローブ：

（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ａ’は水酸基又はオリゴヌクレオチドを表す）。
請求項１〜１１のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体。
一般式５：

（式中、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表し、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｒ_８はリン酸保護基を表し、Ｒ_９及びＲ_１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）
で表される化合物。
芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である請求項１３記載の化合物。
芳香族基が置換又は無置換のフェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環又はピレン環を含むものである請求項１４記載の化合物。
Ｄ’が複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価の炭化水素基であって、少なくとも１つの芳香族基を有する請求項１３〜１５のいずれか１項記載の化合物。
Ｄ’が主鎖に二価の芳香族基を含む請求項１３〜１６のいずれか１項記載の化合物。
Ｄ’が側鎖に芳香族基を有する請求項１３〜１６のいずれか１項記載の化合物。
Ｄ’が一般式２で表される請求項１８記載の化合物：

（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_２、Ｒ_２’及びＲ_３はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）。
Ｒ_２が一般式３：
−Ｒ_４−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_５−（ＣＨ_２）_ｎ− （３）
で表され、
Ｒ_３が一般式４：
−（ＣＨ_２）_ｔ−Ｒ_６−（ＣＨ_２）_ｗ− （４）
で表され、
Ｒ_４は、直接結合又は−（ＣＨ_２）_ｉ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−であり、
Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：

を表し、
ｍ、ｔは、それぞれ独立して０〜２０の整数を表し、
ｎ、ｗ、i、ｑはそれぞれ独立して１〜２０の整数を表し、
Ｒ_７は水素原子又はリン酸保護基を表す、
請求項１９記載の化合物。
Ｌが置換又は無置換のフェナントリル基、フルオレニル基、ナフチル基、アントリル基又はピレニル基である請求項１９又は２０記載の化合物。
Ｄ’が一般式６で表される請求項１７記載の化合物：

（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ_１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ｒ_１５は水酸基保護基を表す）。