JP2003521680A - 基体表面に結合させるための複数の結合部分を有する生体分子 - Google Patents

基体表面に結合させるための複数の結合部分を有する生体分子

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Abstract

(57)【要約】 基体表面に結合させるための複数の結合部位を有する生体分子を提供する。複数の結合部位は生体分子表面に直接もたらされ得るかまたは基体結合部分に対する結合部位をその後に提供し得る樹枝状構造体を形成させるために多数で付加することができる分岐型ホスホルアミダイト成分の使用によってもたらされ得る。基体結合部分には非共有的な結合部分を含むことができる。共有的な結合部分の場合、複数のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチドが提供される。このヒドラジドはホスホルアミダイトなどの保護された組み立て要素を介して、またはそのようなヒドラジドの前駆体形態を含む組み立て要素を介して導入し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、生体分子を基体表面に結合させるための結合化学反応に関する。よ
り詳細には、本発明は、生体分子を基体表面に結合させるために複数の化学的な
結合部分を有する生体分子を提供するための、分岐型構造体を含む結合化学反応
に関する。
【０００２】 発明の背景 下記の説明は、本発明に関連する情報の要約を提供する。本明細書中に提供し
た情報のいずれかがここに特許請求する発明に対して先行技術となることも、ま
た具体的または明示的に参照する刊行物のいずれかが本発明に対して先行技術と
なることも断じて認められるものではない。
【０００３】 オリゴヌクレオチドを基体に固定化することは、ＤＮＡチップ技術、表面プラ
ズモン共鳴実験または他のバイオセンサー適用などの多くの適用に関して重要か
つ必要な工程である。従来、オリゴヌクレオチドは、１の反応基（例えば、アミ
ン、チオールまたはアルデヒド）を用いた３’−末端または５’−末端の修飾（
共有結合）あるいは安定な複合体を形成する基（例えば、ビオチン、フェニルボ
ロン酸など）を用いた３’−末端または５’−末端の修飾（非共有結合）によっ
て基体に固定化されている。ついで、修飾されたオリゴヌクレオチドは、固定化
が望まれる場所にアドレス指定され、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジドなど
の適当な官能基と反応するか、またはストレプトアビジンなどの結合分子と複合
体形成する。基体上の特定の場所にアドレス指定することは、スポッティング（
ピンまたは液滴による付着）によって、または電子的なアドレス指定によって、
または様々な他の方法によって行うことができる。場合により、固定化の反応は
遅く、基体上におけるオリゴヌクレオチドの長時間（一晩）のインキュベーショ
ンを必要とする。これらの固定化反応はまた可逆的であることがあり、時間とと
もに生体分子の放出を生じる。
【０００４】 また、生体分子上におけるデンドリマー構造が記載されている（例えば、WO99
/10362、WO96/19240およびWO99/43287）。しかし、デンドリマー構造の使用は、
検出などのためのシグナル部位を提供することに指向されており、一方、生体分
子そのものは、従来の方法を使用して基体に単に結合されているだけである。
【０００５】 これに対して、本発明では、複数の反応部位（すなわち、求核種、求電子種お
よびルイス酸またはルイス塩基）を含有するオリゴヌクレオチドを使用する生体
分子の改善された固定化方法を記載する。このアプローチの利点は、固定化速度
がより大きいこと、結合の安定性がより高いこと、および基体表面により多量の
固定化オリゴヌクレオチドを得る可能性があることである。これらの改善は、固
定化のために使用するアプローチから独立している。複数の結合部位を有するオ
リゴヌクレオチドは、共有結合および非共有結合の両方の結合法を用いて得るこ
とができる。
【０００６】 さらに、本発明は、１または複数のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチド
の調製を記載する。ヒドラジドは、いずれのタイプのコンジュゲーション反応に
も使用することができる求核性の反応基である。ヒドラジドは、例えば、ヒドラ
ゾン（これは還元によってさらに安定化させることができる）を形成する求電子
性のアルデヒド、および安定した共有結合を形成する活性エステルと反応し得る
（図１８を参照されたい）。この化学反応は、蛍光物質、タンパク質またはペプ
チド、レポーター基および他のオリゴマーをオリゴヌクレオチドに結合させるた
めに使用し得る。ヒドラジドの反応はまた、生体分子を基体に固定化するために
も使用することができる。かかるヒドラジド修飾オリゴヌクレオチドは以前に全
く記載されていない。
【０００７】 本説明の範囲に含まれる本発明の利点は無数である。例えば、本発明では、短
い反応時間を使用し、結合物あたり複数の結合部位が許容され、比較的広いｐＨ
範囲に対する安定性が提供され、そして無水条件または水性条件の両方での結合
能が提供され、それによりいずれの適用可能な使用に関してもいずれの固相表面
にも分子を結合させる改善された方法を提供する。本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
ＰＮＡ、ｐ−ＲＮＡ（ピラノシル−ＲＮＡ）およびペプチド（これらに限定され
ない）を含む生体分子のごとき小分子ライブラリーの固相合成および／または合
成に対して有用である。本発明はまた、ハイブリダイゼーションに基づくアッセ
イ、診断、遺伝子配列同定およびその他（これらに限定されない）などの、固定
化試薬を必要とする分析技術に対しても有用である。
【０００８】 発明の概要 本発明の第１の実施形態において、基体表面に結合するための機能的部位また
は反応部位をそれに連結するための複数の分岐型基またはデンドリマー基を有す
る生体分子を提供する。
【０００９】 複数の反応部位または複合体形成因子を１のオリゴヌクレオチド内に有するオ
リゴヌクレオチドを使用することにより、著しい利点がこの固定化プロセスにも
たらされる。第１に、固定化プロセスの速度が増大する。この効果に対する１の
理由は、１のオリゴヌクレオチドが複数の反応基を有する場合に、拡散による結
合パートナー間の最初の接触の機会がより高くなることである。また、そのよう
なオリゴヌクレオチドは、一次結合の後（またはそれと同時）に形成される二次
的な複数の共有的または非共有的な結合を介して固定化することができる。この
場合、このような二次結合の形成は、分子間の一次結合が形成されることに対し
て速度論的に優先する分子内プロセスである。このことは、固定化速度がより高
い別の理由である。
【００１０】 第２に、複数の結合がオリゴヌクレオチドと基体との間で形成されるため、結
合の全体的な安定性が増大する。これは、生体分子を基体と接触させるために使
用するアプローチとは無関係である。
【００１１】 複数の非共有的な複合体が形成されることは、オリゴヌクレオチドと基体との
複合体のより高い全体的な安定性をもたらし、これにより、安定な固定化のため
に低親和性の複合体形成剤を使用することが可能になる。オリゴヌクレオチドに
ついて頻繁に適用される固定化化学反応のいくつか（例えば、アミンとアルデヒ
ドとの間におけるシッフ塩基の形成）は可逆的であり、例えば、ＮａＣＮＢＨ３ を用いた還元によるその後の安定化工程が必要である。このような可逆的な反応
の場合には、複数の結合を介した固定化が有益である。なぜなら、そのような固
定化により、要するに、安定化反応に先立って形成された中間体のより高い安定
性につながるからである。場合により、安定性の増大は、安定化反応が不必要に
なるほど十分に大きい。
【００１２】 第３に、複数の結合部位を有するオリゴヌクレオチドの使用により、より多く
のオリゴヌクレオチドを負荷する基体を製造することが可能になる。通常、基体
上の反応部位はオリゴヌクレオチドに対して大過剰であり、複数の結合基による
改善された結合により、基体上の利用可能な部位のより良好な使用につながり得
る。
【００１３】 別の実施形態において、生体分子にもたらされる種々の反応性の結合基により
、生体分子を共有的様式または非共有的様式のいずれかで基体表面に結合させる
ことができる。非共有的な結合に関して、様々な結合基には、ビオチン、ストレ
プトアビジン、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）およびサリチルヒドロキサム酸（Ｓ
ＨＡ）などの化学基が含まれ得る。共有結合に関して、様々な結合基には、反応
性のヒドラジド構造体を使用することが含まれ得る。そのような構造は分岐型ま
たは非分岐型のいずれでもよく、それにより、利用できる可能な結合部分のレベ
ルにおいて大きな多用性が可能になる。したがって、生体分子に樹枝状の分岐す
る構造で提供される生体分子のみならず、反応性の結合部分自身もまた、生体分
子を基質表面に結合させるときに使用される反応性のヒドラジドエレメントを各
枝分かれが有するように分枝させることもできる。
【００１４】 別の実施形態において、生体分子における様々な結合部分により、電子的にア
ドレス指定可能なマイクロチップを含む基体表面に結合させた生体分子が、マイ
クロチップ電極の電子的バイアスから生じる高電圧および高電流によって引き起
こされるマイクロチップ上の結合部位からの偶発的な除去から保護される手段が
提供される。したがって、好ましい実施形態において、本発明の多結合スキーム
により、少なくとも４ｍＡ／ｃｍ２の電流密度に耐えることができる、基体に対
する生体分子の結合が提供される。
【００１５】 さらに別の実施形態において、本発明は、付加が単一反応工程で生じ得るよう
に、生体分子に結合した樹枝状構造に反応性結合部分を付加する方法を提供する
。
【００１６】 さらに別の実施形態において、本発明は、１または複数のヒドラジドを含有す
るオリゴヌクレオチドの新たな化学的修飾、およびそれにより、その修飾された
オリゴヌクレオチドを生成するための組み立てブロック（例えば、ホスホルアミ
ダイト）を含む組成物を提供する。これらのヒドラジドは反応基を含み、蛍光物
質または他の小分子に、あるいはペプチド、タンパク質または抗体に、あるいは
基体表面にオリゴヌクレオチドを結合させるために使用することができる。
【００１７】 さらに別の実施形態において、結合スキームは、生体分子の表面合成に対して
、そして化合物の表面固定化を必要とする分析的適用に対して適用することがで
きる。
【００１８】 好ましい実施形態の詳細な説明 ここでは、本発明の具体的な実施形態を参照することにより、種々の基体表面
結合部分を有する生体分子が提供される。
【００１９】 「生体分子」とは、試験サンプル中の分子物と接触させるために使用する生物
学的に関連する分子を意味する。一般に、これらには、少なくとも一部は、生体
分子を基体表面に結合させるための化学基に結合させた核酸（一本鎖核酸、オリ
ゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＣＮＡ（シクロヘキ
シル核酸）、ｐ−ＭｅＮＡ（メチルホスファート核酸またはメトキシホスファー
ト核酸）を含む）、タンパク質、ペプチド、酵素および抗体などの分子が含まれ
る。生体分子にはまた、生体分子を基体表面に結合させるための化学基に結合さ
せたペプチド核酸（ＰＮＡ）またはｐ−ＲＮＡ（ピラノシルＲＮＡ）などの、天
然に存在する分子から構造的に由来する非天然型分子または合成分子も含まれる
。そのような結合部分を有することにより、生体分子はまた「誘導体化生体分子
」と呼ばれることがある。したがって、そのような生体分子にはまた、酸化され
たリボース、アミン末端、またはHermanson(Hermanson,G.T.、Bioconjugate Tech
iniques、著作権:1996年、Academic Press、San Diego、CA)（これは参考として本明
細書中に組み込まれる）によって概略されているような、よく知られているバイ
オコンジュゲート対のいずれかの物を含有するオリゴヌクレオチド、および／ま
たは（同時係属出願09/374,338(1999年8月13日出願、これは参考として本明細書
中に組み込まれる）に記載されるようなｐＲＮＡに関連して）ｐＲＮＡなどの別
の核酸構造が含まれる。一般に、生体分子に対する化学基の結合は共有結合を含
む。誘導体化生体分子を基体表面に結合させることに関して、そのような結合は
共有結合または非共有結合のいずれかを使用することができる。
【００２０】 「ポリマー」とは、当業者によって認識されているように、モノマーと一般に
呼ばれる小分子の非常に多くの数が連続的に連結していることから組み立てられ
る高分子を一般に意味する（より詳しい説明については、Odian, G. Principles
of Polymerization (第3版、著作権: 1991年、John Wiley and Sons Inc.、New Yo
rk、NY)を参照されたい）。好ましい実施形態において、均一ポリマーは単一タイ
プのモノマーから構成され得るが、不均一ポリマーは２以上のタイプのモノマー
から構成される。別の好ましい実施形態において、ポリマーの形成は、開始剤（
例えば、ＡＩＢＮ、過酸化ベンゾイル）の熱分解によって、または開始剤の光分
解的切断（例えば、Daracur 4265のＵＶ開始）によって、またはレドックス反応
（例えば、硫酸セリウム（ＩＶ））によって、またはイオン化放射線（例えば、
α線、β線、γ線またはＸ線）によって、またはプラズマ開始（例えば、アルゴ
ン、窒素、酸素）によって、または電流を使用して重合が所定の部位でのみ生じ
る、過塩素酸テトラブチルアンモニウムを使用する電気分解的開始 (Samal, S.
K.; Nayak, B.、J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 1988、21、1035)によって開始
することができる。
【００２１】 「結合部分」とは、基体表面に対する生体分子の結合を生じさせる際に利用さ
れるいずれの化学基をも一般に意味する。結合部分は、生体分子表面に含有させ
ることができるか、または基体表面に含有させることができる。表１（結合部分
）に、使用した結合部分のリストを掲載する。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】 記号：Ｘ＝生体分子または基体／固体支持体；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３＝別途示さ
れない限り、有機炭素基。
【００２６】 「ルイス塩基」とは、電子対を電子不足中心に供与することができるいずれの
化学基をも一般に意味する。「親電子物」とは、一般に、好ましい実施形態にお
いて、ルイス塩基は、当業者によって認識されているように、反応中心が電子対
を炭素に供与し、これにより反応中心と炭素との間に共有結合を生じさせる「求
核種」として、より具体的に呼ばれる（拡大された定義については、Smith, M.B
.、Organic Synthesis (著作権:1994年、McGraw Hill Inc.、New York、NY)またはい
ずれかの有機化学教本を参照されたい）。
【００２７】 「ルイス酸」とは、電子対を受け取ることができるいずれの電子不足の化学基
を一般に意味する。「求電子種」とは、当業者によって認識されているように、
ルイス酸が炭素である特別な場合が一般に意味される（拡大された定義について
は、Smith, M. B.、Organic Synthesis (著作権:1994年、 McGraw Hill Inc.、 Ne
w York、 NY）またはいずれかの有機化学教本を参照されたい）。好ましい実施形
態において、一例として、サリチルヒドロキサム酸は、フェニルボロン酸のホウ
素（ルイス酸）に電子対を供与するルイス塩基として作用することができ、これ
により非共有結合を生じさせることができる。さらに別の好ましい実施形態にお
いて、一例として、ヒドラジドは、ＮＨＳエステル（求電子種）の反応性の炭素
中心に電子対を供与する求核種として作用することができ、これにより前記炭素
中心に対する共有結合を形成することができる。
【００２８】 「分岐型連結部分」とは、特定の反応基を介して生体分子にカップリングする
ことができ、かつまた別の反応中心を介して２以上の分子に対するさらなる結合
も可能であるいずれの化学種も一般に意味する。好ましい実施形態において、分
岐型連結部分は、表２のエントリー１−４にその例が示されるホスホルアミダイ
トである。これらの例において、リンは反応性成分として作用し、一方、エント
リー１、２および３のエステルならびに４の保護されたアルコールは別の反応中
心である。
【００２９】 「分岐型連結構造」とは、生体分子を分岐型連結部分で処理することから生じ
る生体分子を一般に意味する。この場合には、分岐型連結部分の別の反応中心が
、分岐型連結構造内に含まれる。好ましい実施形態において、一例として、分岐
型連結構造は表２のエントリー５によって表される。表２において、示す生体分
子は、生体分子を分岐型連結部分（具体的には、表２のエントリー４に示す化合
物）で処理した結果である。別の好ましい実施形態において、分岐型連結構造は
均一なシリーズで組み合わせることができる。この場合、生体分子は分岐型連結
部分で修飾され、ついで、得られた分岐型連結構造の別の反応中心を介して同じ
分岐型連結部分によってさらに修飾され、これにより新しい分岐型連結構造が作
製される。分岐型連結部分の一連の連結による、より大きい分岐型連結構造のこ
の構築は、表２のエントリー６−８に示すようにさらに続けることができる。さ
らに別の実施形態において、分岐連結部分は不均一なシリーズで組み合わせるこ
とができる。この場合、生体分子は分岐連結部分で修飾され、ついで、最初の分
岐型連結部分の別の反応中心を介して異なる分岐型連結部分によってさらに修飾
され、これにより新しい分岐型連結構造が作製される。分岐型連結部分の一連の
連結による、より大きい分岐型連結構造のこの構築は、表２のエントリー９−１
２に示すようにさらに続けることができる。
【００３０】
【表４】
【００３１】
【表５】
【００３２】
【表６】
【００３３】
【表７】
【００３４】 「基体」とは、生体分子の複数の反応性結合部分がそれとカップリングし得る
部分をその表面に含むいずれの材料をも一般に意味する。このような基体は、中
でも、スライドガラス、官能基化されたスライドガラス、化学的に活性化された
マイクロチップ表面、反応性分子の単層または多層で覆われた表面、あるいは生
体分子の複数の反応性結合部分がそれと反応し得る部分を有するポリマーで覆わ
れた表面であり得る。好ましい実施形態において、基体の表面は、電子的にアド
レス指定可能なマイクロチップの透過層である。好ましい実施形態において、基
体の官能基、化学的に活性な部分または反応性成分は、表１に列記された官能基
（これらに限定されない）から選択される。
【００３５】 「前駆体」とは、１またはそれを超える化学試薬の処理によって別の反応性部
分に変換することができるいずれの反応性部分をも一般に意味する。好ましい実
施形態において、一例として、１ｄ（表２のエントリー３）の３のエステル部分
は、ヒドラジドに対する前駆体である。それらは、ヒドラジンの処理によってヒ
ドラジド基に変換される。
【００３６】 「保護された」とは、１またはそれを超える試薬を用いて反応性部分の反応性
をブロックし、その一方で、最初の反応性部分に由来する妨害または面倒なこと
を伴うことなく、化学反応を同じ化合物の別の反応部位において行うことができ
ることを一般に意味する。別の反応部位における変換が完了したとき、反応性基
の保護基は除去することができ、これにより反応中心を脱ブロックすることがで
きる。好ましい実施形態において、保護された部分は特定タイプの前駆体である
。さらに別の好ましい実施形態において、一例として、図９Ａの１ａのヒドラジ
ド基はトリチル基で保護する。１ａが生体分子に付加されたとき、トリチル基は
化学的に除去され、ヒドラジド官能基が脱保護される。
【００３７】 「活性化可能な」とは、１またはそれを超える化学試薬で処理した場合に反応
性部分への変換を受けることができるいずれの官能基をも一般に意味する。「活
性化された」とは、反応性部分へのそのような変換を受けている官能基を意味す
る。好ましい実施形態において、活性化可能な部分は、保護された部分または前
駆体であり得る。さらに別の好ましい実施形態において、官能基は一般には、基
体または生体分子に対して良性、非反応性であるか、またはそれに結合すること
ができないと考えられる。１またはそれを超える化学試薬で処理した場合、官能
基は、基体または生体分子に結合することができる部分に変換される。好ましい
実施形態において、一例として、表２のエントリー１−３に掲載する化合物のエ
ステル基は、ヒドラジンでの処理によってヒドラジドに変換される。さらに別の
好ましい実施形態において、一例として、アセタール基を含有する基体は一般に
は非反応性であると考えられる。酸の供給源で処理した場合、アセタールは、ヒ
ドラジドで修飾された生体分子に結合することができるアルデヒドに変換される
。
【００３８】 「マイクロアレイ」とは、決った生体分子を含有する複数の場所の構造配置を
一般に意味する。この場合、そのような個々の場所は１ｍｍ以下の長さ寸法に制
限される。マイクロアレイには、米国特許第5,632,957号（これは参考として本
明細書中に組み込まれる）におけるような「ＡＰＥＸチップ」と呼ばれるアレイ
などの電子的にアドレス指定可能なマイクロアレイが含まれる。
【００３９】 図２は、生体分子が複数の結合部分を介して基体表面に結合している本発明の
スキームに対する基本的な概略図を示す。そのような複数の結合部分は、下記の
方法を使用して生体分子に提供し得る。これらのアプローチはそれぞれ、オリゴ
ヌクレオチドを含む生体分子の標準的な固相合成と適合し得る。
【００４０】 １.複数の結合部位を有するオリゴヌクレオチドの調製 １.１ 分岐するホスホルアミダイトを有するオリゴヌクレオチドの合成： 分岐型ホスホルアミダイトを有する分岐型生体分子（例えば、オリゴヌクレオ
チド）構造は市販されている（Chemgenes, Ashland, MA; Glenn Research, Ster
ling, VA）。そのような分岐するアミダイトを固相オリゴヌクレオチド合成（図
５ＡおよびＢ）において１回以上連続してカップリングした後には、２以上の末
端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドが生成する。枝分かれをオリゴヌ
クレオチドに導入するいずれの他の組み立てブロックも、本発明では、類似する
様式で適用することができる。これらのヒドロキシル基は、生体分子を基体に結
合させるための反応基（すなわち、結合部分）を生じさせるために第二のタイプ
のホスホルアミダイトと反応させることができる。このようなホスホルアミダイ
トは、ビオチンアミダイト（例えば、Glenn Research, カタログ゛番号10595002
）、アミノ修飾剤（例えば、Glenn Research, カタログ番号10190602）、チオー
ル修飾剤（例えば、Glenn Research, カタログ番号10192602）、フェニルボロン
酸アミダイト（Prolinx, Bothell, WA）およびその他などのいくつかの入手可能
なアミダイトから選択し得る。さらに、保護された形態または前駆体形態でヒド
ラジドを含有するホスホルアミダイト（図９Ａ）を使用することができる。結果
は、２またはそれを超える（好ましくは２−８）の反応性基を有するオリゴヌク
レオチドである。
【００４１】 １.２ 結合のために２以上の反応性基を有するシントンの直接的な導入： あるいは、複数の結合部位を有する生体分子は、特別なホスホルアミダイトの
カップリングによっても得ることができる。このようなアミダイトは、基体にお
ける固定化のための２以上の反応性基に由来する保護された形態または前駆体で
含まれ得る。分岐型アミダイトにおける反応性基は、再度ではあるが、アミノ基
、チオール、アルデヒドまたはヒドラジドなどの公知の官能基の１であり得る。
そのようなアミダイトの例を図６Ａ−Ｃに示す。
【００４２】 １.３ 組合せアプローチ： 複数の反応性基を有する生体分子を合成するための第３のアプローチは、分岐
するアミダイトと、複数の反応性部位を有するアミダイトとをカップリングする
ことの組合せである（図８Ａ−Ｃ）。
【００４３】 特に好ましい実施形態において、共有結合を介して基体表面に結合させるため
につながれたヒドラジドを有する生体分子が提供される。この実施形態において
、ＮＨＳおよびスルホ−ＮＨＳおよび他の部分を、基体またはいずれの他のタイ
プの生体分子を活性化し、および生体分子にまたはさらには固体表面にカップリ
ングする手段として使用することができる。本発明の適用において、そのような
結合は、生体分子の結合を行うことができる新規な手段を提供し、そして電子的
マイクロチップの電子的なアドレス指定に伴う極端な反応条件によって生じるつ
ながれた生体分子への損傷に対する耐性を提供する。したがって、本発明のヒド
ラジド化学および多結合スキームは、電子的システムの環境における残存性に対
する要求を満たす。そのような要求には、生体分子の水溶性、固定化する基体に
おける生体分子およびそのカップリング対の水に対する安定性、ならびに約ｐＨ
４のｐＨに対する機能性が含まれる。
【００４４】 本発明においてヒドラジド結合部分を付加し、利用する方法を下記の実施例に
提供する。これらの実施例は、オリゴヌクレオチドを含む生体分子の部位特異的
な共有結合を示している。この場合、結合は、電子的にアドレス指定可能なマイ
クロアレイの上方のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）修飾ポリアクリ
ルアミド透過層へのヒドラジド修飾オリゴの電子的濃縮によって達成される。オ
リゴマーのヒドラジド部分はＮＨＳエステルに置換わって、ビスヒドラジド結合
を形成する。したがって、これらの実施例により、以下のことが示される：１.
）実施例１に示すような新規なヒドラジドホスホルアミダイト（例えば、化合物
１）の合成（図９）および標準的な合成手法を使用してこのようなアミダイトを
合成オリゴマーに首尾よく取り込ませること；２）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルで修飾された透過層の調製；
ならびに３）活性化されたモノマーが上部層にだけ取り込まれた電子的にアドレ
ス指定可能なマイクロアレイの上方の２層型透過層。
【００４５】 別段指摘しない限り、すべての反応は磁気攪拌した。試薬はAldrich Chemical
Company (Milwaukee, WI)から分析等級で入手し、溶媒はRiedelから入手した。
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（Merck、２３０−４００メッシ
ュ）を使用して行う。融点は未補正である。ＩＲスペクトルは、Graseby Specac
10500ＡＴＲユニットを備えたPerkin Elmer Paragon 1000FT-IRで測定する。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX400分光計を用いて、４００ＭＨｚで、１
３Ｃスペクトルは１００ＭＨｚで測定し、そして３１Ｐは１６２ＭＨｚで測定す
る。１Ｈのケミカルシフトは、ＴＭＳを内部標準として使用するδの単位で報告
し、そしてカップリング定数はＨｚ単位で報告する。ＥＳＩ質量スペクトルは負
イオン化モードでFinnigan LCQ装置に記録する。
【００４６】 実施例１ 実験１.１ Ｎ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキシカプロン酸ヒドラジド
の合成（化合物５、図９Ａ）： ６.２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のトリチルヒドラジン塩酸塩（３ａ）を含む２００
ｍｌのＴＨＦの溶液に、２.２２ｇ（２２ｍｍｏｌ、１.１当量）のトリエチルア
ミンを加えた。溶液を室温（ｒｔ）で１５分間攪拌し、ろ過し、濃縮して、化合
物３を得た。次いで、これを２.２９ｇ（２０ｍｍｏｌ、１当量）のε−カプロ
ラクトン（化合物４）で処理した。混合物を６５℃に５時間加熱し、そしてｒｔ
に１８時間冷却した。沈殿を集め、酢酸エチルから再結晶化させて、３.５５ｇ
（４５％）の白色粉末（化合物５）を得た： １Ｈ−ＮＭＲ ７.４９−７.４７（ｍ、５Ｈ）、７.３５−７.１０（ｍ、１０
Ｈ）、６.５５（ｄ、Ｊ＝７.５２、１Ｈ）、５.５５（ｄ、Ｊ＝７.２５、１Ｈ）
、３.５４（ｔ、Ｊ＝６.４５、２Ｈ）、１.８７（ｔ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、１
.６２（ｂｓ、１Ｈ）、１.５７−１.３４（ｍ、４Ｈ）、１.２７−１.１１（ｍ
、２Ｈ）。
【００４７】 実験１.２ ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフ
ァニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドの合成（化合物１ａ、図９
Ａ） ｒｔにて３.０ｇ（７.７ｍｍｏｌ）のＮ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキ
シカプロン酸ヒドラジド（化合物５）を含む５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンの溶
液に、４.０ｇ（３１ｍｍｏｌ、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンお
よび２.０１ｇ（８.５ｍｍｏｌ、１.１当量）のクロロ（ジイソプロピルアミノ
）−β−シアノエトキシホスフィン（化合物６）を１５分にわたって徐々に加え
た。添加が終了すると、反応物を１時間攪拌し、濃縮し、クロマトグラフィー処
理（０.２％トリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２／３））し
て、３.１９ｇ（７０％）の１ａを淡黄色フォームとして得た。 １Ｈ−ＮＭＲ：７.４９−７.４６（ｍ、５Ｈ）、７.３４−７.２０（ｍ、１０
Ｈ）、６.５７（ｄ、Ｊ＝７.２、１Ｈ）、５.５７（ｄ、Ｊ＝７.５、１Ｈ）、３
.８５−３.７４（ｍ、２Ｈ）、３.６２−３.４８（ｍ、４Ｈ）、２.６２−２.５
９（ｍ、２Ｈ）、１.８８−１.８４（ｍ、２Ｈ）、１.５３−１.３３（ｍ、４Ｈ
）、１.２７−１.１３（ｍ、１４Ｈ）； ３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４７.９７。
【００４８】 実験１.３ ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフ
ァニルオキシ］ヘキサン酸エチルの合成（化合物１ｂ、図９Ｂ、スキーム２） ｒｔにて１.６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の６−ヒドロキシヘキサン酸エチル（化
合物７）を含む３０ｍｌのジクロロメタンの溶液に、５.１７ｇ（４０ｍｍｏｌ
、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび２.６ｇ（１１ｍｍｏｌ、
１.１当量）の化合物６を１５分かけて徐々に加えた。添加が終了すると、反応
物をさらに１５分間攪拌し、濃縮し、クロマトグラフィー処理（０.２％トリエ
チルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１／４））して、２.４７ｇ（６
９％）の化合物１ｂを透明なオイルとして得た： １Ｈ−ＮＭＲ ４.１２（ｑ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、３.９０−３.７７（ｍ、
２Ｈ）、３.７５−３.５５（ｍ、４Ｈ）、２.６４（ｔ、Ｊ＝６.４４、２Ｈ）、
２.３０（ｔ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、１.６９−１.５９（ｍ、４Ｈ）、１.４４
−１.３４（ｍ、２Ｈ）、１.２５（ｔ、Ｊ＝７.２５、３Ｈ）、１.２０−１.１
２（ｍ、１２Ｈ）； ３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４８.０１。
【００４９】 実験１.４ エステルホスホルアミダイト：５−｛［（２−シアノエトキシ）
（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル
の調製（化合物１ｃ、図６Ｂ） ＲＴにて１.２９ｇ（５ｍｍｏｌ）の５−（ヒドロキシメチル）イソフタル酸
ジエチル［２５２.２７］（９８％、Aldrich；CAS181425-91-2）を含む２０ｍｌ
の乾燥ジクロロメタンの溶液に、攪拌下で、２.５９ｇ（４０ｍｍｏｌ、４当量
）のＮ−エチルジイソプロピルアミン［１２９.２５］および１.３ｇ（１１ｍｍ
ｏｌ、１.１当量）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロ−ホ
スホルアミダイト［２３６.６８］（Aldrich；CAS89992-70-1）を１５分かけて
加えた。混合物を濃縮して、３０ｍＬの酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）を
用いて塩を沈殿させた。塩酸塩の沈殿をろ過し、ろ液を濃縮して、クロマトグラ
フィーカラムに直接加えた。数滴のトリエチルアミンを含有する酢酸エチル／ｎ
−ヘプタン（１：４）を用いて溶出されたことにより、１.６ｇ（７０％）の１
ｃを無色のオイルとして得た。 Ｃ２２Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｐ； １Ｈ−ＮＭＲ ８.５９（ｍ、１Ｈ、芳香族）、８.２１（ｍ、２Ｈ、芳香族）
、４.８７−４.７５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２、シアノエチル）、４.４１（ｑ、Ｊ＝
６.９８Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ２、エチル）、３.９５−３.８０（ｍ、２Ｈ、２ｘＣ
Ｈ Ｉ−Ｐｒ）、３.７４−３.６１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２、シアノエチル）、２.
６６（ｔ、Ｊ（Ｐ，Ｈ）＝６.４５Ｈｚ、２Ｈ、Ｏ−ＣＨ２−芳香族）、１.４１
（ｔ、Ｊ＝６Ｈ、２ｘＣＨ３、エチル）、１.２３−１.２０（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ ３ 、Ｉ−Ｐｒ）； ３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４９.９４； １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６５.８（Ｃ＝Ｏ）、１４０.２（Ｃ−
ＣＨ２−Ｏ−Ｐ）、１３２.１（２ｘＣ、芳香族）、１３１.１（２ｘＣ−Ｈ、芳
香族）、１２９.７（ＣＨ、芳香族）、１１７.６（ＣＮ）、６４.７（Ｐ−Ｏ−
ＣＨ２−芳香族）、６１.４（２ｘＣＨ２、エチル）、５８.６（Ｏ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＮ）、４３.４（２ｘＣ−Ｈ、Ｉ−Ｐｒ）、２４.７（４ｘＣＨ３、Ｉ−
Ｐｒ）、２０.５（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）、１４.４（ＣＨ３、エチル）； ＨＲＭＳ ４５３.２１５６（［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２２Ｈ３４Ｎ２Ｏ６Ｐ（計算
値）：４５３.２１５４５）。
【００５０】 実験１.５ ３.３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルア
ミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エ
トキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチ
ルの合成（化合物１ｄ、図８Ｂ） ＲＴにて３００ｍｇ（０.７６０ｍｍｏｌ）のトリス−２，２，２−｛［（メ
トキシカルボニル）エトキシ］メチル｝エタノール（ＣＡＳ１６９７４４−２８
−９；(Coutts, S.; Jones, D.S.; Livingston, D.A.; Yu, L.: 1995、化学的規
定される非ポリマー原子価プラットホーム分子およびその結合体、欧州特許公開
EP0642798A2）を含む２ｍｌの乾燥ジクロロメタンの溶液に、１Ｈ−テトラゾー
ルの乾燥アセトニトリルの０.４Ｍ溶液（固相ＤＮＡ合成に由来する標準的な活
性化剤溶液）の２滴および２７４ｍｇ（０.９１ｍｍｏｌ、１.１当量）の２−シ
アノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（
Aldrich；CAS102691-36-1）を加え、そして出発物質が完全に消費されたことが
ＴＬＣにより示されるまでＲＴで攪拌する（３時間）。溶媒を真空下で除き、残
渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。数滴のトリエチルアミン
を含有する酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）を用いて溶出されたことにより
、２４０ｍｇ（５３％）の１ｄを無色のオイルとして得た。 Ｃ２６Ｈ４７Ｎ２Ｏ１１Ｐ； １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３.８８−３.７１（ｍ、２Ｈ、Ｃ−Ｈ）、３.
６８（ｓ、９Ｈ、ＣＨ３エステル）、３.６５（ｔ、Ｊ＝６.４５、６Ｈ、３ｘＣ
Ｈ２−Ｏ）、３.６２−３.４７（ｍ、４Ｈ、２ｘＣＨ２）、３.３６（ｓ、６Ｈ
、３ｘＣ−ＣＨ２−Ｏ）、２.６３（ｔ、Ｊ＝７.２５Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ−ＣＨ２−
Ｏ−Ｐ）、２.５４（ｔ、Ｊ＝６.４５Ｈｚ、６Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯＲ）、１.
１９−１.１６（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ３ｉＰｒ）； ３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４８.６； ＨＲＭＳ：５９５.２９９９（［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２６Ｈ４８Ｎ２Ｏ１１Ｐ（計
算値）：５９５.２９９５７）。
【００５１】 実験１.６ トリチルで保護されたヒドラジドアミダイトを有するオリゴヌク
レオチドの合成（例えば、化合物１；図１７Ａも参照されたい）： オリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成機において固相ホスホル
アミダイト法を使用して合成した。保護されたヒドラジドを有するホスホルアミ
ダイトを、アセトニトリル中の０.１Ｍ溶液として加え、そして標準的な活性化
試薬およびカップリング時間を使用して配列内の所望の場所にカップリングした
。
【００５２】 ＣＰＧ結合オリゴ（１ｍｍｏｌ）を１.５ｍｌの試験管に入れ、２.０ｍｌの濃
ＮＨ４ＯＨで処理した。５５℃で２時間後、アンモニア溶液を取り出し、減圧下
で蒸発乾固した。残渣を１ｍｌの水に溶解して、０.４５μｍのシリンジフィル
ターでろ過した。トリチルで保護されたヒドラジドオリゴを、緩衝液Ａとして０
.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂ
として緩衝液Ａに中の７５％アセトニトリルを使用して、Merck LiChrospher RP
18（１０μＭ）カラム（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取
用：１０ｘ２５０、流速＝３.０ｍＬ／分）を使用する逆相ＨＰＬＣによって精
製した。１００分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエントを分析用分離および分
取用分離のために使用した。トリチル−オン生成物を含有する画分をまとめて、
蒸発乾固した。
【００５３】 トリチル保護基を除去するために、オリゴをＲＴにおいて８０％酢酸で３０分
間処理した。酸を真空下で除き、残渣を水に溶解し、その後、酢酸エチルで２回
抽出した。水層を再び乾固して、再度溶解した。分析用ＨＰＬＣにより、通常、
単一の生成物（場合により、二重ピークとして）が示され、これは、精製するこ
となくさらなる反応に用いることができる。あるいは、ＨＰＬＣによる精製を、
上記に記載した溶媒系を使用して行うこともできる。
【００５４】 実験１.７ 前駆体形態を含有するホスホルアミダイト（例えば、化合物１ｂ
などのエステル、図９Ｂ、スキーム２；図１７Ｂも参照されたい）を使用するオ
リゴヌクレオチドのヒドラジド官能基合成のイン・サイチュ生成： オリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成機において固相ホスホル
アミダイト法を使用して合成した。ヒドラジドの前駆体形態を有するホスホルア
ミダイトは、アセトニトリル中の０.１Ｍ溶液として加え、そして標準的な活性
化試薬およびカップリング時間を使用して配列内の所望の位置にカップリングさ
せた。ヒドラジド前駆体だけでなく、酸に不安定な保護基で標識したヒドロキシ
ル基を含有するホスホルアミダイトの使用により、オリゴヌクレオチドのいずれ
の位置にもヒドラジドの導入が可能になる。これは、ヒドラジドの前駆体形態が
オリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定であり、その一方で、ヒドラジンと
のインキュベーションが行われるまでは、反応性のヒドラジドが形成されないか
らである。
【００５５】 ＣＰＧ結合オリゴ（１ｍｍｏｌ）を、５０ｍｇのジエチルアミンを含む３.５
ｍＬのジクロロメタン溶液で処理した。（遮光して）一晩インキュベーションし
た後、上清を除き、支持体に結合したオリゴをジクロロメタンで数回洗浄し、真
空下で乾燥した。
【００５６】 ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の切断、オリゴの５’末端におけ
るエステルのヒドラジドへの変換、ならびにオリゴの支持体からの切断（図１７
Ｂ）のために、結合したオリゴを有するＣＰＧを１ｍｌの２４％ヒドラジン水和
物で処理した。４℃における一定の攪拌のもとで１８時間後に反応が完了した。
ヒドラジン溶液からのオリゴの単離は逆相抽出（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋまたは
ＨＰＬＣ）によって達成することができる。
【００５７】 Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（０.５ｇ、Waters、No.20515）を、１０
ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、その後、１０ｍｌの０.１Ｍ重炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＴＥＡＢ）で濯ぐことによって活性化した
。ヒドラジン溶液を５倍容量のＴＥＡＢで希釈して、カートリッジに加えた。オ
リゴをＳｅｐ−Ｐａｋカラムに結合させた後、残留するヒドラジンを１０ｍｌの
ＴＥＡＢで洗い流した。その後、オリゴを、ＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２
）を用いてカラムから溶出した。オリゴを含有する画分をまとめ、蒸発乾固させ
た。生成物のＲＰ−ＨＰＬＣによる特徴付けおよび精製については、プロトコー
ル１に記載したのと同じ条件を適用することができる。
【００５８】 他の例が下記に示されるが、オリゴマーは、本発明の複数の結合部分に連結さ
せるために処理される。オリゴは、本開示におけるそのそれぞれの説明の順に番
号が付けられている。
【００５９】 実施例２： 実験２.１ 非分岐型オリゴヌクレオチドの合成 ２.１.１ オリゴ９：ヒドラジド−１５マー（１−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｔ
ＴＴ ＴＴＴ−３’） 合成および脱保護をアミダイト化合物１ａに関して記載したごとく行った。ト
リチル−オン生成物は、記載された条件のもとでは４２.２分に溶出された。オ
リゴ９は２５.６分に溶出された（二重ピーク）。 ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：４７０９.１５、実測値：４７０９.５
。
【００６０】 ２.１.２ オリゴ１０：ヒドラジド−１９マー（１−ｄＧＡ ＴＧＡ ＧＣＡ
ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＧＧ−３’） 合成および脱保護は、アミダイト化合物１ａに関して記載したように行った。
トリチル−オン生成物は、記載された条件のもとでは４１.５分に溶出された。
オリゴ１０は２５.１分に溶出された（単一ピーク）。 ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：６０９２、実測値：６０９２。
【００６１】 ２.１.３ ヒドラジドのイン・サイチュ生成（オリゴ１１：ヒドラジド−１９
マー（８−ｄＧＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＧＧ−Ｃｙ３’）） オリゴヌクレオチドの合成は以前に記載したように行った。Ｃｙ３色素が負荷
されたＣＰＧ支持体を使用して、発蛍光団をオリゴの３’末端に標識した。ＣＰ
Ｇ結合オリゴを上記の実施例１（Ｅ）に概略したように処理し、生成物をＲＰ−
ＨＰＬＣによって精製した。ヒドラジドオリゴは、実施例１（Ｄ）に記載したＨ
ＰＬＣ条件のもとでは３１.８分に溶出された。 ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：６５９９.７、実測値：６５９８±２
。
【００６２】 実験２.２ 分岐しているオリゴヌクレオチドの合成 複数のヒドラジドをオリゴヌクレオチドに導入するために、分岐しているホス
ホルアミダイト（ヒドラジドに変換される２以上のエステル基を有するホスホル
アミダイト）を、両方のアプローチの組合せと同様に使用した。この柔軟な方法
により、１個から数個（約４０）までの規定された数のヒドラジドを有するオリ
ゴヌクレオチドの合成が可能になる。本実施例におけるこれらの実験は、ｐ−Ｒ
ＮＡを使用して記載されているが、ＤＮＡなどの他のオリゴヌクレオチドにも適
用することができる。
【００６３】 実験２.２.１ ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成 ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、下記の例外および改変を用いて、Mi
culka, C.; Windhab, N.; Brandstetter, T.; Burdinski, G.、ＰＣＴ国際特許出
願公開WO99/15540 (1999)に記載したごとく行った：ペンタピラノシルヌクレオ
シドのホスホルアミダイトをＫＯＨ上で真空下にて乾燥し、そして乾燥アセトニ
トリルに溶解して０.１Ｍ溶液を得た。この溶液を、新たに活性化したモレキュ
ラーシーブ（３Å）で３時間乾燥し、その後、PE Biosystems Expedite 8905 Ｄ
ＮＡ合成機上の固相オリゴヌクレオチド合成のために適用した。他のホスホルア
ミダイトは乾燥アセトニトリルに０.１Ｍで溶解し、そしてさらに処理すること
なく使用した。モノメトキシトリチルで保護されたＣｙ３（CAS:182873-80-9、A
P-Biotech、Freiburg、ドイツ）が負荷された支持体特注品のＣＰＧの２’末端
にＣｙ３色素を有するｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドについては、乾燥アセトニ
トリル中の無水ピリジニウム塩酸塩の０.１Ｍ溶液を活性化剤として使用した。
ペントピラノシルヌクレオシドに対する脱トリチル化時間は１０分に増大され、
カップリング時間は２５分に増大した。すべての他の試薬および溶液ならびに手
法は装置製造業者の推奨に従った。
【００６４】 実験２.２.２ ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護： β−シアノエチル保護基を切断するために、オリゴヌクレオチドをジクロロメ
タン中のジエチルアミンの１.５％（ｗ／ｖ）溶液を用いて（遮光して）ＲＴで
一晩処理した。上清を除き、支持体に結合したオリゴヌクレオチドをジクロロメ
タンで数回洗浄して真空乾燥した。
【００６５】 ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の切断、オリゴの５’末端におけ
るエステルのヒドラジドへの変換、ならびにオリゴの支持体からの切断のために
、結合したオリゴを有するＣＰＧを１ｍｌの２４％ヒドラジン水和物で処理した
。４℃における一定の攪拌のもとで１８時間後に反応が完了した。ヒドラジン溶
液からのオリゴの単離は逆相抽出（例えば、Ｓｅｐ−ＰａｋまたはＨＰＬＣ）に
よって達成することができる。
【００６６】 Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（０.５ｇ、Waters、No.20515）を、１０
ｍｌのアセトニトリル、その後、１０ｍｌの０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＴＥＡＢ）で濯ぐことによって活性化した。ヒドラ
ジン溶液を５倍容量のＴＥＡＢで希釈して、カートリッジに加えた。オリゴをＳ
ｅｐ−Ｐａｋカラムに結合させた後に、残留するヒドラジンを１０ｍｌのＴＥＡ
Ｂで洗い流した。その後、オリゴを、ＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２）を用
いてカラムから溶出した。オリゴを含有する画分をまとめて、蒸発乾固させた。
生成物の特徴付けおよび精製は、緩衝液Ａとして０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモ
ニウム（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中の７５％
アセトニトリルを使用して、Merck LiChrospher RP18（１０μＭ）カラム（分析
用：４ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取用：１０ｘ２５０、流速＝３.
０ｍＬ／分）を使用する逆相ＨＰＬＣによって行った。１００分間の０％Ｂ−１
００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法Ａ）または３０分間の０％Ｂ−１００％Ｂ
のグラジエント（ＨＰＬＣ法Ｂ）を分析用分離および分取用分離のために使用し
た。
【００６７】 Ａ.オリゴ１２：１のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−
ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ１）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｂに関して記載したごとく行った。
【００６８】 Ｂ.オリゴ１３：３のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−
ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ３）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｄに関して記載したごとく行った。
生成物は、記載された条件のもとでは３７.９分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）
。 ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：３５１６.６、実測値：３５１５。
【００６９】 Ｃ.オリゴ１４：４のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−
ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−
２’ 合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clonte
ch、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行っ
た。生成物は、記載された条件のもとでは３７.３分に溶出された（ＨＰＬＣ法
Ａ）。 ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：分子量の計算値：３７８４.７、実測値：３７８４
。
【００７０】 Ｄ.オリゴ１５：８のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−
ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ
（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clonte
ch、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行っ
た。生成物は、記載された条件のもとでは３６.９分に溶出された（ＨＰＬＣ法
Ａ）。 ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：分子量の計算値：４６６１.１、実測値：４４６４
。
【００７１】 Ｅ.オリゴ１６：スペーサーおよび８のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−Ｒ
ＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）（
Ｓ１８）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clonte
ch、No.5252-2）およびスペーサー１８（Ｓ１８、Glen research、No.10-1918-0
2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は
、記載された条件のもとでは３８.７分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００７２】 Ｆ.オリゴ１７：１６のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ
−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）８（ＳＢＡ）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡ
Ｇ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clonte
ch、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行っ
た。生成物は、記載された条件のもとでは３８.７分に溶出された（ＨＰＬＣ法
Ａ）。
【００７３】 Ｇ.オリゴ１８：４のヒドラジドを有するｐ−ＲＮＡオリゴ（Ｃｙ３色素なし
）：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ−２
’ 合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。
生成物は、記載された条件のもとでは１２.７５分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ｂ
）。 ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：３２７５.１、実測値：３２７５.４。
【００７４】 実験２.３ ヒドラジドオリゴヌクレオチドをボロン酸オリゴヌクレオチドに
変換するための一般的手法 ５０ｎｍｏｌのヒドラジドオリゴヌクレオチドを２００μＬの１０ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解し、１のヒドラジド当り１５当量の４−
ホルミルフェニルボロン酸（Aldrich、No.C43,196-6；CAS:87199-17-5）を加え
た。４のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチドについては、例えば、ＤＭＳ
Ｏ中の４−ホルミルフェニルボロン酸の０.１Ｍ溶液の３０μＬ（３μｍｏｌ）
を使用した。混合物をＲＴで１時間インキュベーションし、４−ホルミルフェニ
ルボロン酸当り２０当量のＮａＣＮＢＨ３を加えて、インキュベーションをＲＴ
でさらに１時間続けた。例えば、４のヒドラジドを有するオリゴヌクレオチドの
場合には、１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）中のＮａＣＮＢＨ３
の１Ｍ溶液（６.３ｍｇを１ｍＬに溶解した）の１５０μＬ（１５０μｍｏｌ）
が必要であった。
【００７５】 過剰な４−ホルミルフェニルボロン酸およびシアノホウ水素化ナトリウムの除
去は、ＨＰＬＣ、ゲルろ過（Pharmacia PD10 column）または固相抽出（Merck L
iChrolute column）によって除去した。ボロン酸で修飾されたオリゴヌクレオチ
ドの場合、エンドキャップ処理したＨＰＬＣカラムを使用することが重要である
。典型的な条件としては、緩衝液Ａとして０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム
（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中の７５％アセト
ニトリルを使用する、５μｍのPhenomenex Lunaフェニルヘキシルカラム（分析
用：４.６ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取用：１０ｘ２５０、流速＝
３.０ｍｌ／分）とした。１００分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（Ｈ
ＰＬＣ法Ａ）または３０分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法
Ｂ）が分析用分離および分取用分離のために使用した。生成物を含有する画分を
まとめ、蒸発乾固させた。
【００７６】 Ａ.オリゴ１９：１のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ
４’−（ＰＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１２を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７７】 Ｂ.オリゴ２０：３のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ
４’−（ＰＢＡ）３ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１３を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７８】 Ｃ.オリゴ２１：４のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ
４’−（ＰＢＡ）４（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１４を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７９】 Ｄ.オリゴ２２：８のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ
４’−（ＰＢＡ）８（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２
’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１５を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとで
は４６.３分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００８０】 Ｅ.オリゴ２３：スペーサー１８および８のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリ
ゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）８（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣ
Ａ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１６を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００８１】 Ｆ.オリゴ２４：１６のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリ
ゴ４’−（ＰＢＡ）１６（ＳＢＡ）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ Ｔ
Ｔ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１７を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとで
は４９.０分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００８２】 Ｇ.オリゴ２５：１のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ
４’−（ＰＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’ 合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１８を使用して一般
的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００８３】 実施例３：ＨＰＬＣ分析： ヒドラジドオリゴの合成が完了したら、最初の１組の実験により、ヒドラジド
で標識されたオリゴとＮＨＳエステルまたはスルホ−ＮＨＳエステルとの溶液反
応速度論を調べた。５μＬの１３２μＭヒドラジドＡＴＡ５を含む３０μＬの５
０ｍＭヒスチジン溶液に、１０ｍＭのＮＨＳアクリラートの５μＬを加えた。溶
液をＲＴで短時間攪拌し、その後、ＨＰＬＣシステムに注入した。溶液中の化合
物のＨＰＬＣ軌跡は、所与の反応時間について反応混合物中に存在するヒドラジ
ドＡＴＡ５およびＮ’アクリロ−ＡＴＡ５ジヒドラジドの量を示した。出発物質
のＡＴＡ５ヒドラジドおよび修飾されたＡＴＡ５ヒドラジドの保持時間は異なり
、分離可能であった。
【００８４】 図１０Ａ−Ｃに、反応混合物の３の異なる軌跡をが示す。最初の軌跡（Ａ）は
未修飾のＡＴＡ５ヒドラジド（Ａ）から得られたが、３番目の軌跡（Ｃ）は、Ｎ
ＨＳアクリラートとの５分の反応時間の後における完全に修飾されたＡＴＡ５ヒ
ドラジド（Ｂ）を表している。中央の軌跡（Ｂ）は、反応物中に１分で捕捉され
た不完全な修飾体を表している。ＡＴＡ５ヒドラジドがほぼ消費されたことを考
えれば、１２００Ｍ−１ｓ−１の擬一次反応速度が決定される。
【００８５】 この速度と利用した他の結合システムとの比較を図１１に示す。水性環境にお
けるヒドラジドとＮＨＳエステルに対する反応速度は、非常に優れた効率的な反
応を表している。さらに、ヒドラジド修飾のｐＨ依存性を明らかにするために、
反応のｐＨを変化させた。実験は、ｐＨ＝６、５.５、５.０、４.５および４に
ＨＣｌで調節した５０ｍＭヒスチジンの緩衝化系を用いて行った。この変換は、
ｐＨ＝４.５まで下げ続けた。しかし、ｐＨ＝４では、ヒドラジドオリゴは影響
を受けず、変換が起こらなかった。したがって、ｐＨの下限は約４.５である。
【００８６】 実施例４：チップの調製： マイクロアレイを含有するチップをアルゴン下で５分間プラズマ洗浄した。そ
の後、２５部位を有する１ｃｍｘ１ｃｍのチップを、気相蒸着を使用してシラン
化した。マイクロアレイの中心に、０.３％のDaracur4265をＵＶ開始剤として含
む１：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中の９：１（モル比）のアクリルアミド／ビスアク
リルアミドの２０％（重量比）溶液の０.１０μＬを加えた。チップは、一辺が
３.ｍｍの正方形の４ｕＭのくぼみを含むマイクロアレイ部位がＵＶウインドに
押し付けられたマイクロ反応成形システムに入れた。溶液は、ＵＶ光を２０秒間
照射され、そして成形システムから取り出し、水で濯ぎ、空気乾燥した。ウエル
には、正方形のヒドロゲル層がマイクロアレイを覆って形成された。鋳型の限界
を超える過度な重合物は除いた。
【００８７】 存在する透過層に、２０％（重量比）のモノマー濃度のＮＨＳまたはスルホ−
ＮＨＳ／Ａｍ／Ｂｉｓ（１０／８３／７のモル比）を含有する溶液の０.８０μ
Ｌを加えて、存在するポリマーを１分間飽和させた。チップをマイクロ反応成形
システムに置き、直径が４.６ｍｍでウエルの深さが５μＭである円形鋳型を用
いて上記のように重合した。この第２の鋳型は、存在する正方形の層を完全に含
み、それよりも外側に広がる。第２の層の結合は、ポリマー鎖およびバインドシ
ランのインターカレーションによって達成される。チップは水で洗浄し、圧縮空
気で乾燥し、続いて下記の実験で試験した。
【００８８】 実験４.１：活性化エステルの濃度；標識された捕捉物のアドレス： ０％、１％、２％および４％のスルホ−ＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で
修飾されたチップに、特異的な標識された捕捉物として５００ヒドラジド−Ｔ１
２−ＢＴＲを電子的に負荷し、その一方で、５０ｍＭｎＭのビオチン−Ｔ１２−
ＢＴＲを非特異的な標識された捕捉物として使用した。すべての溶液は５０ｍＭ
ヒスチジンで緩衝化した。捕捉物は、５００ｎＡ／パッドの電流で１２０秒間、
一度に４パッドでアドレス指定した。それぞれのチップを、１％ＳＤＳ、０.２
ｘＳＴＥで洗浄し、そして１％ＳＤＳで２０分間すすいだ。このチップを１秒間
画像化して、平均ＭＦＩ値を記録した。
【００８９】 図１２において理解され得るように、標識されたヒドラジドオリゴの共有結合
は、透過層中の活性化エステルの量に依存し、その濃度が増大するにしたがって
大きくなった。ビオチン標識されたオリゴの非特異的な結合はまた、極めて低く
、この実験の場合には平均して４０ＭＦＩ／ｓであった。
【００９０】 実験４.２：電子的条件： １０％のＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾され
たチップに、特異的な標識された捕捉物として５００ｎＭおよび５ｎＭのヒドラ
ジド−Ｔ１２−ＢＴＲを電子的に負荷した。５００ｍＭｎＭのビオチン−Ｔ１２
−ＢＴＲを非特異的な標識した捕捉物として使用した。すべての溶液は５０ｍＭ
ヒスチジンで緩衝化した。捕捉物は、４００ｎＡ／パッド、５００ｎＡ／パッド
、６００ｎＡ／パッド、７００ｎＡ／パッドおよび８００ｎＡ／パッドの電流で
１２０秒間、一度に３パッドをアドレス指定した。非特異的な捕捉物は８００ｎ
Ａ／パッドで負荷した。それぞれのチップは、１％ＳＤＳ、０.２ｘＳＴＥで洗
浄し、そして１％ＳＤＳ中に２０分間浸漬した。これらのチップを１秒間画像化
して、平均ＭＦＩ値を記録した。
【００９１】 図１３によって示され得るように、ＮＨＳで修飾された透過層に対する特異的
な捕捉物の結合は６００ｎＡで劇的に増大しているが、スルホ−ＮＨＳで修飾さ
れたヒドロゲルは最大の結合のためにわずかに大きい電流を必要とした（図１４
）。
【００９２】 実験４.３：多結合の効果 １０％のＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、１、２、
４または８のヒドラジド基を含有するＣｙ３標識されたＡＴＡ５オリゴを負荷し
た。これらの４のオリゴマーを、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化された状態で、７
００ｎＡ／パッドまたは８００ｎＡ／パッドのいずれかの電流で１２０秒間、５
００ｎＭで電子的に負荷した。完了後、これらのチップを洗浄して、結合レベル
を測定した。
【００９３】 記録されたＭＦＩ／ｓ値を図１５に示す。等しい電流を与えたオリゴマー当り
の結合に利用し得るヒドラジド基の数を比較すると、オリゴマーに対するヒドラ
ジドが増加するにしたがって結合レベルが増加することが示された。
【００９４】 実験４.４：リバースドットブロットによる電子的ハイブリダイゼーション １５％のＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、特異的な
捕捉物として、Ｃｙ３標識を有するオクタ−ヒドラジドＡＴＡ５オリゴマーを負
荷した。特異的な捕捉物は、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化された状態で、６００
ｎＡ／パッドまたは７００ｎＡ／パッドのいずれかの電流で１２０秒間、５００
ｎＭで電子的に負荷した。電子的ハイブリダイゼーションを、特異的な標的とし
て５ｎＭのＲＣＡ５−Ｔ１２−Ｃｙ５を用いて行い、一方、５ｎＭのＲＣＡ４−
Ｃｙ５の溶液を非特異的な標的として使用した。標的は４００ｎＡ／パッドで６
０秒間負荷された。これらのチップを、標準的なプロトコールにしたがって洗浄
し、そして画像化した。
【００９５】 図１６に示されるデータは、特異的な標的のハイブリダイゼーションが非特異
的な標的に対して優先することを明確に示している。上記に報告されたデータと
一致して、捕捉物の電子的負荷について、電流を６００ｎＡから７００ｎＡに増
大することにより、ハイブリダイゼーションの増大が生じていることにもまた留
意しなければならない。
【００９６】 実施例５：非共有結合部分を有する生体分子の合成 図４ならびに図５Ａおよび図５Ｂは、複数の結合部分を含むオリゴヌクレオチ
ドの合成を示している。図４には、２のＰＢＡを含有する単一の分岐型ホスホル
アミダイトを付加するオリゴ合成が示されている。図５Ａおよび図５Ｂはそれぞ
れ、４のＰＢＡを有する２の枝分かれ、および８のＰＢＡを有する３の枝分かれ
を示している。示されるような合成はＡＢＩ３９４ ＤＮＡ合成機で行った。分
岐型ホスホルアミダイトの逐次カップリング収率は、通常のヌクレオチドホスホ
ルアミダイトと類似し、約９６％−９８％であった。ＰＢＡホスホルアミダイト
は最終工程で加えた。オリゴヌクレオチドの固体支持体からの切断および保護基
の除去は、当業者に十分に知られているような通常のオリゴヌクレオチドの取扱
いと同じであった。
【００９７】 ＰＢＡを含有する分岐型オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製および分
析した。ＰＢＡ含有オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣは、通常のオリゴヌクレオチ
ドのピークよりも広いピークを示した。
【００９８】 実験５.１：非共有的な結合部分を介する生体分子の電子的負荷 ２０ｎＭの非分岐型および分岐型のＰＢＡ含有ＡＴＡ５捕捉物プローブをヒド
ロゲル基体に電子的に負荷した。捕捉物プローブは、５０ｍＭヒスチジンにおい
て、一度に１０パッド、１２０秒間負荷した。２０ｎＭのＲＣＡ５−ＢＴＲは５
分間受動的に負荷した。基体を洗浄し、画像化した。分析は、分岐型および非分
岐型の両方の捕捉物プローブが透過層に所望するように固定化されていることを
示していた。
【００９９】 実験５.２：非共有的な結合部分を介して電子的に負荷された生体分子の安定
性 オリゴ２０、オリゴ２１およびオリゴ２２（３、４および８個のＰＢＡ結合部
位を含むｐ−ＲＮＡ）をＳＨＡで修飾されたヒドロゲルチップに電子的にアドレ
ス指定した。完了したら、最初の像を、前に記載した標準的な洗浄手法の後に記
録した。その後、チップアレイを、１０μＬの５０ｍＭヒスチジンによる洗浄を
繰り返しながら通常の洗浄に供した。像は５回の洗浄の後に記録した。図２１に
示す結果は２の特徴を含む。第１に、オリゴあたりの結合部位の数がより多い、
より高次のデンドリマーについて記録されたシグナルは明らかに大きくなってい
る。また、シグナルは、２５回の洗浄サイクルの期間にわたって極めて安定して
いる。このことは、デンドリマー状の結合システムを使用することの改善された
安定性を例示している。オリゴ２２はその初期シグナルの約１４％を失い、その
一方で、オリゴ２０およびオリゴ２１はそれぞれ２５％および３５％低下してい
た。
【０１００】 実施例６：複数のヒドラゾン形成を介する共有的な結合 以前、単一のアミンまたはヒドラジドで修飾されたオリゴが、アルデヒドで修
飾されたヒドロゲルに電子的に負荷されている。アルデヒドとアミンまたはヒド
ラジドとの相互作用により、それぞれ、イミン（窒素に対する二重結合を有する
炭素）またはヒドラゾンの生成がもたらされる。これらの基は、水性条件のもと
では可逆的であり、安定した不可逆的な共有的な結合を成形させるためには、Ｎ
ａＢＨ３ＣＮによるさらなる還元を必要とする。実際、単一のヒドラジドを含有
するオリゴマーの電子的濃縮により、ヒドラゾンの形成を介したオリゴマーの表
面への結合がもたらされた。還元工程の省略は、容易に加水分解される不安定な
結合をもたらし、結合したオリゴは容易に拡散して散らばった。著しい数のヒド
ラゾンがオリゴあたりに形成されるならば、デンドリマー状のヒドラジドを使用
することにより、さらなる還元を必要としない、少し不安定な結合による共有的
な結合手段が提供される。可逆的なヒドラゾン形成は一部の連結部位において生
じ得るが、他の部位は無傷のままである（図２２）。ヒドラジドは拡散すること
ができず、アルデヒドが多い環境では捕捉され、ヒドラジドが容易に再び形成さ
れ得る。この平衡は、オリゴ当りの結合部位の数が増大するほど有利であり、そ
してすべての結合が一度に加水分解されないならば、安定な結合システムを提供
すると考えられる。アルデヒドが多い透過層は、グリオキシルアガロースの場合
のように直接調製することができるか、またはアセタールで修飾された透過層か
ら得ることができる。後者の場合、アセタール基は、酸の存在下で容易に加水分
解されてアルデヒドをもたらす。アセタールは保護基として作用し、これにより
、活性化が所望されるまで、アルデヒドの機能性が維持される。加水分解は、酸
性溶液に１時間に曝すことによって完了し得るか、または希釈された塩溶液にお
いて緩衝化された状態で穏和な電流に供することができる。後者の方法では、カ
ソードで生成する酸を利用することによる部位特異的な加水分解が得られる。
【０１０１】 実験６.１：グリオキシルアガロースに結合したデンドリマー状ヒドラジドオ
リゴマー 標準的な２５部位チップにグリオキシルアガロース（FMC、Princeton、NJ）をス
ピンコーティングした。１、２、４および８のヒドラジドを含有するヒドラジド
Ｃｙ３標識オリゴ（５００ｎＭ）を、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化した状態で、
それぞれ、２分間、５００ｎＡ／パッドで電子的に負荷した。これらのチップを
、確立された手順にしたがって洗浄し、画像化した。記録されたMＦＩ／ｓ値を
図２３に示す。１または２のヒドラジドを有するオリゴは極めて不安定であり、
そして予想されるように、バックグラウンドのノイズを越える検出可能な蛍光を
ほとんどもたらさなかった。より多くの数のヒドラジドを有するオリゴは安定し
た共有的な結合を形成することができる。
【０１０２】 実験６.２：アセタールで修飾されたヒドロゲルに結合したデンドリマー状の
ヒドラジドオリゴマー：脱保護および共有的な結合 標準的な２５アレイ部位チップを、１５：２：３の比率で、アクリルアミド、
ビスアクリルアミドおよびビニルアセタールから構成される単層ヒドロゲルで修
飾した。選択された部位を５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中で３００ｎＡ／パッドの電
流に対して２分間処理して、アセタール機能性を加水分解し、アルデヒドを露出
させた。オリゴあたり８のヒドラジドを含有するデンドリマー状のヒドラジドオ
リゴマーを、活性化されたパッドおよび活性化されていないパッドに、５０ｍＭ
ヒスチジンに緩衝化された状態で、２分間、５００ｎＡ／パッドで電子的に負荷
した。非特異的なオリゴもまた、アセタール修飾部位およびアルデヒド修飾部位
の両方に電子的に負荷した。標準的な洗浄サイクルの後、これらのチップを画像
化した。記録されたＭＦＩ／ｓデータを図２４に示す。
【０１０３】 図２４に示され得るように、電子的に活性化され、その後、デンドリマー状の
標識オリゴマーが電子的に負荷されたパッドは、最大の蛍光シグナルを示してい
る。興味深いことに、前処理せず、アセタールとして残留しているそのようなパ
ッドはまた、ヒドラジドで修飾されたオリゴマーのいくらかの結合を示している
。おそらくは、オリゴマーを濃縮するために加えられた電流により、ヒスチジン
の緩衝能を局所的に越えるのに十分な酸が生じ、したがって、有意な量のアセタ
ール基を加水分解することができたと考えられる。
【０１０４】 実施例７：基体表面以外の分子に対するヒドラジドオリゴヌクレオチドのカッ
プリング 実験７.１ ヒドラジド−１５マー９とベンジルオキシアセトアルデヒドとの
反応；図１９ １０μｍｏｌのヒドラジドオリゴヌクレオチド９を６０μＬの１０ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解した。１滴のベンジルオキシアセトアル
デヒド（CAS:6065-87-3；Ｃ９Ｈ１０Ｏ２［１５０.１７６０］、Aldrich No.38,
218-3）を加えて、混合物をＲＴで１時間放置する。溶媒および過剰なアルデヒ
ドを真空下で除去し、生成物をＨＰＬＣによって分析した（カラム：Merck LiCh
rospher RP18、１０μＭ、４ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０.１Ｍ酢酸トリエチル
アンモニウム（ｐＨ＝７.０）、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリル
；流速＝１.０ｍＬ／分；グラジエント：１００分でＢを０％から１００％に）
。生成物の保持時間は３０.７分であり、オリゴ９は２５.５分に溶出された。
【０１０５】 実験７.２ オリゴ１０とペプチドとの結合反応、図２０ ４.４ｎｍｏｌのオリゴ１０を６０μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（
ｐＨ４.０）に溶解した。４４ｎｍｏｌ（１０当量）のアンチパイン塩酸塩（CAS
:37682-72-7；Ｃ２７Ｈ４４Ｎ１０Ｏ６・２ＨＣｌ；［６７７.６３０４］；Calb
io No.F178220）を含む１５μＬの緩衝液を加え、ＲＴで３時間攪拌した。中間
生成物をＮａＢＨ３ＣＮ（１００当量）によってＲＴで１時間還元した。生成物
はＨＰＬＣによって単離した（カラム：Merck LiChrospher RP18、１０μＭ、４
ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）
、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリル；流速＝１.０ｍＬ／分；グラ
ジエント：６０分で１０％Ｂから８５％Ｂに）。生成物（オリゴヌクレオチドペ
プチド結合体）の保持時間は１６.５分であり、オリゴ１０は１３.９分に溶出さ
れた。 ＭＳ（ＥＳＩ）：計算値：６６８０.６；実測値：６６７９.６。
【０１０６】 実施例８：スライドガラス表面におけるヒドラジド修飾生体分子の受動的適用 ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチドを市販のスライドガラスに結合さ
せるために、１個から６個のヒドラジドを含有する一連のｐ−ＲＮＡオリゴヌク
レオチドを使用した。オリゴヌクレオチド１２、１３および１４とともに、１ｄ
から調製され、３個および６個のヒドラジドを有するオリゴマーを使用した。ま
た、アミン末端オリゴマー（５’アミノ修飾剤Ｃ６（Glenn Research）を用いて
調製）および修飾を有しないオリゴヌクレオチドが、非特異的なコントロールと
して使用される。すべてのオリゴマーは、２’末端がＣｙ３で標識され、同じヌ
クレオチド配列を保持した。
【０１０７】 実験８.１：Surmodics 3D LinkＴＭアミン結合性スライドガラスへの結合 オリゴヌクレオチドを、１０μＭ−１００ｎＭの範囲の濃度で、ｐＨ＝８.５
の３ＤＬｉｎｋＴＭプリント緩衝液（Surmodics, Inc.、Eden Prairie、Minneso
ta）に溶解した。それぞれの溶液から、０.５μＬをスライドガラスの表面に直
接付け、そして密閉チャンバーにおいて、ＮａＣｌ飽和溶液の上方で一晩、暗所
にて室温でインキュベーションした。その後、スライドガラスを、３ＤＬｉｎｋ ＴＭ ブロッキング緩衝液を用いて５０℃で１５分間処理して、未反応の表面部位
をブロッキングした。スライドガラスを水で２回洗浄し、次いで０.２％ＳＤＳ
を用いて５０℃で３０分間洗浄し、そして最後に水で２回洗浄し、その後、空気
乾燥した。蛍光の検出は、２０秒の積算時間を用いてPharmaciaスキャナーで行
った。像ならびに強度のプロフィルを図２５に示す。
【０１０８】 非特異的なオリゴヌクレオチドは１０μＭで１０ｘ１０３−２５ｘ１０３の相
対ユニットのシグナルをもたらした。シグナルは、強度が、単一のアミノ基を含
有するオリゴヌクレオチドについて測定された強度に匹敵する。これに対して、
ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチドは、３５−４５ｘ１０３蛍光ユニッ
トのはるかに大きい負荷をもたらした。さらに、ヒドラジドで修飾されたオリゴ
ヌクレオチドは、検出下限が５μＭであるアミン修飾オリゴマーと比較した場合
、より大きな蛍光シグナルをより低い濃度で有し、検出限界が１.２５μＭと低
くなった。
【０１０９】 実験８.２：スーパーアルデヒドスライドガラスへの結合 オリゴヌクレオチドを、１０μＭ−１００ｎＭの範囲の濃度でｐＨ＝８.５の
３ＤＬｉｎｋＴＭプリント緩衝液（Surmodics,Inc.、Eden Prairie、Minnesota
）に、またはｐＨ＝４.０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解する。それ
ぞれの溶液から、０.５μＭをスーパーアルデヒドスライドガラス（Telechem In
ternational、Inc.、Sunnyvale、CA）の表面に直接付けて、ｒｔで一晩インキュ
ベーションする。その後、スライドガラスを０.２％ＳＤＳで２回洗浄し、そし
て水で４回洗浄する（それぞれ２分間）。その後、表面を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ
＝７）における０.３％ＮａＢＨ３ＣＮ溶液を用い、そして発泡を抑えるために
１３３ｍＬのエタノールとともに処理した。この後、０.２％ＳＤＳおよび水に
よる１分間の洗浄を３回行った。蛍光の検出を、２０秒の積算時間を用いてPhar
maciaスキャナーで行った。像ならびに強度のプロフィルが図２６に示される。
【０１１０】 図２６において理解され得るように、ｐＨ＝８.５および４.０の両方において
、ヒドラジドオリゴヌクレオチドは、アミン末端オリゴマーと比較して、はるか
に大きいシグナル強度をもたらし、そしてｐＨの変化による影響を受けなかった
。さらに、同じ濃度の場合、ヒドラジドで修飾されたオリゴマーは、アミンで修
飾されたオリゴマーよりもはるかに大きいシグナル強度をもたらす。アミンオリ
ゴヌクレオチドは２.５μＭ未満ではもはや検出することができず、一方、ヒド
ラジドオリゴマーは１.２５μＭもの低い濃度で検出される。
【０１１１】 前記は、本発明の様々な実施形態を例示することを目的とし、本発明を限定す
ることを決して意図するものではない。本発明は特定の修飾に関して記載されて
いるが、その細部は限定として解釈してはならない。様々な均等物、変化および
改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく用いることができること
が明かであり、そしてそのような均等的な実施形態は本発明に包含され得ること
が理解されるからである。すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の
刊行物または特許出願が参考としてに組み込まれるように具体的かつ個々に示さ
れているかのようにそれと同じ程度で参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 平坦な基体にオリゴヌクレオチドを固定化する従来の方法を示す
概略図である。一般には、単一の反応基を、オリゴマーを基体表面に結合させる
ために使用する。
【図２】 本発明の固定化方法の概略図である。この方法では、生体分子は
、基体に対する生体分子の共有的な結合または非共有的な結合に関与し得る複数
の結合部分または結合部分を有する。
【図３】 基体表面に結合させるための複数の反応性成分に結合した核酸鎖
の一例をより詳細に示す図である。この例では、様々な分岐型ホスホルアミダイ
トの化学構造が、生体分子に結合したデンドリマー状構造体を作製するために複
数の様式で付加されている。
【図４】 フェニルボロン酸（ＰＢＡ）の結合部分を含有するデンドリマー
状構造体を有する構造体を製造するための一連の化学工程を示す。
【図５Ａ−Ｂ】 生体分子を基体表面に非共有結合的に結合させるための４
（Ａ）または８（Ｂ）のいずれかの結合部分を有するオリゴヌクレオチド生体分
子を含む化学的構造体を製造するための一連の化学工程を示す。
【図６Ａ−Ｃ】 複数の反応基を有する生体分子を製造するためにホスホル
アミダイトを使用する合成工程を例示する。これらの部分は、オリゴヌクレオチ
ドをヒドラジンで脱保護しているときにヒドラジドに変換されるエステル基を含
有する。
【図７】 基体への共有結合を介して生体分子を固定化する際に使用される
ヒドラジド基の直接的な結合を有する生体分子を含む化学構造体ＡおよびＢを示
す。
【図８Ａ−Ｄ】 複数の結合部分を有する構造体を製造するための化学合成
を示す。（Ａ）では、分岐型ホスホルアミダイトがオリゴヌクレオチドに付加さ
れ、これはさらに二官能性ホスホルアミダイトで修飾され、その後、ジエチルア
ミン／ＣＨ２Ｃｌ２およびヒドラジンで脱保護され、基体と結合するための４の
ヒドラジド基を有する結合部分が作製される。（Ｂ）では、（Ａ）に類似する反
応スキームが提供され、６のヒドラジド結合部分が得られる。（Ｃ）では、２の
異なる分岐型ホスホルアミダイトを連続的に使用することにより、１の生体分子
あたり１６のヒドラジド結合部分が得られる。（Ｄ）では、分岐型ホスホルアミ
ダイトが、デンドリマー構造体を形成させる２の工程において使用され、その後
、ホスホルアミダイトおよびヒドラジンの処理により、１の生体分子あたり４の
ヒドラジド結合部分が得られる。
【図９Ａ−Ｃ】 オリゴヌクレオチド生体分子に取り込まれる新規なホスホ
ルアミダイトを作製するための工程がＡおよびＢによって示される３のスキーム
を示す。図９Ｃはヒドラジドで標識されたオリゴヌクレオチドを活性化エステル
モノマーと反応させ、そして生体分子を固定化するための基体を形成するために
使用することができるスキームを示す。
【図１０】 ヒドラジドで標識されたオリゴを、図９のスキーム３に示され
るモノマーなどの活性化エステルモノマーにカップリングするための反応混合物
の３の異なるＨＰＬＣ軌跡のグラフである。
【図１１】 多標識生体分子の結合に対する反応速度を示すグラフである。
ヒドラジド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルの結合が、他
の共有的な結合システムの速度よりも測定可能などに大きい速度で、そして２の
非共有結合的なシステムの速度に近い速度で生じた。
【図１２】 標識されたヒドラジドオリゴの共有的な結合が基体表面の活性
化エステルの量に依存することを示すグラフである。
【図１３】 ＮＨＳエステルまたはＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジ
ル（スルホ−ＮＨＳ）エステルのいずれかで修飾された基体表面に対する共有的
な結合の完全性を示すグラフである。これらのグラフは、加えた電流の範囲にわ
たる、電極に結合させた標識オリゴマーに由来する特異的な蛍光強度および非特
異的な蛍光強度を示している。
【図１４】 ＮＨＳエステルまたはＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジ
ル（スルホ−ＮＨＳ）エステルのいずれかで修飾された基体表面に対する共有的
な結合の完全性を示すグラフである。これらのグラフは、加えた電流の範囲にわ
たる、電極に結合させた標識オリゴマーに由来する特異的な蛍光強度および非特
異的な蛍光強度を示している。
【図１５】 ヒドラジド基を多数結合させることにより、基体における生体
分子のより高レベルの検出がもたらされることを示すグラフである。
【図１６】 ハイブリダイゼーションが、ヒドラジドで修飾されたオリゴヌ
クレオチド（ＡＴＡ５）を含有するそれらの部位においてのみ完全であった電子
的リバースドットブロットの結果を示すグラフである。捕捉物プローブを、適切
な電子的条件のもとで活性化エステル含有基体に特異的に結合させた。ヒドラジ
ドを有しない非特異的な捕捉物は活性化エステルと反応せず、したがってハイブ
リダイゼーションに利用することができない。
【図１７】 ２の異なるプロトコールＡおよびＢにしたがったヒドラジド修
飾オリゴヌクレオチドの合成を示す。Ａでは、保護されたヒドラジドホスホルア
ミダイトを使用して、オリゴマーを修飾し、その後、オリゴマーを脱保護する。
Ｂでは、エステルのホスホルアミダイトを使用して、オリゴマーを修飾し、その
後、オリゴマーをヒドラジンと反応させる。
【図１８】 ヒドラジド修飾オリゴマーと反応し得る様々な官能基を例示す
る概略図である。
【図１９】 アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２０】 アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２１】 １のオリゴあたり３、４および８のフェニルボロン酸で標識し
たオリゴマーに対する記録された平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。結合したオ
リゴマーを、この結合システムの安定性をモニターするために様々な洗浄条件に
付した。
【図２２】 アルデヒドが多い透過層におけるデンドリマー状ヒドラジドの
動的平衡および安定性を例示する概略図を示す。４のヒドラジド基とともに示さ
れるオリゴマーをアルデヒドが多い透過層に電子的に負荷し、これにより複数の
ヒドラゾン結合がもたらされる。この特定の例において、結合は個々に加水分を
受けやすい。複数の結合部位を使用することにより得られる安定性は、一部のヒ
ドラゾンが無傷で維持される一方で、一部のヒドラゾンが加水分解されることを
考慮している。隣接するヒドラゾン結合部位によって結び付けられているヒドラ
ジドは、拡散することができず、したがって、結合を回復させることができるア
ルデヒドが多い透過層において保持される。
【図２３】 ヒドラゾン結合を介してカップリングされたグリオキシルアガ
ロース透過層に対する、１、２、４および８のヒドラジドのデンドリマー状オリ
ゴマーの結合を示すグラフである。
【図２４】 アセタールで修飾されたヒドロゲルに対するデンドリマー状オ
リゴマーの結合を示すグラフである。アセタール基は、共有的な結合能力に必要
なアルデヒドを生成させるためには酸による加水分解を必要とする。
【図２５】 様々な濃度におけるSurmodics 3D LinkＴＭアミン結合性スラ
イドガラスに対するヒドラジドオリゴマーの使用および改善された結合を例示す
る。図２５Ｂはガラス製スライドガラスに結合させたオリゴマーの実際の蛍光像
であり、その結合レベルを図２５Ａにグラフで示す。
【図２６】 図２５で使用したSurmodicsスライドガラスに対する非特異的
な結合の結合レベルを示す。図２６Ｂは、スライドガラスに結合させたオリゴマ
ーの実際の蛍光像であり、その結合レベルを図２６Ａにグラフで示す。
【図２７】 図２７Ａは、ヒドラジドオリゴマーが固体支持体に対する固定
化を成功させることができる適用可能なｐＨ範囲を示す。図２７Ｂは、標準的な
アミン修飾オリゴマーを上回るヒドラジドオリゴマーの改善された感度はより低
い濃度で検出可能であることを示している。
【図２８】 分岐型または非分岐型のヒドラジド修飾オリゴマーがいかにし
て別の結合システムに対して容易に改変され得るかの一例を例示する。この特定
の例では、６のヒドラジドを有する分岐型オリゴマーを、分岐型ＰＢＡ結合プロ
ーブを得るためにｐ−ホルミルフェニルボロン酸で修飾している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 ノルベルト・ヴィントハープ ドイツ連邦共和国デー−65795ハッターシ ャイム、アカツィーエンシュトラーセ28番 (72)発明者 ジョン・アール・ヘイヴンズ アメリカ合衆国92122カリフォルニア州サ ンディエゴ、ラマス・ストリート5628番 (72)発明者 トーマス・ジェイ・オノフリー アメリカ合衆国92078カリフォルニア州サ ン・マルコス、ソノマ・ストリート590番 (72)発明者 チャールズ・エイチ・グリーフ アメリカ合衆国92065カリフォルニア州ラ モーナ、オークリー・ロード16345番 (72)発明者 ワン・ダグアン アメリカ合衆国92126カリフォルニア州サ ンディエゴ、レヴェルストック・ウェイ 8872番 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 CB03 FB05 HA02 4B024 AA11 BA80 CA01 HA12 4B029 AA07 BB20 CC08 FA01 FA12

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生体分子を基体に結合させる方法であって、 ａ.生体分子を準備し、 ｂ.前記生体分子を分岐型連結部分と接触させて、基体内の結合部分とカップ
    リングすることができる分岐型連結構造を形成させ、 ｃ.前記連結構造を、基体内に含まれる結合部分と接触させて、カップリング
    した基体結合構造を形成させることを含み；ここに、生体分子が前記基体に結合
    する方法。
  2. 【請求項２】 前記分岐型連結構造がカップリングした基体結合構造を形成
    させる前に活性化を必要とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記基体がポリマーである請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記基体が活性化されたポリマーである請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記基体が電子的にアドレス指定可能なマイクロチップと接
    触している請求項３または４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記基体が活性化されたスライドガラスである請求項３また
    は４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記基体がスライドガラスである請求項３または４に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 生体分子の連結構造がルイス塩基または求核種を含む請求項
    １に記載の方法。
  9. 【請求項９】 生体分子の連結構造がルイス酸または求電子種を含む請求項
    １に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ルイス塩基または求核種がアルコール、アミン、ヒドラジ
    ン、ヒドラジド、サリチルヒドロキサム酸およびスルフヒドリルよりなる群から
    選択される請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ルイス酸または求電子種がエポキシド、アジリジン、ビニ
    ル、アルデヒド、ケトン、アセタール、ジスルフィド、カルボン酸、アミド、ブ
    ロモアセトアミドまたはヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
    エステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アズラクトン、
    イソシアナート、チオイソシアナート、フェニルボロン酸およびカルボナートよ
    りなる群から選択される請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 生体分子の結合部分がルイス酸または求電子種を含む請求
    項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 結合部分がルイス塩基または求核種を含む請求項１に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 ルイス酸または求電子種がエポキシド、アジリジン、ビニ
    ル、アルデヒド、ケトン、アセタール、ジスルフィド、カルボン酸、アミド、ブ
    ロモアセトアミドまたはヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
    エステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アズラクトン、
    イソシアナート、チオイソシアナート、フェニルボロン酸、ホスホルアミダイト
    およびカルボナートよりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ルイス塩基または求核種がアルコール、アミン、ヒドラジ
    ン、ヒドラジド、サリチルヒドロキサム酸およびスルフヒドリルよりなる群から
    選択される請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記分岐型連結部分がホスホルアミダイトである請求項１
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ホスホルアミダイトが３−［（２−シアノエトキシ）
    （ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、５−｛［
    （２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル
    ｝イソフタル酸ジエチル、３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイ
    ソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカ
    ルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピ
    オン酸ジメチル、６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホス
    ファニルオキシ］ヘキサン酸エチル、および６−［（２−シアノエトキシ）（ジ
    イソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジ
    ドよりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記分岐型連結部分が基体に結合するために活性化される
    分岐型連結構造を形成する請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記基体に対する前記生体分子の前記結合が共有結合を介
    して達成される請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記基体に対する前記生体分子の前記結合が非共有結合を
    介して達成される請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ヒドラジドを生体分子に結合させるための方法であって： ａ.保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を含むホスホルアミダイト
    に生体分子をカップリングすること、および ｂ.前記保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を、少なくとも１の試
    薬と接触させて保護された形態または前駆体形態をヒドラジド基に変換すること
    を含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記ホスホルアミダイトが３−［（２−シアノエトキシ）
    （ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、５−｛［
    （２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル
    ｝イソフタル酸ジエチル、３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイ
    ソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカ
    ルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピ
    オン酸ジメチル、６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホス
    ファニルオキシ］ヘキサン酸エチル、および６−［（２−シアノエトキシ）（ジ
    イソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジ
    ドよりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ３−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）
    ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、５−｛［（２−シアノエトキシ）（
    ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル、
    ３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフ
    ァニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチ
    ル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチル、６−［（
    ２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサン
    酸エチル、および６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホス
    ファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドよりなる群から選択され
    るホスホルアミダイトの組成物。
  24. 【請求項２４】 前記生体分子が最初に活性化され、その後、アルデヒド、
    ケトン、エステル、活性化エステル、アセタール、ハロアセトアミドおよびハロ
    ゲン化アルキルよりなる群から選択される結合部分を含む基体に結合される請求
    項２１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を有する前
    記生体分子が最初にヒドラジドに変換され、その後、２−ホルミルフェニルボロ
    ン酸、３−ホルミルフェニルボロン酸および４−ホルミルフェニルボロン酸より
    なる群から選択される試薬で処理される請求項２４に記載の生体分子の活性化方
    法。
  26. 【請求項２６】 活性化された生体分子が還元される請求項２５に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 ヒドラジドを含むオリゴヌクレオチドを作製する方法であ
    って： ａ.オリゴヌクレオチドをヒドラジド基の少なくとも１の前駆体形態にカップ
    リングすること、および ｂ.前記前駆体形態を少なくとも１の試薬と接触させて前駆体形態をヒドラジ
    ド基に変換することを含む方法。
  28. 【請求項２８】 ヒドラジド基の前記前駆体形態がアルデヒド、ケトン、エ
    ステル、カルボン酸、活性化エステル、アセタール、ハロアセトアミド、ハロゲ
    ン化アルキルおよびトリチルヒドラジドよりなる群から選択される請求項２７に
    記載の方法。
  29. 【請求項２９】 さらに、 ａ.前記分岐型連結構造をボロン酸含有基と接触させること、および ｂ.前記ボロン酸含有基を前記基体に接触させることを含む請求項１に記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】 電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、
    サリチルヒドロキサム酸を含有する基体表面に生体分子を結合するための分岐型
    フェニルボロン酸含有分子または非分岐型フェニルボロン酸含有分子の使用。
  31. 【請求項３１】 電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、
    活性化エステルを含有する基体表面に結合するための生体分子を含有する分岐型
    ヒドラジドまたは非分岐型ヒドラジドの使用。
  32. 【請求項３２】 前記活性化エステルがアズラクトン、Ｎ−ヒドロキシスク
    シンイミジルエステルおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル
    よりなる群から選択される請求項３１に記載の使用。
  33. 【請求項３３】 電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、
    アルデヒドを含有する基体表面に結合するための生体分子を含有する分岐型ヒド
    ラジドまたは非分岐型ヒドラジドの使用。
  34. 【請求項３４】 電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、
    ケトンを含有する基体表面に結合するための生体分子を含有する分岐型ヒドラジ
    ドまたは非分岐型ヒドラジドの使用。
  35. 【請求項３５】 それに結合した生体分子を有するマイクロアレイであって
    、前記生体分子の各々が複数の結合基によって前記マイクロアレイに結合し、前
    記結合基が分岐型連結構造によって前記生体分子にカップリングしているマイク
    ロアレイ。
  36. 【請求項３６】 前記アレイが前記アレイ１μｍ２あたり１０３の生体分子
    を超える結合した生体分子の密度を有する請求項３５に記載のマイクロアレイ。
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